DCM011-12

Ed. 09/2018

PROLACTIN ELISA for routine analysis

Direct immunoenzymatic determination of Prolactin in human serum.

LOT
IVD
See external label  = 96 tests REF DKO011

INTENDED USE abnormalities, in response to certain pharmacologic

Immunoenzymatic colorimetric method for agents and in hypothyroidism.
quantitative determination of Prolactin concentration Hypoprolactinemia (low prolactin levels) are observed
in human serum. in cases of hypopituitarism.
Prolactin ELISA kit is intended for laboratory use only.
2. PRINCIPLE
1. CLINICAL SIGNIFICANCE The essential reagents required for an
Prolactin is a polypeptide hormone synthesized and immunoenzymatic assay include high affinity and
secreted by the Adenohypophysis (anterior Pituitary specificity antibodies (enzyme and immobilised) with
gland) and the placenta. It is also produced in other different and distinct epitope recognition, in excess,
tissues including the breast and the decidua. Pituitary and native antigen.
prolactin secretion is regulated by neuroendocrine In this procedure the immobilization takes place
neurons in the hypothalamus, most importantly by during the assay at the surface of a microplate well
neurosecretory dopamine neurons of the arcuate through the interaction of streptavidin coated on the
nucleus, which inhibit prolactin secretion. well and exogenously added biotinylated monoclonal
Prolactin is present in several body fluids, including anti-PRL antibody.
blood plasma, amniotic fluid, milk, mucosal secretions Upon mixing monoclonal biotinylated antibody, the
and cerebrospinal fluid. enzyme labeled antibody and a serum containing the
Prolactin has many effects, the most important of native antigen, a reaction results between the native
which is to stimulate the mammary glands to produce antigen and the antibodies without competition or
milk (lactation). Other possible functions of prolactin steric hindrance to form a soluble sandwich complex.
include the surfactant synthesis of the fetal lungs at The interaction is illustrated by the following equation:
the end of the pregnancy and immune tolerance of
the foetus by the maternal organism during Ka
pregnancy. EnzAb
(p) + AgPRL + BtnAb
(m)  EnzAb(p)- AgPRL- BtnAb(m)
Prolactin may also have inhibitory effects on gonadal K-a
function when present in high concentrations.
There is a diurnal cycle in prolactin secretion. BtnAb = Biotinylated Monoclonal Antibody (Excess
(m)
During pregnancy, high circulating concentrations of quantity)
estrogen promote prolactin production. The resulting
high levels of prolactin secretion cause maturation of AgPRL = Native PRL antigen (variable quantity)
EnzAb
the mammary glands, preparing them for lactation. (p) = Enzyme labeled policlonal antibody (Excess
After childbirth, prolactin levels fall as the internal quantity)
stimulus for them is removed. EnzAb -
(p) AgPRL- BtnAb(m) = Antigen-Antibodies
High prolactin levels also tend to suppress the Sandwich complex
ovulatory cycle by inhibiting the secretion of both FSH
Ka = Rate constant of association
and GnRH.
Prolactin levels may be checked as part of a sex K-a = Rate constant of disassociation
hormone workup, as elevated prolactin secretion can
suppress the secretion of FSH and GnRH, leading to Simultaneously the complex is deposited to the well
hypogonadism, and sometimes causing erectile through the high affinity reaction of streptavidin and
dysfunction in men. biotinylated antibody.
Elevations in plasma prolactin concentrations occur This interaction is illustrated below:
during ovulation, pregnancy, nursing and stress.
Abnormal elevations in plasma prolactin levels EnzAb -Ag
(p)
Btn
PRL- Ab(m) + Streptavidincw Immobilized
(hyperprolactinemia) can occur as a result of pituitary complex
adenomas, other anatomic and traumatic
Streptavidincw = Streptavidin immobilized on well 4. WARNINGS
Immobilized complex = Antibodies-Antigen sandwich  This kit is intended for in vitro use by professional
bound. persons only. Not for internal or external use in
Humans or Animals.
After equilibrium is attained, the antibody-bound
 Use appropriate personal protective equipment
fraction is separated from unbound antigen by
while working with the reagents provided.
decantation or aspiration. The enzyme activity in the
 Follow Good Laboratory Practice (GLP) for
antibody-bound fraction is directly proportional to the
handling blood products.
native antigen concentration. By using several
 Some reagents contain small amounts of Proclin
different serum references of known antigen values, a
300R as preservative. Avoid the contact with skin
dose response curve can be generated from which
or mucosa.
the antigen concentration of an unknown can be
 The TMB Substrate contains an irritant, which may
ascertained.
be harmful if inhaled, ingested or absorbed
through the skin. To prevent injury, avoid
3. REAGENTS, MATERIALS AND INSTRUMENTATION
inhalation, ingestion or contact with skin and eyes.
 The Stop Solution consists of a diluted sulphuric
3.1. Reagents and materials supplied in the kit
acid solution. Sulphuric acid is poisonous and
1. Calibrators (6 vials, 1 mL each) corrosive and can be toxic if ingested. To prevent
CAL0 REF DCE002/1106-0 chemical burns, avoid contact with skin and eyes.
CAL1 REF DCE002/1107-0  Avoid the exposure of reagent TMB/H2O2 to
CAL2 REF DCE002/1108-0 directed sunlight, metals or oxidants. Do not
CAL3 REF DCE002/1109-0 freeze the solution.
 This method allows the determination of Prolactin
CAL4 REF DCE002/1110-0
from 5.0 to 100.0 ng/mL.
CAL5 REF DCE002/1111-0
2. Control (1 vial, 1 mL) 5. PRECAUTIONS
Control Concentration is indicated on the Certificate  Please adhere strictly to the sequence of pipetting
of Analysis REF DCE045/1103-0 steps provided in this protocol. The performance
3. Conjugate (1 vial, 12 mL) data represented here were obtained using
Antibodies Anti Prolactin conjugated with Horseradish specific reagents listed in this Instruction For Use.
peroxidase (HRP) and Anti Prolactin biotinylated  All reagents should be stored refrigerated at 2-8°C
REF DCE002/1102-0 in their original container. Any exceptions are
clearly indicated. The reagents are stable until the
4. Coated Microplate (1 breakable microplate) expiry date when stored and handled as indicated.
Streptavidin adsorbed on microplate  Allow all kit components and specimens to reach
REF DCE002/1103-0 room temperature (22-28°C) and mix well prior to
5. TMB Substrate (1 vial, 15 mL) use.
H2O2-TMB 0.26 g/L (avoid any skin contact)  Do not interchange kit components from different
REF DCE004-0 lots. The expiry date printed on box and vials
6. Stop Solution (1 vial, 15 mL) labels must be observed. Do not use any kit
Sulphuric acid 0.15 mol/L (avoid any skin contact) component beyond their expiry date.
 If you use automated equipment, the user has the
REF DCE005-0
responsibility to make sure that the kit has been
7. 10X Conc. Wash Solution (1 vial, 50 mL) appropriately tested.
Phosphate buffer 0.2M pH 7.4 REF DCE054-0  The incomplete or inaccurate liquid removal from
the wells could influence the assay precision
and/or increase the background. To improve the
3.2. Reagents necessary not supplied performance of the kit on automatic systems is
Distilled water. recommended to increase the number of washes.
3.3. Auxiliary materials and instrumentation  It is important that the time of reaction in each well
Automatic dispenser. is held constant for reproducible results. Pipetting
Microplates reader (450 nm, 620-630 nm) of samples should not extend beyond ten minutes
to avoid assay drift. If more than 10 minutes are
Note needed, follow the same order of dispensation. If
Store all reagents at 28°C in the dark. more than one plate is used, it is recommended to
Open the bag of reagent 4 (Coated Microplate) only repeat the dose response curve in each plate
when it is at room temperature and close it  Addition of the TMB Substrate solution initiates a
immediately after use; once opened, it is stable until kinetic reaction, which is terminated by the
expiry date of the kit. addition of the Stop Solution. Therefore, the TMB
Substrate and the Stop Solution should be added
in the same sequence to eliminate any time
deviation during the reaction.
 Observe the guidelines for performing quality
control in medical laboratories by assaying
controls and/or pooled sera.
 Maximum precision is required for reconstitution  To avoid potential microbial and/or chemical
and dispensation of reagents. contamination, unused reagents should never be
 Samples microbiologically contaminated, highly transferred into the original vials.
lipemeic or haemolysed should not be used in the  As it is necessary to perform the determination in
assay. duplicate in order to improve accuracy of the test
 Plate readers measure vertically. Do not touch the results, prepare two wells for each point of the
bottom of the wells. calibration curve (C0-C5), two for each Control, two
for each sample, one for Blank.
6. PROCEDURE
Sample/
Reagent Calibrator Blank
6.1. Preparation of the Calibrators (C0…C5) Control
The Calibrators are ready to use, are calibrated Sample/
against WHO 3rd IS 84/500 and have the following 50 µL
Control
concentrations:
Calibrator
C0 C1 C2 C3 C4 C5 50 µL
C0-C5
ng/mL 0 5 10 25 50 100
The Calibrators are stable until the expiry date printed Conjugate 100 µL 100 µL
on the label. Once opened, the Calibrators are stable
6 months at 2-8°C. Incubate at room temperature (22÷28°C) for 1 hours.
Remove the contents from each well; wash the wells
6.2. Preparation of Wash Solution 3 times with 300 μL of diluted Wash Solution.
Dilute the contents of each vial of the buffered wash Important note: during each washing step, gently
solution concentrate (10X) with distilled water to a shake the plate for 5 seconds and remove excess
final volume of 500 mL prior to use. For smaller solution by tapping the inverted plate on an absorbent
volumes respect the 1:10 dilution ratio. The diluted paper towel.
wash solution is stable for 30 days at 2-8°C. In
concentrated wash solution is possible to observe the Automatic washer: if you use automated equipment,
presence of crystals; in this case mix at room wash the wells at least 5 times.
temperature until the complete dissolution of crystals; TMB
100 µL 100 µL 100 µL
for greater accuracy, dilute the whole bottle of Substrate
concentrated wash solution to 500 mL, taking care to
Incubate at room temperature (22÷28°C) for 15
transfer completely the crystals, then mix until crystals
minutes in the dark.
are completely dissolved.
Stop
6.3. Preparation of the Sample 100 µL 100 µL 100 µL
Solution
Prolactin determination can be done on human
Shake the microplate gently.
serum. Do not use plasma for this assay (plasma Read the absorbance (E) at 450 nm against a
samples can lead to false results). reference wavelength of 620-630 nm or against
Samples microbiologically contaminated, highly Blank within 5 minutes.
lipemeic or haemolysed should not be used in the
assay.
7. QUALITY CONTROL
To obtain the serum, collect blood by venipuncture,
Each laboratory should assay controls at normal, high
allow to clot, and separate serum by centrifugation at
and low levels range of Prolactin for monitoring assay
room temperature. Do not centrifuge before complete
performance. These controls should be treated as
clotting has occurred.
unknowns and values determined in every test
Specimen can be stored at 2÷8°C for at short time
procedure performed. Quality control charts should be
(max two days). For longer storage the specimen
maintained to follow the performance of the supplied
should be frozen at -20°C. Avoid repeated freezing
reagents. Pertinent statistical methods should be
and thawing. Thawed samples should be inverted
employed to ascertain trends. The individual
several times prior to testing.
laboratory should set acceptable assay performance
For sample with concentration over 100 ng/mL dilute
limits. Other parameters that should be monitored
the sample 1:2 with Calibrator 0.
include the 80, 50 and 20% intercepts of the
The Control is ready for use.
calibration curve for run-to-run reproducibility. In
addition, maximum absorbance should be consistent
6.4. Procedure
with past experience. Significant deviation from
 Allow all reagents to reach room temperature
established performance can indicate unnoticed
(22-28°C) for at least 30 minutes. At the end of change in experimental conditions or degradation of
the assay, store immediately the reagents at 2- kit reagents. Fresh reagents should be used to
8°C: avoid long exposure to room temperature. determine the reason for the variations.
 Unused coated microwell strips should be
released securely in the foil pouch containing
desiccant and stored at 2-8°C.
8. RESULTS 10.1.2. Inter Assay Variation
Between run variation was determined by replicate
8.1. Mean Absorbance (10x) the measurement of three different control sera
Calculate the mean of the absorbance (Em) for each with kits of different lots.
point of the calibration curve (C0-C5) and of each
sample.
Sample N X  C.V.
Level 1 10 5.46 0.30 5.49%
8.2. Calibration curve
Level 2 10 17.72 0.91 5.16%
Plot the values of absorbance (Em) of the calibrators
(C0-C5) against concentration. Draw the best-fit curve Level 3 10 36.29 1.67 4.60%
through the plotted points (Es: Four Parameter
Logistic or Sigmoide). 10.2. Sensitivity
The lowest detectable concentration of Prolactin that
8.3. Calculation of Results can be distinguished from the Calibrator 0 is 0.12
Interpolate the values of the samples on the calibration ng/mL at the 95 % confidence limit.
curve to obtain the corresponding values of the
concentrations expressed in ng/mL. 10.3. Accuracy
The recovery of 3,13 - 6,25 - 12,50 - 25,00 - 50,00
9. REFERENCE VALUES ng/mL of Prolactin added to sample gave an average
value (±SD) of 102.52% ± 9.75% with reference to the
Each laboratory must establish its own normal ranges
original concentrations.
based on patient population.
The dilution test performed on three sera diluted 2 - 4 -
The serum Prolactin values are comprised in the
8 - 16 times gave an average value (±SD) of 102.19%
following intervals:
± 9.80%.
Sample Range ng/mL 10.4. Specificity
Male 1.8 - 17.0 The cross reaction of the antibody calculated at 50%
menstrual cycle 1.2 - 19.5 according to Abraham are shown in the table:
Female:
menopause 1.5 - 18.5
hProlactin 100%
LH N.D.
Some of the female population tested in this group FSH N.D.
were probably using oral contraptives, wich may hCG N.D.
affect results. TSH N.D.
Please pay attention to the fact that the determination hGH N.D.
of a range of expected values for a “normal”
population in a given method is dependent on many 10.5. Correlation
factors, such as specificity and sensitivity of the [Link] Prolactin ELISA kit (y) was compared to
method used and type of population under another commercially available Prolactin assay (x).
investigation. Therefore each laboratory should Serum samples of 37 subjects were analysed.
consider the range given by the Manufacurer as a The linear regression curve was calculated:
general indication and produce their own range of y = 1.01 x + 1.94
expected values based on the indigenous population r2 = 0.957
where the laboratory works.
The new [Link] Prolactin ELISA kit (y) was
10. PERFORMANCE AND CHARACTERISTICS compared to the old [Link] Prolactin ELISA kit (x).
Serum samples of 37 subjects were analysed.
10.1. Precision The linear regression curve was calculated:
10.1.1. Intra Assay Variation y = 0.85 x + 2.58
Within run variation was determined by replicate (20x) r2 = 0.937
the measurement of three different control sera in one
assay. 10.6. Hook Effect
Sample N X  C.V. [Link] Prolactin assay shows no Hook effect up to
Level 1 20 5.33 0.15 2.78% 200 ng/mL.
Level 2 20 18.21 0.73 4.03%
Level 3 20 37.20 1.38 3.71% 11. WASTE MANAGEMENT
Reagents must be disposed off in accordance with
local regulations.
BIBLIOGRAPHY
 Wisdom, G.B. Clin. Chem. 22/8 1243 - 1255
(1976)
 Shome, B. and Parlow, A.F.,
J. Clin. Endocr. Metab.,39, 199 – 202 (1974).
 Shome, B. and Parlow, A.F.,
J. Clin. Endocr. Metab.,39, 203 – 205 (1974).
 Uotila, M. Ruoslahti, E. Engvall, E.,
J. Immunol. Methds, 42, 11-15 (1981)
 Acosta, A.A.M.D. and Wright, G.L.,
Journal of Clinical Immunoassays, 6, 41 (1983).
 Cohen, K. L., Metabolism, 26 1165-1177 (1977)

Ed. 09/2018 DCM011-12

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Ed. 09/2018

PROLACTIN ELISA para análisis de rutina

Determinación inmunoenzimática directa de la prolactina en suero humano.

LOT
IVD
Ver etiqueta externa  = 96 ensayos REF DKO011

USO PREVISTO de GnRH, dando lugar a hipogonadismo y, en

Método inmunoenzimático colorimétrico para la ocasiones, a disfunción eréctil en los hombres.
determinación cuantitativa de la concentración de Se presentan altas concentraciones de prolactina en
prolactina en suero humano. el plasma durante la ovulación, el embarazo y el
El kit Prolactin ELISA está destinado al uso en estrés. Niveles normales de prolactina en plasma
laboratorio exclusivamente. (hiperprolactinemia) pueden aparecer como
consecuencia de adenomas pituitarios, de otras
1. SIGNIFICADO CLÍNICO anomalías anatómicas y traumáticas, como
La prolactina es una hormona polipeptídica respuesta a determinados agentes farmacológicos y
sintetizada y secretada por la adenohipófisis en el hipotiroidismo. Se ha observado
(glándula pituitaria anterior) y la placenta. También se hipoprolactinemia (bajos niveles de prolactina) en
produce en otros tejidos, incluyendo el pecho y la casos de hipopituitarismo.
decidua. La secreción pituitaria de prolactina está
regulada por las neuronas neurosecretoras de 2. PRINCIPIO DEL MÉTODO
dopamina del núcleo arqueado, que inhiben la Los reactivos esenciales requeridos para el ensayo
secreción de prolactina. inmunoenzimático incluyen anticuerpos con alta
La prolactina está presente en varios fluidos afinidad y especificidad (conjugados con enzima e
fisiológicos, incluyendo el plasma sanguíneo, el inmovilizados) con reconocimiento de epítopos
líquido amniótico, la leche, las secreciones mucosas distintos, en exceso, y antígeno nativo.
y el líquido cefalorraquídeo. La prolactina tiene En este procedimiento, la inmovilización se produce
numerosos efectos, el principal es la estimulación de durante el ensayo en la superficie de los pocillos de la
las glándulas mamarias para la producción de leche microplaca mediante la interacción de la
(lactancia). Entre otras funciones de la prolactina se estreptavidina fijada en los pocillos y el anticuerpo
incluyen la síntesis del agente tensioactivo de los anti-PRL biotinilado añadido.
pulmones fetales al final del embarazo y de la Mezclando el anticuerpo biotinilado, el anticuerpo
inmunotolerancia del feto del organismo materno conjugado con enzima y un suero que contiene el
durante el embarazo. antígeno nativo, se produce la reacción entre el
La prolactina también puede tener efectos inhibidores antígeno nativo y los anticuerpos, sin competencia o
sobre la función de las gonadas cuando está impedimento estérico, para formar un complejo
presente en altas concentraciones. sándwich soluble.
La secreción de la prolactina presenta una La interacción se ilustra mediante la siguiente
regularidad cíclica diaria. ecuación:
Durante el embarazo, las altas concentraciones de Ka
estrógeno circulante promueven la síntesis de EnzAb
(p) + AgPRL + BtnAb(m)  EnzAb(p)- AgPRL- BtnAb(m)
prolactina. Los niveles elevados resultantes de la K-a
secreción de prolactina causan la maduración de las
glándulas mamarias para la lactancia. Después del BtnAb
(m) = anticuerpo biotinilado monoclonal (cantidad
parto, los niveles de prolactina disminuyen puesto en exceso)
que el estímulo interno desaparece. AgPRL = antígeno PRL nativo (cantidad variable)
Los niveles elevados de prolactina tienden a suprimir EnzAb
(p) = anticuerpo policlonal marcado con enzima
el ciclo ovulatorio inhibiendo la secreción de FSH o (cantidad en exceso)
de GnRH. EnzAb -
(p) AgPRL- BtnAb(m) = complejo sándwich
Los niveles de prolactina se pueden controlar como antígeno-anticuerpos
componente de un diagnóstico diferencial de las Ka = constante de asociación
hormonas sexuales, puesto que la secreción elevada K-a = constante de disociación
de prolactina puede suprimir la secreción de FSH y
Al mismo tiempo, el complejo se fija en el pocillo Nota
mediante la reacción de alta afinidad de la Conservar todos los reactivos a 28°C, protegidos
estreptavidina y el anticuerpo biotinilado. de la luz. Abrir la bolsa del reactivo 4 (microplaca
Esta interacción se describe a continuación: recubierta) solo cuando se encuentre a temperatura
PRL- Ab(m) + estreptavidinacw complejo
EnzAb -Ag Btn
(p) ambiente y cerrarla inmediatamente después de
inmovilizado extraer las tiras que se vayan a utilizar; una vez
abierta, permanece estable hasta la fecha de
Estreptavidinacw = estreptavidina inmovilizada en el caducidad del kit.
pocillo
Complejo inmovilizado = complejo sándwich 4. ADVERTENCIAS
antígeno-anticuerpos  Este kit de ensayo está previsto para usarse in
vitro y por personal experto. No es para uso
Tras lograr el equilibrio, la fracción de antígeno unida interno o externo en humanos o animales.
al anticuerpo se separa del antígeno libre mediante  Usar los equipos de protección individual previstos
decantación o aspiración. al trabajar con los reactivos suministrados.
La actividad enzimática de la fracción unida es  Siga las Buenas Prácticas de Laboratorio (GLP)
directamente proporcional a la concentración de en el manejo de las muestras sanguíneas y sus
antígeno nativo. derivados.
Usando distintos sueros de referencia con valores  Algunos reactivos contienen pequeñas cantidades
conocidos de antígeno se puede generar una curva de Proclin 300R como conservante. Evite el
dosis-respuesta con la que se puede determinar la contacto con la piel y las mucosas.
concentración del antígeno de muestras  El cromógeno TMB contiene un irritante que
desconocidas. puede ser dañino si se inhala, se ingiere o se
absorbe a través de la piel. Para prevenir lesiones,
3. REACTIVOS, MATERIALES E INSTRUMENTACIÓN evitar la inhalación, la ingestión o el contacto con
la piel y con los ojos.
3.1. Reactivos y materiales suministrados en el kit  La Solución de Parada está formada por una
1. Calibradores (6 frascos, 1 mL cada uno) solución de ácido sulfúrico diluido. El ácido
CAL0 REF DCE002/1106-0 sulfúrico es venenoso y corrosivo, y puede ser
CAL1 REF DCE002/1107-0 tóxico si se ingiere. Para prevenir posibles
CAL2 REF DCE002/1108-0 quemaduras químicas, evitar el contacto con la
CAL3 REF DCE002/1109-0 piel y con los ojos.
 Evite la exposición de los reactivos TMB/H2O2 a la
CAL4 REF DCE002/1110-0
luz solar directa, metales u oxidantes. No congelar
CAL5 REF DCE002/1111-0 la solución.
2. Control (1 frascos, 1 mL)  Este método permite determinar concentraciones
La concentración del Control se indica en el certificado de prolactina de 5,0 ng/mL a 100,0 ng/mL.
de calidad (Certificate of Analysis)
REF DCE045/1103-0 5. PRECAUCIONES
3. Conjugado (1 frasco, 12 mL)  Respetar rigurosamente la secuencia de los pasos
Anticuerpos anti-prolactina conjugado con peroxidasa indicados en este protocolo. Los resultados aquí
de rabano (HRP) y anti-prolactina biotinilado presentados se han obtenido utilizando los
REF DCE002/1102-0 reactivos específicos que figuran en estas
instrucciones de uso.
4. Microplaca recubierta (1 microplaca rompible)  Todos los reactivos deben conservarse a una
Estreptavidina absorbida en la microplaca temperatura controlada de 2-8°C en sus
REF DCE002/1103-0 recipientes originales. Todas las excepciones
5. Substrato TMB (1 frasco, 15 mL) están claramente marcadas. Los reactivos son
H2O2 -TMB (0,26 g/L) (evitar el contacto con la piel) estables hasta la fecha de caducidad cuando se
REF DCE004-0 almacenan y manipulan de acuerdo con las
instrucciones proporcionadas.
6. Solución de parada (1 frasco, 15 mL)
 Antes del uso, esperar hasta que todos los
Ácido sulfúrico 0,15 mol/L (evitar el contacto con la piel)
componentes del kit y las muestras se encuentren
REF DCE005-0
a temperatura ambiente (22-28°C) y mezclar
7. Solución de lavado conc. 10X (1 frasco, 50 mL) cuidadosamente.
Tampón fosfato 0.2M pH 7.4 REF DCE054-0  No mezclar componentes de kits de lotes
distintos. Se debe observar la fecha de caducidad
3.2. Reactivos necesarios no suministrados indicada en la etiqueta de la caja y de todas las
en el kit ampollas. No usar componentes después de la
Agua destilada. fecha de caducidad.
3.3. Material e instrumentación auxiliares  Si utiliza un equipo automático, es responsabilidad
Dispensadores automáticos. del usuario asegurar que la metodología aplicada
Lector de microplacas (450 nm, 620-630 nm). haya sido debidamente validada.
 Un lavado incompleto o impreciso y la aspiración 6.3. Preparación de la muestra
insuficiente del líquido de los micropozos ELISA La determinación de la prolactina se realiza en suero
pueden causar una precisión pobre y/o un elevado humano. No utilizar plasma.
fondo. Para mejorar el rendimiento del kit en los No use muestras con contaminación microbiana,
sistemas automatizados, se recomienda aumentar altamente lipémicas o hemolizadas. La obtención de
el número de lavados. la muestra es por extracción de sangre venosa, dejar
 Para la reproducibilidad de los resultados, es coagular y separar por centrifugado, recuperar el
importante que el tiempo de reacción sea igual suero.
para cada pocillo. El tiempo de dispensación de Si la dosificación no se realiza en un plazo de dos
los pocillos no debe superar los 10 minutos; si se días desde la extracción, conservar la muestra a -
prolongara más allá de los 10 minutos, respétese 20°C. No volver a congelar las muestras una vez
el orden de dispensación. Si utiliza más de una descongeladas.
placa, se recomienda repetir la curva de Para muestras con una concentración superior a 100
calibración en cada placa. ng/mL, diluir 1:2 la muestra con Calibrador 0.
 Al añadir el Sustrato TMB se inicia una reacción El Control está listo para usar.
cinética que termina al agregar la Solución de
Parada. Tanto el Sustrato TMB como la Solución 6.4. Procedimiento
de Parada deben agregarse en la misma  Esperar hasta que todos los reactivos se
secuencia para evitar diferentes tiempos de encuentren a temperatura ambiente (22-28°C)
reacción. durante al menos 30 minutos. Al final del ensayo
 Observar las directrices para la ejecución del inmediatamente poner todos los reactivos a 2-8°C
control de calidad en los laboratorios clínicos al para evitar largos periodos a temperatura
comprobar controles y/o pool de sueros. ambiente.
 Observar la máxima precisión en la reconstitución  Las tiras de pocillos no utilizados se deben
y dispensación de los reactivos. guardar de inmediato en la bolsa desechable que
 No use muestras con contaminación microbiana, contiene desecantes y almacenarse a 2-8°C.
altamente lipémicas o hemolizadas.  Para evitar la contaminación microbiana y/o
 Los lectores de microplacas leen las DO química no regrese porciones de reactivos no
verticalmente, por tanto no debe tocarse el fondo usados en los viales originales.
de los pocillos.  Para aumentar la precisión de los resultados de la
prueba es necesario trabajar en duplicado:
6. PROCEDIMIENTO preparar dos pocillos para cada punto de la curva
de calibración (C0-C5), dos para cada control, dos
6.1. Preparación de los Calibradores (C0…C5) para cada muestra, uno para el blanco.
Los Calibradores son listo para usar, son calibrados
frente al WHO 3rd IS 84/500, y tienen las siguientes
concentraciones: Muestras
Reactivos Calibrador Blanco
C0 C1 C2 C3 C4 C5 /Control
ng/mL 0 5 10 25 50 100 Muestras
50 µL
/Control
Los Calibradores son estables hasta la fecha de
caducidad impresa en la etiqueta. Una vez abiertos, Calibrador
los calibradores permanecen estables al menos 6 C0-C5 50 µL
meses a 2-8°C.
Conjugado 100 µL 100 µL
6.2. Preparación de la solución de lavado
Antes del uso, diluir el contenido de cada ampolla de Incubar 1 h a temperatura ambiente (22÷28°C).
"Solución de lavado conc. 10X" con agua destilada Retirar la mezcla de reacción, lavar 3 veces
hasta un volumen de 500 mL. Para preparar añadiendo a cada pocillo 0,3 mL de solución de
volúmenes menores, respetar la relación de dilución lavado diluida.
de 1:10. La solución de lavado diluida se mantiene Nota importante: agite suavemente la placa durante
estable a 2-8°C durante al menos 30 días. 5 segundos en cada paso del lavado. Después del
En la solución de lavado concentrada es posible último lavado asegúrese haber eliminado
observar la presencia de cristales. En ese caso, completamente la solución de lavado de los pozos,
agitar a temperatura ambiente hasta que los cristales invierta la placa y golpéela repetidas veces contra una
se disuelvan por completo. Para una mayor precisión, servilleta de papel absorbente.
diluir todo el frasco de la solución de lavado Lavados automático: si está utilizando una lavadora
concentrada a 500 mL, teniendo cuidado para automática, lavar los pocillos al menos 5 veces.
transferir también los cristales y, a continuación,
agitar hasta que se disuelvan por completo. Substrato
100 µL 100 µL 100 µL
TMB
Incubar 15 minutos a temperatura ambiente
(22÷28°C), protegida de la luz.
 Es importante señalar que la determinación de un
Solución de rango de valores esperados en un método dado para
100 µL 100 µL 100 µL
parada una población "normal" depende de muchos factores,
Agitar la microplaca con cuidado. tales como la especificidad y sensibilidad del método
Leer la absorbancia (E) a 450 nm frente una segunda en uso, y la población en estudio. Por lo tanto, cada
lectura de referencia a 620-630 nm o frente al blanco laboratorio debe considerar el intervalo especificado
dentro de los 5 minutos. por el fabricante como una guía general y producir su
propio rango de valores calculados en base al
7. CONTROL DE CALIDAD estadístico obtenido por el laboratorio, donde reside
Cada laboratorio debe analizar sueros control para la población local.
los rangos bajo, medio y alto de prolactina para
supervisar el rendimiento del análisis. Estas muestras 10. PARÁMETROS CARACTERÍSTICOS
deben tratarse como desconocidas y los valores
deben determinarse en cada ensayo realizado. Se 10.1. Precisión
deben mantener los gráficos de control de calidad 10.1.1. Intraensayo
para seguir el rendimiento de los reactivos La variabilidad dentro del mismo kit se ha
suministrados. Se deben emplear métodos determinado replicando (20x) la medición de tres
estadísticos adecuados para determinar las sueros de control distintos.
tendencias. El laboratorio debe establecer los límites
de aceptabilidad del rendimiento del análisis. Entre Muestra N X  C.V.
otros parámetros que se deben controlar, se incluyen Nivel 1 20 5.33 0.15 2.78%
las intersecciones de 80, 50 y 20% de la curva de Nivel 2 20 18.21 0.73 4.03%
calibración para evaluar la reproducibilidad. Además, Nivel 3 20 37.20 1.38 3.71%
la capacidad de absorción máxima debe ser
constante con la experiencia anterior. Una desviación 10.1.2. Interensayo
significativa del rendimiento establecido puede indicar La variabilidad entre distintos kits se ha determinado
un cambio inadvertido en las condiciones replicando (10x) la medición de tres sueros de control
experimentales o la degradación de los reactivos del distintos con kits pertenecientes a lotes distintos.
kit. Se deben usar reactivos frescos para determinar
la causa de las variaciones. Muestra N X  C.V.
Nivel 1 10 5.46 0.30 5.49%
8. RESULTADOS
Nivel 2 10 17.72 0.91 5.16%
Nivel 3 10 36.29 1.67 4.60%
8.1. Absorbancia media
Calcular la absorbancia media (Em) de cada punto de
10.2. Sensibilidad
la curva de calibración (C0-C5) y de cada muestra.
La concentración mínima de prolactina medible que
puede distinguirse del Calibrador 0 es de 0,12 ng/mL
8.2. Curva de calibración
con un límite de confianza del 95%.
Trazar el gráfico de la absorbancia (Em) en función
de las concentraciones de los calibradores (C0-C5) (p.
ej.: logística de cuatro parámetros o sigmoideo). 10.3. Exactitud
La prueba de recuperación realizada en una muestra
enriquecida con 3.13 - 6.25 - 12.50 - 25.00 - 50.00
8.3. Cálculo de los resultados
ng/mL de prolactina ha dado un valor medio (±DE) de
Interpolar del gráfico los valores de absorbancia
102.52% ± 9.75%.
relativos a cada muestra y leer la concentración
La prueba de dilución conducta en tres muestras
correspondiente en ng/mL.
diluidas 2 - 4 - 8 - 16 veces dio una media (± DE) de
102.19% ± 9.80%.
9. VALORES DE REFERENCIA
Cada laboratorio debe establecer su propio rango
10.4. Especificidad
basándose en la población de los pacientes.
El anticuerpo empleado presenta las siguientes
Los valores séricos de prolactina se incluyen en los
reacciones cruzadas, calculadas al 50% según
siguientes intervalos:
Abraham:

Muestras Rango ng/mL h. prolactina 100%

Hombres 1,8 - 17,0 LH N.D.
ciclo menstrual 1,2 - 19,5 FSH N.D.
Mujeres: hCG N.D.
Menopausia 1,5 - 18,5 TSH N.D.
hGH N.D.
Algunas muestras femeninas comprobadas en este
grupo probablemente usan anticonceptivos orales
que pueden haber influido en los resultados.
 10.5. Correlación
El kit Prolactin ELISA ([Link]) se ha comparado
con un kit disponible en el mercado. Se han
comprobado 37 muestras de suero.
La curva de regresión es:
[Link]=1.01*(ensayo comercial) + 1.94
r2 = 0,957

El kit Prolactin ELISA [Link] (Y) se ha comparado

con el kit Prolactin ELISA [Link] del método
anterior (X). Se probaron 37 muestras de suero.
La curva de regresión es la siguiente:
Y = 0,85*X + 2.58
r2 = 0,937

10.6. Efecto "Hook"

Este método no afecta “Hook” se observó hasta 200
mIU/mL.

11. DISPOSICIONES PARA LA ELIMINACIÓN

Los reactivos deben eliminarse de acuerdo con las
leyes locales.

BIBLIOGRAFÍA
 Wisdom, G.B. Clin. Chem. 22/8 1243 - 1255
(1976)
 Shome, B. and Parlow, A.F.,
J. Clin. Endocr. Metab.,39, 199 – 205 (1974).
 Uotila, M. Ruoslahti, E. Engvall, E.,
J. Immunol. Methds, 42, 11-15 (1981)
 Acosta, A.A.M.D. and Wright, G.L.,
Journal of Clinical Immunoassays, 6, 41 (1983).
 Cohen, K. L., Metabolism, 26 1165-1177 (1977)

Ed. 09/2018 DCM011-12

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FR Dispositif medical de diagnostic in vitro FR Fabriqué par
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IT Dispositivo medico-diagnostico in vitro IT Produttore
PT Dispositivos medicos de diagnostico in vitro PT Produzido por

DE Achtung, Begleitdokumente
ES Precaución, consulte los documentos adjuntos
DE Herstellungs datum
FR Attention, veuillez consulter les documents
ES Fecha de fabricacion
d'accompagnement
FR Date de fabrication
GB Caution, consult accompanying documents
yyyy-mm GB Date of manufacture
IT Attenzione, consultare la documentazione
IT Data di produzione
allegata
PT Data de produção
PT Atenção,consultar os documentos de
acompanhamento

DE Verwendbar bis DE Biogefährdung

ES Establa hasta (usar antes de último día del mes) ES Riesco biológico
FR Utiliser avant (dernier jour du mois indiqué) FR Risque biologique
GB Use by (last day of the month) GB Biological risk
yyyy-mm-dd IT Utilizzare prima del (ultimo giorno del mese) IT Rischio biologico
PT Utilizar (antes ultimo dia do mês) PT Risco biológico

DE Gebrauchsanweisung beachten DE Chargenbezeichnung

ES Consultar las instrucciones ES Codigo de lote
FR Consulter le mode d’emploi FR Numero de lot
GB Consult instructions for use LOT GB Batch code
IT Consultare le istruzioni per l’uso IT Codice del lotto
PT Consultar instruções para uso PT Codigo do lote

DE Ausreichend für “n” Tests DE Inhalt

ES Contenido suficiente para ”n” tests ES Contenido del estuche
FR Contenu suffisant pour “n” tests FR Contenu du coffret
GB Contains sufficient for “n” tests CONT GB Contents of kit
Σ = xx IT Contenuto sufficiente per “n” saggi IT Contenuto del kit
PT Contém o suficiente para “n” testes PT Conteúdo do kit

Max DE Temperaturbereich DE Bestellnummer

ES Límitaciôn de temperatura ES Nûmero de catálogo
FR Limites de température de conservation FR Réferéncès du catalogue
GB Temperature limitation REF GB Catalogue number
Min IT Limiti di temperatura IT Numero di Catalogo
PT Temperaturas limites de conservação PT Número do catálogo

DE Vor direkter sonneneinstrahlung schützen

ES Mantener alejado de la luz solar
FR Tenir à l'écart de la lumière du soleil
GB Keep away from sunlight
IT Tenere lontano dalla luce solare
PT Mantenha longe da luz solar
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SUGGERIMENTI PER LA RISOLUZIONE DEI PROBLEMI/TROUBLESHOOTING

ERRORE CAUSE POSSIBILI/ SUGGERIMENTI

Nessuna reazione colorimetrica del saggio
- mancata dispensazione del coniugato
- contaminazione del coniugato e/o del Substrato
- errori nell’esecuzione del saggio (es. Dispensazione accidentale dei reagenti in sequenza errata o provenienti da
flaconi sbagliati, etc.)
Reazione troppo blanda (OD troppo basse)
- coniugato non idoneo (es. non proveniente dal kit originale)
- tempo di incubazione troppo breve, temperatura di incubazione troppa bassa
Reazione troppo intensa (OD troppo alte)
- coniugato non idoneo (es. non proveniente dal kit originale)
- tempo di incubazione troppo lungo, temperatura di incubazione troppa alta
- qualità scadente dell’acqua usata per la soluzione di lavaggio (basso grado di deionizzazione,)
- lavaggi insufficienti (coniugato non completamente rimosso)
Valori inspiegabilmente fuori scala
- contaminazione di pipette, puntali o contenitori- lavaggi insufficienti (coniugato non completamente rimosso)
CV% intrasaggio elevato
- reagenti e/o strip non portate a temperatura ambiente prima dell’uso
- il lavatore per micropiastre non lava correttamente (suggerimento: pulire la testa del lavatore)
CV% intersaggio elevato
- condizioni di incubazione non costanti (tempo o temperatura)
- controlli e campioni non dispensati allo stesso tempo (con gli stessi intervalli) (controllare la sequenza di
dispensazione)
- variabilità intrinseca degli operatori

ERROR POSSIBLE CAUSES / SUGGESTIONS

No colorimetric reaction
- no conjugate pipetted reaction after addition
- contamination of conjugates and/or of substrate
- errors in performing the assay procedure (e.g. accidental pipetting of reagents in a wrong sequence or from the
wrong vial, etc.)
Too low reaction (too low ODs)
- incorrect conjugate (e.g. not from original kit)
- incubation time too short, incubation temperature too low
Too high reaction (too high ODs)
- incorrect conjugate (e.g. not from original kit)
- incubation time too long, incubation temperature too high
- water quality for wash buffer insufficient (low grade of deionization)
- insufficient washing (conjugates not properly removed)
Unexplainable outliers
- contamination of pipettes, tips or containers
insufficient washing (conjugates not properly removed) too high within-run
- reagents and/or strips not pre-warmed to CV% Room Temperature prior to use
- plate washer is not washing correctly (suggestion: clean washer head)
too high between-run - incubation conditions not constant (time, CV % temperature)
- controls and samples not dispensed at the same time (with the same intervals) (check pipetting order)
- person-related variation
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ERROR / POSIBLES CAUSAS / SUGERENCIAS

No se produce ninguna reacción colorimétrica del ensayo
- no se ha dispensado el conjugado
- contaminación del conjugado y/o del substrato
- errores en la ejecución del ensayo (p. ej., dispensación accidental de los reactivos en orden incorrecto o
procedentes de frascos equivocados, etc.)
Reacción escasa (DO demasiado bajas)
- conjugado no idóneo (p. ej., no procedente del kit original)
- tiempo de incubación demasiado corto, temperatura de incubación demasiado baja
Reacción demasiado intensa (DO demasiado altas)
- conjugado no idóneo (p. ej., no procedente del kit original)
- tiempo de incubación demasiado largo, temperatura de incubación demasiado alta
- calidad escasa del agua usada para la solución de lavado (bajo grado de desionización)
- lavados insuficientes (el conjugado no se ha retirado completamente)
Valores inexplicablemente fuera de escala
- contaminación de pipetas, puntas o contenedores- lavados insuficientes (el conjugado no se ha retirado
completamente)
CV% intraensayo elevado
- los reactivos y/o tiras no se encontraban a temperatura ambiente antes del uso
- el lavador de microplacas no funciona correctamente (sugerencia: limpiar el cabezal del lavador)
CV% interensayo elevado
- condiciones de incubación no constantes (tiempo o temperatura)
- controles y muestras no dispensados al mismo tiempo (con los mismos intervalos) (controlar la secuencia de
dispensación)
- variación en función de los operadores

ERREUR CAUSES POSSIBLES / SUGGESTIONS

Aucune réaction colorimétrique de l'essai
- non distribution du conjugué
- contamination du conjugué et/ou du substrat
- erreurs dans l'exécution du dosage (par ex., distribution accidentelle des réactifs dans le mauvais ordre ou en
provenance des mauvais flacons, etc.)
Réaction trop faible (DO trop basse)
- conjugué non approprié (par ex., ne provenant pas du coffret original)
- temps d'incubation trop court, température d'incubation trop basse
Réaction trop intense (DO trop élevée)
- conjugué non approprié (par ex., ne provenant pas du coffret original)
- temps d'incubation trop long, température d'incubation trop élevée
- mauvaise qualité de l'eau utilisée pour la solution de lavage (bas degré de déionisation)
- lavages insuffisants (conjugué non entièrement éliminé)
Valeurs inexplicablement hors plage
- contamination des pipettes, embouts ou récipients - lavages insuffisants (conjugué non entièrement éliminé)
CV% intra-essai élevé
- les réactifs et/ou les bandes n'ont pas atteint la température ambiante avant usage
- le laveur de microplaques ne lave pas correctement (suggestion : nettoyer la tête du laveur)
CV% inter-essai élevé
- conditions d'incubation non constantes (temps ou température)
- contrôles et échantillons non distribués en même temps (avec les mêmes intervalles) (contrôler l'ordre de
distribution)
- variabilité intrinsèque des opérateurs