C5.
Analiza acizilor nucleici pe baza
hibridizrii. Microarray
Termodinamica acizilor nucleici
Termodinamica acizilor
nucleici consta n
studierea modului n
care temperatura
influeneaz structura
dublu catenar a
acidului nucleic
(ADNdc). Procesul de
separare a lanurilor se
numete topire
(melting).
Hibridizarea
Hibridizarea este procesul de
stabilire a unei interacii non-
covalente ce depinde de
secven, ntre doua sau mai
multe catene complementare
ale acizilor nucleici
Hibridul dublucatenar se
numeste duplex.
Pot hibridiza numai
monocatene :
-
- oligonucleotidele (ex.
primeri, sonde),
-
- catenele ADN
-
- catena ARN
Alinierea
n practica hibridizarea este realizat printr-un
procedeu numit aliniere n condiii adecvate de
temperatur, concentraie ionic i pH
Hibridizarea este condiionat de
complementaritatea bazelor azotate
Odat legate, catenele se pot disocia doar prin
creterea temperaturii
Sondele moleculare sunt fragmente de ADN
sau ARN, marcate sau nu, care recunosc
secvente complementare de pe o catena de ADN
supusa investigarii
Denaturarea ADN
Denaturarea ADN este un proces prin care
acidul dezoxiribonucleic dublu catenar se
desface n doua catene separate prin ruperea
legturilor de hidrogen ntre baze
Termenul sugereaz un proces clasic de topire,
referirea fiind fcut la un proces care decurge
prin nclzirea amestecului de nucleotide, de i
termenul denaturare poate sa se refere i la
separarea catenelor de ADN indus de
substane chimice precum ureea
Denaturare - Renaturare
ADN 2c
Denaturare Prin tratment termic sau chimic a
ADN
legturile de hidrogen se rup =
denaturarea ADN
monocatenele de ADN rcite
lent se pot reasocia pe baza
ADN partial denaturat complementaritii =
renaturare sau hibridizare.
Prin rcire brusc ADN ramane
sub forma
monocatenara
Temperatura de topire (Tm)
Temperatura de topire (Tm) se definete ca
temperatura la care jumtate din catenele ADN
sunt n stare de nativa (dublu helix) i jumtate
au o configuratie monocatenara
Tm depinde de lungimea moleculei de ADN i
de compozitia nucleotidelor
Atunci cnd cele doua catene ale moleculei de
ADN sunt disociate (adic, molecula de ADNdc
exista sub forma a doua catene independente
de ADNmc), denaturarea a fost completa
Aplicaii
Procesul de denaturare a ADN poate fi utilizat
pentru a analiza compozitia ADN
Deoarece perechea de baze citozina/guanina
este mai puternica dect perechea de baze
adenozina/timina, cantitatea de citozina si
guanin din genom (numit procent GC) poate
fi estimat prin msurarea temperaturii la care
ADN-ul genomic se topete
Temperaturile mai nalte sunt asociate cu un
coninut mare de GC.
SSouthern Blotting
Este o metod folosit n mod
curent in biologia molecular
pentru a detecta o secvena
de ADN specific. Combin
transferul de fragmente de
ADN separate prin
electroforeza pe o membran
i detectarea fragmentului de
interes prin hibridizare cu o
sond
Southern, Edwin Mellor (5
November 1975). "Detection of
specific sequences among
DNA fragments separated by
gel electrophoresis". Journal of
Molecular Biology 98 (3): 503
517.
Tehnica Southern blot
transferul ADN pe membrane de nitroceluloza
- Clivarea ADN cu enzime de restrictie si migrarea fragmentelor in gel de agaroza
- asamblarea sistemului de transfer: cuva cu solutie alcalina, gelul de agaroza si
- membrana de nitroceluloza plasate intre hartii de filtru
- Transferul ADN din gel pe membrana prin capilaritate
- Hibridizarea ADN transferat pe membrana cu sonde ADN sau ARN, marcate cu
- radioizotopi sau cu fluorocromi
Tehnica dezvoltata de Edwin Southern
Expresia genelor poate fi reglata in
timpul transcrierii
DNA RNA PROTEIN
TRANSCRIPTION TRANSLATION
Totalitateagenelorcaresunttranscrisesenumeste
transcriptom
Northern Blotting
Este o tehnica de analiza a
ARN prin care este posibil
s se observe nivelele
specifice de expresie a
genelor n condiii normale
sau patologice. Tehnica
implic utilizarea
electroforezei la separarea
probelor de ARN iar apoi
detectare cu o sond
complementara hibridizata
la secvena int
A fost dezvoltat in 1977
de ctre James Alwine,
David Kemp, i George
Stark de la Universitatea
Stanford.
Microarray
In tehnica microarray o matrice poate conine zeci de mii de sonde
Sondele sunt sintetizate i apoi ataate pe un suport prin legturi
covalente.
Studiul expresiei genelor
Analiza ADN prin tehnica microarray
Molecule ADN monocatenare (sonde) sunt fixate pe un
suport (lama de sticla sau microcip) printr-o tehnica
robotizata
Pe un singur suport se pot atasa 10.000 de molecule
ADN (spots of DNA)
Se extrage din tesutul de investigat ARN mesager
(ARNm), se marcheaza cu un colorant fluorescent si se
incubeaza in mediu lichid pentru hibridizare cu sondele
ADN aflate pe suport (lama de sticla)
ARNm va hibridiza cu sondele ADN complementare
Lama este apoi scanata cu un laser care va induce
aparitia unor spoturi fluorescente
DNA microarray assay for gene
expression
Principle of Microarray (Chip) Assay
Prehybridization Posthybridization
Synthetic DNA probes Probes with
hybridized DNA
DNA microarray
microcip
- Microarray permite analiza simultana a expresiei
ARNm provenit de la citeva mii de gene
- Pentru organismele cu genomul secventiat
integral (cum este genomul uman) microarrays
poate analiza expresia fiecarei gene
- Pot fi analizate 30.000 de gene in acelasi timp
- Inainte de introducerea acestei tehnici
automatizate, evaluarea cantitativa a ARN era
facuta cu Northern blot pe care se analizau
maxim 40 de probe
Analiza exprimarii genelor
Poate fi utilizata ca test de diagnostic, de ex.
pentru cancer
Poate indica modificari cantitative ale ARNm
legate de expresia genelor:
- in timpul ciclului celular
-in timpul dezvoltarii organismului de la embrion la
adult
-dupa expunere la diferiti stimuli
-In conditii patologice versus conditia normala
(cancer)
Ofera informatii despre functionarea unui sistem
ca intreg
Affymetrix
Affymetrix este una din primele
companii care au produs
microarrays
- au dezvoltat tehnologia
microarray si sinteza bazata pe
chimie combinatorie. Aceste
metode au fost aplicate pentru a
construi matrici de nalt densitate
in oligonucleotide pe substraturi de
sticla sau silicon (chip-uri).
Affymetrix
Interpretarea datelor pe microcip
Verde reprezinta hibridizare Control
Rosu reprezinta hibridizare Sample (proba de
testat)
Galben reprezinta combinatia dintre Control
si proba hibridizate in acelasi loc
Negru zone unde nu hibridizeaza nici Proba
nici Controlul.
DNA Microarrays