LP 2: Prepararea și sterilizarea mediilor de cultura

Un mediu de cultură reprezintă un substrat nutritiv complex, steril, care trebuie să asigure
microorganismelor cantitatea necesară de apă, sursa de carbon, azot, săruri minerale, factori de creștere.
Mediile de cultură sunt formate din soluții apoase care conțin substanțele necesare creșterii
microorganismului, reproducerii și întreținerii funcțiilor vitale ale acestuia. Mediile de cultură trebuie să
furnizeze microorganismelor substanțele și energia necesare elaborării produsului dorit.
Mediile de cultură trebuie să îndeplinească următoarele condiții:

- să corespundă din punct de vedere nutritiv;

- să aibă o concentrație a substanțelor dizolvate care să nu influențeze negativ schimburile osmotice ale
celulei;
- să nu conțină substanțe toxice;
- să aibă un anumit pH;
- să fie sterile (lipsite de microorganisme), astfel încât să se dezvolte numai celulele introduse prin inocul.
Mediile de cultură se flosesc în practica de laborator sau în practica industrială și sunt foarte
diferențiate în funcție de scopul urmărit. În tehnica de laborator, mediile se folosesc pentru izolarea din
mediul natural a diferitelor microorganisme, pentru obținerea de culturi pure, pentru întreținerea culturilor
selecționate. În scopuri industriale, mediile de cultură sunt utilizate pentru obținerea de biomasă sau a
unor compuși de natură microbiană.
1) După scopul utilizării lor, mediile de cultură se împart în:

a) medii de cultură de laborator:

- simple (generale), care asigură dezvoltarea unui număr mare de specii;
- complexe, care sunt utilizate la izolări de microorganisme, pentru creșterea și păstrarea lor;
- speciale:
- selective, care permit dezvoltarea unui număr restrâns de microorganisme;
- de diferențiere, care permit separarea speciilor în funcție de anumite caractere biochimice;
- de îmbogățire, destinate separării și cultivării unor microorganisme pretențioase din punct de
vedere nutritiv saucare se află în număr redus;
- de conservare, destinate menținerii în viață și păstrării proprietăților fiziologice și biochimice ale
microorganismelor.
b) medii de cultură industriale.

2) Din punct de vedere al compoziției chimice:

- naturale, de origine animală sau vegetală, cu o compoziție chimică nedefinită în mod exact;
- sintetice, acestea sunt soluții de substanțe chimice pure în apă distilată, cu o compoziție perfct
determinată;
- semi-sintetice, sunt constituite din produse chimice bine definite, dar și din produse de origine naturală
(de compoziție cunoscută).

3) După consistență:
- lichide;
- semisolide;
- solide.
 Consistența mediilor de cultură este dată de includerea în compoziția lor a unei substanțe inerte:
agar-agar (geloză) sau gelatină.
Constituenții principali ai mediilor de cultură sunt:

1) Extracte de carne și macerate

Aceste produse, comercializate în formă concentrată sub denumirea de ”extracte de carne”, conțin
în principal proteine puțin hidrolizate, glucide, săruri minerale, vitamine hidrosolubile. Compoziția lor
variază în funcție de carnea utilizată pentru preparare.

2) Extracte de drojdie
Aceste extracte, comercializate sub formă deshidratată, sunt preparate din drojdia de bere, fiind
utilizate ca sursă de aminoacizi și de vitamine hidrosolubile (vitamine din complexul B).

3) Peptone și hidrolizate
Peptonele reprezintă un amestec de compuși solubili în apă care provin în urma acțiunii enzimelor
asupra materialului proteic. Pot fi: peptonă pepsică din carne, peptonă tripsică din cazeină (cu conținut
crescut în triptofan), peptonă pancreatică de cazeină, peptonă tripsică din carne, peptonă papainică de
soia, peptone compuse.
Hidrolizatele sunt peptone obținute în urma acțiunii compușilor anorganici asupra proteinelor (de
exemplu HCl). Cel mai des întrebuințat este hidrolizatul acid de cazeină, conținând aminoacizii
constitutivi ai cazeinei din lapte.

4) Agar-agar sau geloza

Agar-agarul, numit și geloză, este un extract de alge roșii din genul Gelidium și Gracilaria,
recoltate în mările Japoniei sau ale Noii Zeelande. Se dizolvă în apă la o temperatură de 90°C și se
solidifică sub 45°C, fiind utilizat pentru solidificarea mediilor de cultură. Nu este degradat de
microorganismele obișnuite. Este comercializat în forma sa inițială deshidratată, numit ”agar fibre”
(foarte impur), sub formă de paiete (mai puțin impur) sau sub formă de pulbere.

Exemple de tipuri de medii de cultură

1) Geloza simplă (mediu simplu)

Compoziție:
- agar 3g;
- extract bovin 1g;
- peptonă 1g;
- NaCl 0,5g.
Utilizare: cultivarea bacteriilor nepretențioase.

2)Geloză sânge (mediu compus)

Compoziție:
- agar 15g;
- peptonă C 15g;
- peptonă S 15g;
- NaCl 5g;
- sânge de berbec defibrinat 50 ml;
- pH 7,4±0,2 la 25°C.
Utilizare: cultivarea bacteriilor pretențioase.

3) Mediu Sabouraud (mediu selectiv)

Compoziție:
- glucoză 120g;
- NaCl 90g;
- agar 45g;
- peptonă 30g;
- soluție Cloramfenicol 15ml;
- soluție Cicloheximidă 15ml;
- soluție Gentamicină 15ml.
Utilizare: izolarea și cultivarea fungilor.

4) Mediu MacConkey (mediu selectiv diferențial)

Compoziție:
- agar 13g;
- lactoză 10g;
- NaCl 5g;
- săruri biliare 1,5g;
- peptonă A 1,5g;
- peptonă C 1,5g;
- peptonă G 17g;
- roșu neutru 0,03g;
- cristal violet 1mg;
- pH 7,1±0,2 la 25°C.
Utilizare: izolarea, cultivarea și diferențierea coliformilor și a patogenilor enterali. Enterobacteriile
patogene nu fermentează lactoza, producând colonii transparente.

Prepararea mediilor de cuștură pentru fungi

Cartof – glucoză – agar – mediu propice pentru dezvoltare

Compoziție:
- cartofi 200g;
- agar 20g;
- glucoză 20g;
- apă distilată până la 1000ml;
- vase Petri.

Mod de lucru
1) Se spală, curăță cartofii și se taie cuburi (de 0,5 cm latura).
2) Se cântăresc 200g cartofi, se clătesc cu apă și se fierb până se înmoaie.
3) Se sfărâmă artofii și se strecoară cu cât mai multă pulpă printr-o sită fină.
4) Se adaugă agarul și se aduce compoziția la fierbere.
5) Se ia compoziția de pe plită, se adaugă glucoză și se omogenizează până la dizolvare.
6) Compoziția este apoi completată până la 1000ml cu apă distilată.
 7) După preparare, mediul de cultură se repartizează pe plăci Petri sau eprubete.
8) Ulterior mediile de cultură se sterilizează, putând fi, astfel, păstrarte timp de 2-3 luni la
temperaturi cuprinse între 2 și 4°C până la însămânțare.

Sterilizarea mediilor de cultură

Presupune distrugerea sau înlăturarea tuturor microorganismelor atât în formă vegetativă, cât și
spori, din mediu și de pe obiectele supuse sterilizării.
Se poate realiza cu ajutorul agenților fizici (temperatură, radiații) și/sau chimici (alcool).
Sticlăria utilizată pentru prepararea mediilor de cultură (după spălare și uscare) se sterilizează în
etuvă la 180°C cel puțin 30 minute sau la 170°C cel puțin o oră.
După distribuirea mediului în vase, acestea se vor închide, vor fi puse în coșuri de sârmă și se vor
steriliza în autoclav la 121°C timp de 20 minute.
Etuvă – aer uscat
Autoclav – aer umed.

LP 3: Evidențierea proprietăților enzimelor

Enzime: - compuși de natură proteică înzestrați cu proprietăți catalitice;

- măresc viteza reacției fără să se consume;
- cantități mici de enzimă catalizează cantități mari de substrat;
- nu intervin în ecuația de echilibru a reacției, doar grăbesc echilibrul;
- clasificare: în funcție de reacțiile pe care le catalizează:
- oxidoreductaze;
- hidrolaze;
- transferaze;
- liaze;
- izomeraze;
- ligaze.
- unele catalizează un singur substrat, altele mai multe.

1) Evidențierea efectului catalitic al enzimelor

Principiul metodei
O soluție de uree tratată cu urează la 37°C sau NaOH 10% la fierbere este descompusă în amoniac
și CO2.
NH2
/
urează/NaOH 10%
C=O 2NH3 + CO2 ↑
\ - H2O
NH2

Materiale necesare
- extract urează;
- uree 2%;
- NaOH 10%;
- reactiv Nessler;
- apă distilată.
Pentru prepararea extractului de urează vom avea nevoie de făină de soia și soluție tampon acetat
2N de pH 4,8:
1) Se cântăresc 4g făină de soia peste care se adaugă 40 ml soluție tampon și se agită cu atenție.
2) Amestecului i se adaugă 2-3 picături Toluen și se lasă la rece, la 4°C timp de cca 20 ore, interval
suficient pentru ca enzima să treacă în soluție.
3) Soluția apoi se filtrează și filtratul poate fi utilizat pentru determinarea activității enzimei.

Mod de lucru
În 4 eprubete se adaugă:
Reactivi (sol) 1 2 3 4
Soluție uree 2% 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml -
Extract urează 0,5 ml - - -
NaOH 10% - 0,5 ml - -
H2O2 - - 0,5 ml 0,5 ml
R Nessler 0,2 ml 0,2 ml 0,2 ml 0,2 ml

Eprubetele se aduc în baie de apă timp de 10-15 minute.

După ce scoatem eprubetele din baia de apă, vom urmări prezența amoniacului prin adăugarea R
Nessler în eprubetele răcite.

Concluzii

După adăugarea R Nessler putem identifica prezența NH 3 deoarece reactivul colorează mediul cu
NH3 în galben.
E1: Reacția este pozotovă, apariția culorii galben intens indicând prezența amoniacului.
E2: Reacția este tot pozitivă.
E3: Reacție negativă.
E4: Etalon.
Cea catalizată enzimatic este compatibilă cu viața, cea catalizată neenzimatic nu este.

2) Evidențierea specificității absolute de substrat a enzimelor

Unele enzime catalizează transformarea unui singur substrat, proprietate numită specificitate
absolută de substrat.
E+S→ES→P+E

Principiul metodei
Ureaza descompune hidrolitic ureea în NH3 și CO2.
Materiale
- uree 2%;
- tiouree 2,5%;
- apă distilată;
- extract de urează;
- R Nessler;
- soluție alcoolică fenolftaleină 1% în alcool 70%.

Mod de lucru
În 6 eprubete se aduc:
Reactivi (ml) 1 2 3 4 5 6
Uree 2% 2 2 - - - -
Tiouree 2,5% - - 2 2 - -
H2O2 - - - - 2 2
Extract urează 1 1 1 1 1 1

Eprubetele se aduc în baie de apă timp de 10-15 minute și după răcire se adaugă:
Reactivi 1 2 3 4 5 6
R Nessler 0,2 - 0,2 - 0,2 -
Fenolftaleină (picături) - 2 - 2 2

Concluzii

E1: Reacție pozitivă. (explicată la evidențierea efectului catalitic al emzimelor)

E2: Reacție pozitivă. Fenolftaleina se colorează în mediul alcalin în roz până la roșu intens. NH 3 este o
bază.
E3: Reacție negativă. Precipitatul brun este datorat existenței sulfului în structura tioureei.
E4: Reacție negativă. Nu am identificat mediul alcalin.
E5 și E6: Etalon.
Deoarece am folosit cea mai apropiată soluție ca structură și nu am obținut un rezultat asemănător,
am demonstrat specificitatea absolută de substrat a enzimelor.

LP4: Studiul scindării enzimatice a proteinelor

Proteine: - dimensiune – KDa → necesită scindare;

- 20 aminoacizi esențiali → produc proteine;
În funcție de locul în care enzimele proteolitice scindează proteinele, proteazele se clasifică în:
-exoproteaze: realizează tăierea la capătul lanțului polimeric. Reultă un aminoacid și un lanț polipeptidic.
-endoproteaze: atacul enzimatic are loc în interiorul lanțului polimeric. Rezultă 2 lanțuri polipeptidice.

Scop: Analiza comparativă a vitezei de degradare enzimatică a proteinelor.

Materiale
- albumină;
- caseină;
- gelatină;
- enzimă proteolitică (protează);
- ninhidrină.

Mod de lucru
Se va studia procesul de scindare enzimatică a 3 proteine în prezența proteazei astfel:

1) Se prepară 3 soluții de 10 g/l proteină prin dizolvarea proteinelor menționate în apă distilată (100 ml).
2) Se agită soluțiile pe plite cu agitare magnetică 10-15 minute pentru solubilizare.
3) Soluțiile se filtrează și în soluția limpede se adaugă 0,5 g enzimă.
4) Recipientele sunt ținute în permanență pe plita cu agitare magnetică.
Pentru urmărirea evoluției procesului din 20 în 20 minute se va doza o concentrație de aminoacizi
eliberați din structura proteinei sub acțiunea proteazei.

Dozarea aminoacizilor
Se realizează prin metoda spectrofotometrică cu ninhidrină.
Ninhidrina reacționează cu aminoacizii liberi formând un complex colorat albastru-violet (soluția
inițială de ninhidrină este galbenă).
Acest compus colorat este spectrofotometrabil prezentând un maxim de absorbție la 570 nm
(domeniu vizibil).
Deoarece ninhidrina nu reacționează cu proteina nedegradată, ci doar cu aminoacizii eliberați,
intensitatea culorii compusului obținut va fi direct proporțională cu aminoacizii eliberați din lanțul
proteic.
Dozarea aminoacizilor se efectuează prin adăugarea într-o eprubetă a 5 ml probă și 5 ml
ninhidrină, și încălzirea acesteia în baie de apă la fierbere timp de 5 minute.
După răcire la temperatura camerei și filtrare se citește absorbanța compusului format la 570 nm.
În prealabil, se trasează dreapta etalon sau se etalonează spectrofotometrul.
În final se reprezintă grafic concentrația aminoacizilor eliberați din cele 3 soluții de enzimă.

albumină
}
caseină + protează → aminoacizi +...+ lanț polipeptidic
gelatină
Dozarea aa: metoda spectrofotometrică: 5 ml probă + 5 ml ninhidrină →t°C(pe baia de apă)→A (570 nm)
Din absorbanța totală aparatul scade absorbanța ninhidrinei și măsoară doar absorbanța aminoacizilor.

A↓ / timp → 15’ 30’ 45’

Albumină 2,711 3,350 2,955
Caseină 0,017 0,954 1,670
Gelatină 0,008 1,692 2,878

Variația este media aritmetică a valorilor obținute.

Concluzii
Variațiile sunt crescătoare → concentrația aminoacizilor eliberați prin scindare enzimatică crește
în timp. Variația va crește pânîă se degradează complet proteina. Variația nu scade.
Comparativ, albumina a eliberat mai repede aminoacizi, față de caseină și gelatină, iar gelatina
mai repede decât caseina.
 LP5: Studiul evoluției în timp a unei culturi de drojdie

În general drojdiile sunt microorganisme eucariote clasificate ca membri ai regnului fungi. Se

cunosc peste 1500 de specii, acestea reprezentând doar 1% din toate speciile de fungi cunoscute.
Din punct de vedere structuraș, drojdiile sunt microorganisme de diemnsiuni mici care variază
substanțial de la o specie la alta. În general diametrul acestora este cuprins între 3-10μm.
Microorganismul Saccharomyces cerevisiae (drojdia de bere) este unul dintre cei mai studiați
membri ai acestei specii.
! Obligatoriu voi și denumirea acestui microorganism!

Celulele S. cerevisiae prezintă o structură asemănătoare celulelor animale, ele fiind constituite din:
- perete celular;
- membrană celulară;
- citoplasmă;
- nucleu;
- reticol endoplasmatic;
- organite celulare: - aparat Golgi;
- mitocondrii;
- vacuole;
- vezicule secretorii.
Studierea gradului de distrugere celulară reprezintă de fapt studierea procesului de degradare a
membranei celulare în vederea eliberării conținutului citoplasmatic.
Trebuie să se țină cont de câțiva factori care pot influența major performanța procesului:
- localizarea produsului util;
- efectele enzimatice sau fizico-chimice ale conținutului celular asupra membranei și peretelui celular;
- conținutul și proprietățile structurale ale membranei și peretelui celular.

Scop: Se va urmări în timp evoluția unei culturi celulare de S. cerevisiae sub acțiunea unor diverși factori.

Mod de lucru
1) Se prepară 2 soluții 100 g/l 50 ml de drojdie în apă distilată.
2) În una dintre acestea se adaugă din 10 în 10 minute câte 5 g glucoză. După adăugare se omogenizează
cu atenție soluția.
3) Cea de-a 2-a soluție va fi supusă degradării cu ajutorul unui vortex. Se va urmări gradul de distrugere
la diferite valori de turații.
4) În final se vor reprezenta grafic evoluțiile în timp a celor 2 culturi celulare.
Pentru a urmări procesul de transformare celulară se va utiliza microscopul optic.

Număr celule Influența glucozei Influența turației

Proba inițială 136 136
Proba 1 5 g - 179 2000 - 81
Proba 2 10 g - 184 3000 - 68
Proba 3 15 g - 194 5000 - 15