The counterstain is DAPI antifade (ES: 0.

125g/ml DAPI (4,6-diamidino-2-

phenylindole)).

Warnings and Precautions

1. For in vitro diagnostic use. For professional use only.
2. Wear gloves when handling DNA probes and DAPI counterstain.
3. Probe mixtures contain formamide, which is a teratogen; do not breathe
fumes or allow skin contact. Wear gloves, a lab coat, and handle in a fume
hood. Upon disposal, flush with a large volume of water.
4. DAPI is a potential carcinogen. Handle with care; wear gloves and a lab
coat. Upon disposal, flush with a large volume of water.
5. All hazardous materials should be disposed of according to your
institutions guidelines for hazardous waste disposal.

Storage and Handling

The Aquarius kit should be stored at -20C until the expiry date indicated on
Instructions For Use the kit label. The probe and counterstain vials must be stored in the dark.
REF: LPH 025-S / LPH 025 / LPH 025-20 Equipment Necessary but not Supplied
1. Hotplate (with a solid plate and accurate temperature control up to 80C).
2. Variable volume micropipettes and tips range 1l - 200l.
Del (7q) Deletion Probe 3. Water bath with accurate temperature control at 72C.
4. Microcentrifuge tubes (0.5ml).
5. Fluorescence microscope (Please see Fluorescence Microscope
Recommendation section).
6. Plastic or glass coplin jars.
7. Forceps.
8. Fluorescence grade microscope lens immersion oil.
PROFESSIONAL USE ONLY 9. Bench top centrifuge.
10. Microscope slides.
ENGLISH/FRANAIS/ITALIANO/DEUTSCH/ESPAOL 11. 24x24mm coverslips.
12. Timer.
Further information available at [Link] 13. 37C incubator.
14. Rubber solution glue.
Fluorescence In Situ Hybridisation (FISH) is a technique that allows DNA
sequences to be detected on metaphase chromosomes or in interphase nuclei Fluorescence Microscope Recommendation
from fixed cytogenetic samples. The technique uses DNA probes that hybridise For optimal visualisation of the probe we recommend a 100-watt mercury lamp
to entire chromosomes or single unique sequences, and serves as a powerful and plan apochromat objectives x63 or x100. The Triple bandpass filter
adjunct to classic cytogenetics. Recent developments have meant that this DAPI/FITC/Texas Red is optimal for viewing all fluorophores and DAPI
valuable technique can now be applied as an essential diagnostic tool in simultaneously.
prenatal, haematological and pathological chromosomal analysis. Target DNA,
after fixation and denaturation, is available for annealing to a similarly Sample Preparation
denatured, fluorescently labelled DNA probe, which has a complementary The kit is designed for use on cultured peripheral blood cells or cultured bone
sequence. Following hybridisation, unbound and non-specifically bound DNA marrow cells fixed in Carnoys fixative, that should be prepared according to the
probe is removed and the DNA is counterstained for visualisation. laboratory or institution guidelines. Prepare air dried samples on microscope
Fluorescence microscopy then allows the visualisation of the hybridised probe slides according to standard cytogenetic procedures.
on the target material.
FISH Protocol
Probe Information (Note: Please ensure that exposure of the probe to laboratory lights is limited at
Abnormalities of chromosome 7 are very common in myeloid malignancies, all times).
such as adult and paediatric MDS and treatment related AML/MDS. In children,
1,2,3,4 Slide preparation
it is often associated with juvenile Chronic Myeloid Leukaemia (jCML) .
1. Spot the cell sample onto a glass microscope slide. Allow to dry.
There is also a predominance in leukaemias associated with a constitutional
2. Immerse the slide in 2xSSC for 2 minutes at room temperature (RT)
predisposition, caused by disorders including neurofibromatosis 1 (NF1),
without agitation.
Fanconi Anaemia and possibly Down syndrome, which produces a distinct
3. Dehydrate in an ethanol series (70%, 85% and 100%), each for 2 minutes
clinical picture known as Monosomy 7 syndrome. Another rearrangement, -
at RT.
5/del(5q), is found as an additional abnormality in 40-60% of secondary MDS
4 4. Allow to dry.
cases. +8 is less frequently seen . Studies of myeloid disorders involving -
7/del(7q) have found that signalling pathways involving RAS proteins are Pre-Denaturation
affected. There are two commonly deleted regions (CDR): one at 7q22, the 5. Remove the probe from the freezer and allow it to warm to RT.
2,3,5,6,7
other at 7q31-34 . RELN (7q22) encodes a large secreted protein related 6. Ensure that the probe solution is uniformly mixed with a pipette.
to extracellular matrix proteins, a family of proteins that contains multiple 7. Remove 10l of probe per test, and transfer it to a microcentrifuge tube.
epidermal growth factor (EGF)-like proteins. Quickly return the remaining probe to -20C.
8. Place the probe and the sample slide to prewarm on a 37C (+/- 1C)
Probe Specification hotplate for 5 minutes.
7q22.1-q22.2, Red 9. Spot 10l of probe mixture onto the cell sample and carefully apply a
7q31.2, Green coverslip. Seal with rubber solution glue and allow the glue to dry
completely.

Denaturation
10. Denature the sample and probe simultaneously by heating the slide on a
hotplate at 75C (+/- 1C) for 2 minutes.
7q22.1-q22.2 7q31.2
Hybridisation
11. Place the slide in a humid, lightproof container at 37C (+/- 1C) overnight.
TES
RELN ORC5 Post-Hybridisation Washes
12. Remove the coverslip and all traces of glue carefully.
D7S796 D7S658 D7S2543 D7S2886 13. Immerse the slide in 0.4xSSC (pH 7.0) at 72C (+/- 1C) for 2 minutes
D7S486 without agitation.
203Kb 14. Drain the slide and immerse it in 2xSSC, 0.05% Tween-20 at RT (pH 7.0)
396kb 203kb for 30 seconds without agitation.
100kb
15. Drain the slide and apply 10l of DAPI antifade onto each sample.
16. Cover with a coverslip, remove any bubbles and allow the colour to
develop in the dark for 10 minutes.
17. View with a fluorescence microscope.
The 7q22 probe, labelled in red, covers a 396kb region including the telomeric
end of the RELN gene and extending beyond the marker D7S658. The 7q31 Stability of Finished Slides
probe, labelled in green, covers a 203kb region including the TES gene. FISHed slides remain analysable for up to 1 month if stored in the dark at/or
below RT.
Materials Provided
Probe: 50l per vial (5 tests), 100l per vial (10 tests) or 200l per vial (20 Procedural Recommendations
tests) 1. Baking or ageing of slides is not recommended as it may reduce signal
Amount of red 7q22 probe: 16-20ng/test fluorescence.
Amount of green 7q31 probe: 72-90ng/test 2. Hybridisation conditions may be adversely affected by the use of reagents
The probes are provided premixed in hybridisation solution (Formamide; other than those provided or recommended by Cytocell Ltd.
Dextran Sulphate; SSC) and are ready to use. 3. The use of a calibrated thermometer is strongly recommended for
measuring temperatures of solutions, waterbaths, and incubators as these
Counterstain: 150l per vial (15 tests) or 500l per vial (50 tests) temperatures are critical for optimum product performance.
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4. The wash concentrations, pH and temperatures are important as low
stringency can result in non-specific binding of the probe and too high Prparation des chantillons
Le kit a t dvelopp pour utilisation sur les cellules du sang priphrique ou de moelle
stringency can result in a lack of signal.
osseuse cultives et fixes avec du fixateur Carnoy et doivent tre prpares selon les
5. Incomplete denaturation can result in lack of signal and over denaturation protocoles en vigueur dans le laboratoire ou institution.
can also result in non-specific binding. Prparer les lames de microscope avec les chantillons schs l'air selon les procdures
standard de cytogntique.
Expected Results
In a normal cell there should be two red and two green signals (2R, 2G). Protocole FISH
Deleted cells may show one of the following signal patterns: (Remarque : Veuillez toujours vous assurer de limiter lexposition de la sonde lclairage
du laboratoire)
1. If a deletion encompasses the proximal CDR only and is hemizygous one
red and two green signals should be observed (1R, 2G). Prparation de la lame chantillon
2. If a deletion encompasses the proximal CDR only and is homozygous no 1. Dposer lchantillon cellulaire sur une lame propre. Laisser scher.
red and two green signals should be observed (0R, 2G). 2. Plonger la lame dans du 2xSSC pendant 2 minutes temprature ambiante sans
3. If a deletion encompasses the distal CDR only and is hemizygous two red agitation.
and one green signals should be observed (2R, 1G) 3. Dshydrater dans une srie de bains thanol (70%, 85% et 100%), 2 minutes dans
chaque bain temprature ambiante.
4. If a deletion encompasses the distal CDR only and is homozygous two red
4. Laisser scher.
and no green signals should be observed (2R, 0G)
5. One red and one green signal pattern (1R, 1G) can be observed in case of Pr-dnaturation
monosomy 7 or hemizygous deletion of both CDRs on 7q. 5. Retirer la sonde du conglateur -20C et la laisser prchauffer temprature
ambiante.
Limitations 6. Bien homogniser la sonde en pipetant plusieurs fois.
7. Prlever 10l de sonde par test et placer dans un tube microcentrifugation. Remettre
Reporting and interpretation of FISH results should be consistent with
le tube avec le restant de sonde -20C.
professional standards of practice and should take into consideration other 8. Mettre la sonde et la lame chantillon prchauffer sur une plaque chauffante 37C
clinical and diagnostic information. This kit is intended as an adjunct to other (+/1C) pendant 5 minutes.
diagnostic laboratory tests and therapeutic action should not be initiated on the 9. Dposer 10l de sonde sur lchantillon et couvrir avec une lamelle. Sceller avec du
basis of the FISH result alone. rubber cment et laisser scher.

Dnaturation
Additional Information
10. Dnaturer simultanment la sonde et lchantillon en plaant la lame sur une plaque
For additional product information please contact the Cytocell Technical chauffante 75C (+/- 1C) pendant 2 minutes.
Support Department.
T: +44 (0)1223 294048 Hybridation
E: techsupport@[Link] 11. Incuber la lame pendant une nuit 37C (+/1C) labri de la lumire et dans une
W: [Link] chambre humide.

Lavages post-hybridation
FRANAIS 12. Retirer la lamelle et liminer toutes traces de rubber cment.
13. Laver la lame dans du tampon 0.4xSSC (pH 7.0) 72C (+/- 1C) pendant 2 minutes.
Lhybridation in situ par fluorescence (FISH) est une technique qui permet de dtecter des 14. Egoutter la lame et laver dans du tampon 2xSSC, 0.05% Tween-20 (pH 7.0)
squences ADN sur les chromosomes en mtaphase ou sur les noyaux interphasiques temprature ambiante pendant 30 seconde sans agitation.
dchantillons cytogntiques fixs cultivs ou non cultivs. La technique utilise des sondes 15. Scher la lame et appliquer 10l de DAPI antifading sur chaque chantillon.
ADN qui shybrident aux chromosomes entiers ou des squences spcifiques, et sert de 16. Recouvrir dune lamelle, enlever les bulles et laisser la coloration apparatre labri de
test complmentaire la cytogntique classique. De rcents dveloppements ont dmontr la lumire pendant 10 minutes.
que cette technique informative peut maintenant tre utilise comme un outil diagnostic 17. Visualiser avec un microscope fluorescence.
essentiel lors de lanalyse des chromosomes en prnatal, hmatologie et pathologie. LADN
cible, aprs fixation, est trait par la chaleur et la formamide pour dnaturer la double Stabilit des lames
hlice, la rendant simple hlice. LADN cible est alors disponible pour hybridation avec une Les lames FISH sont analysables pendant un mois si elles sont conserves lobscurit et
sonde ADN complmentaire simple brin, dnature de la mme manire et marque avec /ou au-dessous de la temprature ambiante.
un fluorochrome. Aprs lhybridation, lADN non hybrid et lADN non li spcifiquement sont
limins par une srie de lavages stringents et lADN est ensuite contre-color. Un Recommandations
microscope fluorescence permet ensuite la visualisation de la sonde hybride sur lADN 1. Cuire ou vieillir les lames n'est pas recommand, ceci pouvant rduire l'intensit du
cible. signal.
2. Les conditions dhybridation peuvent tre affecte par lutilisation de ractifs autres que
Caractristiques de la sonde ceux fournis ou recommands par Cytocell Ltd.
Sonde de la rgion 7q22.1-q22.2 en rouge 3. Lutilisation dun thermomtre calibr est fortement recommand pour mesurer les
Sonde de la rgion 7q31.2 en vert tempratures des solutions, bains-marie et incubateurs. Ces tempratures sont
essentielles pour une efficacit optimale du produit.
La sonde 7q22, marque en rouge, couvre une rgion de 396kb, y compris l'extrmit 4. Les concentrations des lavages (stringence), pH et temprature sont importants. Une
tlomrique du gne RELN, et s'tend au-del du marqueur D7S658. La sonde 7q31, faible stringence peut rsulter en une liaison non-spcifique de la sonde et une trop
marque en vert, couvre une rgion de 203kb, y compris le gne TES. forte stringence peut rsulter en une perte de signal.
5. Une dnaturation incomplte peut engendrer une perte de signal et une trop forte
Conditionnement dnaturation une hybridation non-spcifique.
Sonde : 50l par tube (5 tests), 100l par tube (10 tests) ou 200l par tube (20 tests)
Concentration de sonde 7q22, rouge: 16-20ng/test Rsultats attendus
Concentration de sonde 7q31, vert: 72-90ng/test. Dans une cellule normale, deux signaux rouges et deux signaux verts (2R, 2V) doivent tre
La sonde est fournie prte--lemploi dans le tampon dhybridation (formamide, sulphate de observs. Les cellules dltes peuvent afficher l'un des motifs de signaux suivants :
dextran, SSC. 1. Si une dltion inclut le CDR proximal uniquement et est hmizygote, un signal rouge
Contre-colorant: 150l par tube (15 tests) ou 500l par tube (50 tests) et deux signaux verts doivent tre observs (1R, 2V).
Le contre-colorant est le DAPI antifading (ES: 0.125g/ml DAPI (4,6-diamidino-2- 2. Si une dltion inclut le CDR proximal uniquement et est homozygote, aucun signal
phenylindole)). rouge et deux signaux verts devraient tre observs (0R, 2V).
3. Si une dltion inclut le CDR distal uniquement et est hmizygote, deux signaux rouges
Avertissements et prcautions et un signal vert doivent tre observs (2R, 1V).
1. Pour utilisation en diagnostic in vitro. Pour usage professionnel uniquement. 4. Si une dltion inclut le CDR distal uniquement et est homozygote, deux signaux
2. Porter des gants lors de la manipulation des sondes ADN et du contre-colorant DAPI. rouges doivent tre observs, sans aucun signal vert (2R, 1V).
3. La sonde contient de la formamide qui est un tratogne. Ne pas respirer les vapeurs. 5. Un motif constitu dun signal rouge et dun signal vert (1R, 1V) peut tre observ en
Ne pas mettre en contact avec la peau. Porter des gants, une blouse de laboratoire et cas de monosomie du chromosome 7 ou dune dltion hmizygote des deux CDR sur
manipuler sous une hotte. Aprs limination, rincer abondamment avec de leau. 7q.
4. Le DAPI est un carcinogne potentiel. Manipuler avec prcaution. Porter des gants et
une blouse de laboratoire. Aprs limination, rincer abondamment avec de leau. Limitations
5. Toutes matires dangereuses doivent tre limines selon les rglementations en La diffusion et linterprtation du test FISH doivent tre effectus conformment aux normes
vigueur dans votre institution pour llimination des dchets dangereux. professionnelles mises en pratique et tout en prenant en considration les autres
informations cliniques et diagnostiques disponibles. Ce kit est dvelopp comme un test
Conservation et manipulation complmentaire la cytogntique classique, pour cette raison des actions thrapeutiques
Le kit Aquarius doit tre conserv -20C jusqu la date dexpiration indique sur le kit. La ne doivent pas tre lances sur la seule base des rsultats du test FISH.
sonde et le contre-colorant doivent tre conservs labri de la lumire.
Informations supplmentaires
Equipement ncessaire non fourni Pour plus dinformations sur le produit, veuillez contacter lAssistance technique Cytocell.
1. Plaque chauffante (avec bloc et contrle de la temprature jusqu 80C). T: +44 (0)1223 294048
2. Micropipettes 1l - 200l. E: techsupport@[Link]
3. Bain-marie avec contrle de la temprature 72C. W: [Link]
4. Tubes microcentrifugation (0.5ml).
5. Microscope fluorescence (Voir la section Microscope et filtres). ITALIANO
6. Jarres en plastique ou en verre.
7. Forceps. L'ibridazione in situ in fluorescenza (Fluorescence In Situ Hybridisation - FISH) una tecnica
8. Huile immersion pour microscope fluorescence. che permette di rilevare sequenze di DNA su cromosomi in metafase o in nuclei in interfase
9. Centrifugeuse de paillasse. di campioni citogenetici fissati, o in coltura dopo prelievo. La tecnica prevede l'utilizzo di
10. Lames de microscope. sonde di DNA in grado di ibridare con l'intero cromosoma o con singole sequenze. La FISH
11. Lamelles 24x24mm. costituisce quindi un potente strumento in aggiunta alle tecniche citogenetiche classiche.
12. Chronomtre. Recenti sviluppi hanno reso possibile che questa preziosa tecnica pu ora essere applicata
13. Incubateur 37C. come strumento diagnostico essenziale nellanalisi cromosomica prenatale, ematologia e
14. Colle Rubber cement. patologica. Il DNA bersaglio, dopo la fissazione, sottoposto a denaturazione al calore in
presenza di formamide. Il DNA bersaglio cos disponibile per lannealing con una sonda di
Microscope et filtres DNA a singola elica a sequenza complemetare, marcata con una sostanza fluorescente.
Pour une visualisation optimale de la sonde, nous recommandons lutilisation dune lampe Terminata libridazione, la sonda di DNA non legata o legata in modo non specifico,
mercure de 100-watts et dobjectifs plan apochromatiques x63 or x100. Le filtre triple bande rimossa per mezzo di lavaggi stringenti ed il DNA in seguito colorato con un colorante di
DAPI/FITC/Texas Red est optimal pour la visualisation des 3 fluorochromes simultanment. contrasto. Libridazione della sonda viene infine analizzata con un microscopio a
fluorescenza.

Specifiche della sonda

Regione 7q22.1-q22.2 rosso
Regione 7q31.2 verde
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 queste temperature sono di fondamentale importanza per la performance ottimale del
La sonda 7q22, marcata in rosso, copre una regione di 396kb che include l'estremit prodotto.
telomerica del gene RELN e si estende oltre il marcatore D7S658. La sonda 7q31, marcata 4. Le concentrazioni del lavaggio (stringenza), il pH e la temperatura sono di
in verde, copre una regione di 203kb che include il gene TES. fondamentale importanza in quanto condizioni di stringenza blande possono favorire un
legame non specifico della sonda e condizioni di stringenza troppo elevate possono
Materiali forniti condurre alla perdita del segnale.
Sonda: 50l per provetta (5 test), 100l per provetta (10 test) o 200l per provetta (20 test) 5. La denaturazione incompleta pu tradursi in una perdita del segnale mentre una
Quantit di 7q22 rosso probe: 16-20ng/test denaturazione eccessiva pu anche tradursi in un legame non specifico.
Quantit di 7q31 verde probe: 72-90ng/test
La sonda fornita gi miscelata e pronta per l'uso nella soluzione di ibridazione (Formamide; Risultati attesi
Destrano solfato; SSC). In una cellula normale ci dovrebbero essere due segnali rossi e due verdi (2R, 2G). Le
Colorante di contrasto: 150l per provetta (15 test) o 500l per provetta (50 test) cellule delete possono presentare uno dei seguenti pattern di segnale:
Il colorante di contrasto il DAPI antifade (ES: 0,125g/ml DAPI (4,6-diamidino-2- 1. Se una delezione include solo il CDR prossimale ed emizigotica, si dovrebbero
fenilindole)). vedere un segnale rosso e due verdi (1R, 2G).
2. Se una delezione include solo il CDR prossimale ed omozigotica, si dovrebbero
Avvertenze e misure precauzionali vedere zero segnali rossi e due verdi (0R, 2G)
1. Per uso diagnostico in vitro. Per uso professionale. 3. Se una delezione include solo il CDR distale ed emizigotica, si dovrebbero vedere
2. Quando si manipolano le sonde ed il colorante di contrasto DAPI necessario due segnali rossi e uno verde (2R, 1G)
indossare i guanti. 4. Se una delezione include solo il CDR distale ed omozigotica, si dovrebbero vedere
3. Le miscele di sonda contengono formamide, una sostanza teratogena. Non due segnali rossi e zero verdi (2R, 0G)
respirare i fumi ed evitare il contatto con la pelle. Indossare guanti, camice da 5. In caso di monosomia 7 o delezione emizigotica di entrambi i CDR su 7q, si possono
laboratorio e maneggiare in una cappa aspirante. Per lo smaltimento, lavare con osservare un segnale rosso e uno verde (1R, 1G).
grandi quantit di acqua.
4. Il DAPI un potenziale cancerogeno. Maneggiare con cura, indossare guanti ed Limitazioni
un camice da laboratorio. Per lo smaltimento, lavare con grandi quantit di acqua. La refertazione e linterpretazione dei risultati della FISH devono essere coerenti con gli
5. Eseguire lo smaltimento dei materiali pericolosi nel rispetto delle normative standard professionali della pratica medica e dovrebbe prendere in considerazione altre
interne dell'istituzione relative allo smaltimento dei residui tossici. informazioni cliniche e diagnostiche. Questo kit concepito in aggiunta alla tecniche
citogenetica classica e azione terapeutica non deve essere messa in atto esclusivamente
Conservazione e utilizzo sulla base del risultato di FISH.
Conservare il kit Aquarius a -20C fino alla data di scadenza riportata sull'etichetta. I Informazioni aggiuntive
flaconcini della sonda e del colorante di contrasto devono essere conservati al buio. Per informazioni aggiuntive sul prodotto contattare il Dipartimento di Assistenza Tecnica
Cytocell.
Apparecchiature necessari non forniti T: +44 (0)1223 294048
1. Piastra riscaldante (con - un controllo accurato della temperatura fino ad 80C). E: techsupport@[Link]
2. Micropipette a volume variabile compreso tra 1l - 200l. W: [Link]
3. Bagno termostatato con controllo accurato della temperatura a 72C.
4. Provette da microcentrifuga (0,5 ml). DEUTSCH
5. Microscopio a fluorescenza (riferirsi alla sezione Configurazione ottimale del
microscopio e dei filtri). Die Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (FISH) ist eine Technik, mit der DNA-Sequenzen auf
6. Contenitori di Coplin in plastica o vetro. Metaphase-Chromosomen oder Interphase-Kernen in fixierten zytogenetischen Proben
7. Pinzette. nachgewiesen werden knnen. Dabei werden DNA-Sonden verwendet, die an ganze
8. Olio per lenti ad immersione del microscopio a fluorescenza. Chromosomen oder einzelne, einmalige Sequenzen hybridisieren. Krzliche Entwicklungen
9. Centrifuga da banco. haben gezeigt, dass diese ntzliche Technik nun auch als essentielles diagnostisches
10. Vetrini da microscopia. Werkzeug fr prnatale, hmatologische und pathologische Chromosomenanalysen
11. 24x24 mm vetrini coprioggetto. eingesetzt werden kann. Nachdem die zu untersuchende DNA fixiert und denaturiert wurde,
12. Timer. kann die Fluoreszenz markierte, einzelstrngige Sonde daran binden. Nach der
13. Incubatore a 37C. Hybridisierung werden nicht gebundene sowie unspezifisch gebundene DNA-Sonden durch
14. Colla per vetrini. eine Reihe von Waschvorgngen entfernt und die DNA zur Visualisierung gegengefrbt.
Unter dem Fluoreszenzmikroskop wird dann die hybridisierte Sonde am Zielmaterial
Configurazione ottimale del microscopio e dei filtri erkennbar.
Per una visualizzazione ottimale della sonda si raccomanda di utilizzare una lampada a
mercurio da 100-watt ed obiettivi plan apochromat 63x e 100x. Il filtro triplo Sondenspezifikation
DAPI/FITC/Texas Red ottimale per visualizzare tutti e tre i fluorofori contemporaneamente. 7q22.1-q22.2 Region, rot
7q31.2 Region, grn
Preparazione del campione
Il kit stato progettato per l'utilizzo con cellule del sangue periferico coltivate o cellule di Die 7q22-Sonde, rot markiert, deckt eine 396kb-Region, einschlielich des Telomerendes
midollo osseo coltivate, fissate nel fissativo di Carnoy e preparate secondo le linee guida del des RELN-Gens, ab und erstreckt sich ber den Marker D7S658 hinaus. Die 7q31-Sonde,
laboratorio o dell'istituzione. grn markiert, deckt eine 203kb-Region einschlielich der TES-Gens ab.
Stendere i campioni da analizzare su vetrini da microscopia secondo le procedure
citogenetiche standard. Kitkomponenten
Sonde: 50l pro Rhrchen (5 tests),100l pro Rhrchen (10 tests) oder 200l pro Rhrchen
Protocollo (20 tests)
(Nota: Limitare l'esposizione della sonda alle luci del laboratorio durante l'intera procedura) Menge an 7q22 rot: 16-20ng/Test
Menge an 7q31 grn: 72-90ng/Test
Preparazione del vetrino Die Sonden wird vorgemischt und gebrauchsfertig in Hybridisierungslsung geliefert
1. Caricare il campione cellulare su un vetrino da microscopia. Lasciare asciugare i (Formamid, Dextransulfat, SSC).
vetrino. Gegenfrbung: 150l pro Rhrchen (15 Tests) oder 500l pro Rhrchen (50 Tests)
2. Immergere i vetrini in 2xSSC per 2 minuti a temperatura ambiente (TA) senza Die Gegenfrbung besteht aus DAPI antifade (ES: 0.125g/ml DAPI (4,6-Diamidino-2-
agitazione. Phenylindol)).
3. Disidratare in una serie di diluizioni di etanolo (70%, 85% e 100%), ognuna per 2 minuti
a TA. Warnungen und Vorsichtsmanahmen
4. Lasciare asciugare il vetrino. 1. Zur Verwendung in der in vitro Diagnostik. Durchfhrung ausschlielich durch
qualifiziertes Laborpersonal.
Pre-denaturazione 2. Beim Umgang mit DNA-Sonden und der DAPI-Gegenfrbung Handschuhe tragen.
5. Rimuovere la sonda dal congelatore a -20C e lasciarla riscaldare a TA. 3. Sondenmischungen enthalten Formamid, das teratogen ist. Keine Dmpfe einatmen
6. Accertarsi che la soluzione della sonda sia uniforme pipettando ripetutamente con und nicht mit der Haut in Berhrung bringen. Handschuhe und Labormantel tragen und
delicatezza. unter einer Abzugshaube arbeiten. Bei der Entsorgung mit viel Wasser nachsplen.
7. Pipettare 10l di sonda per test ed inserirli in una provetta da microcentrifuga. Riporre 4. DAPI ist ein potentielles Karzinogen. Vorsichtig damit umgehen, Handschuhe und
la sonda non utilizzata a -20C. Labormantel tragen. Bei der Entsorgung mit viel Wasser nachsplen.
8. Pre-riscaldare la sonda, il vetrino ed il coprioggetto su una piastra riscaldante a 37C 5. Alle Gefahrstoffe sollten gem den Ihren hausinternen Richtlinien zur
(+/- 1C) per 5 minuti. Gefahrstoffentsorgung entsorgt werden.
9. Caricare 10l di miscela della sonda sul campione cellulare e coprire delicatamente
con il coprioggetto. Sigillare con soluzione collante gommosa e far asciugare Lagerung und Behandlung
completamente.
Das Aquarius-Kit sollte bis zum Ablaufdatum, das auf dem Kit-Etikett angegeben ist, bei
20C gelagert werden. Die Rhrchen mit den Sonden und der Gegenfrbung mssen im
Denaturazione
Dunkeln aufbewahrt werden.
10. Denaturare simultaneamente il campione e la sonda riscaldando il vetrino su una
piastra riscaldante a 75C (+/- 1C) per 2 minuti.
Bentigte, aber nicht mitgelieferte Laborgerte
1. Heizplatte (mit stabiler Heizplatte und genauer Temperaturregelung bis 80C).
Ibridazione
2. Mikropipetten mit variablem Volumen von 1l - 200l.
11. Disporre il vetrino in una camera umida, non permeabile alla luce, a 37C (+/- 1C) per
3. Wasserbad mit genauer Temperaturkontrolle bei 72C.
tutta la notte.
4. Mikro-Zentrifugenrhrchen (0,5ml).
5. Fluoreszenzmikroskop (siehe auch Empfehlungen zum Fluoreszenzmikroskop).
Lavaggi post-ibridazione
6. Coplin-Frbetrog aus Kunststoff oder Glas.
12. Rimuovere accuratamente il vetrino coprioggetto e tutte le tracce di colla.
7. Pinzette.
13. Lavare il vetrino in 0.4xSSC (pH 7.0) a 72C (+/- 1C) per 2 minuti, senza agitazione.
8. Fr Fluoreszenzobjektive geeignetes Immersionsl.
14. Scolare il vetrino e lavare in 2xSSC, Tween-20 0,05% (pH 7.0) a TA per 30 secondi
9. Tischzentrifuge.
senza agitazione.
10. Objekttrger fr das Mikroskop.
15. Scolare i vetrini e applicare 10l di DAPI antifade su ciascun campione.
11. 24x24mm Deckglser.
16. Coprire con un vetrino coprioggetto, rimuovere eventuali bolle e attendere 10 minuti
12. Timer.
lasciando il vetrino al buio.
13. 37C Inkubator.
17. Analizzare con il microscopio a fluorescenza.
14. Gummilsung zum Versiegeln der Deckglasrnder.
Stabilit del vetrino finito
Empfehlungen zum Fluoreszenzmikroskop
I vetrini FISH restano analizzabili per circa 1 mese se conservati al buio a temperatura
Fr die optimale Visualisierung der Probe empfehlen wir die Verwendung plan-
ambiente o inferiore.
apochromatischer Objektive mit 63-facher oder 100-facher Vergrerung sowie einer 100-
Watt Quecksilberlampe. Das Dreifach-Bandpasssfilter DAPI/FITC/Texasrot ist fr die
Raccomandazioni per l'uso
simultane Beobachtung aller drei Fluorophore optimal geeignet.
1. Leccessivo riscaldamento o linvecchiamento dei vetrini non raccomandato in quanto
potrebbe ridurre la fluorescenza del segnale.
Probenvorbereitung
2. Le condizioni di ibridazione potrebbero essere influenzate negativamente dallimpiego
Der Kit ist fr Verwendung an kultivierten, peripheren Blutzellen und Knochenmarkszellen,
di reagenti differenti rispetto a quelli forniti o raccomandati da Cytocell Ltd.
die in Carnoys Fixativ fixiert sind, ausgelegt. Die Vorbereitung erfolgt entsprechend der
3. Lutilizzo di un termometro calibrato fortemente raccomandato per la misurazione
Laborrichtlinien.
delle temperature delle soluzioni, dei bagni termostati e degli incubatori in quanto

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Fertigen Sie die luftgetrockneten Proben auf Objekttrgern entsprechend der La sonda se proporciona mezclada previamente y lista para utilizar en la solucin de
zytogenetischen Standardvorschriften an. hibridacin (Formamida; sulfato de dextrano; SSC).

FISH-Protokoll Contraste: 150l por vial (15 reacciones) o 500l por vial (50 reacciones)
(Hinweis: Bitte versuchen Sie nach Mglichkeit, die Sonde vor Licht zu schtzen.) DAPI Antifade (ES: 0.125g/ml DAPI (4,6-diamidino-2-fenilindol)).

Vorbereitung des Objekttrgers Avisos y precauciones

1. Zellprobe auf Objekttrger auftropfen und trocknen lassen. 1. Para diagnstico in vitro. Slo para uso profesional.
2. Den Objekttrger in 2xSSC fr 2 Minuten bei RT eintauchen (schtteln nicht 2. Utilizar guantes al manipular las sondas de ADN y la contratincin DAPI.
notwendig). 3. La sonda contiene formamida, que es teratgena; no respire los vapores y evite el
3. Dehydration mittels Alkoholreihe (70%, 85% und 100%), jeweils fr 2 Minuten bei RT. contacto con la piel. Utilizar guantes, bata de laboratorio y manipular utilizando la
4. Trocknen lassen. campana de humos. Para eliminarla, aclarar con abundante agua.
4. La contratincin DAPI puede producir cncer. Manipular con cuidado; utilizar guantes y
Pr-denaturierung bata de laboratorio. Para eliminarla, aclarar con abundante agua.
5. Nehmen Sie die Sonde aus dem Gefrierschrank und lassen Sie diese sich auf 5. Las sustancias peligrosas deben eliminarse de acuerdo con las instrucciones de su
Zimmertemperatur aufwrmen. institucin en relacin con la eliminacin de sustancias peligrosas.
6. Mischen der Sondenlsung durch mehrmaliges Aufpipettieren.
7. Pro Test 10l Sonde entnehmen und in ein Mikrozentrifugenrhrchen geben. Almacenamiento y manejo
Bewahren Sie die restliche Sonde bei -20C auf. El kit Aquarius debe almacenarse a -20C hasta la fecha de caducidad que se indica en la
8. Sonde und Probenobjekttrger 5 Minuten auf einer Heizplatte bei 37C (+/- 1C) etiqueta del kit. Los viales de contraste y de sonda deben almacenarse en un lugar oscuro.
vorwrmen.
9. 10l Sondenmischung auf die Zellprobe auftropfen und Deckglas sorgfltig auflegen. Equipo necesarios pero no proporcionados
Mit Gummikleber-Lsung versiegeln und vollstndig trocknen lassen. 1. Placa caliente (con una placa slida y un control de temperatura preciso hasta 80C).
2. Micropipetas de volumen variable (rango 1l - 200l).
Denaturierung 3. Bao de agua con control preciso de temperatura a 72C.
10. Denaturieren sie Probe und Sonde gleichzeitig durch 2 mintiges Erwrmen des 4. Tubos de microcentrifugado (0.5ml).
Objekttrgers auf einer Heizplatte bei 75C (+/- 1C). 5. Microscopio de fluorescencia (lea la seccin Recomendaciones para el microscopio
de fluorescencia).
Hybridisierung 6. Recipientes de cristal y de plstico.
11. Den Objekttrger ber Nacht bei 37C (+/- 1C) in eine feuchte, lichtdichte Kammer 7. Pinzas.
geben. 8. Microscopio de fluorescencia con objetivo de inmersin en aceite.
9. Centrfuga de banco.
Waschen nach der Hybridisierung 10. Portaobjetos para microscopio.
12. Deckglschen und alle Kleberspuren vorsichtig entfernen. 11. Cubreobjetos de 24x24mm.
13. Objekttrger 2 Minuten in 0,4 x SSC (pH 7,0) bei 72C (+/- 1C) waschen. 12. Cronmetro.
14. Objekttrger abtropfen lassen und 30 Sekunden in 2 x SSC, 0,05% Tween-20 bei RT, 13. Incubador 37C.
(pH 7,0), waschen. 14. Pegamento.
15. Den Objekttrger abtropfen lassen und 10l des DAPI Antifade zu jeder Probe geben.
16. Mit einem Deckglas abdecken, die Luftblasen entfernen and 10 Minuten unter Recomendaciones para el microscopio de fluorescencia
Lichtschutz entwickeln lassen. Para una visualizacin ptima de la sonda, se recomienda utilizar una lmpara de mercurio
17. Unter dem Fluoreszenzmikroskop betrachten. de 100 vatios y objetivos x63 o x100 Plan-Apochromat. El filtro de triple banda
DAPI/FITC/Texas Red es ptimo para ver simultneamente los tres fluorocromos.
Stabilitt der fertigen Objekttrger
Objekttrger mit FISH-Proben knnen bis zu einem Monat lang analysiert werden, wenn sie Preparacin de la muestra
im Dunkeln bei oder unter Raumtemperatur gelagert werden. El kit est diseado para su uso en clulas sanguneas perifricas cultivadas y fijadas o en
clulas de mdula sea cultivadas y fijadas en fijador de Carnoy, y deben prepararse de
Empfehlungen zur Durchfhrung acuerdo con las instrucciones del laboratorio o la institucin.
1. Es wird empfohlen, die Auswertung prompt durchzufhren, da das Fluoreszenzsignal Prepare extensiones celulares sobre portaobjetos para microsopio de acuerdo con los
mit der Zeit abnimmt. Wrme kann ebenfalls zur Abnahme der Fluoreszent fhren. procedimientos generales utilizados en citogenetica.
2. Durch die Verwendung von anderen Reagenzien, als den von Cytocell Ltd.
empfohlenen, knnen die Hybridisierungsbedingungen negativ beeinflusst werden. Protocolo FISH
3. Es wird dringend empfohlen, zur Temperaturmessung von Lsungen, Wasserbdern (Observacin: asegrese de limitar la exposicin de la sonda a las luces del laboratorio en
und Inkubatoren ein geeichtes Thermometer zu verwenden, da diese Temperaturen fr todo momento)
die optimale Leistung des Produkts ausschlaggebend sind.
4. Die Konzentrationen der Waschlsungen (Stringenz), pH und Temperatur sind wichtig, Preparacin del portaobjetos
da niedrig stringente Bedingungen zu nicht-spezifischer Bindung der Sonde fhren 1. Extender la muestra en un portaobjetos. Dejarlo secar.
kann und zu hohe Stringenz zum Verlust des Signals. 2. Sumerja el portaobjetos en 2xSSC durante 2 minutos a temperatura ambiente sin
5. Unvollstndige Denaturierung kann zu einem Verlust des Signals fhren und agitacin.
bermige Denaturierung kann zu nicht-spezifischer Bindung der Sonde fhren. 3. Deshidrate en una serie de etanol (70%, 85% y 100%), 2 minutos en cada una a TA.
4. Dejarlo secar.
Zu erwartende Ergebnisse
In einer normalen Zelle sollten zwei rote und zwei grne Signale vorhanden sein (2R, 2G). Antes de la desnaturalizacin
Zellen mit Deletion zeigen eines der folgenden Signalmuster: 5. Saque la sonda del congelador a -20C y deje que se caliente a TA.
1. Wenn eine Deletion nur die proximale CDR umfasst und hemizygot ist, sollten ein rotes 6. Asegrese de que la solucin de la sonda es uniforme mezclando varias veces con la
und zwei grne Signale zu beobachten sein (1R, 2G). pipeta.
2. Wenn eine Deletion nur die proximale CDR umfasst und homozygot ist, sollten kein 7. Extraiga 10l de la sonda por prueba, poner en un tubo de microcentrfuga. Vuelva a
rotes und zwei grne Signale zu beobachten sein (0R, 2G). almacenar el resto de la sonda a -20C.
3. Wenn eine Deletion nur die distale CDR umfasst und hemizygot ist, sollten zwei rote 8. Precaliente el portaobjetos y la muestra en una placa caliente a 37C (+/- 1C) durante
und ein grnes Signal zu beobachten sein (2R, 1G). 5 minutos.
4. Wenn eine Deletion nur die distale CDR umfasst und homozygot ist, sollten zwei rote 9. Ponga 10l de sonda sobre el portaobjetos y aplique cuidadosamente el cubreobjetos.
und kein grnes Signal zu beobachten sein (2R, 0G). Selle con solucin de goma y deje secar completamente.
5. Ein rotes und ein grnes Signalmuster (1R, 1G) knnen im Falle einer Monosomie 7
oder einer hemizygoten Deletion beider CDR auf 7q beobachtet werden. Desnaturalizacin
10. Desnaturalice la muestra y la sonda simultneamente calentando el porta en la placa
Einschrnkungen
caliente a 75C (+/- 1C) durante 2 minutos.
Protokollierung und Interpretation der FISH Tests sollte nach professionellen Standards fr
die Praxis und unter Bercksichtigung anderer klinischer und diagnostischer Informationen .
Der Test ist als Ergnzung zur klassischen Zytogenetik zu verstehen. Daher sollten Hibridacin
11. Ponga el porta en un contenedor hmedo a prueba de luz a 37C (+/- 1C) toda la
therapeutische Manahmen nicht allein auf Grundlage der FISH-Ergebnisse veranlasst.
noche.
Weitere Informationen:
Weitere Produktinformationen erhalten Sie vom Technischen Kundendienst von Cytocell. Lavados post-hibridacin
T: +44 (0)1223 294048 12. Quite el cubreobjetos y los restos de goma cuidadosamente.
E: techsupport@[Link] 13. Lave el portaobjetos en 0.4xSSC (pH 7.0) a 72C (+/- 1C) durante 2 minutos.
W: [Link] 14. Seque el portaobjetos y lvelo en 2 x SSC, 0.05% Tween-20 (pH 7.0) a TA durante 30
segundos sin agitacin.
ESPAOL 15. Escurra el portaobjetos y aada 10l de DAPI antifade sobre cada muestra.
16. Aplique un cubreobjetos, elimine burbujas y deje reposar en oscuridad durante 10
La hibridacin in situ fluorescente (FISH) es una tcnica que permite detectar secuencias minutos.
de ADN en cromosomas metafsicos o ncleos interfsicos en muestras citogenticas y 17. Obsrvelo con el microscopio de fluorescencia.
fijadas. En la tcnica se utiliza una sonda de ADN que hibrida los cromosomas completos o
las secuencias nicas simples y es un complemento til para la citogentica clsica. Estabilidad de los portaobjetos terminados
Recientes estudios indican que esta es una tcnica que puede aplicarse como herramienta Los portaobjetos de FISH permanecen analizables durante 1 mes si se han almacenado en
esencial de diagnstico prenatal, hematolgico y patolgico. Despus de la fijacin, el ADN la oscuridad y por debajo de la temperatura ambiente.
diana se trata con calor para desnaturalizar el ADN bicatenario haciendo que resulte
monocatenario. El ADN diana queda entonces disponible para hibridarlo con una sonda de Recomendaciones de procedimiento
ADN igualmente desnaturalizado, monocatenario marcado con fluorescencia que tiene una 1. No se recomienda calentar ni envejecer los portaobjetos ya que se podra reducir la
secuencia complementaria. Despus de la hibridacin la sonda de ADN no fluorescencia de la seal.
especficamente hibridada y no hibridada se elimina y se aplica un contraste al ADN para 2. Las condiciones de hibridacin pueden verse afectadas negativamente con el uso de
su visualizacin. El uso de un microscopio de fluorescencia permite la visualizacin de la reactivos distintos de los suministrados o recomendados por Cytocell Ltd.
sonda hibridada en el material utilizado. 3. Se recomienda encarecidamente el uso de un termmetro calibrado para medir las
temperaturas de soluciones, baos de agua e incubadores ya que estas temperaturas
Especificaciones de la sonda son cruciales para el rendimiento ptimo del producto.
Regin 7q22.1-q22.2 en rojo 4. Las concentraciones del lavado (estringencia), el pH y la temperatura son importantes
Regin 7q31.2 en verde ya que una estringencia baja puede provocar una fijacin no especfica de la sonda y
demasiada estringencia puede derivar en una falta de seal.
La sonda 7q22, marcada en rojo, cubre una regin de 396kb que incluye el extremo 5. Una desnaturalizacin incompleta puede provocar falta de seal y una
telomrico del gen RELN y se extiende ms all del marcador D7S658. La sonda 7q31, desnaturalizacin excesiva tambin puede originar una fijacin no especfica.
marcada en verde, cubre una regin de 203kb que incluye el gen TES.
Resultados esperados
Material proporcionado En una clula normal deben existir dos seales rojas y dos verdes (2R, 2V). Las clulas con
Sonda: 50l por vial (5 reacciones), 100l por vial (10 reacciones) o 200l por vial (20 delecin pueden mostrar uno de los siguientes patrones de seales:
reacciones) 1. Si una delecin solo abarca la CDR proximal y es hemicigtica, debe observarse una
Sonda de la regin de 7q22 rojo: 16-20ng/reaccin seal roja y dos seales verdes (1R, 2V).
Sonda de la regin de 7q31 verde: 72-90ng/reaccin

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2. Si una delecin solo abarca la CDR proximal y es homocigtica, no debe observarse
ninguna seal roja y deben observarse dos seales verdes (0R, 2V).
3. Si una delecin abarca solo la CDR distal y es hemicigtica, deben observarse dos
EN: Catalogue number
seales rojas y una seal verde (2R, 1V). DE: Bestellnummer
4. Si una delecin abarca la CDR distal y es homocigtica, deben observarse dos seales REF FR: Rfrence du catalogue
rojas y ninguna seal verde (2R, 0V).
5. El patrn con una seal roja y una seal verde (1R, 1V) puede observarse en el caso
IT: Riferimento di Catalogo
de monosoma del 7 o delecin hemicigtica de ambas CDR en 7q. ES: Nmero de catlogo
EN: In vitro diagnostic device
Limitaciones
La comunicacin y la interpretacin de FISH debe ser conforme a los estndares de DE: In-vitro-Diagnostikum
prcticas profesionales, y debe tener en consideracin otra informacin clnica y de FR: Dispositif mdical de diagnostic in vitro
diagnstico. Esta prueba est diseada como un complemento de la citogentica clsica y IT: Dispositivo medico-diagnostico in vitro
no deben tomarse medidas teraputicas basndose nicamente en el resultado de FISH.
ES: Producto sanitario para diagnstico in vitro
Informacin adicional EN: Batch code
Si desea obtener informacin adicional sobre el producto, pngase en contacto con el DE: Loscode
Departamento de soporte tcnico de Cytocell.
T: +44 (0)1223 294048 FR: Code du lot
E: techsupport@[Link] IT: Codice di lotto
W: [Link] ES: Cdigo
References/Bibliographie/Bibliographia/Literatur/Bibliografa
EN: Consult instructions for use
1. Heim and Mittelman, Willey-Liss, Inc. 1995 DE: Gebrauchsanweisung beachten
2. Emerling BM et al., Oncogene 2002;21:4849-54 FR: Consulter la notice d'utilisation
3. Kratz CP et al., Genomics 2001;77(3):171-80 IT: Consultare le istruzioni per l'uso
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1999 EN: Manufacturer
5. Le Beau MM et al., Blood 1996;88(6):1930-5 DE: Hersteller
6. Fischer K et al., Blood 1997;89(6):2036-41
7. Koike M et al., Leukemia Res 1999;23:307-10
FR: Fabricant
IT: Fabbricante
ES: Fabricante
EN: Use by
DE: Verwendbar bis
FR: Utiliser jusquau
IT: Utilizzare entro
ES: Fecha de caducidad
EN: Temperature limitation
DE: Temperaturbegrenzung
FR: Limites de temprature
IT: Limiti di temperatura
ES: Limitacin de temperatura
EN: Sufficient for <n> tests
DE: Ausreichend fr
FR: Suffisant pour
IT: Sufficiente per
ES: Vlido para
EN: Contents
DE: Inhalt
CONT FR: Contenu
IT: Contenuto
ES: Contenido

Patents and Trademarks

Aquarius and Cytocell are registered trademarks of Cytocell Ltd.
This product contains technology licensed from Life Technologies Corporation
and is available for human diagnostics or life science research use only.

Cytocell Ltd.
3-4 Technopark
Newmarket Road
Cambridge, CB5 8PB, UK.
T: +44(0)1223 294048
F: +44(0)1223 294986
E: probes@[Link]
W: [Link]

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