LP12. Expresia genica.
Metode de
evaluare a gradului de activare genica.
Controlul expresiei genice
- principii generale -
- proteine comune TUTUROR CELULELOR. Ex: proteinele
structurale cromozomiale, ARN-polimerazele;
-proteine abundente IN CELULE SPECIALIZATE. Ex:
hemoglobina;
- o celula umana tipica exprima 30-60% din genele structurale.
Pattern-ul este specific (poate fi depistata originea cel.
canceroase);
- nivelurile ARNm nu pot prezice cu exactitate diferentele intre
modelele de expresie a proteinei (reglaj postranscriptional).
Controlul expresiei genice
- nivele de reglaj -
1. controlul transcriptional - cand si de cate ori o gena este
transcrisa;
2. controlul procesarii ARN - controlul splicing-ului si
procesarii ARN;
3. controlul transportului si localizarii ARN - selectarea
moleculelor de ARNm care sunt transportate din nucleu in
citoplasma, precum si localizarea moleculelor de ARNm in
citosol;
Controlul expresiei genice
- nivele de reglaj -
4. controlul translational - selectarea moleculelor de ARNm
din citoplasma care vor fi translatate in proteine la nivelul
ribozomilor;
5. controlul degradarii ARNm - destabilizarea selectiva a
anumitor molecule de ARNm in citoplasma;
6. controlul activitatii proteinei - activarea, inactivarea,
degradarea sau localizarea specifica a anumitor molecule
proteice dupa sinteza.
Controlul expresiei genice
- nivele de reglaj -
Metode de evaluare a gradului de
activare genica
Analiza ARNm prin Northern blot
Testul de protectie la ribonucleaze (ribonuclease protection
assay)
Hibridizarea tisulara in situ
Reacţia de polimerizare în lanţ în timp real cantitativă (qRT-
PCR)
Tehnicile microarray
I. Analiza ARNm prin Northern blot
- acidul nucleic ţintă este ARNm
- obiectiv - obţinerea de informaţii privind profilurile de expresie
(tipul celular, abundenţa transcriptului) unei anumite gene
-punerea în evidenţă a unui anumit ARN mesager se bazează pe
hibridarea moleculară a ARN cu o sondă complementară
monocatenară (ADN c denaturat; oligonucleotide ADN antisens).
Tehnica
moleculele de ARNm, de diferite lungimi (în funcţie de gena
transcrisă), extrase din diferite ţesuturi
separare prin electroforeză în gel de agaroză denaturant
transfer pe un filtru de nitroceluloză şi hibridare cu o sondă de
ADN marcată
pe autoradiogramă se observă una sau mai multe benzi a căror
talie, număr şi intensitate sunt indicaţii preţioase
II. Testul de protectie la ribonucleaze
(ribonuclease protection assay)
permite evaluarea cantitativa a unor produsi de transcriptie
specifici anumitor gene, identificati cu o sonda de ARN
complementara, dintr-un amestec de ARN total.
tehnica- incubarea unei sonde ARN monocatenare marcate,
antisens fata de gena de interes, cu amestecul de ARN total, in
conditii ce favorizeaza hibridizarea complementara a genei
tinta cu sonda
tratarea amestecului cu o ribonucleaza care digera toate
moleculele monocatenare de ARN, dar nu si pe cele de ARN
bicatenar rezultate in urma hibridizarii
ARN bicatenar este apoi separat prin electroforeza in gel
denaturant de poliacrilamida.
IV. Reacţia de polimerizare în lanţ în
timp real cantitativă (qRT-PCR)
cea mai avansată tehnologie pentru detecţia şi
cuantificarea ARNm, fiind suficient de
sensibilă pentru a evalua cantitativ transcripţii
prezenţi într-o singură celulă.
Etape
izolarea si purificarea ARN total (sau ARNm) dintr-un tesut
sau cultura de celule.
revers-transcriptia ARN in ADN complementar monocatenar
presupune utilizarea unui amestec de reactie de contine:
primeri, revers-transcriptaza, ADN polimeraza, dNTPs si
componente tampon.
reacţia de polimerizare în lanţ în timp real (Real-Time PCR)
V. Tehnicile microarray
permit analiza simultană a sute sau mii de gene
tipul de microarray depinde de materia de pe suport: ADN -
ADN-microarray; ARN - ARN-microarray; proteina -
proteina-microarray; ţesut - ţesut-microarray
tehnica ADN-microarray funcţionează prin cercetarea abilităţii
unei molecule de ARNm de a se lega sau de a se hibridiza cu
matriţa de ADN din care a luat naştere
ADN-microarray este utilizat pentru a determina:
- nivelurile expresiei genelor într-o probă (profilul expresiei);
- secvenţa genelor într-o probă, fenomen numit minisecvenţiere
când sunt analizate secvenţe scurte de nucleotide
- analiza mutaţiilor sau analiza SNP (single nucleotide
polymorphism) când se analizează un singur nucleotid.
Microarray-urile au fost utilizate:
- la nivel subcelular pentru cartografierea genelor care codifică
proteinele membranare;
- la nivel celular pentru cartografierea genelor care diferenţiază
diferitele tipuri de celule ale sistemului imun;
- la nivel tisular pentru identificarea genelor exprimate în
diverse ţesuturi.
- studiile farmacologice au utilizat microarray-uri pentru a
diferenţia mecanismele de acţiune ale agenţilor terapeutici şi
ca un corolar pentru a obţine noi agenţi terapeutici.
- monitorizarea progresiei replicaţiei ADN-ului în celulă
- identificarea agenţilor microbieni prin hibridizarea ADN-ului
din ţesuturile infectate la un array ce conţine secvenţe din
ADN-ul genomic al unui numar mare de agenţi patogeni.