IV.

Enzime

Enzimele sunt proteine ce posedă o funcţie înalt specializată şi anume aceea de

biocataliză şi se deosebesc de catalizatorii din lumea nevie prin câteva propriet ăţi care le
definesc. Enzimele se caracterizează prin următoarele proprietăţi:
6 12
- capacitatea catalitică mare, eficienţa catalitică creşte cu un factor de 10 – 10 faţă de
reacţia necatalizată.
- Specificitatea superioară de reacţie – elimin ă formarea de produşi secundari
- Activităţile catalitice enzimatice sunt reglate prin mecanisme diferite, care privesc fie
acţiunea lor, fie cantitatea de enzimă sintetizată. Controlul enzimatic are semnificaţie majoră
pentru reglarea metabolismului celular.
- Enzimele acţionează în condiţii foarte blânde şi anume la temperatura celulelor vii, la pH
aproape neutru şi la presiune atmosferică.

Nomenclatură şi clasificare
Multă vreme enzimele au fost denumite prin adăugarea sufixului aza la numele substratului.
Ex. Amilaza, ureeza, alcool dehidrogenaza.
Unele denumiri însă nu includeau nici substratul, nici reacţia catalizată.
Ex. Tripsina, pepsina, catalaza.
Datorită faptului că numărul de enzime este în continuă creştere, nomenclatura veche crea
confuzii, astfel că s-a impus introducerea unei terminologii unitare şi a unei clasificări adecvate.
În 1961, Comisia de Enzime a Uniunii Internaţionale de Biochimie, adoptă o claisficare şi
o nomenclatură sistematică, bazată pe natura reacţiei chimice catalizate.
Astfel, enzimele au fost clasificate în 6 clase, fiecare cuprinzând un num ăr de subclase şi,
respectiv subsubclase.
1. Oxidoreductaze – enzime ce catalizeaz ă reacţiile de oxidoreducere.
2. Transferaze – enzime ce catalizeaz ă reacţiile de transfer de grupări funcţionale.
3. Hidrolaze – enzime ce catalizeaz ă reacţiile de hidroliză.
4. Liaze – enzime ce catalizeaz ă reacţiile de descompunere a substratului prin alte mecanisme
decât cele de oxidare şi hidroliză.
5. Izomeraze – enzime ce catalizeaz ă reacţii de interconversiune a izomerilor.
6. Ligaze – enzime ce catalizeaz ă reacţii de formare a legăturii C-O, C-C, C-S, C-N, cuplată cu
scindarea unui compus macroergic (ATP).

Pentru a defini o enzimă, fiecăruia i se atribuie un număr sistematic format din numele
substratelor, urmat de cuvântul ce indic ă tipul de reacţie catalizată, la care adaugă sufixul aza.
Deasemenea, fiecărei enzime i se atribuie un cod determinat de poziţia pe care enzima o ocupă în
sistemul zecimal.
Exemplu: Acest număr de clasificare este alcătuit din iniţialele EC (Comisia de enzime) şi 4
cifre. Prima cifră indică clasa din care face parte enzima, a doua indică subclasa, determinată de
felul grupării implicate în reacţie, a treia cifră reprezintă subsubclasa , adică natura particulară a
substratelor din grupul respectiv, iar a patra cifră reprezintă poziţia ocupată de enzimă în
subsubclasă.
- alcool dehidrogenaza: E.C. [Link].
- glucozooxidaza: E.C. [Link].

Structura enzimelor

În cea mai mare parte, enzimele sunt proteine globulare. Excepţie face ribonucleaza P.
O mică proporţie de enzime sunt proteine simple (pepsina, chimotripsina, lizozim), iar
celelalte sunt heteroproteine (metaloenzime, dehidrogenaze piridinice). Unele enzime sunt alcătuite
40
sunt alcătuite dintr-un singur lanţ polipeptidic (ribonucleaza), altele din mai multe lanţuri
identice sau diferite.
Masa moleculară a enzimelor este extrem de variabilă datorită lungimii lanţurilor
polipeptidicre componente, cât şi datorită asocierii unui număr diferit de subunităţi, ca în cazul
enzimelor oligomer.
Pe lâng ă aceste aspecte legate de structură, la enzime mai apar anumite caracteristici
specifice lor:
- identificarea centrului catalitic, şi, la enzimele allosterice şi a centrilor allosterici.
- Cunoaşterea cofactorilor enzimatici cât şi locul lor în ansamblul structural enzimatic.

Cofactorii enzimatici sunt componente micromoleculare indispensabile activităţii unui

număr mare de enzime.
Cofactorul poate să fie un ion metalic sau o moleculă organică specifică, uneori sunt ceruţi
ambii şi foarte rar cofactorul este un anion anorganic.
1. Metalele în cataliza enzimatică
+2 +2
Un număr mare de enzime cer pentru a-şi manifesta activitatea ioni [Link] , Mn ,
+2 +3 +3 +2 +2 + + +2
Mo , Co , Fe , Cu , Mg , K , Na , Ca . Unele enzime care conţin o cantitate definită de
ion metalic funcţional, fiind strâns legat în structura lor se numes c metalo-enzime, iar altele care
leagă slab metalu se numesc enzime metalo-activate. Exemple:
- +2
anhidraza carbonică: Zn
-
enzimele heminice: Fe+3
- +2 +
piruvat kinaza : Mg , K
[Link] de natură organică sunt sisteme conjugate în care mobilitatea electronică este
foarte mare, ceea ce explică puterea lor catalitică. Cofactorii slab legaţi de enzimă sau ataşaţi
temporar se numesc coenzime.
+ +
Exemplu: acid lipoic, coenzima Q, biopterinele, NAD , NADP , FAD, CoA.

Centrul activ al enzimei ( centrul catalitic)

Centrul activ al enzimei este o zonă restrâns ă din structura enzimei responsabilă direct de
funcţia ei catalitică, aceea de legare şi transformare a substratului. Această regiune reprezintă la
majoritatea enzimelor cca 5% din total.
Ca entitate tridimensională centrul activ poate cuprinde o porţiune sau mai multe din acelaşi lanţ,
ori din lanţuri diferite, apropiate spaţial.
Exemplu:
Din centrul activ al ribonucleazei fac parte: His 12, His119, Lys41. Aceşti aminoacizi deşi
sunt situaţi la distanţă în structura liniară, sunt apropiaţi în structura terţiară, datorită plierii
lanţului. Centrii activi conţin resturi de aminoacizi şi eventual cofactori cu rol de a recunoaşte şi
lega substratul sau care participă în transformarea lor chimică, uneori aceşti aminoacizi
îndeplinind ambele funcţii. Alţi aminoacizi aflaţi la distanţe variabile de centrul activ contribuie la
stabilitatea structurii proteice, sunt resturi structurale, considerate alături de resturile catalitice
şi de legare ca esenţiale pentru activitatea enzimei.
De fapt, în procesul catalitic participă indirect întreaga moleculă. Activitatea este
condiţionată de existenţa conformaţiei native a structurii enzimatice.
Aminoacizii care nu participă în nici un fel la actul catalitic sunt numiţi resturi neesenţiale, ele
conferind moleculei anumite proprietăţi fizico- chimice.

Mecanismul de acţiune al enzimelor

Procesul catalitic constă în formarea complexului cu substratul sau substratele, ceea ce

determină o scădere a energiei stării de tranziţie, transformarea chimică şi eliberarea produşilor. Se
41
cunosc următoarele mecanisme de acţiune ale enzimelor:
Cataliza prin distorsie implică interacţiuni care deformează legăturile şi unghiurile acestora
în molecula substratului. În unele cazuri, contorsia, poate fi consecinţa ataşării covalente a
substratului de enzimă.
Cataliza acido-bazică se datorează radicalilor aminoacizilor din centrul activ care pot
funcţiona ca acizi sau baze Bronsted sau ca acizi sau baze Lewis.
Cataliza prin orientarea reactanţilor. Enzima are rolul de a dispune substratele într-o
poziţie favorabilă reacţiei.

Specificitatea catalizei enzimatice

Specificitatea unei enzime reprezintă capacitatea unei enzime de a selecta dintr-un număr
de compuşi substratul particular şi a-l transforma printr-o reacţie de un anume tip. Se distinge :
specificitatea de acţiune ( de reacţie), şi specificitatea de substrat.

Specificitatea de recţie.
Spre deosebire de catalizatorii neproteici, care accelerează o varietate de reacţii, o enzimă
catalizează, de regulă, un singur tip de reacţie.
Exemplu:
- o reacţie de hidroliză
- o reacţie redox
- formarea unei legături.
Există, însă unele proteine, puţine la număr, cu activităţi polienzimatice. În acest caz proteina
posedă centri catalitici independenţi, responsabili de reacţii diferite ce decurg prin mecanism
deosebit.
Specificitatea de substrat reprezintă calitatea enzimei de a forma complexul enzimă-
substrat ca prima etapă obligatorie în transformarea acestuia.
Dacă enzima acţionează asupra unei varietăţi de compuşi avem de-a face cu o specificitate
relativă (de grup), în care caz enzima are capacitatea de a transforma un număr de substrate
înrudite chimic. Exemplu:
- hidrolaze: - esteraze
- peptidaze
- glicozidaze
- proteaze: - exopeptidaze
- endopeptidaze.
Specificitatea relativă are importanţă în biochimia analitică, deoarece permite
introducerea de substrate artificiale la determinări enzimatice.
Se cunosc şi enzime cu specificitate absolută. Acestea sunt inactive faţă de analogii
structurali ai substratului, ceea ce presupune recunoaşterea integrală a unei molecule, precum şi o
rigiditate a centrului activ, în conformitate cu modelul cheie- broască. Exemplu:

- ureaza
- arginaza
- anhidraza carbonică
- fructozo-1,6-difosfataza.
Stereospecificitatea enzimelor.
Stereospecificitatea enzimelor este un caz de specificitate absolută. Există un număr mare
de substrate care se caracterizează prin asimetrie structurală, iar în procesele metabolice adeseori
se întâlne şte unul din izomerii posibili.
Exemplu:
- L – şi D – aminoacid oxidazele sunt specifice pentru ste reoizomerii respectivi.
- Alte enzime recunosc numai izomerii geometrici: succinat dehidrogenaza, fumaraza.

42
Factorii care influenţează activitatea enzimatică

În reacţiile enzimatice viteza de reacţie se măsoară fie prin cantitatea de substrat

transformată, fie prin cantitatea de produs format, exprimată în molaritate, iar timpul se exprimă
în minute.
Viteza unei reacţii enzimatice poate fi influenţată de un număr de factori, dintre care amintim:
concentraţia de enzimă, concentraţia de substrat, temperatura, pH, inhibitori.
1. Influenţa concentraţiei de enzimă
Viteza unei reacţii enzimatice arată o dependenţă liniară de concentraţia enzimei, în condiţiile
în care concentraţia de substrat este fixă.

[ E]
Dependenţa vitezei de reacţie de concentraţia de enzimă

Abaterile de la liniaritate se datorează erorilor tehnice sau existenţei unui inhibitor ce

acţionează numai la o anumită concentraţie.

2. Influenţa concentraţiei de [Link] Michaelis-Menten

De exemplu să presupunem următoarea reacţie catalizată de enzimă:

E+S k ES k E+P
1 3

k2

Pentru enzimele michaeliene, dependenţa vitezei de reacţie de concentraţia de substrat este

descrisă ca o hiperbolă, la o concentraţie de enzimă constantă.
Astfel viteza de reacţie creşte la început rapid şi liniar, după care dependenţa nu mai este
liniară, iar la o anumită concentraţie de substrat curba tinde spre o valoare maximă.

43
 V

Vmax

Vm/2

Km [ S]

V0 = Vmax = [S] / [S] + Km

V - viteza iniţială de reacţie

Vmax – capacitatea catalitic ă maximă a enzimei – viteza maxim ă
realizată [ S ] – concentra ţia de substrat
Km – Constanta lui Michaelis – Menten, reprezint ă concentraţia de de substrat pentru care
viteza de reacţie atinge jumătatea valorii maxime.
Dozările de activitate enzimatică se efectuează la concentraţii mari, saturante de substrat
pentru a asigura o cinetică de ordinul zero.
Ecuaţia Michaelis-Menten este fundamentală în studiile de cinetică enzimatică, permiţând
analiza cantitativă a majorităţii reacţiilor enzimatice. Pe lâng ă utilitatea la interpretarea
mecanismului reacţiilor enzimatice şi a acţiunii inhibitorilor, cei doi parametri cinetici
( Vmax, Km ) au importanţă la determinarea de enzime, inclusiv în laboratorul clinic.

3. Inhibitorii enzimelor
Inhibiţia reprezintă scăderea parţială sau pierderea activităţii enzimatice ca urmare a legării de
enzimă a unui compus numit inhibitor. Inhibiţia poate să fie un proces reversibil sau ireversibil.
a. Inhibiţia reversibilă
În cazul inhibiţiei reversibile inhibitorul se combină cu enzima sau cu complexul ES, iar
prin îndepărtarea inhibitorului activitatea enzimei se restabileşte.

k1
E+I EI
k2 [E] [I]
Ki =
Ki [EI]
ES + I ESI

Eficienţa unui inhibitor se măsoară prin Ki. Cu cât valoarea Ki este mai mic ă cu atât
inhibitorul este mai efficient.
Inhibiţia reversibilă este de două tipuri competitivă şi necompetitivă.

44
 Inhibiţia competitivă

În cazul inhibiţiei competitive inhibitorul intră în competiţie cu substratul pentru acelaşi loc de
legare la situsul activ al enzimei.

E+S ES E+P [E][I]

Ki =
[ EI]
E+I EI E+P

În cazul inhibiţiei competitive inhibitorul este un analog structural al substratului.

Exemplu:

CH2 COOH HC COOH

+
FAD
-
FADH
COOH 2 CH
CH2 HOOC

Enzima succinat dehidrogenaza, care catalizează această reacţie, este inhibată competitiv de
analogi structurali, ca de exemplu: acid malonic, acid oxalilacetic, acid oxalic.
Aceşti acizi dicarboxilici se pot lega de centrul activ al enzimei la fel ca şi succinatul.

Inhibiţia necompetitivă are loc prin legarea inhibitorului la un loc diferit de centrul activ
al enzimei, rezultând un complex ternar ESI. Inhibitor ul poate interacţiona fie cu enzima liberă,
fie cu complexul ES.
E+S ES E+P
+ +
I I Vmax
Ki Ki V'max =
1 + [I]/K

EI + S ESI

Pe de altă parte substratul se poate lega şi de complexul EI. Spre deosebire de inhibiţia competitivă
efectul inhibitorului necompetitiv nu este influenţat de creşterea concentraţiei de substrat.

45
 1/v
Inhibiţie competitivă

inhibiţie necompetitivă

1/Vm Reacţie fără

inhibitor

1/Vm

-1/Km -1/K’m 1/S

Un alt tip de inhibiţie reversibilă este inhibiţia necompetitivă (incompetitivă ), care are
loc atunci când se formeaz ă complexul ternar ESI, ca urmare a interacţiunii I cu complexul ES,
când are loc scăderea valorii Km şi Vmax.

b. Inhibiţia ireversibilă
Inhibiţia ireversibilă este consecinţa legării covalente a inhibitorului de enzimă sau de
complexul ES, el neputând fi îndep ărtat.
E+S ES E+P
+ +
I I

EI ESI

inactivi

Capacitatea inhibitorului ireversibil este măsurată printr-o constantă de viteză care exprimă
fracţiunea de enzimă inhibată într-o perioadă definită de timp la o anumită concentraţie de inhibitor.
Inhibitorii ireversibili sunt toxici, fiind numiţi şi otrăvuri enzimatice.
Exemplu: metalele grele, agenţii oxidanţi, organofosforicele, compuşi ai arseniului.

Semnificaţia şi importanţa practică a inhibiţiei enzimatice

1. Inhibiţia enzimatică este o modalitate importantă de control metabolic.
2. Unele toxice îşi exercită acţiunea datorită calităţii lor de inhibitori enzimatici
ireversibili. Exemplu: insecticidele
3. Inhibitorii enzimatici au aplicabilitate în toxicologia clinică, servind ca
antidoturi. Exemplu: etanolul este folosit ca antidot în intoxicaţiile cu metanol şi
etilenglicol.
4. Utilizarea inhibitorilor în enzimologie pentru identificarea mecanismului de acţiune şi a

46
centrilor activi.
5. Inhibiţia enzimatică este un instrument terapeutic
polivalent. Exemplu: agenţii chimioterapici, antiinflamatoarele
nesteroidiene.

4. Influenţa temperaturii asupra activităţii enzimatice

Viteza reacţiei enzimatice creşte odată cu temperatura, în intervalul în care enzima respectivă
este stabilă, datorită creşterii energiei cinetice a reactanţilor. În multe procese biologice o creştere
0
a temperaturii cu 10 C duce la dublarea sau triplarea vitezei de reacţie.
Temperatura optimă pentru majoritatea enzimelor este temperatura celulelor în care acestea
0
se găsesc. Peste temperatura de 50 – 60 C majoritatea enzimelor sunt inactive. Excepţie fac
0
unele microorganisme termofile ale căror enzime sunt active şi la 80 C.

5. Efectul pH-ului asupra activităţii enzimatice.

Enzimele sunt stabile într-un domeniu relativ îngust de pH, domeniu în care se g ăseşte o
valoare, numită pH optim, pentru care activitatea unei enzime este maximă.
Majoritatea enzimelor au pH-ul optim în jurul pH-ului fiziologic de 7,4.
Excepţii fac enzimele digestive pentru care pH-ul optim este cel acid, monoaminooxidazele
din membrana mitocondrială externă care au pH optim aproximativ 10. Există unele enzime a
căror activitate este independentă de pH ( pepsina ).

Reglarea activităţii enzimatice

Reglarea activităţii enzimatice este o componentă esenţială a procesului de control şi de

coordonare a metabolismului, în directă legătură cu menţinerea homeostaziei.
Fluxul reacţiei enzimatice poate fi influenţat prin 3 mecanisme generale:
- variaţii în cantitatea absolută de enzimă
- modificarea fondului metabolic celular de substrate şi cofactori, condiţionate şi de
transportul prin membrane
- schimbări în eficienţa catalitică a enzimelor.

Enzimele allosterice
Enzimele allosterice sunt alcătuite din subunităţi care interacţionează în cursul procesului
catalitic, fenomen ce se numeşte cooperativitate.
Activitatea acestor enzime este controlată prin legarea necovalentă a unor metaboliţi specifici
în locuri distincte de centrul activ, locuri ce se numesc centri alosterici.
Deci, proteinele (enzimele) allosterice sunt oligomeri alcătuiţi din monomeri identici sau nu,
aflaţi în număr par. Fiecare monomer posedă un centru activ şi locuri separate şi diferite de
situsul activ numite centri alosterici.
O enzimă allosterică catalizează de obicei o etapă iniţială din secvenţa multienzimatică a
unei căi metabolice. Reacţiile enzimelor allosterice sunt ireversibile sau cu grad redus de
reversibilitate, reprezenţînd astfel puncte de control pentru întregul lanţ de reacţii. Astfel, când
produsul final al căii metabolice se acumulează peste concentaţia necesară, el funcţionează ca
modulator negativ al enzimei. Acest efect se numeşte inhibiţie prin produs final, inhibiţie
feedback sau retroinhibiţie.
Exemplu:

47
 E1 E
P
2

S S1 S2

P inhiba enzima

- aspartat transcarbamilaza, enzimă ce catalizează prima reacţie din procesul de sinteză a

ribonucleotidelor pirimidinice.

Importanţa biomedicală şi farmaceutică

Enzimologia aduce un aport important atât în prob lemele de diagnostic cât şi în ceea ce
priveşte terapia cu enzime.
I. Diagnosticul enzimatic
Diagnosticul enzimatic se bazează pe informaţiile furnizate de dozarea enzimelor din ser.
Determinările enzimatice din hematii şi leucocite, precum şi din material bioptic sunt mai
puţin abordate. Se mai urmăresc unele enzime şi în urină, suc gastric şi suc duodenal.
În funcţie de locul de producere şi modul în care ajung în sânge, enzimele serice se
clasifică astfel:
9. Enzime secretate activ; se produc în ficat şi se eliberează în plasmă, unde
îndeplinesc un anumit rol fiziologic.
Exemplu: lipoproteinlipaza, pseudocolinesteraza, lecitin –colesterol- acil- transferaza.
10. Enzime ale secreţiilor exocrine. Acestea se produc în diferite organe şi difuzează
pasiv în plasmă.
Exemplu: amilaza salivară şi pancreatică, lipaza pancreatică, fosfataza acidă prostatică,
fosfataza alcalină.
11. Enzime celulare. Aceste enzime se găsesc în plasmă în cantităţi de sute de ori mai
mici decât în ţesuturi.

12. Enzimele inductibile, sintetizate în exces ca răspuns la un agent imductor, şi ca atare

îmbogăţesc plasma.
Exemplu: γ- glutamil transpeptidaza, enzimele de hidroxilare, glicuronozil-transferaza.
Izoenzimele
Izoenzimele sunt enzime ce îndeplinesc acelaşi rol catalitic, dar diferă prin proprietăţile
structurale, fizice, chimice, cinetice şi imunologice.
Din punct de vedere structural sunt oligomeri alcătuiţi din subunităţi identice sau diferite.
Exemplu:
1. lactat dehidrogenaza prezintă 5 izoenzime LDH, care se deosebesc prin
proporţia în care sunt distribuite. Cele 5 izoenzime rezultă prin combinarea difertă a 2 tipuri
de lanţuri, notate cu H (subunitate de origine miocardică) şi M (subunitate ce provine din
muşchi).
LDH1 : H4
LDH2 : H 3M
LDH3: H 2M2
LDH4 : HM3
LDH5 : M4
Aceste enzime se dozează în studiul leziunii de organ şi anume în boli cu citoliză.
2. Creatin – kinaza prezint ă 3 izoenzime, şi anume:
48
 CK1 : BB
CK2. BM
CK3 : MM
Aceste izoenzime sunt dozate în infarctul miocardic

Terapia cu enzime.

Pentru multe medicamente atât ac ţiunea principală cît şi efectele secundare sunt în
legătură directă cu diferite activităţi enzimatice.
Enzimele sunt agenţi terapeutici unici ce produc efecte importante şi specifice.
Enzimele sunt introduse în terapie din aproximativ 1930.
Medicamentul enzimatic apare în diferite forme solide, soluţii buvabile, soluţii injectabile
precum şi preparate destinate uzului local.
Terapia cu enzime este indicată în afecţiuni digestive şi boli genetice, boli cardio-
vasculare, neoplazii sau ca medicamente antiinflamatoare în dermatologie, oftalmologie, ORL,
reumatologie, afecţiuni bronşice.
Metode şi surse de obţinere a enzimelor terapeutice:
- Extragerea din diferite ţesuturi sau lichide biologice umane (placenta, sâng e, urină) sau
animală şi purificarea corespunzătoare.
- Culturi de celule mamifere sau bacterii din sol.
- Surse vegetale
- În ultimul timp tehnologia ADN-ului recombinat.
Exemplu: - streptokinaza, urokinaza, enzime ce se obţin prin biotehnologie. Aceste enzime reduc
mortalitatea prin infarctul de miocard.