RIA, RAST, RIST, ELISA
RIA (Radio Immuno Assay)
• tehnică de fază solidă bazată pe reacția Ag-Ac,
în care se folosesc izotopi radioactivi
[Link]
Izotopi
= atomi ai aceluiași
element care au un
nr diferit de neutroni
în nucleu
• același nr atomic
• nr de masă diferit
Izotopi radioactivi
• Izotopii instabili emit particule sau energie pentru a ajunge la o formă
stabilă
• Izotopii radioactivi = izotopi care pentru a ajunge la o formă stabilă emit
radiații alfa, beta sau gama
RIA (Radio Immuno Assay)
• tehnică de fază solidă, bazată pe reacția Ag-Ac, în care se
folosesc izotopi radioactivi (radioizotopi)
• Radioizotopii se pot lega covalent de proteine.
• Radiațiile emise pot fi măsurate folosind gamma countere.
• Cel mai folosit radioizotop este 125I (T1/2 ≈ 60 zile)
• Tehnica se bazează pe:
– legarea competitivă a Ag din ser și a Ag radiomarcat la Ac specifici fixați pe
suportul solid
– legarea competitivă a Ac din ser și a Ac radiomarcați la Ag fixate pe suportul solid
[Link]
[Link]
• Antigenul este incubat pe o suprafata solida (plastic) si
adsorbit la aceasta.
• Antigenele nelegate sunt indepartate prin spalare.
• Suprafata solida este tratata cu o proteina irelevanta
(blocata) pentru a preveni legarea ulterioara
nespecifica.
• Se adauga anticorpi specifici pentru Ag respectiv
• Excesul de anticorp este indepartat prin spalare.
• Anticorpul legat este identificat cu ajutorul unui ligand
radioactiv. Ligandul ar putea fi o molecula precum
proteina A a stafilococului, care se leaga la fragmentul
Fc al IgG, sau un anticorp secundar.
• Excesul de ligand este indepartat prin spalare.
• Radioactivitatea placii este masurata cu ajutorul unui
contor (gamma counter).
• Prin utilizarea unei cantitati crescande de ligand
radiomarcat se obtine o curba de titrare, cu valori
incepand de la „zgomotul de fond” (background) pana
la un maximum (platou liniar). In mod obisnuit, platoul
are valori de 20-100 de ori mai mari decat
background-ul.
• Curba de titrare poate fi utilizata pentru determinari
cantitative doar in portiunea ei liniara!
• O anumita cantitate de antigen liber (in solutie) va
lega anticorpii si ii va impiedica sa se lege la suprafata
solida. Astfel, radioactivitatea placii va fi proportional
mai mica.
• Sensibilitatea metodei este de cca 1-50 ng/ml
Radioimmunosorbent test (RIST)
= tehnică de fază solidă bazată pe reacția Ag-Ac
prin care sunt cuantificate IgE totale din ser
folosindu-se izotopi radioactivi
• cantitatea de IgE totale se determină prin compararea
radioactivității cu cea a standardelor cunoscute de IgE
RIST
RAST(radio-allergo-sorbent test)
= tehnică de fază solidă bazată pe reacția Ag-Ac prin care sunt determinate
IgE specifice pentru un anumit alergen, folosindu-se Ac anti-ε marcați cu
radioizotopi
ELISA
Enzyme-Linked
Immunosorbent Assay
• Cost redus • Cuantificarea nivelului
• Nr mare de probe hormonilor
– HCG (test pentru sarcina)
• Screening-ul sangelui – LH (determinarea momentului
donatorilor pentru ovulatiei
evidentierea contaminarii – TSH, T3, T4 (evaluarea
virale functiei tiroidiene)
– HIV-1 si HIV-2 (prezenta • Detectarea infectiilor
anticorpilor anti-HIV) – Patogeni cu transmitere
– Hepatita C (prezenta Ac) sexuala (HIV, Treponema
– Hepatitra B (Ac si Ag) pallidum, Chlamydia)
• Diagnosticul bolilor – Hepatita
autoimune: • Detectia substantelor ilicite
– Artrita reumatoida (FR, Ac anti- – Cocaina, opiacee
CCP cyclic citrulinate peptide) • Industria alimentara:
– Boala celiaca (Ac anti-gliadina – Dectectia alergenilor in
deamidata) mancare si praful de casa
– Vasculita (Ac ANCA anti- – Masurarea toxinelor din
citoplasma neutrofilelor)
– Lupus (Ac anti-histone, Ac anti- mancarea contaminata
ADNdc)
ELISA = Enzyme linked immunosorbent assay
substrat
enzimă
= tehnică de fază solidă bazată pe
reacția Ag-Ac, în care se folosesc
enzime care, acționând asupra unui
substrat cromogen (incolor), vor
genera un produs colorat
• intensitatea reacției de culoare
este estimată spectrofotometric
[Link]
ELISA
HRP (horseradish peroxidase)
OPD (o-phenylendiamine) galben portocaliu
TMB (tetrametilen benzidina) albastru
ABTS verde
2,2'-Azinobis [3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid]-diammonium salt
Fosfatază alcalină
PNPP (p-nitrophenyl phosphate) galben
ELISA directă
substrat
ELISA directă
A.
• Ag atașat la suportul solid
• Ac cuplați cu enzima
B.
• Ac atașați la suportul solid
• Ag cuplat cu enzima
ELISA indirectă
ELISA indirectă
- Se lucrează în plăci cu 96 de godeuri cu fund plat
- Godeurile sunt tapetate cu antigen
[Link]
ELISA indirectă
- Se adaugă serul pacientului care conține diverși Ac
- Ac specifici se leagă la Ag; cei nespecifici, ne-legați, sunt îndepărtați prin
spălarea godeurilor
[Link]
ELISA indirectă
- Se adaugă Ac anti-Ac umani, legați covalent de o enzimă
- excesul de enzimă nelegată se îndepărtează prin spălare
- se adaugă un substrat colorat pentru enzimă
ELISA indirectă
- Intensitatea culorii e proportională cu cantitatea de Ac legat în placă
Cu cât e mai mare cantitatea Ag (sau Ac) din proba
examinată, cu atât e mai intensă culoarea din godeu
ELISA cantitativă
[Link]
ELISA sandwich
ELISA sandwich
ELISA competitivă