4.

Gating

Procesul de gating (termen intraductibil în română ~ cele mai

apropiate aproximaţii ar fi activare sau comandă) reprezintă probabil
cel mai important grup de proprietăţi ale canalelor ionice, care asigură
extraordinara diversitate a funcţiilor lor. Gatingul se referă la
modularea căii de permeaţie (porul hidrofil) prin modificări
conformaţionale ale subunităţilor constituente, asemănător deschiderii
şi închiderii unor porţi. Ideea este formulată iniţial de Hodgkin şi
Huxley, pornind de la constatarea că, la variaţii bruşte de potenţial,
conductanţele Na+ şi K+ au o reacţie instantanee lineară, însă sunt
modulate de o serie de procese cu cinetică lentă (ms) declanşate de
variaţii de potenţial, numite activare şi inactivare. În funcţie de stimulul
care determină activarea se poate realiza o clasificare funcţională a
canalelor ionice. Distingem două categorii principale: canale activate
de voltaj (voltage-gated) şi activate de ligand (ligand-gated). În plus, în
structura diferiţilor receptori întâlnim şi canale activate de alţi stimuli:
mecanici, termici, chimici (de exemplu, variaţii ale pH extracelular).

4.1 Tehnica patch-clamp

Pe parcursul ultimilor 60 ani asistăm în biofizică la o dezvoltare

inimaginabilă a metodelor de evidenţiere şi studiere a proprietăţilor
canalelor ionice la nivel microscopic. Problema se înscrie într-o
categorie mai largă, şi anume determinarea corelaţiilor între
proprietăţile macroscopice, la nivelul unui ansamblu statistic, şi cele
microscopice, obţinute prin măsurători directe pe o singură moleculă,
în condiţii staţionare sau non-staţionare.
Prima evidenţiere a caracterului discret, discontinuu, al fluxurilor ionice
transmembranare pasive a fost realizată în anii ‘60-’70 printr-o metodă
statistică foarte elegantă numită analiza fluctuaţiilor. Metoda a fost
iniţiată de Verveen şi Derksen, continuată de Katz şi Miledi, Stevens,
DeFelice, Neumcke, pe curenţii de placă motorie activaţi de ACh, şi pe
canalele de Na+ sensibile la amilorid din epitelii de Lindemann, Van
Driessche, Helman şi Baxendale. Ea se bazează pe calcularea varianţei
curentului printr-un ansamblu statistic de canale menţinute în voltage-
clamp, pentru n eşantioane:

1 n
2
∑x 2
2 x ∑ xi 1 
σ i2 = ∑ ( xi − x ) =
n i =1 n
i
−
n
+ x 2 =  ∑ xi2  − x 2
n 
Considerând că fiecare din cele N canale ale ansamblului are aceeaşi
probabilitate a stării deschise, p, şi acelaşi curent unitar, i, obţinem
următoarele expresii pentru varianţa curentului şi pentru curentul

σ i2 = Npi 2 − Np 2 i 2 = Np (1 − p )i 2 I = Npi
macroscopic mediu I:
Din aceste expresii se poate calcula valoarea curentului unitar i şi a
densităţii de canale N, dacă se estimează corect probabilitatea stărilor
de non-conductanţă.
În plus, dacă relaxările din fluctuaţii sunt monoexponenţiale, spectrul
de putere al transformatelor în frecvenţă ale înregistrărilor are o formă

S ( 0)
S( f ) =
1 + ( 2πfτ ) 2
Lorentziană:
unde τ reprezintă constanta de timp a relaxării, la fel ca în modelul
Hodgkin-Huxley:

1 1
τ= =
α + β 2πf c

Fig. 4.1 Fluctuaţii de curent induse de ACh la nivelul plăcii motorii menţinute în
voltage clamp, prin deschiderea aleatoare a receptorilor nicotinici. În dreapta,
densitatea spectrală de putere obţinută prin transformarea Fourier a semnalului
de curent, fitată cu funcţii Lorentz. Se observă creşterea corner frequency (fc) la
creşterea temperaturii sau la depolarizare.
Fig 4.2 Curenţii de gating ai canalelor de Na+ înregistraţi la nivelul axonului
gigant de calmar. În timp ce curentul de gating de tip ON are o cinetică mai
rapidă decât curentul ionic, cel de tip OFF are exact aceeaşi cinetică, ceea ce
demonstrează efectul de imobilizare a sarcinii de gating prin inactivare.

O altă tehnică de studiu rafinată a proceselor de gating dezvoltată în

anii ’70 se bazează pe ipoteza lui Hodgkin şi Huxley, şi anume
existenţa unor “sezori de voltaj”, a căror deplasare în câmpul electric
transmembranar intens (estimat la 80 mV/40 Å = 20,000,000 V/m)
trebuie să genereze un minuscul curent electric, numit curent de
gating. Considerând valoarea sarcinii echivalente de gating, calculată
de Hodgkin & Huxley, de aproximativ 6 sarcini elementare/canal,
putem estima din intensitatea curenţilor de gating densitatea de
canale. Înregistrarea acestor curenţi este dificilă, deoarece au o
cinetică rapidă şi o intensitate cu câteva ordine de mărime mai mică
decât a curenţilor ionici, deci este necesară înlăturarea acestora din
urmă cu ajutorul unor blocanţi peptidici puternici (neurotoxine, precum
TTX sau STX), care să nu afecteze însă modificările conformaţionale
induse de variaţiile de voltaj. În plus, curenţii de leakage prin
conductanţe de background şi tranzienţii capacitivi pot fi eliminaţi prin
aplicarea a două pulsuri de voltaj egale şi de sens contrar, pornind de
la aceeaşi valoare de holding, şi sumarea ulterioară a celor două
înregistrări, ce duce la anularea acestor componente datorită
proprietăţilor lor de simetrie. De aceea, curenţii de gating au fost
denumiţi şi asymmetry (nonlinear) capacitive transients. Pentru
decelarea lor este necesară în plus medierea coerentă a mai multor
înregistrări, ceea ce duce la anularea zgomotului din diferite surse, a
cărui distribuţie este aleatoare, deci valoarea medie în fiecare moment
tinde la 0, în timp ce semnalul util este “amplificat” cu fiecare
înregistrare adăugată.
Metoda a fost dezvoltată pe sisteme cu o densitate mare de canale: pe
receptorii dihidropiridinici din tubulii transversali ai muşchilor scheletici
de Schneider & Chandler, şi pe de acum clasicul axon gigant de calmar
de Keynes & Rojas şi Armstrong & Bezanilla. Un exemplu de aplicaţie îl
reprezintă descoperirea efectului de imobilizare a sarcinii de gating de
tip OFF: în timp ce curentul de gating de tip ON are o cinetică mai
rapidă decât curentul ionic de Na+, cel de tip OFF are aceeaşi
constantă de timp de relaxare ca şi curentul ionic, deci trecerea
canalelor de Na+ într-o stare de non-conductantă după activare duce la
blocarea senzorilor de voltaj.
O altă categorie de metode sunt cele de evidenţiere directă a
fluctuaţiilor unitare de conductanţă obţinute prin activitatea canalelor
ionice. Primele “salturi de conductanţă” au fost observate în 1969 de
Bean et al. prin încorporarea unei proteine bacteriene, purificată de
Müller et al. (1962), numită EIM (excitability-inducing material), în
bistraturi lipidice. Un progres a fost trecerea la gramicidină, un
antibiotic polipeptidic de origine microbiană (Hladky & Haydon, 1972),
a cărei importanţă ca model molecular de permeaţie a fost discutată în
capitolul precedent. Ulterior şi alte canale ionice izolate în lipozomi au
fost încorporate în bistraturi artificiale.
Însă cea mai importantă modernizare a metodelor electrofiziologice a
fost adusă de tehnica patch clamp (în traducere ad literam “petic
fixat”), iniţiată de un grup de biofizicieni germani: B. Sakmann, E.
Neher, F. Sigworth, O. Hamill, şi continuată de un grup din ce în ce mai
larg de entuziaşti. Primele experimente relevante (1976) au constat în
înregistrarea curenţilor uni-canal (această variantă poartă numele de
single-channel recording) prin receptorii nicotinici de ACh de pe placa
motorie de broască prin presarea unei pipete cu vârful polizat termic
conţinând suberyldicholină, un analog sintetic al ACh. În 1980 metoda
este îmbunătăţită substanţial prin aplicarea unei presiuni negative
(sucţiune) în pipetă, ceea ce duce la realizarea unui contact intim între
bistratul lipidic şi sticlă în zona vârfului (gigaseal), ducând la creşterea
rezistenţei de izolaţie de la câteva zeci de MΩ la peste 1 GΩ, ceea ce
duce la o rezoluţie foarte bună a fluctuaţiilor unitare de conductanţă
ale canalului/canalelor active din peticul de membrană astfel delimitat.
Fig. 4.3 Circuitele electronice folosite în metoda patch-clamp. În stânga,
principiul de funcţionare al convertorului I-V: putem fixa potenţialul la nivelul
pipetei aplicând o tensiune variabilă pe o rezistenţă de feedback (Rfeedback) şi
măsurând eroarea cu un instrument foarte sensibil. Aceasta acţiune este
realizată de un amplificator diferenţial cu tranzistoare FET în etajul de intrare,
cu curenţi de poartă extrem de mici, deci curentul prin pipetă este egal cu
curentul de feedback. Astfel, tensiunea la ieşire este IpipetteRfeedback. În dreapta,
circuitul electric echivalent al membranei şi convertorului I-V.

Această incredibilă realizare este un rezultat al apariţiei unei noi

generaţii de amplificatoare operaţionale, având în etajul de intrare
tranzistoare cu efect de câmp, al căror curent de poartă este redus la
doar 0.5-10 pA. O analiză a surselor de zgomot din etajul de intrare
(headstage) identifică 3 tipuri diferite:
- zgomotul termic (thermal noise) datorat agitaţiei termice a
purtătorilor mobili de sarcină, descris în anii 1920 de Johnson şi
Nyquist. Acesta este independent de frecvenţă (zgomot alb) şi
Gaussian, având o densitate de putere proporţională cu

S (2Hz ) = ( 4k BT ) / R
temperatura absolută a mediului:
Valorile medii pătratice (rms(BW)) pentru o bandă de 10 KHz sunt 0.4 pA
pentru 1 GΩ, 0.13 pA pentru 10 GΩ, 0.04 pA pentru 100 GΩ; astfel se
explică avantajul adus de îmbunătăţirea rezistenţei de izolaţie (Rseal sau
Rshunt) şi de reducerea suprafeţei de membrană a patchului (creşte Rm şi
scade Cm)
- zgomotul "de împuşcături” (shot noise) datorat caracterului
discontinuu al mişcării purtătorilor individuali de sarcină. El este tot
independent de frecvenţă şi Gaussian, având o densitate spectrală
de putere:

S(2Hz ) = 2 Iq

unde q este sarcina electrică elementară (1.6·10-19 C). Sursa este

curentul de leakage al porţilor tranzistoarelor cu efect de câmp, de
aceea amplificatorul de headstage trebuie ales cu grijă, astfel încât
biasul intrărilor să fie minim. Un curent de poartă de 5 pA generează o
densitate spectrală a zgomotului de împuşcături echivalentă cu
zgomotul termic al unui rezistor de 10 GΩ
- zgomotul de voltaj al amplificatorului poate fi modelat introducând
două surse de eroare de voltaj (Ver(+) şi Ver(-)) în serie cu voltajele de
intrare (V+ şi V-). Astfel, voltajul de ieşire:

Vout = G{[ V+ +Ver ( +) ] −[V− +Ver ( −) ]}

va conţine fluctuaţii proporţionale cu Ver(+) şi Ver(-), care se vor reflecta în

ifeedback. Dacă feedbackul ar fi pur rezistiv, zgomotul if ar fi redus. Însă
datorită prezenţei unor capacităţi în paralel pe intrare şi pe Rf,
impedanţa scade la frecvenţe înalte, amplificând zgomotul de voltaj la
ieşire. Densitatea spectrală de putere a zgomotului de voltaj al

S (2BW ) = ( 2πCinput Ver BW ) 2

amplificatorului este:
Fig. 4.4 Contribuţia diferitelor surse de zgomot la zgomotul total. În cazul
bistraturilor, datorită capacităţii mai mari, zgomotul de voltaj creşte la frecvenţe
înalte, ceea ce limitează lărgimea de bandă, deci metoda poate fi aplicată doar
la studiul canalelor cu cinetică mai lentă. În dreapta, etapele procesării
semnalului de curent în metoda patch clamp: datorită benzii de trecere limitate
a convertorului I-V, este necesar un high frequency boost stage care să
corecteze atenuarea frecvenţelor înalte, urmat de un low-pass filter.

ceea ce limitează lărgimea de bandă a înregistrărilor, în special la

valori mari ale Cinput. Capacitatea de intrare poate fi redusă tot prin
reducerea suprafeţei patchului. În plus, acoperirea pipetei în regiunea
vârfului cu un elastomer (Sylgard) reduce capacitatea prin creşterea
grosimii dielectricului şi prin suprafaţa exterioară hidrofobă.
Valoarea mare a rezistenţei de feedback limitează banda de ieşire a
primului etaj, de aceea este nevoie de un circuit activ care să
compenseze atenuarea la frecvenţe înalte (boost stage), pentru a nu
pierde evenimentele rapide. În plus, sunt necesare două circuite
suplimentare de compensare, unul pentru anularea tranzienţilor
capacitivi şi altul pentru compensarea căderii de tensiune pe rezistenţa
serie.
Semnalul refăcut de boost stage trebuie filtrat înainte de conversie şi
stocare, pentru a reduce zgomotul de frecvenţă înaltă, care altfel ar
masca deschiderile reale ale canalelor. Majoritatea amplificatoarelor
comerciale au încorporate filtre active a căror frecvenţă de tăiere (fcut =
frecvenţa la care puterea este redusă la 1/2, echivalent cu -3 dB) este
ajustabilă. Se folosesc de obicei filtre Bessel, care au un timp de
creştere (trise) mai scurt şi nu dau overshoot. Datorită caracteristicii de
răspuns a filtrelor, evenimentele scurte sunt pierdute sau
distorsionate. tdead defineşte durata unui eveniment pentru care
semnalul filtrat atinge 1/2 din amplitudinea reală, deci este omis de
protocoalele de detecţie uzuale (50% threshold crossing). El poate fi
corelat cu timpul de creştere trise (definit ca reciproca pantei
răspunsului la un semnal treaptă la jumătatea amplitudinii). Pentru un
filtru Gaussian (modelul teoretic de filtru cel mai folosit datorită
proprietăţilor matematice speciale ale funcţiilor sale de răspuns):

t dead = 0.538 t rise = 0.179 / f cut

O altă constantă de timp importantă legată de intervalul de

eşantionare tsamp este durata unui semnal de intrare pentru care
valoarea de ieşire depăşeşte pragul de 50% pentru un interval de timp
egal cu tsamp. Aceasta poartă denumirea de tall, deoarece evenimentele
având o durată mai mare sau egală cu ea sunt întotdeauna detectate

Fig. 4.5 Distorsionarea duratei evenimentelor elementare în funcţie de

răspunsul treaptă al filtrului şi frecvenţa de eşantionare. A, evenimentele cu
durata reală < tdead nu ating pragul de detecţie de 50 %. B-D, evenimentele mai
lungi decât tdead pot fi detectate, dar durata lor va fi măsurată distorsionat dacă
sunt mai scurte decât timpul de creştere al filtrului, trise. E- F, evenimentele > trise
sunt măsurate corect.
prin algoritmul descris. Dacă se alege tsamp = tdead, evenimentele cu
durata între 1-2 tdead vor fi măsurate distorsionat după eşantionare
(durata măsurată mai mică decât cea reală), în timp ce evenimentele
cu durata mai mare de 2 tdead vor fi măsurate corect. Aceste
considerente sunt importante în alegerea adecvată a frecvenţei de
eşantionare şi a caracteristicii filtrului în funcţie de cinetica
evenimentelor pe care dorim să le înregistrăm, precum şi pentru
eventuala corecţie pentru evenimente reale pierdute.
O altă corecţie ce poate fi aplicată atunci când raportul semnal/zgomot
este semnificativ este înlăturarea evenimentelor false. Se poate defini
o rată a evenimentelor false (= ½ false threshold crossings – FTC) în
funcţie de frecvenţa de tăiere a filtrului şi valoarea medie pătratică în
banda de filtrare a zgomotului de curent:

FTC = 2kf cut exp( −ithresh

2
/ 2rms (2BW ) )

unde parametrul k variază în funcţie de tipul de zgomot, de la 0.849

pentru zgomotul alb la 1.25 pentru zgomotul de tip f2. O estimare
simplă a frecvenţei evenimentelor false se poate obţine alegând un
prag de 50% de partea opusă a liniei de bază faţă de evenimentele
reale.
Este dificil să trecem în revistă în spaţiul restrâns al acestei prezentări
larga varietate de aplicaţii ale metodei patch clamp. Ne vom limita la a
prezenta pe scurt principalele configuraţii de înregistrare, aşa cum au
fost descrise de Erwin Neher. Configuraţia de pornire se numeşte cell-
attached. De aici se poate fie retrage pipeta, excizând un patch inside-
out (deşi adeseori se formează vezicule ce pot fi sparte prin scoaterea
pipetei în aer şi reintroducerea ei în baie), fie se poate perfora peticul
de membrană (prin sucţiune, electroporare sau aplicarea unui ionofor,
de exemplu nystatin sau amfotericină), intrând astfel în configuraţia
whole cell. Aceasta este echivalentă cu o abordare folosind
microelectrozi intracelulari, însă prezintă un număr de avantaje, între
care: rezistenţa de shunt este foarte mare, egală cu rezistenţa sealului,
rezistenţa serie este redusă deoarece se folosesc pipete largi (~ 3 MΩ),
se pot controla concentraţiile ionice intracelulare şi se pot aplica în
pipetă diverşi agenţi farmacologici cu acţiune asupra căilor de
semnalizare intracelulară sau markeri. Prin retragerea pipetei din
whole cell se formează un nou patch, cu faţa externă a membranei
expusă la exterior, numit outside-out, configuraţie ideală pentru studii
farmacologice ale compuşilor ce acţionează din exterior.
 Fig. 4.6 Variante de
experimente utilizând tehnica
patch-clamp (după E. Neher).

Merită semnalate şi dezvoltările tehnologice recente – metoda patch

on a chip – în care pipeta este înlocuită de o serie de perforaţii cu
geometrie controlată pe suprafaţa unei plăcuţe de cuarţ. Pe faţa
superioară a plăcuţei se depune o suspensie de celule, care vor
sedimenta acoperind orificiile. Ulterior se aplică o sucţiune de pe faţa
interioară şi se scanează reţeaua de electrozi corespunzători fiecărui
orificiu, identificând sealurile adecvate penru înregistrări. Această
procedură simplifică extrem de mult etapele de preparare, oferind un
randament foarte înalt (high throughput) necesar în studiile de
screening întreprinse de companiile farmaceutice în dezvoltarea de noi
compuşi bioactivi.
4.2 Modele cinetice de gating: Markov şi fractale

O problemă matematică incitantă deschisă de realizarea înregistrării

fluctuaţiilor unitare de conductanţă prin canale ionice este
determinarea unui model cinetic adecvat care să descrie corect
comportamentul sistemului real într-o varietate cât mai largă de
condiţii experimentale. Frumuseţea şi, în acelaşi timp, dificultatea
subiectului constau în faptul că nu există soluţii unice, de aceea trebuie
definite criterii precise de comparare a diferitelor modele şi alegere a
modelului optim.
O primă etapă în analiza unei înregistrări single-channel (în afară de
corectarea liniei de bază, stabilirea numărului de canale şi de stări de
conductanţă şi evaluarea stabilităţii) este detectarea evenimentelor
reale, determinarea duratei lor – stocată într-un fişier numit listă de
evenimente – urmată de generarea unei histograme a densităţii de
probabilitate de tranziţie în funcţie de timpul de viaţă petrecut în
starea respectivă. De fapt histogramele nu reprezintă direct funcţia de
densitate de probabilitate de tranziţie (pdf), ci o aproximare a ei, şi
anume numărul de evenimente care au duratele în limitele unui scurt
interval de valori de timp numit bin. Nu întâmplător, pentru bini de
durate egale histograma are o alură mono- sau multiexponenţială,
corespunzătoare unei singure stări sau unor stări multiple cu timpi de
viaţă diferiţi corespunzătoare nivelului de conductanţă reprezentat. Se
poate demonstra că duratele medii de viaţă ale stărilor respective sunt
proporţionale cu constantele de timp ale exponenţialelor din
histogramă. Frecvent, distribuţiile pdf ale timpilor de viaţă
corespunzători nivelurilor de conductanţă sunt monoexponenţiale, iar a
celor corespunzători nivelului de nonconductanţă multiexponenţiale,
ceea ce corespunde unei singure stări deschise şi mai multor stări
închise. Pentru o identificare mai uşoară a diferitelor constante de timp
dintr-o distribuţie multiexponenţială se folosesc bini de durate inegale,
Fig. 4.7 Diferite tipuri de reprezentare a histogramelor densităţii de
probabilitate a tranziţiilor. A, reprezentarea clasică, cu scale lineare pentru timp
şi numărul de evenimente pe bin: componentele exponenţaile cu pondere mai
mică sunt greu de observat. B, reprezentare logaritmic-lineară, în care cele
două componente exponenţiale se disting clar, dar erorile (reprezentate în
graficul de sus) sunt neuniform distribuite. C, reprezentare logaritmic-radical, ce
duce la uniformizarea erorilor pe toată lungimea scalei de timp, este varianta
utilizată în mod curent pentru histogramele pdf.

reprezentând o scală de timp logaritmică. În plus, scala verticală a

histogramelor pdf poate fi transformată printr-o funcţie rădăcină
pătrată, ceea ce asigură o distribuţie uniformă a erorilor pe întreaga
scală de timp, deci o distorsionare redusă a reprezentării.
Cel mai folosit model statistic pentru descrierea cineticii de gating a
canalelor ionice este lanţul de evenimente discrete aleatoare descris
de matematicianul rus Andrey Markov, bazat pe următoarele reguli:
- există un număr redus de stări distincte ale sistemului
- într-o anumită stare, probabilităţile de tranziţie sunt independente
de stările prin care a trecut sistemul anterior (sistemul nu are o
“memorie” a stărilor anterioare)
- probabilitatea de tranziţie de la o stare la alta este independentă de
timpul de viaţă petrecut în starea respectivă.
Cu ajutorul acestui set de restricţii se poate demonstra că timpul de
viaţă al unei stări are o distribuţie exponenţială. Considerând
probabilitatea ca sistemul să se afle într-o anumită stare la momentul
t, R(t), şi rata de tranziţie α (independentă de timp), putem calcula
probabilitatea ca sistemul să rămână în aceeaşi stare după un interval
de timp ∆ t:
 R (t + ∆t ) = R (t )[1 −α∆t − o(∆t )]

unde o(∆ t) este probabilitatea unor tranziţii multiple cu revenire în

starea iniţială. Prin împărţire la ∆ t când ∆ t → 0 obţinem:

dR (t ) / dt = −αR (t )[ −o( dt ) / dt →0] ⇒ R (t ) = exp( −αt )

Spre deosebire de modelul Markov, modelul fractal consideră rate de

tranziţie dependente de timp:

k (t ) = At 1−D

unde D este un număr între 1 şi 2 denumit dimensiune fractală

(evident, pentru D = 1 se revine la modelul Markov). Modelul fractal
porneşte de la presupunerea unui număr foarte mare de conformaţii
ale proteinei-canal, sistemul circulând în permanenţă de la una la alta.
Astfel, pe măsură ce trece timpul după o modificare conformaţională,
sistemul se îndepărtează din ce în ce mai mult de conformaţia iniţială,
favorabilă tranziţiei, deci probabilitatea de revenire în această
conformaţie urmată de tranziţie scade. Pe lângă problema unor rate de
tranziţie infinite la t = 0, s-a constatat că în multe cazuri modelele de
tip Markov fitează mai bine distribţiile pdf decât cele fractale.
Un test suplimentar al independenţei stărilor este analiza corelaţiilor, în
care se poate reprezenta densitatea de probabilitate a duratei unei
stări în funcţie de durata stării/stărilor precedente. Prin aplicarea
metodei s-a demonstrat că stările lungi de non-conductanţă sunt
precedate de deschideri scurte.
O modalitate diferită de abordare a inferării unui model cinetic
superpozabil unei înregistrări sau unui întreg set de înregistrări single-
channel este calcularea matricilor Q. Pornind de la un model cu n stări,
se poate construi o matrice ai cărei coeficienţi kij definesc ratele de
tranziţie între stări. Cu ajutorul ei se poate calcula probabilitatea

n
L(t1...t n ) = π 0 Π...Gij (tl )... 1
l =1
(likelihood) realizării întregii succesiuni de evenimente observate
experimental sau generate de un model computerizat:
în care termenii Gij sunt matrici ale căror elemente ij reprezintă
densitatea de probabilitate a menţinerii stării i pentru un interval de
timp ti (R(ti)),urmată de tranziţia în starea j:

Gij (ti ) = R (ti −ξ)Qij exp( Qij ξ)

ξ reprezintă intervalul standard de tranziţie, definit de Ball & Sansom

(1988). Maximizarea probabilităţii se realizează prin metodele
variaţionale uzuale (de exemplu algoritmul simplex). O implementare
eficientă a metodei a fost realizată de un grup din Departamentul de
Fiziologie şi Biofizică al Universităţii de Stat din New York la Buffalo,
condus de F. Sachs şi A. Auerbach, sub forma pachetului software QuB.
Acesta introduce segmentarea înregistrărilor şi un algoritm recursiv de
reestimare a parametrilor.
Tot pe matrici Q se bazează şi metoda modelelor Markov ascunse
(hidden Markov models – HMM). Aceasta consideră o matrice A a
probabilităţilor de tranziţie la intervale de timp discrete, egale cu
intervalul de eşantionare, aij=exp(kij∆ t) , şi calculează probabilitatea
modelului pentru toate secvenţele de evenimente posibile Si (secvenţa
reală este incertă datorită suprapunerii unei surse de zgomot alb,
Gaussian):

L = ∑P ( data , Si A) = ∑P ( data Si ) P ( Si A)
all S all S

4.3 Activarea dependentă de voltaj şi dependentă de ligand

Existenţa a două forme fundamentale de manifestare a materiei,

substanţa şi câmpul electromagnetic, a generat de-a lugul secolelor şi
în biologie discuţii aprinse asupra naturii propagării informaţiei în
organismele vii. Atât în domeniul propagării influxului nervos cât şi în
transmiterea sinaptică au apărut grupuri de susţinere fie a ipotezei
electrice fie a celei chimice. Faimoasele studii ale lui Hodgkin, Huxley şi
Katz din anii 40’ au clarificat prima dintre probleme, arătând că
potenţialul de acţiune al nervului reprezintă o succesiune de reacţii
chimice (modificări de permeabilitate prin deschiderea unor “porţi”) ale
căror rate de reacţie sunt controlate de potenţialul transmembranar
după o distribuţie Boltzmann cu două niveluri de energie. Deşi la
vremea respectivă nu au putut furniza un mecanism molecular exact al
activării conductanţelor de Na+ şi K+, Hodgkin şi Huxley au calculat
aşa-numita sarcină echivalentă de gating, definită drept sarcina care s-
ar deplasa pe întreaga întindere a câmpului electric transmembranar
(de pe o faţă a membranei pe cealaltă) pentru a deschide o poartă. Din
faptul că fracţiunea de conductanţă activată în funcţie de amplitudinea
depolarizării atinge o pantă maximă de 3.9 mV/creştere de e ori a gNa şi
4.8 mV/creştere de e ori a gK, folosind distribuţia:

O 1
=
O +C 1 + exp[( w − z g eE ) / k BT ]

deducem că zg = 24 mV/3.9 mV = 6.15 sarcini elementare pentru gNa+

şi 5 sarcini elementare pentru gK. Determinări ulterioare au plasat zg
pentru Na+ la aproximativ 12 sarcini elementare. O altă predicţie
extrem de importantă a modelului Hodgkin-Huxley este necesitatea
deschiderii independente a 4 porţi pentru activarea gK, ce prefigurează
arhitectura homotetramerică a canalelor de K+ dependente de voltaj.
Existenţa senzorilor de voltaj a fost pusă în evidenţă direct prin
înregistrarea curenţilor de gating, descrisă anterior. După secvenţierea
urmată de clonarea canalelor de Na+ dependente de voltaj, şi
realizarea faptului că fiecare din cele patru subunităţi are şase domenii
transmembranare (S1-S6), au fost întreprinse studii de mutageneză
pentru a dovedi că reziduurile pozitive înalt conservate din S4 (arginină
şi lizină, repetate la fiecare a treia poziţie) reprezintă senzorul de
voltaj. Ţinând seama de multiplicitatea stărilor închise, Almers (1978) a
postulat că panta maximă a activării, numită de el sensibilitate
Fig. 4.8 Studiu comparativ de aliniere a secvenţelor segmentului S4, cu
evidenţierea reziduurile pozitive R şi K conservate, ce constituie senzorul de
voltaj. În dreapta, experimentele de mutageneză punctiformă cu neutralizarea
sarcinii scad sarcina echivalentă de gating (zg), iar cele cu conservarea sarcinii
menţin sau cresc zg.

logaritmică la potenţial, nu poate fi măsurată corect decât la potenţiale

foarte negative, pentru că odată cu depolarizarea apare o acumulare a
sarcinii în stări închise intermediare. Folosirea acestor potenţiale
implică măsurarea unor probabilităţi ale stării deschise foarte mici (10-
3
–10-4), sau folosirea unor modele de gating multistare care să poată fi
extinse dincolo de limita observaţiilor experimentale. O altă dificultate,
evidenţiată tot de Almers, este distorsionarea măsurătorilor prin
inactivare rapidă – aceasta poate fi însă înlăturată. În fine, există o
metodă directă de determinare a sarcinii de gating, independentă de
model: evaluarea sacinii totale obţinută prin integrarea curentului de
gating de tip ON şi împărţirea la numărul de canale, estimat prin
diverse metode. Primele studii de mutageneză ale reziduurilor pozitive
din S4, întreprinse de echipa lui Walter Stühmer, au stabilit că
neutralizarea primelor patru poziţii externe reduce corespunzător zg.
Transformarea unei arginine în histidină (R1448H) face ca gatingul să
devină dependent de pH, datorită tranziţiei între forma protonată,
încărcată pozitiv, la pH 6.2, şi forma neutră la pH 7.8. Transformarea
aceluiaşi reziduu în cisteină face ca el să fie accesibil pentru reactivi
MTS aplicaţi fie pe faţa intracelulară, la hiperpolarizare, fie pe faţa
extracelulară, la depolarizare. Deci reziduul respectiv străbate complet
membrana. Studii ulterioare ale lui F. Bezanilla prin metode optice
(FRET – fluorescence resonance energy transfer = transferul unui foton
de la un fluorofor la altul, a cărui eficienţă depinde de distanţa între
cele două molecule) au stabilit că domeniul S4 suferă de fapt o rotaţie

la activare, transferând reziduurile pozitive de la interstiţiul format de

Fig. 4.9 Activarea senzorilor de potenţial ai canalelor voltage-gated constă
într-o mişcare de rotaţie a domeniului S4, cu translocaţia reziduurilor încărcate
pozitiv din crevasa internă, in contact cu mediul intracelular, în crevasa
externă, în contact cu mediul extracelular (din Hille 2001).
S1 şi S5 (crevasa internă) la cel format de S2 şi S3 (crevasa externă). O
altă dovadă a acestui mecanism este apariţia unui carrier de protoni
prin mutarea reziduurilor de pe S4 în histidină şi blocarea curentului
ionic – protonii circulă în sensul gradientului de concentraţie.
Coeficientul termic al acestui curent de protoni (Q10) este mai aproape
de cel al proceselor de gating decât de cel al difuziei libere.
Spre deosebire de gatingul prin voltaj, gatingul prin ligand foloseşte un
mecanism diferit pentru a declanşa modificările conformaţionale
premergătoare deschiderii căii de conductanţă: interacţiunea cu un
compus chimic. Există o largă categorie de canale ionice ligand-gated,
care îndeplinesc roluri esenţiale în comunicarea inter- şi intracelulară.
Ele realizează transmiterea şi modularea sinaptică, recepţia unor
semnale chimice, sau intervin în căi ale mesagerilor secunzi. O
categorie aparte o reprezintă gatingul prin Ca2+ intracelular şi prin pH,
care vor fi tratate separat.
La originea studiilor biofizice asupra transmiterii sinaptice se află
lucrărille lui Fatt & Katz (1951), care au studiat proprietăţile
potenţialelor de placă terminală miniaturale (MEPPs) de la nivelul plăcii
motorii musculare, dovedind că sunt produse prin eliberarea spontană
şi individuală în fanta sinaptică a veziculelor de mediator (acetilcolina –
ACh), şi că procesul respectiv necesită prezenţa Ca2+. Din faptul că
există o dependenţă de voltaj a constantei de timp de relaxare a
curenţilor de placă motorie (înregistraţi în voltage clamp) care nu
poate fi atribuită direct acţiunii ACh, Magleby & Stevens (1971) au
emis ipoteza că acest fenomen reflectă mai degrabă cinetica de
deschidere şi închidere a receptorilor colinergici nicotinici (NAChR),

β ...
→
A
 ..
 → A R*
R ← A R
clo sed   clo sed←  
α (E)
 o pen

sensibilizaţi prin legarea ACh. Folosind modelul de activare a

complexului agonist-receptor (AR) (del Castillo & Katz 1957):
ei au presupus că rata de închidere a receptorului, α , este cea care
conferă dependenţa de voltaj, ceea ce ar explica coeficientul de
variaţie cu temperatura al constantei de timp de relaxare, Q10 = 2.8,
prea mare pentru un proces de difuzie.
Experimentele prin metoda analizei fluctuaţiilor (Katz & Miledi 1970–
1971) au confirmat această ipoteză, însă o serie de studii (Katz &
Thesleff 1957, Adams 1975) indicau un fenomen de cooperativitate
pozitivă la legarea ACh de receptor, exprimat printr-un coeficient Hill
între 1.5–2.2. După apariţia şi perfecţionarea metodei patch clamp, ale
cărei începuturi sunt legate chiar de acest receptor, Bert Sakmann şi
David Colquhoun (1981, 1985) au reuşit să pună în evidenţă închideri
→
A k1
 →
A k2
R ←  AR ←  A2 R
closed k -1 closed k− 2 closed

α 1 ↑↓ β 1 α 2 ↑↓ β 2
*
*   → A R*
A k2
AR ←  * 
2
open k open
−2

foarte scurte (gaps), cu durate de câteva zeci de µ s, care nu pot fi

explicate prin desfacerea ligandului, ci prin închiderea canalului.
Această serie de deschideri succesive punctate de scurte închideri a
primit denumirea de burst, durata sa per ansamblu fiind egală cu
timpul de viaţă al complexului receptor-ligand. Ţinând seama de noile
date, modelul cinetic al NAChR devine:
În plus, prezenţa prelungită a ACh duce la apariţia fenomenului de
desenzitizare, în care canalele nu mai răspund prin activare la agonist.
Desenzitizarea poate explica mecanismul de acţiune al curarizantelor
depolarizante (leptocurare) folosite în intervenţiile chirurgicale pentru
miorelaxare.
Cele două situsuri de legare a ACh au fost puse în evidenţă cu ajutorul
α -bungarotoxinei, o neurotoxină peptidică extrasă din veninul de
şarpe. Ea a fost folosită pentru purificarea NAChR din organul electric
al torpilei electrice. Canalul are o arhitectură pentamerică, α 2β γ δ
(Weill et al. 1974, Raftery et al. 1980), pe subunităţile α fiind localizate
situsurile de legare a ACh. Fiecare subunitate conţine 4 α -helixuri
transmembranare. Studii ulterioare au arătat că arhitectura
pentamerică este comună mai multor canale ligand-gated, incluzând
receptorii GABAA şi de glicină, cu rol inhibitor la nivelul sistemului
nervos central. Aceste canale anionice, activate de barbiturice,
benzodiazepine şi alcool, hiperpolarizează membrana neuronală, ceea
ce explică efectele sedative ale compuşilor menţionaţi. Principalul
neurotransmiţător excitator central, glutamatul, acţionează pe diverse
tipuri de receptori, dintre care o parte sunt canale ionice. Ele sunt
numite receptori NMDA (N-methyl-D-aspartate, un analog al
glutamatului), prezintă o selectivitate pentru Ca2+, iar prin blocarea de
către Mg2+ intracelular dobândesc proprietatea de inward rectification,
participând la fenomenul de long-term potentiation, implicat în
memorie (vezi capitolul 2). În fine, receptorii purinergici P2X, activaţi de
ATP extracelular, au fost implicaţi în nocicepţie. La nevertebrate
(melcul Helix aspersa) a fost descris un canal din familia canalelor
epiteliale de Na+ (Deg/ENaC) activat de neurotransmiţătorul peptidic
FMRFamidă, numit FaNaCh (Lingueglia et al. 1995).

4.4 Inactivarea de tip N şi de tip C

Inactivarea a fost definită de Hodgkin şi Huxley ca un proces cu

cinetică monoexponenţială care reduce conductanţa de Na +, după
activarea ei printr-o treaptă de potenţial. Ei au modelat acest proces
prin închiderea unei “porţi de inactivare” a cărei probabilitate de a fi
deschisă este h; ratele de deschidere şi de închidere, α h şi β h, sunt
dependente de voltaj, deschiderea fiind favorizată la potenţiale
negative (hiperpolarizare) iar închiderea la potenţiale pozitive
(depolarizare). Hodgkin şi Huxley au tratat activarea şi inactivarea ca
două procese independente, deci probabilitatea stării deschise a
 canalelor de Na+ este egală în modelul lor cu produsul probabilităţilor
stării deschise a porţilor de activare şi inactivare, m3h. Inadvertenţa
acestui model a fost dovedită în anii ’60 de Chandler şi Meves, prin
faptul că în axonul gigant de calmar inactivarea curenţilor de Na+ este
incompletă, chiar la potenţiale pozitive mari. Ei au sugerat existenţa a
două stări deschise ale porţii de inactivare, una dintre ele fiind
favorizată de depolarizare. Înregistrarea curenţilor de gating în anii ’70
a adus noi surprize: Armstrong şi Bezanilla au demonstrat imobilizarea
sarcinii de gating pentru curenţii de tip OFF. Cu cât pulsul de
depolarizare era mai prelungit cu atât scădea sarcina aparentă de
gating, obţinută prin integrarea curentului, astfel încât raportul între

Fig. 4.10 Studiile lui Aldrich, Corey şi Stevens pe canalele de Na+ dintr-o linie de
neuroblastom au relevat faptul că, deşi constanta de timp macroscopică de
inactivare este dependentă de voltaj, timpul mediu de viaţă al stării deschise
este independent. Astfel, aceeaşi cinetică macroscopică poate fi descrisă prin
modele microscopice diferite. Prin înregistrări single-channel ei au dovedit că
deschiderea este lentă şi inactivarea rapidă şi independentă de voltaj (modelul
ABACS).

sarcina de gating OFF şi cea ON (Qoff/Qon) urma o cinetică similară celei

a inactivării curentului macroscopic de Na+ în acelaşi preparat. Acest
rezultat sugerează un cuplaj între cele două procese: inactivarea
imobilizează senzorii de voltaj în poziţia activată iar revenirea lor la
poziţia iniţială are loc numai după ieşirea din inactivare, deci foarte
lent. Pe baza modelului cuplat, Armstrong şi Bezanilla au dedus că
inactivarea nu trebuie neapărat să prezinte o dependenţă de voltaj
intrinsecă, şi, mai mult, că rata de inactivare a curentului macroscopic
nu reflectă în mod real ratele proceselor microscopice de activare şi
inactivare. O confirmare strălucită a acestei ipoteze a fost adusă în
1983 de Aldrich, Corey şi Stevens, prin înregistrări de tip single-
channel ale canalelor de Na+ voltaj-dependente dintr-o linie de
neuroblastom de mamifere, utilizând tehnica patch clamp. Astfel, deşi
constanta de timp aparentă de inactivare (τ h) a curentului
macroscopic elicitat de un puls de depolarizare (obţinut prin sumarea
coerentă a unui mare număr de înregistrări single-channel) era de 3
ms, durata medie de deschidere a canalelor pe înregistrările
individuale era de doar 0.95 ms. Latenţa primei deschideri prezenta
variaţii largi, iar majoritatea înregistrărilor (85%) conţineau o singură
deschidere. Concluzia logică este că, în acest caz, activarea este un
proces lent şi inactivarea unul rapid (constanta de timp microscopică
0.95 ms), canalele fiind “absorbite” în starea inactivată la scurt timp
după deschidere. Mai mult, această constantă microscopică de
inactivare este independentă de voltaj. În plus, dependenţa de voltaj a
conductanţei “de vârf” de Na+ este distorsionată de această inactivare
rapidă.
Celebrele studii ale lui Clay M. Armstrong (‘71-’75) cu derivaţi
cuaternari de amoniu (analogi ai TEA precum tetrapentylamoniul –
TPeA, sau nonyltriethylamoniul – C9) au arătat că aplicarea
intracelulară a acestor compuşi modifică cinetica clasică a canalelor de
K+ voltaj-dependente (delayed rectifiers) introducând o inactivare
dependentă de concentraţie ce le face asemănătoare canalelor de Na+.
În plus, curba IV se modifică prin apariţia unei rectificări de tip inward.
Armstrong a sintetizat aceste date într-un model cinetic numit open
channel block: aminele cuaternare exercită efectul blocant numai după
deschiderea canalelor, deci trebuie să treacă de o poartă de activare
situată pe endodomeniul canalului, pătrunzând într-un vestibul intern
de dimensiuni suficient de mari pentru a le acomoda, şi producând
astfel procesul asemănător inactivării. Ele pot fi înlăturate din acest
situs intern numai de către ionii care pătrund dinspre exterior (curenţii
de inward), ceea ce explică rectificarea. Studii similare au arătat că
anestezicele locale pătrund în vestibulul intern, mimând inactivarea şi
imobilizând sarcinile de gating (Yeh & Armstrong 1978, Cahalan &

Fig. 4.11 Modelul de inactivare de tip N (ball and chain). După activarea
canalelor, capătul N-terminal (bila) obturează orificiul intern, ducând la
inactivare. Îndepărtarea acestei particule prin tratament enzimatic duce la
dispariţia inactivării (din Armstrong & Bezanilla 1977).

Almers 1979).
Urmând această linie de raţionament, Armstrong & Bezanilla au
imaginat inactivarea ca pătrunderea unui ghem proteic în orificiul
intern al porului, atunci când acesta este deschis, ceea ce explică
cuplajul cu activarea. S-a arătat că tratamentul cu enzime proteolitice
(papaină, pronază, etc.) aplicate pe faţa internă a membranei înlătură
inactivarea, ceea ce duce şi la dispariţia imobilizării sarcinii de gating,
iar aplicarea peptidelor solubile rezultate prin acest tratament
reinstaurează componenta de inactivare.
Un model foarte frumos de studiu al acestui tip de inactivare a apărut
după clonarea canalelor de K+ de tip Shaker din Drosophila (Hoshi,
Zagotta, Aldrich 1990), canale ce produc aşa-numiţii curenţi tranzienţi
de K+ de tip A (pentru că au forma literei A). Studii de mutageneză
deleţională au arătat că înlăturarea primelor 20 de reziduuri din
capătul N-terminal al unei subunităţi (canalele sunt homotetrameri)
înlătură inactivarea, iar adăugarea lor sub forma unei peptide sintetice
solubile o restaurează. Îndepărtarea unei părţi din următoarele 60 de
reziduuri accelerează inactivarea, în timp ce alungirea secvenţei
respective o încetineşte. Aceste rezultate conturează modelul numit
inactivare de tip N sau modelul bilă-lanţ, în care, evident, primele 20
reziduuri formează “bila” iar următoarele 60 “lanţul”. În plus, studiile
cu peptide sintetice ball-like arată că rata inactivării este proporţională
cu concentraţia de peptid, în timp ce rata revenirii din inactivare este
independentă de ea. Pentru canalele de Na+ voltage-gated s-a
descoperit prin studii de mutageneză un mecansim asemănător de
inactivare, ce implică linkerul dintre subunităţile III şi IV.
Un alt tip de inactivare a canalelor de Na+ este cel numit inactivare
lentă, care este favorizat de depolarizări prelungite (secunde sau
minute) şi are un timp de revenire de acelaşi ordin de mărime, după
repolarizare. Acesta a fost denumit inactivare de tip C (Hoshi et al.
1991) deoarece variantele naturale de splicing ale genei Shaker
prezintă modificări ale acestui proces atunci când sunt afectate
reziduurile din treimea C-terminală a secvenţei. Inactivarea de tip C
este încetinită de TEA aplicat extracelular şi nu intracelular (Grissmer &
Cahalan 1989), şi de cationii extracelulari permeanţi, în special K+ şi
Rb+), ceea ce sugerează o modificare conformaţională a filtrului de
selectivitate al porului (López-Barneo et al. 1993). În absenţa K+
extracelular, canalele inactivate devin permeabile pentru Na+. Astfel,
inactivarea de tip C reflectă importanţa cationilor extracelulari în
stabilizarea conformaţiei funcţionale a canalelor ionice.

4.5 Alte tipuri de gating cu implicaţii în transducţia senzorială:

mecanosenzitivitatea şi termosenzitivitatea
În afara tipurilor clasice de gating discutate anterior, a căror
importanţă în funcţionarea sistemului neuromuscular este evidentă,
canalele ionice sunt implicate, într-un fel sau altul, în diferitele etape
ale transducţiei senzoriale, procesul biofizic prin care energia diferiţilor
stimuli din mediul intern sau din lumea înconjurătoare declanşează
serii de potenţiale de acţiune repetitive pe căile nervoase aferente.
Funcţionarea unui sistem senzorial poate fi sistematizată şi
generalizată într-o diagramă simplă, reprezentând o înlănţuire de trei
procese: detecţie, amplificare şi semnalizare. Detecţia reprezintă o
modificare conformaţională a unei molecule receptoare sub acţiunea
stimulului (de exemplu izomerizarea trans-cis a retinalului sub acţiunea
unui foton din spectrul vizibil). Amplificarea foloseşte cascadele
enzimatice ale căilor de semnalizare intracelulară (de exemplu,
sistemul proteinelor G) al căror rezultat este variaţia potenţialului
 Fig. 4.12 Schema de principiu a
unui receptor, cu ilustrarea celor
trei procese înlănţuite: detecţia,
amplificarea şi semnalizarea, şi a
căilor de feed-back ce le
controlează (Steven Block 1991).

transmembranar al celulei receptoare (potenţialul de receptor), în

sensul depolarizării sau al hiperpolarizării. A treia etapă, semnalizarea,
reprezintă corelarea variaţiilor potenţialului de receptor cu frecvenţa
de declanşare a potenţialelor de acţiune ce vor fi propagate pe căile
sensibilităţii respective, cu alte cuvinte o modulare în frecvenţă, care
reduce efectul factorilor perturbatori ce acţionează de-a lugul căii de
comunicaţie (se ştie că semnalele modulate în frecvenţă sunt mai
rezistente la perturbaţii decât cele modulate în amplitudine – un
exemplu banal este diferenţa de calitate între o transmisie radio
modulată AM şi una modulată FM).
Într-o discuţie teoretică a principiilor fizice ale transducţiei sensoriale,
biofizicianul Steven Block remarca faptul că, dintre cele patru tipuri
fundamentale de interacţiuni (forţe), numai două sunt detectate în
lumea vie: interacţiunea electromagnetică şi cea gravitaţională, ale
căror distanţe de acţiune includ intervalul de dimensiuni ale fiinţelor
vii. Nu s-a descoperit încă (şi este improbabil să se descopere în viitor)
un receptor biologic pentru interacţiunea nucleară (tare), care asigură
legăturile între nucleoni, având o rază de acţiune de 10-12 m, sau
pentru interacţiunea slabă (răspunzătoare, de exemplu, de
dezintegrarea β ). Comparând nivelul elementar de energie al diferiţilor
stimuli cu valoarea kBT, aşa-numita ”cuantă de energie termică”
(dublul energiei cinetice pe grad de libertate al unei molecule ~ cu o
valoare de 1/40 eV sau 0.58 kcal/mol la temperatura camerei ~ 300 K)
distingem două tipuri de traductori: cei limitaţi cuantic, pentru care
cuanta de energie este mai mare decât kBT, şi cei limitaţi clasic, pentru
care este mai mică, uneori cu multe ordine de mărime. Un exemplu din
prima grupă este, din nou, fotorecepţia: energia unui foton vizibil cu λ
= 500 nm, care corespunde culorii verde-albăstrui, este hc/λ (unde h
= 6.62⋅ 10-34 J⋅ s este constanta lui Planck) egală cu 57 kcal/mol, deci cu
două ordine de mărime deasupra “cuantei termice”. Experienţe
psihofizice efectuate la începutul secolului 20 au arătat că ochiul uman
adaptat la întuneric poate distinge fotoni individuali sub forma unor
scurte străfulgerări. Şi chemorecepţia intră tot în categoria limitată
cuantic: considerând constanta de disociere KD în intervalul 10-1–10-11
M, şi utilizând expresia KD ≅ exp(-∆ E/kBT), obţinem un interval de
energii între 2 kBT şi 25 kBT. O situaţie complet diferită o reprezintă
auzul, pentru care energia “cuantei de sunet” (fonon) în spectrul de
frecvenţă 10–100,000 Hz este de 108 – 1011 ori mai mică decât cuanta
termică. Aceasta face ca deplasările membranei bazilare din urechea
internă, la pragul audibil, să fie cu câteva ordine de mărime mai mici
decât amplitudinea medie a fluctuaţiilor termice ale cililor celulelor
auditive (0.1–1 Å comparativ cu 2 nm). Această diferenţă poate fi
surmontată prin limitarea temporală a benzii de trecere a detectorului,
ştiut fiind că zgomotul termic are o distribuţie spectrală uniformă a
densităţii de putere, cu alte cuvinte este “alb”. Totuşi, limitarea
lărgimii de bandă nu funcţionează decât pentru un circuit rezonant
activ, pentru un sistem pasiv întreaga putere de zgomot termic fiind
deplasată în vârful de rezonanţă, conform teoremei de fluctuaţie-
disipaţie a lui Landau & Lifshitz (1977).
Înregistrări electrofiziologice la nivelul celulelor ciliate din cohlee
(Corey & Hudspeth 1983) au evidenţiat curenţi cationici activaţi de
deplasarea laterală a cililor, cu o latenţă de activare mai mică de 10
µ s şi un timp mediu de deschidere sub 40 µ s. Ei au presupus că
activarea acestor canale este produsă direct de un stimul mecanic (o
forţă de întindere transmisă prin filamente extracelulare ce leagă cilii
învecinaţi), energia de activare fiind similară celei a senzorilor de voltaj
din canalele voltage-gated. Adaptarea la deschideri prelungite este
datorată influxului de Ca2+ prin aceste canale, care sunt cuplate cu un
motor intracelular reprezentat de molecule de miozină ce
interacţionează cu citoscheletul de filamente de actină asociat
membranei, menţinând o tensiune mecanică constantă asupra
canalelor. Amplificarea activă a oscilaţiilor mecanice, stipulată teoretic,
este realizată de celulele ciliate externe, dispuse în mai multe rânduri.
Depolarizarea lor activează un alt motor molecular numit prestină,
identificată (Zheng et al 2000) printr-o metodă genetică originală,
amplificarea diferenţială. Două biblioteci de cDNA, obţinute prin RT-
PCR din extractele mRNA ale celulelor ciliate externe şi interne au fost
amestecate în exces de cDNA din celulele ciliate interne, deci
secvenţele comune au hibridizat; restul secvenţelor libere, specifice
celulelor ciliate externe, au fost amplificate în continuare şi exprimate
într-un sistem heterolog. Studii anterioare asupra celulelor ciliate
externe (Ashmore 1987, Santos-Sacchi 1991) arătaseră că
electromotilitatea şi curenţii capacitivi neliniari sunt inhibaţi reversibil
de salicilatul de Na (Shehata et al 1991). Această proprietate a fost
regăsită în sistemele celulare în care a fost exprimată prestina. Din
punct de vedere molecular, ea prezintă similarităţi cu transportorii de
sulfat, însă şi două clustere de reziduuri pozitive în regiunea C-
terminală (reziduurile 557-580 şi 596-613, lungimea totală a secvenţei
fiind 744).
Fig. 4.13 Diferite canale ionice cu rol presupus sau cert în mecanosenzitivitate
şi/sau termosenzitivitate. Ele aparţin unor familii diferite: TRP (transient
receptor potential) şi CNG (cyclic nucleotide gated), cu 6 domenii TM pe
subunitate, provin din canalele de K+ voltage-gated, Deg/ENaC
(degenerine/canale epiteliale de Na) şi receptorii purinergici P2X, cu 2 domenii
TM pe subunitate.

Studii la nivelul procariotelor au dus la identificarea unui canal ionic

mecanosenzitiv (MscL – Sukharev et al. 1994, 1997) a cărui structură
3D a fost rezolvată prin difracţie de raze X. Canalul este un
homopentamer format din subunităţi 2TM, neselectiv şi cu o
conductanţă enormă (3000 pS). O altă linie de studii a identificat la
nematodul C. elegans mutaţii ale unor gene din familia Deg/ENaC care
alterează sensibilitatea la atingere. Întrucât membri ai acestei familii
sunt exprimaţi în neuronii senzitivi ai mamiferelor (genele ASIC1-
ASIC4), se presupune că ei ar fi implicaţi în mecanosenzitivitate.
Dovezi suplimentare în acest sens sunt furnizate prin aplicarea
stimulilor mecanici de deformare asupra neuronilor izolaţi din
ganglionii spinali. La subpopulaţia care răspunde prin creşteri ale
activităţii Ca2+ intracelular, Ni2+ şi verapamilul inhibă acest răspuns
(Gotoh & Takahashi 1999). O altă categorie de mecanosenzori
candidaţi sunt membri ai familiei TRP (transient receptor potential –
fotoreceptorul din Drosophila), de exemplu nompC sau SIC (stretch-
inhibitable channel), a cărui secvenţă este înrudită cu receptorul
vaniloid (VR1).
Termosenzitivitatea este alt domeniu care a reprezentat o terra
incognita până recent, datorită dificultăţii de abordare
electrofiziologică directă a receptorilor subcutanaţi, de dimensiuni
minuscule. În prezent au fost identificate şi clonate câteva canale
ionice din familia TRP responsabile de detecţia temperaturilor extreme:
căldura nocivă şi frigul. Astfel, în 1996, P. Cesare şi P. McNaughton
identifică în neuronii spinali nociceptivi un curent cationic cu un prag
de activare ridicat (~ 42 °C), senzitizat de bradikinină prin activarea
proteinkinazei C (isoforma ε ). În 1997, o echipă de la Departamentele
de Anesteziologie şi Farmacologie ale Universităţii din California la San
Francisco (M. Caterina, D. Julius, M. Tominaga, etc.) reuşeşte să
cloneze un canal ionic (VR1) , activat de multipli stimuli nocivi: căldură,
pH scăzut şi compuşi vaniloizi. După numai câţiva ani este identificat,
tot într-un grup de neuroni spinali, un curent activat de frig (prag de
activare ~ 15 °C) şi de D-menthol (Reid & Flonta 2001). Recent,
canalul ionic candidat pentru acest efect a fost clonat tot de echipa lui
D. Julius, fiind numit CMR1 (cold and menthol receptor 1). Este
interesant faptul că VR1 şi CMR1 sunt înrudite, ambele aparţinând
familiei TRP. Graficul de hidrofobicitate al celor două secvenţe arată
existenţa la CMR1 a două regiuni hidrofobe suplimentare, în afara celor
şase domenii transmembranare cunoscute. Acest fapt poate ajuta la
explicarea activării sale prin frig. Se presupune că activarea termică
este o reacţie controlată entropic. Întrucât ∆ G = ∆ H - T∆ S, reacţiile
cu variaţie pozitivă de entropie vor fi favorizate la temperaturi
crescute, iar cele cu variaţie negativă de entropie la temperaturi
scăzute. Variaţia negativă de entropie în CMR1 ar putea fi reprezentată
de detaşarea acestor două domenii hidrofobe la temperaturi scăzute,
Fig. 4.14 Analiza comparativă a hidrofobicităţii secvenţelor receptorului
vaniloid VR1 şi receptorului de rece şi menthol CMR1. În afara regiunilor
hidrofobe corespunzătoare celor 6 α -helixuri transmembranare, CMR1
prezintă două zone hidrofobe suplimentare, cu rol presupus în activarea la
rece.
întrucât entropia lor în soluţie este mai mică decât într-un mediu
hidrofob (efectul imobilizării moleculelor de apă din “cuşca de
hidratare”).

Referinţe
Aldrich RW, Corey DP, Stevens CF. 1983. A reinterpretation of
mammalian sodium channel gating based on single channel
recording. Nature 306(5942):436-41.
Almers W. 1978. Gating currents and charge movements in excitable
membranes. Rev Physiol Biochem Pharmacol 82:96-190.
Armstrong CM. 1971. Interaction of tetraethylammonium ion
derivatives with the potassium channels of giant axons. J Gen
Physiol 58(4):413-37.
Armstrong CM, Bezanilla F. 1973. Currents related to movement of the
gating particles of the sodium channels. Nature 242(5398):459-
61.
Armstrong CM, Bezanilla F. 1977. Inactivation of the sodium channel. II.
Gating current experiments. J Gen Physiol 70(5):567-90.
Ashmore JF. 1987. A fast motile response in guinea-pig outer hair cells:
the cellular basis of the cochlear amplifier. J Physiol 388:323-47.
Ball FG, Sansom MS. 1988. Single-channel autocorrelation functions:
the effects of time interval omission. Biophys J 53(5):819-32.
Bean RC, Shepherd WC, Chan H, Eichner J. 1969. Discrete conductance
fluctuations in lipid bilayer protein membranes. J Gen Physiol
53(6):741-57.
Bezanilla F. 2002. Voltage sensor movements. J Gen Physiol
120(4):465-73.
Block SM. 1991. Biophysical principles of sensory transduction. In:
Corey DP, Roper SD, editors. Sensory Transduction. New York:
Rockefeller University Press. p 1-17.
Cahalan MD, Almers W. 1979. Interactions between quaternary
lidocaine, the sodium channel gates, and tetrodotoxin. Biophys J
27(1):39-55.
Caterina MJ, Schumacher MA, Tominaga M, Rosen TA, Levine JD, Julius
D. 1997. The capsaicin receptor: a heat-activated ion channel in
the pain pathway. Nature 389(6653):816-24.
Cesare P, McNaughton P. 1996. A novel heat-activated current in
nociceptive neurons and its sensitization by bradykinin. Proc Natl
Acad Sci U S A 93(26):15435-9.
Chahine M, George AL, Jr., Zhou M, Ji S, Sun W, Barchi RL, Horn R.
1994. Sodium channel mutations in paramyotonia congenita
uncouple inactivation from activation. Neuron 12(2):281-94.
Chandler WK, Meves H. 1970. Rate constants associated with changes
in sodium conductance in axons perfused with sodium fluoride. J
Physiol 211(3):679-705.
Colquhoun D, Hawkes AG. 1995. The Principles of the Stochastic
Interpretation of Ion-Channel Mechanism. In: Neher BSaE, editor.
Single-Channel recording. 2 ed. New York: Plenum Press. p 397-
482.
Colquhoun D, Sakmann B. 1981. Fluctuations in the microsecond time
range of the current through single acetylcholine receptor ion
channels. Nature 294(5840):464-6.
Corey DP, Hudspeth AJ. 1983. Kinetics of the receptor current in
bullfrog saccular hair cells. J Neurosci 3(5):962-76.
DeFelice LJ. 1981. Introduction to Membrane Noise. New York: Plenum.
500 p.
del Castillo J, Katz B. 1957. Interaction at endplate receptors between
different choline derivatives. Proc R Soc Lond B 146:369-381.
Fatt P, Katz B. 1951. An analysis of the end-plate potential recorded
with an intracellular electrode. J Physiol 115:320-370.
Fertig N, Blick RH, Behrends JC. 2002. Whole cell patch clamp
recording performed on a planar glass chip. Biophys J
82(6):3056-62.
Gotoh H, Takahashi A. 1999. Mechanical stimuli induce intracellular
calcium response in a subpopulation of cultured rat sensory
neurons. Neuroscience 92(4):1323-9.
Grissmer S, Cahalan M. 1989. TEA prevents inactivation while blocking
open K+ channels in human T lymphocytes. Biophys J 55(1):203-
6.
Hamill OP, Marty A, Neher E, Sakmann B, Sigworth FJ. 1981. Improved
patch-clamp techniques for high-resolution current recording
from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch
391(2):85-100.
Helman SI, Baxendale LM. 1988. Open channel probability of apical Na
channels in epithelial frog skin. FASEB J 2:A750.
Hladky SB, Haydon DA. 1970. Discreteness of conductance change in
bimolecular lipid membranes in the presence of certain
antibiotics. Nature 5231(231):451-3.
Hodgkin AL, Huxley AF. 1952. A quantitative description of membrane
current and its application to conduction and excitation in nerve.
J Physiol 117:500-544.
Hoshi T, Zagotta WN, Aldrich RW. 1991. Two types of inactivation in
Shaker K+ channels: effects of alterations in the carboxy-
terminal region. Neuron 7(4):547-56.
Katz B, Miledi R. 1970. Membrane noise produced by acetylcholine.
Nature 226(249):962-3.
Keynes RD, Rojas E. 1974. Kinetics and steady-state properties of the
charged system controlling sodium conductance in the squid
giant axon. J Physiol 239(2):393-434.
Lindemann B, Van Driessche W. 1977. Sodium-specific membrane
channels of frog skin are pores: current fluctuations reveal high
turnover. Science 195(4275):292-4.
Lingueglia E, Champigny G, Lazdunski M, Barbry P. 1995. Cloning of
the amiloride-sensitive FMRFamide peptide-gated sodium
channel. Nature 378(6558):730-3.
López-Barneo J, Hoshi T, Heinemann SH, Aldrich RW. 1993. Effects of
external cations and mutations in the pore region on C-type
inactivation of Shaker potassium channels. Receptors Channels
1(1):61-71.
McKemy DD, Neuhausser WM, Julius D. 2002. Identification of a cold
receptor reveals a general role for TRP channels in
thermosensation. Nature 416(6876):52-8.
Müller P, Rudin DO, Tien HT, Wescott WC. 1962. Reconstitution of cell
membrane structure in vitro and its transformation into an
excitable system. Nature 194:979-980.
Neher E, Sakmann B. 1976. Single-channel currents recorded from
membrane of denervated frog muscle fibres. Nature
260(5554):799-802.
Neumcke B. 1982. Fluctuation of Na and K currents in excitable
membranes. Int Rev Neurobiol 23:35-67.
Reid G, Flonta M. 2001a. Cold transduction by inhibition of a
background potassium conductance in rat primary sensory
neurones. Neurosci Lett 297(3):171-4.
Reid G, Flonta ML. 2001b. Physiology. Cold current in thermoreceptive
neurons. Nature 413(6855):480.
Santos-Sacchi J. 1991. Reversible inhibition of voltage-dependent outer
hair cell motility and capacitance. J Neurosci 11(10):3096-110.
Schneider MF, Chandler WK. 1973. Voltage dependent charge
movement of skeletal muscle: a possible step in excitation-
contraction coupling. Nature 242(5395):244-6.
Shehata WE, Brownell WE, Dieler R. 1991. Effects of salicylate on
shape, electromotility and membrane characteristics of isolated
outer hair cells from guinea pig cochlea. Acta Otolaryngol
111(4):707-18.
Sigworth FJ, Klemic KG. 2002. Patch clamp on a chip. Biophys J
82(6):2831-2.
Starace DM, Stefani E, Bezanilla F. 1997. Voltage-dependent proton
transport by the voltage sensor of the Shaker K+ channel.
Neuron 19(6):1319-27.
Stevens CF. 1972. Inferences about membrane properties from
electrical noise measurements. Biophys J 12(8):1028-47.
Stühmer W, Conti F, Suzuki H, Wang XD, Noda M, Yahagi N, Kubo H,
Numa S. 1989. Structural parts involved in activation and
inactivation of the sodium channel. Nature 339(6226):597-603.
Sukharev SI, Blount P, Martinac B, Blattner FR, Kung C. 1994. A large-
conductance mechanosensitive channel in E. coli encoded by
mscL alone. Nature 368(6468):265-8.
Venkataramanan L, Sigworth FJ. 2002. Applying hidden Markov models
to the analysis of single ion channel activity. Biophys J
82(4):1930-42.
Verveen AA, Derksen HE. 1969. Amplitude distribution of axon
membrane noise voltage. Acta Physiol Pharmacol Neerl
15(3):353-79.
Wonderlin WF, French RJ, Arispe NJ. 1990. Recording and Analysis of
Currents from Single Ion Channels. In: A. A. Boulton GBB, C. H.
Vanderwolf, editor. Neurophysiological Techniques: Basic
methods and Concepts. Clifton, NJ: The Humana Press Inc.
Yang N, Horn R. 1995. Evidence for voltage-dependent S4 movement
in sodium channels. Neuron 15(1):213-8.
Zagotta WN, Hoshi T, Aldrich RW. 1990. Restoration of inactivation in
mutants of Shaker potassium channels by a peptide derived from
ShB. Science 250(4980):568-71.
Zheng J, Shen W, He DZ, Long KB, Madison LD, Dallos P. 2000. Prestin
is the motor protein of cochlear outer hair cells. Nature
405(6783):149-55.