MICROPROPAGAREA IN VITRO

LA STEJARUL BRUMARIU (QUERCUS PEDUNCULIFLORA)

1. INTRODUCERE

Speciile de stejari ocup suprafete ntinse n pdurile de foioase datorit lemnului valoros si sunt importante din punct de vedere ecologic si economic. Acestea sunt rspndite zonal, n funcie de conditiile stationale, formnd arborete pure sau de amestec cu alte specii forestiere. Influenta antropic negativ asupra mediului a provocat declinul sau disparitia unor pduri, fiind amenintate multe specii de arbori. De aceea in ultimul timp s-a sporit interesul pentru propagarea vegetativ, prin noile

tehnici de culturi in vitro. Pn n prezent s-au acumulat multe date n literatura de specialitate, cu privire la multiplicarea in vitro la stejari, prin organogenez sau embriogenez somatic (Jacoiot, 1952; Chalupa, 1981, 1983, 1985, 1987; Jorgensen)

Stejarul brumriu (Quercus pedunculiflora ) prezint trsturi xerofitice mai accentuate dect stejarul pedunculat si cerul, fapt ce i permite s vegeteze mai bine pe solurile uscate de step.

2. MATERIALE SI METODE

2.1. Initierea culturilor in vitro la stejarul brumriu

Materialul vegetal: Culturile au fost iniiate utiliznd urmtoarele tipuri de explante: 1) segmente nodale cu muguri axilari, excizate de la puieti de patru luni, obtinuti n conditii de laborator; 2) fructe verzi germinate aseptic; 3) ghinde mature recoltate n luna octombrie. Metoda de sterilizare: Segmente nodale cu muguri axilari, excizate de la puieti de 4 luni si ghindele verzi au fost dezinfectate prin imersie n clorur mercuric 0,2 %, timp de 35 minute, urmat de splri n trei bi de ap steril. Ghindele mature selectionate au fost sterilizate, dup ndeprtarea pericarpului si tinerea n ap steril 24 ore pentru diminuarea continutului de fenoli, prin agitare n solutie de clorur mercuric 0,2 %, timp de 45 minute, urmat de trei splri cu ap steril. Toate tipurile de explante au fost presterilizate prin splare cu ap si Tween 20. Mediul de cultur: Initierea de culturi in vitro la stejarul brumriu a fost testat pe mediile de cultur GD (Gresoff si Doy, 1972) si Woody Plant Medium WPM (Lloyd si McCown, 1981, citati de Chalupa, 1983) (tabelul 1). Incubarea culturilor s-a fcut n camera de crestere la temperatura de 22-26 C si o fotoperioad de 8 ore -ntuneric si 16 ore lumin.

2.2. Etapa de alungire-multiplicare n conditii normale si experimentale n faza de alungire - multiplicare la stejarul brumriu a fost studiat influenta mediului de cultur si balantei hormonale asupra capacittii de crestere a explantelor prelevate din culturile de initiere. a) ntr-un prim experiment s-a urmrit capacitatea de multiplicare a plantulelor excizate din cultura de initiere, care a folosit ca inoculi ghindele mature germinate aseptic. Plantulele care s-au format n etapa de initiere au fost subcultivate n vederea multiplicrii n primul pasaj, pe mediul de cultur GD, n trei variante hormonale: (i)M1- BAP 1 mg/l, IBA 0,05 mg/l; (ii) M2- BAP 1 mg/l, IBA 0,05 mg/l, NAA 0,05 mg/l;(iii) M3 BAP 0,6 mg/l, 2,4-D 0,05 mg/l, iar n pasajul al doilea pe mediul de cultur WPM, de asemenea, n trei variante hormonale: (i) M4- BAP 1 mg/l, IBA 0,05 mg/l,NAA 0,05 mg/l; (ii) M5- BAP 0,8 mg/l, IBA 0,05 mg/l, NAA 0,05 mg/l; (iii) M6-BAP 0,4 mg/l, IBA 0,05 mg/l, NAA 0,05 mg/l.

b) Al doilea experiment de alungire-multiplicare a folosit ca explante lstari excizati din culturi de segmente nodale prelevate de la puieti de patru luni. Lstarii au fost inoculati n prezenta factorului abiotic manitol n concentratie de 5 g% pe mediul de cultur GD, n trei variante hormonale: (i) M1- BAP 1 mg/l, IBA 0,05 mg/l, 2,4-D0,05 mg/l; (ii) M2- BAP 0,6 mg/l, IBA 0,05 mg/l, 2,4-D 0,05 mg/l; (iii) M3- BAP 0,2 mg/l, IBA 0,05 mg/l, 2,4-D 0,05 mg/l.

c) n experimentul al treilea s-a testat capacitatea de supravietuire a explantelor n etapa de alungire - multiplicare la concentratia PEG de 5, 10, 15 g% pe mediul de -cultur GD cu BAP 0,4; 0,8 sau 1 mg/l si IBA 0,05 mg/l, NAA 0,05 mg/l. d) n experimentul al patrulea s-a testat capacitatea de supravietuire a explantelor ce au fost cultivate pe mediul de cultur WPM cu BAP 0,8 mg/l, IBA 0,05 mg/l, NAA 0,05 mg/l n prezenta factorului abiotic manitol n concentratie de 10, 12 si 16 g%. e) n faza de alungire - multiplicare la stejarul brumriu un alt experiment a urmrit capacitatea de regenerare a explantelor excizate din cultura de multiplicare dup expunerea la manitol 5 g% si polietilen glicol 5 g%. S-a utilizat mediul de cultur WPM, n trei variante hormonale: (i) M1-1/2 cu BAP 0.2 mg/l, IBA 0,05 mg/l, crbune activ 1 g/l; (ii) M2 - BAP 0,8 mg/l, IBA 0,05 mg/l, 2,4-D 0,05 mg/l; (iii) M3- BAP 1 mg/l, IBA 0,05 mg/l, 2,4-D 0,05 mg/l.

2.3. Etapa de nrdcinare n conditii normale si experimentale

a)Un prim experiment a urmrit capacitatea de nrdcinare in vitroa explantelor excizate din cultura de multiplicare, pe medii de rizogenez normale (lipsite de factorul abiotic stresant): (1) V1-WPM 1/2 cu IBA 0,3 mg/l, NAA 0,1 mg/l, crbune activ 1g/l; (2) V2- WPM 1/2 cu IBA 0,3 mg/l, NAA 0,1 mg/l, 2,4-D 0,05 mg/l; (3) V3- WPM 1/2 cu IBA 1 mg/l, NAA 0,05 mg/l, 2,4-D 0,05 mg/l. b) Al doilea experiment a urmrit capacitatea de nrdcinare a lstarilor prelevati din faza de multiplicare pe mediul de rizogenez optim cu factorul abiotic stresant: (1) V1-WPM 1/2 cu IBA 0,3 mg/l, NAA 0,1 mg/l, crbune activ 1g/l, manitol

5 g%;
(2) V2- WPM 1/2 cu IBA 0,3 mg/l, NAA 0,1 mg/l, crbune activ 1g/l, PEG 5 g%; (3) V3- WPM 1/2 cu IBA 0,3 mg/l, NAA 0,1 mg/l, manitol 5 g% i PEG 5 g%. Pentru aclimatizarea in vitro s-a utilizat ca substrat nutritiv un amestec steril de pmnt de pdure si perlit (10:1).

3. REZULTATE SI DISCUTII

3.1. Initierea

Rezultate bune la initierea culturilor in vitro de stejar brumriu s-au obtinut cnd s-au folosit segmentele nodale prelevate de la puietii obtinuti n conditii de laborator, care au avut putine infectii endogene, fapt ce a permis o viabilitate mare comparativ cu ghindele verzi si mature.

Varianta hormonal optim pentru initierea de culturi in vitro la stejarul brumriu din puieti a fost M2, care a avut n compozitie BAP n concentraie de 0,8mg/l.
Embrionii din ghindele verzi si mature au germinat optim pe mediul nutritiv GD, la concentratii de BAP 1 mg/l. Initierea culturilor in vitro la stejarul brumriu a fost influentat de starea fiziologic a explantului, metoda de sterilizare si balanta hormonal.

3.2. Multiplicarea

Un prim experiment de alungire multiplicare a folosit ca explante lstari excizati din culturi de ghinde mature germinate aseptic. Lstarii au fost subcultivati pe parcursul a dou pasaje, utiliznd mediile de cultur GD si WPM. Concentraia BAP-lui din mediul de cultur a influenat semnificativ procentul explantelor viabile pe parcursul pasajelor de multiplicare la stejarul brumriu n primul pasaj concentraia BAP de 0,6 mg/l a determinat reducerea viabilitii comparativ cu concentraia de 1 mg/l. n pasajul al doilea varianta hormonal cu 0,8 mg/l BAP a fost mai eficient dect variantele cu 0,4 i 1 mg/l. n experimentul al doilea s-a testat capacitatea de supravieuire a explantelor ce au fost cultivate n prezena factorului abiotic manitol n concentraie de 5 g%. La aceast concentraie a manitolului varianta de mediu nutritiv cu BAP 0,6 mg/l a fost mai eficient. n experimentul al treilea s-a testat capacitatea de supravieuire a explantelor n etapa de alungire - multiplicare la concentraia de 5, 10, 15 g% PEG. La aceste concentraii viabilitatea explantelor s-a redus de la 71,4% la 37,5%. n experimentul patru s-a testat capacitatea de supravieuire a explantelor ce au fost cultivate pe mediul de cultur WPM cu BAP 0.8 mg/l, IBA 0,05 mg/l, NAA 0,05 mg/l n prezena factorului abiotic manitol n concentraie de 10, 12 i16 g% La concentraia ridicat a manitolului de 16 g%, viabilitatea se reduce sub 20%, iar capacitatea de multiplicare se reduce pn la stagnare. n experimentul cinci s-a testat capacitatea regenerare a explantelor prelevate din culturile de multiplicare ce au avut n compoziia mediului de cultur manitol 5 g% i polietilen glicol (PEG) 5 g%. Capacitatea de regenerare a explantelor a fost influenat de factorul abiotic prezent n pasajul anterior. Astfel, manitolul permite o regenerare mai mare cu 12,5 procente comparativ cu polietilen glicolul. Concentraiile optime de manitol sau polietilen glicol la care se poate realiza selectia in vitro s-au situat ntre 12 si 15 g%.

3.3. nrdcinarea

Un prim experiment a urmrit capacitatea de formare a rdcinilor in vitro la explantele de stejar brumriu excizate din cultura de multiplicare, pe medii de rizogenez normale (lipsite de factorul abiotic stresant). Capacitatea de nrdcinare in vitro a explantelor a fost influenat semnificativ de varianta hormonal a mediului de rizogenez. Astfel, varianta V1 a mediului WPM a fost mai eficient comparativ cu varianta V2 la care a lipsit crbunele activ sau varianta V3 ce a coninut auxine la un nivel ridicat. Al doilea experiment a urmrit capacitatea de nrdcinare a lstarilor prelevai din faza de multiplicare pe mediul de rizogenez optim (IBA 0,3 mg /l, NAA 0,1 mg/l,crbune activ 1 g/l) cu factorul abiotic stresant. Concentraia i tipul factorului abiotic a influenat semnificativ formarea i numrul rdcinilor. Varianta mediului nutritiv cu manitol i polietilen glicol n concentraie de 5 g% fiecare a fost mai stresant hidric cu 8% pentru rizogenez comparativ cu variantele care au coninut factorii abiotici separat. Dac viabilitatea este dependent mai mult de natura explantului i metoda de sterilizare, reactivitatea este dependent mai mult de starea fiziologic a explantului (balana hormonal intern). Lstarii inoculai pentru rizogenez au avut o reactivitate neuniform pe aceeai balan hormonal, ceea ce se explic prin complexitatea factorilor ce determin un anumit rspuns la condiiile in vitro, n primul rnd la gradientul diferit al hormonilor endogeni prezeni n explantele inoculate. Plantulele de stejar brumriu cu sistemul bine dezvoltat a fost transferate ntr-o mixtur de pmnt de pdure i perlit (10:1), pentru aclimatizare la condiiile de solar. n aceste condiii s-au aclimatizat 42% din plantulele nrdcinate. O uscare mai evident la transferul n solar s-a produs la plantulele care au avut coletul mai hipertrofiat i cele cu mugurele terminal slab dezvoltat.

4. CONCLUZII
La stejarul brumriu explantele cele mai reactive pentru realizarea etapei de iniiere au fost segmentele nodale cu muguri axilari excizate de la puiei. Eficiena dezinfeciei explantelor a depins n mare msur de infeciile endogene, agentul sterilizant i timpii de tratare. O multiplicare optim la stejarul brumriu s-a realizat pe mediul nutritiv WPM cu un coninut al BAP de 0,8 mg/l. S-au stabilit concentraiile factorilor abiotici manitol sau polietilen glicol (12-15g/%) necesare fazei de selecie in vitro la stres hidric a butailor de stejar brumriu. n general, att segmentele nodale, ct i ghindele au rspuns satisfctor la cultura in vitro. Pierderile cele mai mari de material la stejarul brumriu au fost generate de creterea discontinu a lstarilor i eliberarea n mediul de cultur a substanelor oxidante, care a determinat uscarea sau brunificarea explantelor. S-au creat premisele stabilirii secvenelor de multiplicare i selectie in vitro la stres hidric la stejarul brumriu. Micropropagarea la stejarul brumriu, dei susceptibil de perfecionri, ofer o alternativ la nmulirea pe cale vegetativ a genotipurilor valoroase.