NOTE DE CURS AN UNIVERSITAR 2015-2016 BIOLOGIE

MOLECULARĂ anul II, Specializarea Biochimie

Titular curs Prof. Dr. Marieta Costache LP –Asist. Dr. Sorina Dinescu
STRUCTURA NOTE DE CURS
STRUCTURĂ ACIZI NUCLEICI –RAPEL
I. NOTE DE CURS BM1 - STRUCTURA MOLECULARĂ A
CROMOZOMILOR ŞI GENELOR II. NOTE DE CURS BM2 -
ORGANIZAREA MOLECULARĂ,
EXPRESIA ŞI REGLAREA GENELOR EUCARIOTE III. NOTE DE CURS
BM3 - REGLAREA INIŢIERII
TRANSCRIPŢIEI IV. NOTE DE CURS BM4 - PROCESAREA ARN,
TRANSPORT NUCLEAR ŞI CONTROL POST- TRANSCRIPŢIONAL V.
NOTE DE CURS BM5 - TRADUCEREA VI. NOTE DE CURS BM6 -
REPLICAREA
-ÎMPACHETAREA ADN: HISTONELE
CHAPERONE ŞI CĂILE DE ASAMBLARE NUCLEOSOMALĂ
2
 I. NOTE DE CURS BM1 - STRUCTURA MOLECULARĂ A
CROMOZOMILOR ŞI GENELOR
Scurt istoric- Biologia Moleculara- slide-urile 2-15
SLIDE 27. Reprezentare clasică a unei celule procariote Figura: Reprezentare clasică
a unei celule procariote (după Campbell, et al., Biology, 2002).
Unul dintre criteriile care stau la baza clasificării organismelor este absenţa sau prezenţa
nucleului individualizat. Celulele procariote lipsite de un veritabil nucleu, includ eubacteriile şi
archeobacteriile. De cealaltă parte se află celulele eucariote care posedă o membrană nucleară care
separă cromozomii de restul celulei. Cromozomul unic al celulelor procariote este format dintr-o
moleculă de ADN dublu catenar circulară care conţine câteva milioane de perechi de baze. În
general, genoamele eucariotelor au o mărime şi o complexitate variabilă şi conţin mai mulţi
cromozomi.
Atât celulele procariote cât şi cele eucariote posedă mecanisme, pe de o parte comune şi
pe de altă parte distincte, pentru reglarea expresiei genelor şi a fluxului de informaţie de la ADN
la proteine. Transcripţia ADN realizată de ARN polimeraze constituie prima etapă, comună la
toate organismele. La celulele procariote, ribozomii se fixează pe molecula de ARNm, în curs de
sinteză, şi realizează traducerea imediată a informaţiei în proteine, în citoplasmă. Din contră, la
eucariote membrana celulară separă locul în care se realizează transcripţia de cel în care are loc
traducerea. Transcriptul primar, ARNm imatur, conţine o succesiune de secvenţe netraduse,
numite introni, care vor fi eliminate prin procedeul de scindare a intronilor şi sudare a exonilor
(„splicing”), în procesul de maturare a ARNm. În urma acestei etape, localizată în nucleu, ARNm
trece în citoplasmă unde este tradus. Maturarea ARNm prin „splicing” conferă celulei eucariote
posibilitatea diversificării informaţiei prin combinarea alternativă a exonilor, o altă etapă foarte
importantă în dezvoltarea organismelor.
Bacteriile, organismele procariote cele mai simple întâlnite în toate mediile naturale,
prezintă caracteristici comune. Adesea, un perete celular, format din peptidoglicani, înconjoară
membrana plasmatică şi conferă celulei o formă rigidă. De asemenea, este prezentă o membrană
externă care posedă un număr de flageli şi pili variabil. Bacteriile au un compartiment
citoplasmatic unic care conţine un nucleoid format dintr-o moleculă simplă circulară de ADN,
ARN şi proteine. Pe lângă ADN prezent în nucleoid, citoplasma majorităţii bacteriilor conţine mici
molecule circulare de ADN, numite plasmide. Cel mai adesea acestea conferă celulei rezistenţă la
antibiotice şi la alte toxine. În condiţii favorabile, bacteriile se multiplică rapid prin diviziune.
Capacitatea lor de adaptare la condiţiile de mediu şi de diviziune rapidă fac ca aceste celule să
constituie suporturi excelente pentru numeroase analize biochimice şi de biologie moleculară, in
vitro.
Deşi cea mai mare parte a genoamelor procariote sunt mai mici de 5 Mpb lungime, există
şi câteva mai mari. În prezentarea tradiţională, genomul tipic procariotelor conţine o singură
moleculă circulară de ADN, localizată la nivelul nucleoidului.
 Această abordare este adevărată pentru E. coli şi pentru multe alte bacterii foarte studiate,
dar specificăm că evoluţia cunoaşterii, în sfera genomului
3
procariotelor, pune în discuţie anumite concepte dezvoltate în era pre-genomică a microbiologiei.
Aceste aspecte se referă atât la structura fizică a genomului procariotelor cât şi la organizarea
genetică.
SLIDE 28. Punctul de vedere tradiţional asupra cromozomului
bacterian Tabel Mărimea şi complexitatea
genomului la câteva virusuri şi celule
Asemeni eucariotelor, genomul procariotelor trebuie să se încadreze într-un spaţiu foarte
restrâns. Cromozomul circular de la E. coli are o circumferinţă de 1,6 mm în timp ce dimensiunile
celulei sunt de 1,0 x 2,0 μm. Structurarea necesară este realizată, ca şi la eucariote, cu ajutorul
proteinelor de legare la ADN („DNA binding proteins”) care compactează genomul într-o formă
organizată. Structura obţinută nu prezintă similitudini substanţiale cu cromozomul de la eucariote
cu toate că din punct de vedere didactic este folosită exprimarea de „cromozom bacterian”.
Majoritatea cunoştinţelor pe care le avem despre organizarea ADN în nucleoid sunt
rezultatul studiilor pe E. coli. Genomul circular al E. coli este suprarăsucit. Suprarăsucirile apar
când ture suplimentare sunt introduse sau îndepărtate din structura dublei elice (suprarăsucire
pozitivă/negativă). Suprarăsucirea este modalitatea ideală de împachetare a unei molecule într-un
spaţiu redus. Primele dovezi că suprarăsucirile sunt implicate în împachetarea genomului circular
de la E. coli au fost obţinute în 1970 în urma examinării unor nucleoizi izolaţi, fiind confirmate
definitiv ca o trăsătură a celulelor vii în 1981. Se consideră că, la E. coli supra-răsucirile sunt
generate şi controlate de două enzime, ADN giraza şi ADN topoizomeraza I.
Cea mai plauzibilă explicaţie privind compactarea nucleoidului este aceea că ADN este
ataşat la proteine care restrâng capacitatea de relaxare, astfel încât rotaţia la nivelul unui situs de
scindare are ca rezultat pierderea unei suprarăsuciri dintr-un mic segment al moleculei. Modelul
curent propune ataşarea ADN de la E. coli pe structura unei proteine miez de la care radiază 40-
50 bucle în interiorul celulei. Fiecare buclă radiază în interiorul celulei şi conţine aproximativ 100
kpb de ADN suprarăsucit.
SLIDE 29. Compactarea cromozomului la E. coli Figura Model pentru structura
nucleoidului de E. coli
Componentele proteice ale nucleoidului includ ADN giraza şi ADN topoizomeraza I, cele
două enzime care sunt principale responsabile pentru menţinerea stării de suprarăsucire, ca şi un
set de aproximativ patru proteine considerate a avea un rol mai specific în împachetarea ADN
bacterian. Cea mai abundentă proteină este HU, care este foarte diferită structural de histonele
eucariote dar acţionează similar, formând un tetramer în jurul căruia se înfăşoară aproximativ 60
pb. În celula de E. coli sunt prezente aproximativ 60 000 copii ale HU care acoperă aproximativ
1/50 din molecula de ADN, dar nu se cunoaşte dacă tetramerii sunt distribuiţi de-a lungul ADN
sau sunt poziţionaţi numai în regiunea centrală a nucleoidului.
Discuţii pe tema structurii nucleoidului procariot
 În ultimii 10 ani a devenit foarte clar că anatomia genomului procariot dezvoltată pe baza
studiilor pe E. coli este foarte simplistă. Deşi marea majoritate a genoamelor bacteriene sau a
cromozomilor de la archeobacterii sunt circulari, a fost
4
descoperit un număr mare de forme lineare. Prima a fost descrisă pentru Borrelia burgdorferi, în
1989 de către Ferdows şi Barbour, următorii ani fiind realizate descoperiri similare pentru genul
Streptomyces şi alte bacterii.
Un alt aspect îl reprezintă prezenţa plasmidelor care reprezintă mici molecule de ADN,
adesea dar nu întotdeauna circulare, care coexistă cu cromozomul principal în celula bacteriană.
Anumite tipuri de plasmide sunt capabile de integrare în genomul principal, în timp ce altele pot
avea o existenţă independentă. Plasmidele conţin gene care, de obicei, nu se găsesc pe cromozomul
principal, dar care sunt, în multe cazuri, neesenţiale pentru bacterie, deoarece codifică pentru
fenotipuri cum sunt rezistenţa la antibiotice fără de care bacteriile pot trăi în condiţii de mediu
normale. Multe plasmide sunt capabile de transfer de la o celulă la alta, şi aceleaşi plasmide sunt
adesea regăsite în bacterii care aparţin la diferite specii. Trăsăturile diferite ale plasmidelor
sugerează că ele reprezintă entităţi independente care, în majoritatea cazurilor, nu sunt incluse în
definiţia genomului bacterian.
Pentru o bacterie de tipul E. coli, care are un cromozom de 4,6 Mpb şi care poate conţine
variate combinaţii de plasmide, nici una mai mare de câteva kilobaze, toate dispensabile, putem
defini cromozomul principal ca „genom”. În cazul altor procariote lucrurile nu stau la fel de
simplu. De exemplu, cromozomul linear al Borrellia burgdoferi care are 910 kpb şi conţine 853
gene, este însoţit de cel puţin 17 plasmide circulare şi lineare care împreună contribuie cu alte 533
kpb şi cu cel puţin 430 gene. Deşi, majoritatea acestor gene sunt ’orfane’ (fără funcţie identificată),
au fost identificate şi structuri indispensabile cum sunt genele pentru proteinele membranare şi
biosinteza purinelor. Se consideră că măcar unele din cele 17 plasmide de la Borrelia sunt
componente esenţiale ale genomului. Astfel, este admisă posibilitatea ca anumite procariote să
posede genoame constituite din mai multe componente care includ un număr separat de molecule
ADN. Această situaţie este mult mai apropiată de ceea care există la eucariote decât la procariotele
„tipice”. De fapt, interpretarea informaţiilor privind genomul de la Borrelia este încă controversată,
şi complicată datorită existenţei unei bacterii înrudite, Treponema pallidum, al cărei genom este
format dintr-o singură moleculă de ADN de 1138 kpb care conţine 1041 gene, este lipsit de orice
omologie cu genele prezente în plasmidele de la Borrelia.
Tabel Trăsăturile câtorva plasmide tipice Tip de plasmidă Funcţiile genelor Exemple
Rezistenţă Rezistenţă antibiotice Rbk la E. coli şi alte bacterii Fertilitate Conjugare şi transfer ADN
între bacterii
F de la E. coli
Ucigaşă („killer”) Sinteza de toxine care ucid
alte bacterii
Col de la E. coli; produce colicină
Degradativă Enzime pentru metabolismul
moleculelor neobişnuite
 TOL pentru Pseudomonas putida; metabolism toluen Virulenţă Patogenitate Ti de la
Agrobacterium tumefaciens; capacitatea de a determina formarea galelor la dicotiledonate O altă
complicaţie privind structura fizică a genoamelor procariote este legată de diferenţele dintre
sistemele de împachetare pentru moleculele de ADN de la bacterii şi archeobacterii. Una dintre
motivaţiile pentru care archeobacteriile sunt privite ca un grup distinct de organisme, diferite de
bacterii, este faptul că acestea nu posedă proteine de compactare de tipul HU, dar posedă
proteine mult mai
5
asemănătoare cu histonele. Cu toate că, informaţiile despre nucleoidul de la archeobacterii sunt
destul de incomplete, se presupune că proteinele asemănătoare histonelor au un rol important în
împachetare.
Cunoaştem deja că genomul bacterian are o structură genetică compactă cu foarte puţin
spaţiu între gene. Această organizare este foarte bine demonstrată şi tipică la genomul de la E. coli.
La acest organism ADN care nu codifică pentru diferite gene reprezintă numai 11% din total şi
este distribuit pe toată lungimea sub forma unor segmente mici. O serie de teorii susţin că
organizarea compactă este benefică pentru replicarea rapidă a genomului cu toate că ipotezele nu
pot fi susţinute de dovezi experimentale.
SLIDE 30. Conţinutul minim de gene şi identitatea genelor specifice Tabel. Catalog
comparativ de gene pentru E. coli, H. influentze, M. genitalium
Cu toate că numărul de genoame procariote secvenţializate integral creşte continuu, nu este
încă posibilă realizarea unui catalog complet cu conţinutul genelor fiecărei specii, din simplul
motiv că funcţiile anumitor gene rămân necunoscute. De exemplu, genomul de la E. coli conţine
4 288 gene care codifică pentru proteine dar peste 1 500 din acestea sunt orfane. Chiar dacă
informaţia este adesea incompletă, este interesant să examinăm rolul genelor ale căror funcţii sunt
cunoscute, şi să apreciem numărul diferit al genelor implicate în diferite activităţi biochimice la o
bacterie de tipul E. coli.
Cataloagele de gene sunt mult mai interesante când comparaţiile se realizează între diferite
specii. De exemplu, la E. coli 243 de gene sunt implicate în metabolismul energetic, la
Haemophylus influenzae numai 112 şi la Mycoplasma genitalium numai 31. Aceste comparaţii
pot duce la speculaţii privind numărul minim de gene necesar pentru supravieţuirea unei celule.
Majoritatea demersurilor realizate în acest sens au demarat cu studiul celor mai mici genoame, cel
al Mycoplasma genitalium şi cel a Mycoplasma pneumoniae, care conţin numai 470 şi respectiv
679 gene. Consideraţii teoretice au dus la sugestia că 256 gene reprezintă minimul necesar, dar
experimentele de inducere de mutaţii sugerează că pentru Mycoplasma sunt necesare minim 300.
Studii similare interesante au fost realizate pentru genele specifice care determină distincţia dintre
o specie şi alta. Din cele 470 gene ale genomului de la M. genitalium, 350 sunt prezente şi la
bacterii mai îndepărtate evolutiv, cum este Bacillus subtilis. Aceasta sugerează că trăsăturile
biochimice şi structurale care disting Mycoplasma de Bacillus sunt codificate în aproximativ cele
120 gene care sunt unice la fiecare tip. Din nefericire, astfel de comparaţii privind genele
particulare nu dau răspunsuri cheie privind caracteristicile care individualizează fiecare tip de
microorganism.
SLIDE 31. Operonii sunt caracteristici ale genoamelor procariote Figura. Diferite tipuri de operoni:
a) operonul lactoză de la E. coli; b) operonul triptofan de la E. coli; c) operonul mixt de la Aquifex
aeolicus
Cea de a doua caracteristică a genomului de la procariote, ilustrată la E. coli, este prezenţa
operonilor. Operonii reprezintă un grup de gene localizate una lângă cealaltă. Toate genele din
structura unui operon sunt exprimate ca o singură unitate. Acest tip de aranjament este comun
genoamelor procariote şi poate fi ilustrat la E. coli cu operonul lactozei care a fost descoperit în
1961 de către Jacob şi Monod. Acesta conţine trei gene implicate în transformarea dizaharidului
lactoză în unităţile sale componente (glucoză şi galactoză). Genele operonului lactoză sunt
implicate în utilizarea lactozei ca sursă de energie de către E. coli. Deoarece, lactoza nu este o
6
componentă comună a mediul înconjurător pentru E. coli, majoritatea timpului operonul nu este
exprimat şi enzimele pentru utilizarea lactozei nu sunt sintetizate de bacterie. Când lactoza devine
disponibilă se realizează activarea operonului şi cele trei gene sunt exprimate împreună. Operonul
lactoză reprezintă un exemplu clasic de reglare a expresiei genelor la bacterii (Figura a).
La E. coli şi la Bacillus subtilis există aproximativ 600 operoni. În majoritatea cazurilor,
genele unui operon sunt corelate funcţional şi codifică pentru un set de proteine implicate într-o
anumită cale metabolică, cum ar fi utilizarea unui glucid ca sursă de energie sau sinteza unui
aminoacid (operon triptofan, Figura b). La alte bacterii sau archeobacterii există posibilitatea ca
operonii să conţină gene implicate în diferite căi metabolice. Este cazul unuia dintre operonii de la
Aquiflex aeolicus care conţine şase „gene linkate” care codifică pentru: i) două proteine implicate
în recombinare; ii) o enzimă folosită în sinteza proteică; iii) o proteină necesară pentru mobilitate;
iv) o enzimă utilizată în sinteza nucleotidică; v) o enzimă pentru sinteza lipidică (Figura c). În
concluzie, teoria că expresia unui operon conduce la sinteza coordonată a mai multor enzime
necesare pentru o singură cale metabolică nu este valabilă pentru toate speciile.
SLIDE 32. Structura materialului genetic la eucariote Nucleul celulei eucariote
Figura . Nucleul celular şi caracteristicile sale (după Campbell, et al., Biology,
2002). Structura materialului genetic la eucariote
În ciuda diferenţelor evidente de formă şi de funcţie, diferitele tipuri celulare care compun un
organism multicelular, fie că este vorba de o ciupercă sau de un mamifer, conţin un lot complet de
gene. Văzută din exterior o celulă din constituţia unui cartilaj şi un neuron nu se aseamănă deloc.
Cu toate acestea cele două tipuri celulare conţin acelaşi complement de gene.
Informaţia genetică, prezentă într-o celulă eucariotă specializată, se poate compara cu o
carte care conţine toate informaţiile necesare construcţiei unei clădiri cu utilităţi multiple. În
cursul realizării construcţiei, sunt probabil necesare toate planurile dar numai o mică parte a
informaţiei va trebui consultată în timpul activităţii de construcţie a unui etaj sau a unei singure
camere. Această abordare este adevărată şi pentru un ovul fecundat, care conţine ansamblul
instrucţiunilor genetice, şi care este fidel replicat şi informaţia distribuită tuturor celulelor
organismului în dezvoltare. În consecinţă, celulele poartă mult mai multă informaţie genetică
decât pot utiliza vreodată. Acestea posedă mecanisme care le permit să exprime informaţia
genetică, în mod selectiv, urmând numai instrucţiunile care privesc numai o singură celulă într-
un moment particular al existenţei acesteia. În acest subcapitol, o să analizăm modalităţile care le
permit celulelor eucariote să structureze totalitatea materialului genetic pe care îl conţin, în
condiţiile controlului coordonat al expresiei genelor menite să asigure numai sinteza anumitor
proteine. Mai întâi vom descrie structura şi proprietăţile nucleului celulei eucariote, care conţine
majoritatea informaţiei genetice şi mecanismele de reglare a acesteia. Nucleul celulei eucariote
În ciuda importanţei sale pentru stocarea şi utilizarea informaţiei genetice, nucleul celulei
eucariote posedă o morfologie destul de comună. Conţinutul nuclear reprezintă o masă vâscoasă
amorfă de materie, închisă într-un înveliş nuclear complex. În nucleul unei celule tipice, în
interfază, se evidenţiază: i) cromozomii, prezenţi sub forma unor fibre nucleoproteice foarte
alungite, cromatina; ii) matricea nucleară care este formată dintr-o reţea fibrilară care conţine
proteine; iii) unul sau
7
mai mulţi nucleoli, structuri amorfe, opace la microscopie electronică care sunt sediul sintezei
ARN ribozomal şi al asamblării ribozomilor; iv) nucleoplasma, substanţă lichidă care conţine
toate componentele şi elementele nucleului eucariot. În figura sunt ilustrate schematic diferitele
elemente ale nucleului eucariot. Învelişul nuclear
În opoziţie cu termenul de membrană nucleară, învelişul nuclear desemnează structura
complexă care se află la frontiera dintre nucleul şi citoplasma unei celule eucariote. Într-o celulă,
separarea materialului genetic şi a citoplasmei care îl înconjoară este poate caracteristica cea mai
importantă care distinge eucariotele de procariote. Apariţia învelişului nuclear este cu siguranţă un
punct de reper în evoluţia biologică. Învelişul nuclear constă în mai multe elemente distincte.
Continuitatea învelişului care delimitează nucleul este asigurată de două membrane concentrice
separate de un spaţiu intermembranar de 10 la 50 nm. Cele două membrane sunt fuzionate din loc
în loc şi formează pori circulari care sunt compuşi dintr-un ansamblu complex de proteine.
Densitatea porilor nucleari variază de la aproximativ 2 la 4 pe μm2 în învelişul nuclear al
eritrocitelor de pasăre, relativ inactiv din punct de vedere metabolic, la mai mult de 60 μm2 în cel
al ovocitelor care se pregătesc să răspundă nevoilor viitoare ale dezvoltării embrionare.
O celulă de mamifere, de mărime medie, posedă aproximativ 3 000 de pori nucleari.
Membrana externă este în general presărată cu ribozomi şi adesea în continuitate cu membrana
reticulului endoplasmatic.
Suprafaţa internă a învelişului nuclear este bordată de o plasă fibrilară densă, numită lamina
nucleară. În anumite celule, cum este ovocitul de amfibian, această lamină formează un strat
continuu, în timp ce în altele pare mult mai fragmentată. Considerăm că lamina nucleară reprezintă
un suport structural pentru învelişul nuclear şi serveşte la fixarea fibrelor de cromatină la periferia
nucleului.
Fibrilele laminei nucleare au un diametru de aproximativ 10 nm şi sunt compuse din
polipeptide numite lamine, care aparţin aceleiaşi superfamilii de polipeptide care compun
filamentele intermediare ale citoscheletului. Ca şi pentru componentele intermediare ale
citoplasmei, integritatea laminei nucleare este controlată de către procesul de
fosforilare/defosforilare. Dezasamblarea laminei nucleare, înainte de mitoză, este indusă de către
fosforilarea laminelor de către o kinază specifică.
SLIDE 33-40. Ciclul Celular - principalele stadii ale fazei M într-
o celulă animală Ciclul celular normal şi mecanisme de control Ciclul celular
Ciclul celular reprezintă totalitatea modificărilor şi transformărilor suferite de celulă în
timpul procesului de replicare şi diferenţiere.
Într-o populaţie de celule ce se divid, replicarea şi diviziunea unei celule în două celule
fiice identice cuprinde 2 faze funcţionale şi 2 faze preparatorii.
Fazele funcţionale sunt reprezentate de :
• copierea precisă a ADN: faza S (de replicare a ADN);
• segregarea sau împărţirea setului de cromosomi între cele două celule fiice: faza M (mitoza).
Celula se pregateşte biologic pentru faza S într-o fază preparatorie, numită G1 şi pentru mitoză
într-o fază mult mai puţin înţeleasă, G2.
Celulele ce nu se mai divid pot fi permanent scoase din ciclul celular prin diferenţiere
terminală, sau pot fi oprite într-o stare intermediară, G0, (celular resting).
8
Evenimentele ce presupun desfăşurarea unui ciclu celular intervin într-un mod organizat, astfel
încat anumite evenimente se termină înainte ca altele să înceapă. Această ordine a evenimentelor
este controlată de o serie de mecanisme de control intracelulare incomplet elucidate şi este
influenţată de factori extracelulari: factori de creştere, mitogeni şi antimitogeni, inductori de
diferenţiere, contact celulă-celulă sau factori de ancorare, nutrienţi, etc. Fig. 1. Fazele ciclului
celular
Notatii: Go=faza de repaus G1=faza de presinteză ADN G2=faza de postsinteză ADN S =faza de
replicare a ADN M=faza de mitoză Controlul ciclului celular Factorii ce influenţează ciclul
celular sunt:
• Factori extracelulari: -factori de creştere; -factori mitogeni; -factori antimitogeni;
-inductori ai diferenţierii celulare;
• Factori intracelulari: -cicline; -cdk - kinaze ciclin dependente; -proteine codate de gene
supresoare ale tumorii:-p53, Rb-1; -PCNA - proliferating cell nuclear antigen; -gena myc.
Abilitatea celulei de a produce o copie exactă a ei însăşi, prin diviziune, este o componentă
esenţială a vieţii celulare. Acest proces trebuie realizat cu mare fidelitate, astfel încât
organismele să fie capabile să se înmulţească. Mecanismul molecular de control al ciclului
celular utilizat de celulă are un nivel înalt de organizare şi este relativ bine conservat în cursul
evoluţiei speciilor.
Ne aflăm de-abia la începutul revelării mecanismului implicat în acest proces complicat,
în care sunt implicate numeroase semnale intra- şi extracelulare. Deşi în timpul procesului
evoluţiei şi al diferenţierii celulare pot interveni anumite schimbări subtile, genetice sau
epigenetice, în orice fază a ciclului celular, aceste schimbări trebuie să se producă într-un mod
controlat, pentru a preveni urmări dezastruoase.
Lipsa fidelităţii în procesul de reproducere a celulelor crează o situaţie de instabilitate
genetică care pare a fi un factor contributiv semnificativ în dezvoltarea celulelor maligne în
organismele eucariote avansate.
Deci nu este surprinzător că boala canceroasă este caracterizată printr-o reglare anormală
a creşterii şi a reproducerii celulare. Pentru a întelege cum debutează cancerul şi pentru a dezvolta
strategii optime pentru a elimina celulele canceroase, trebuie să fie identificate diferenţele, chiar
la nivel molecular, între celula normală şi celula canceroasă.
Fenomenul cheie al tranziţiei de la o etapă la alta a ciclului celular este reprezentat de
acţiunea enzimatică a unei anumite kinaze ciclin-dependente. Forma activă a acestor enzime se
realizează prin formarea unui complex cu o anumită proteină specifică unui anumit stadiu al
ciclului celular. Aceste proteine se numesc cicline.
9
Tabel - Kinazele ciclin dependente (cdk), ciclinele şi substraturile kinazelor din diverse faze ale
ciclului celular
FAZA
KINAZA CICLIN-
DEPENDENTĂ CICLINA SUBSTRATUL
KINAZELOR G1 cdk2 Ciclina D Rb-1
G1/S cdk2 Ciclina E Rb-1
S cdk2 Ciclina A ?
G2/M cdk2 Ciclina B/A ?

Dat fiind că progresia celulei în ciclul celular este condiţionată de activitatea cdk,
controlul activităţii acestor enzime şi a complexelor pe care acestea le formează cu ciclinele,
constituie un mecanism esenţial de reglare a ciclului celular. Acest tip de control acţionează la
mai multe niveluri: 1. Sinteza ciclinelor
Condiţionarea sintezei unui anumit tip de ciclină se face în funcţie de etapa ciclului
celular. Din punct de vedere cantitativ, sinteza de cicline depinde de: - amploarea semnalelor
extracelulare ce favorizează proliferarea (hormoni, factori de crestere); - intensitatea degradării
proteolitice a ciclinelor.
Complexul cdk-ciclină activat fosforilează substraturile necesare tranziţiei celulei la
urmatoarea fază a ciclului.
Controlul ciclului celular prin kinaze ciclin-dependente. 2. Blocarea activităţii enzimatice
a cdk – se realizează prin fosforilarea cdk sau prin legarea lor de inhibitori ai kinazelor ciclin-
dependente (CKI), proces ce împiedică formarea complexului activ cu ciclinele.
Tabel- Complexele cdk-ciclină şi inhibitorii acestora în funcţie de etapele ciclului celular
COMPLEXUL CDK-CICLINĂ
KIP (inhibitori ai cdk)
INK (proteine inhibitoare ale kinazelor)
FAZA
cdk 4-Ciclina D p21 p27
p15, p16 p18, p19
G1
cdk 2-Ciclina E p21, p27 - G1/S
cdk 2-Ciclina A p 21 - S
cdk 2-Ciclina B p21 - G2/M
Mai explicit, activitatea cdk este controlată la cel puţin 6 nivele: 1. Fiecare ciclină este
sintetizată într-un anumit stadiu al ciclului celular. Ciclinele D şi E sunt sintetizate în faza G1,
ciclina A în fazele S şi G2, ciclina B în fazele G2 şi M;
10
2. Degradarea ciclinelor este reglată în mod riguros; 3. Ciclina poate forma un complex cu o cdk
(kinază ciclin-dependentă); 4. Acest complex devine activ prin acţiunea unei CAK (cdk
activating kinase); 5. Cdk sunt inactivate prin fosforilare în poziţia Thr14 şi Tyr15 şi pot fi
reactivate prin acţiunea unei fosfataze în aceleaşi poziţii, 6. Proteine inhibitoare de cdk pot fie
preveni asamblarea complexelor cdk-ciclină, fie inactiva cdk din complexele formate.
Complexul cdk-ciclină activat fosforilează substratele necesare tranziţiei celulei la
urmatoarea fază a ciclului. Anumite evenimente intracelulare sau extracelulare pot determina
oprirea parcurgerii ciclului celular:
• denutriţia;
• schimbări drastice de temperatură;
• factori de stres;
• alterarea ADN, etc. Afectarea ADN celular este cel mai studiat semnal de iniţiere a sistemelor
de control ale ciclului celular. Detectarea de erori de copiere a genomului celular determină
sechestrarea celulelor în faza G1 sau, dacă aceasta a fost depaşită, în faza S, inhibându-se atât
iniţierea replicării, cât şi elongaţia. Blocarea ciclului celular se face prin intermediul inhibitorilor
kinazelor ciclin-dependente. Există mecanisme specifice de reglare a fiecărei etape ale ciclului
celular:
• Tranziţia G1 - S În faza G1 a ciclului celular există un punct de control cunoscut drept punctul
de restricţie, R. El marchează fosforilarea proteinei Rb (a retinoblastomului) prin intervenţia
complexului holoenzimatic format de cdk 4 cu ciclina D. Consecinţa este anularea acţiunii
inhibitorii pe care o are proteina Rb în forma hipofosforilată şi legarea acesteia la nivelul unor
secvenţe specifice ale ADN prin intermediul unor factori de transcripţie de tipul proteinei myc.
Acţiunea inhibitorie a proteinei Rb înainte de fosforilare se manifestă prin legarea de un alt
factor de transcripţie, E2F. Complexul astfel format este capabil să lege ADN, dar nu poate iniţia
transcripţia. E2F devine capabil să-şi îndeplinească rolul de factor de transcripţie doar după
fosforilarea proteinei Rb, când factorul E2F redevine liber. Astfel se activează transcripţia
genelor ai căror produşi sunt necesari pentru trecerea la faza S a ciclului celular şi pentru
desfaşurarea corespunzătoare a copierii ADN. Se consideră că proteina Rb este factorul-cheie
pentru trecerea în faza S a ciclului celular.
Alterarea ADN celulei aflate în faza G1 induce sinteza în cantităţi mai mari a proteinei
oligodimerice p53. Aceasta induce transcripţia genei p21, sintetizându-se astfel cantităţi crescute
de proteina p21, un inhibitor multipotent al kinazelor ciclin- dependente. Consecinţa finală este
inhibarea fosforilării proteinei Rb şi, deci, blocarea progresiei ciclului celular. Se consideră că
proteina p53 induce şi transcripţia unor compusi implicaţi în procesele de reparaţie a ADN. În
condiţiile în care defectul este mult prea grav pentru a fi reparat, p53 contribuie la declanşarea
apoptozei.
• Faza S
Mecanismele de reglare a parcurgerii fazei S nu sunt suficient cunoscute. Se ştie că, imediat
după iniţierea replicării ADN-ului, se formează complexul activator, cdk-ciclina A. Consecinţa
este fosforilarea şi, deci, activarea proteinelor care se leagă la nivelul situsurilor de replicare
autonomă unde debutează acest proces. Odată ce ADN a fost copiat în întregime, celula intră în
faza G2.
• Tranziţia G2-M
11
 Primul factor reglator descris ca fiind implicat în tranziţia de la faza G2 la faza M a fost
factorul de promovare a mitozei, MPF. MPF este de fapt complexul cdk2- ciclina B care, acţionând
pe un substrat-cheie necunoscut, determină trecerea la faza M.
• Faza M Faza debutează după activarea complexului cdk2-ciclina B. Iesirea din faza mitozei şi
intrarea în stadiul G1 este marcată de distrucţia proteolitică a ciclinei B şi de inactivarea cdk2.
Reglarea extracelulară a ciclului celular
Celula integrează continuu semnale extracelulare cu rol în controlul mecanismelor de
diviziune celulară. Statutul nutriţional, contactul celulă-celulă şi peptidele extracelulare
influenţează evenimentele intracelulare.
SLIDE 41. Structura şi funcţia complexului porilor nucleari Figura. Complexul porului
nuclear, model schematic (după Molecular Cell Biology Lodish H., et. al., 2000)
Învelişul nuclear este o barieră care separă două din cele mai importante compartimente
ale celulei, nucleul şi citoplasma, porii fiind porţi în această barieră. Contrar membranei
plasmatice, care împiedică trecerea macromoleculelor între citoplasmă şi spaţiul extracelular,
anvelopa nucleară este un centru activ pentru ARN şi proteinele care se deplasează în cele două
sensuri, între compartimentele pe care aceasta le separă. Replicarea şi transcripţia materialului
genetic, care au loc în nucleu, necesită participarea unui mare număr de proteine care se
sintetizează în citoplasmă şi sunt transportate prin învelişul nuclear. Invers, moleculele de ARNm,
ARNt şi subunităţile ribozomilor care sunt fabricate în nucleu trebuie să fie transportate prin
membrana nucleară.
Anumite elemente, cum sunt moleculele ARNsn (ARN „small nuclear”), se deplasează în
cele două direcţii. Acestea sunt sintetizate în nucleu, se asamblează în particule ribonucleoproteice
(RNP), în citoplasmă, şi sunt reimportate în nucleu unde intervin în maturarea ARNm. Acest trafic
intens se realizează prin porii nucleari. Ţinând seama că particule materiale, de talia subunităţilor
ribozomale, pot să treacă prin porii nucleari, putem presupune că aceştia sunt canale deschise dar,
de fapt, este exact contrar. Porii nucleari conţin un aparat complex, în formă de coş, numit
Complexul Porului Nuclear (CPN) care obturează porul ca un dop şi care se reliefează în afară în
citoplasmă şi în nucleoplasmă. Structura CPN este prezentată în modelul schematic din figura din
Slide 16 şi în micrografiile electronice din Slide 17.
SLIDE 42. Porul nuclear-imagini de microscopie electronică Figura Anvelopa nucleară a
ovocitelor de Xenopus vizualizată prin microscopie electronică: a) faţa citoplasmatică a complexului
porului nuclear (CPN); b) faţa nucleoplasmatică a anvelopei nucleare după îndepărtarea membranei
nucleare a CPN, evidenţiind structura sub formă de coş; c) faţa nucleoplasmatică a anvelopei nucleare
după îndepărtarea membranei nucleare prin tratament blând cu detergent. Reţeaua laminară, care se
inserează în inelul nuclear al NPC, este expusă după acest tratament (după Molecular Cell Biology
Lodish H., et. al., 2000)
CPN este un enorm complex molecular cu simetrie octogonală care se estimează că are în
structură 100 la 200 polipeptide. Masa CPN este de aproximativ 30 ori mai mare decât masa unui
ribozom. Structura moleculară a complexului CPN a fost determinată de-a lungul timpului graţie
tehnicilor de microscopie electronică şi de
12
analiză de imagini din ce în ce mai performante. Dacă sunt injectate soluţii, ale moleculelor cu
masă moleculară mică, în citoplasma unei celule acestea pot penetra rapid în porii nucleari prin
simplă difuzie. Experimentul sugerează că aceste substanţe sunt capabile să treacă printre fantele
existente între razele coşului.
Capacitatea moleculelor mai mari (proteine şi nucleoproteine) de a trece din citoplasmă în
nucleu depinde de sediul lor obişnuit de rezidenţă, în nucleu sau în afara acestuia. De exemplu,
dacă o proteină citoplasmatică, cum este albumina serică bovină, este marcată radioactiv şi
injectată în citoplasmă, ea are tendinţa de a rămâne acolo. Din contră, dacă injectarea este realizată
cu o proteină cu localizare nucleară, nucleoplasmina, proteina marcată va fi regăsită imediat în
nucleu.
SLIDE 43. Mecanisme de transport În 1982, Robert Laskey şi colaboratorii săi de
la Medical Research Council, Anglia, au descoperit că nucleoplasmina, una dintre cele mai
abundente proteine nucleare din ovocitele de amfibieni, conţine o secvenţă de aminoacizi în
apropierea extremităţii C terminale care funcţionează ca un Semnal de Localizare Nucleară
(SLN), care îi permite să treacă prin porii nucleari şi să intre în nucleu. De atunci au fost
identificate o serie de alte SLN, cea mai mare parte a acestora fiind constituite din scurte
secvenţe de aminoacizi cu sarcină pozitivă. În principiu, orientarea (adresarea) proteinelor către
nucleu este asemănătoare cu transportul altor proteine care sunt distribuite în anumite organite,
de tipul mitocondriei sau peroxizomilor. În toate cazurile, proteinele posedă o „etichetă”
specifică care este recunoscută de către un receptor particular de la suprafaţa organitului ţintă.
Importul proteinelor în nucleu trece prin mai multe etape: i) proteina care trebuie importată
se cuplează cu un receptor pentru SLN care pare a fi localizat la suprafaţa filamentelor depărtate
de inelul extern al porului către citoplasmă; ii) interacţia între proteina nucleară şi receptorul pentru
SLN permite acostarea proteinei pe faţa citoplasmatică a complexului porului nuclear prin
formarea unui complex de transport; iii) deplasarea complexului de transport prin por necesită
energie eliberată din hidroliza ATP. Aceasta implică o modificare a conformaţiei transportorului,
structură mare în formă de dop (inel intern) situată în centrul complexului porului nuclear.
Modificarea de conformaţie deschide un canal în centrul transportorului şi permite moleculelor
situate în proximitatea acestuia să pătrundă în nucleoplasmă. După acelaşi principiu, substanţele
care trec din nucleu în citoplasmă declanşează, probabil, deschiderea transportorului în sens invers.
În figura este prezentat un model schematic de import nuclear al unei proteine (cargo) după
cuplarea acesteia cu semnalul de localizare nucleară (SLN). În citoplasmă, importinele α şi β
interacţionează cooperativ cu proteina cargo care urmează a fi transportată, prin legarea importinei
α la SLN. Subunitatea importinei α, din complexul cargo trimeric rezultat, interacţionează cu
componentele CPN, translocând complexul în nucleoplasmă prin mecanisme destul de puţin
cunoscute. Această translocare necesită hidroliza ATP. În nucleoplasmă, Ran-GTP interacţionează
cu importina β, determinând disocierea complexului cargo şi eliberând proteina transportată în
nucleoplasmă. Pentru a susţine un alt ciclu de import, importina α monomeră şi complexul
importină β-Ran-GTP sunt transportate înapoi în citoplasmă. Proteina de activare RanGAP (Ran
GTP activating protein), din citoplasmă, stimulează transformarea Ran-GTP la Ran-GDP având
drept rezultat o transformare conformaţională la nivelul Ran care determină disocierea de
importina β. Importina β liberă interacţionează apoi cu importina α şi se formează un nou complex
cargo purtător al unui semnal bazic SLN, care iniţiază un alt ciclu de import nuclear.
13
Se presupune că Ran-GDP este şi el translocat prin porii nucleari din citoplasmă în nucleoplasmă,
unde factorul nucleotidic de schimb, Ran (RCC1), determină eliberarea GDP şi relegarea GTP.
SLIDE 44. Influenţa semnalului de localizare nucleară Un por nuclear individual este
capabil să importe proteine şi să exporte ARN şi ribonucleoproteine. Acest transport
bidirecţional poate fi vizualizat prin microscopie electronică. De asemenea, tendinţa de
acumulare în unul dintre cele două compartimente celulare a unor proteine purtătoare de semnale
de localizare în citoplasmă sau în nucleu poate fi vizualizată prin microscopie de fluorescenţă sau
confocală.
Semnalul de Localizare Nucleară (SLN) al antigenului T (SV40) poate direcţiona o
proteină citoplasmatică în nucleu:
a) piruvat kinaza normală, localizată în citoplasmă, vizualizată prin imunofluorescenţă
după tratarea celulelor în cultură cu un anticorp specific;
b) piruvat kinaza himeră, care conţine un semnal SNL al SV40 la capătul său N-terminal,
este direcţionată către nucleu. Proteina himeră a fost exprimată în urma transfecţiei unei gene
modificate produsă prin fuziunea unui fragment al unei gene virale care codifică NLS al SV40 cu
gena piruvat kinazei (după Molecular Cell Biology Lodish H., et. al., 2000).
SLIDE 45. Matricea nucleară Figura. Localizarea situsurilor de sinteză
şi de maturare a pre-ARN cu sonde fluorescente: a) vizualizarea procesului de transcripţie prin
colorare cu DAPI pentru evidenţierea genei şi cu anticorpi faţă de heterogen nuclear
ribonucleoproteine, marcaţi cu fluoresceină; b) evidenţierea procesului de poliadenilare prin
colorare cu poli-dT marcată cu rodamină şi cu DAPI pentru evidenţierea ADN; c) evidenţierea
„splicingului” prin utilizarea de anticorpi monoclonali, faţă de proteina de splicing SC-35,
marcaţi cu fluoresceină Nucleul este un organit organizat
Specialiştii în biologie celulară se bazează mult pe studiile biochimice pentru a înţelege
activităţile nucleului. Cu toate că acestea furnizează un număr mare de informaţii, distrug toate
structurile moleculare organizate care pot exista în nucleu şi dau impresia că acesta nu este decât
un „sac” de elemente repartizate la întâmplare. În acelaşi timp, o serie de studii de microscopie ne
fac să realizăm că nucleul este în realitate un compartiment foarte organizat. De exemplu, fibrele
de cromatină, care compun un cromozom interfazic, nu sunt dispersate în tot nucleul, cum am
putea crede, ci ele sunt concentrate într-un domeniu specific care nu se suprapune deloc cu
domeniile altor cromozomi.
Interacţiunile între extremităţile cromozomilor şi anvelopa nucleară reprezintă un alt mod
de organizare a cromozomilor în nucleu. Această asociere este evidentă mai ales în meioză, când
cromozomii pot să se îndepărteze de anvelopa nucleară şi să formeze un „buchet”.
De mai bine de treizeci de ani se ştie că ARN ribozomal este sintetizat în nucleol, dar se
consideră că celelalte molecule de ARN, şi mai ales ARNm se asamblau în tot nucleul. Cercetările
ultimilor zece ani au demonstrat clar că moleculele de ARNm sunt sintetizate într-un număr limitat
de situsuri discrete situate în întregul nucleu. Dacă sunt identificate cu ajutorul unor sonde marcate
fluorescent, situsurile de sinteză şi de maturare a moleculelor de pre-ARNm apar sub forma unor
„pete” strălucitoare în nucleoplasma nemarcată. Fiecare din cele 20 la 50 de pete
14
observate într-un anumit nucleu reprezintă situsul sintezei mai multor molecule de ARNm diferite.
Diferitele elemente ale nucleului sunt organizate în acest compartiment printr-o reţea interactivă
complexă de filamente care compun matricea nucleară.
Proba cea mai clară privind importanţa matricei nucleare a fost furnizată de o serie de
cercetări efectuate în laboratorul lui Jeanne Lawrence de la Universitatea din Massachusetts.
Utilizând hibridizarea fluorescentă, in situ, pentru a identifica localizarea secvenţelor specifice de
ADN sau ARN. Lawrence şi colaboratorii săi au constatat că moleculele de ARN transcrise,
pornind de la o anumită genă, apar ca o trenă într-o serie limitată de nuclee. Trena fluorescentă
apare datorită prezenţei mai multor sute de molecule de pre-ARNm transcrise pornind de la o
singură genă. Concentrarea transcripţilor într-un loc limitat ne sugerează că aceştia nu sunt liberi
să difuzeze plecând de la ADN de pe care au fost transcrişi. Se pare că aceştia sunt menţinuţi stabili
de unele dintre elementele nucleului pe toată perioada maturării lor.
Dacă nucleele sunt tratate cu detergenţi şi cu săruri concentrate, practic toate moleculele
de pre-ARNm care au fost transcrise rămân asociate matricei nucleare reziduale. De fapt, urmele
de ARNm fluorescente care au fost observate înainte de extracţia dintr-un anumit nucleu îşi
păstrează exact poziţia şi după extracţie, deoarece moleculele de ARNm nou formate sunt asociate
elementelor matricei celulare. De asemenea, orientarea trenelor sugerează că moleculele de ARN
părăsesc locurile de sinteză pentru a se localiza în situsuri mai apropiate de periferia nucleului. În
cursul deplasării moleculelor de ARNm faţă de gena de la care sunt sintetizate, intronii sunt
eliminaţi din structura transcripţilor prin mecanismul de „splicing”. Orientarea trenei, dinspre
interiorul nucleului către periferia sa, este compatibilă cu un model în care matriţa nucleară
ghidează moleculele de ARN, în curs de maturare, de la locul în care sunt transcrise către porii
nucleari pentru a ieşi din nucleu.
SLIDE 46. Matricea nucleara
Figura. Matricea nucleară: a) micrografie electronică a unui nucleu izolat în prezenţă de
detergenţi şi săruri 2M; b) micrografie electronică a unei regiuni de fibroblast de şoarece în urma
tratamentului cu detergent şi înlăturare a cromatinei şi ADN
Când nucleele izolate sunt tratate cu detergenţi anionici şi o concentraţie crescută de săruri
(NaCl 2M), pentru a extrage lipidele şi aproape toate proteinele histonice şi nehistonice ale
cromatinei, ADN apare ca un halou care înconjoară un centru nuclear rezidual. Dacă fibrele de
ADN sunt apoi digerate cu nuclează, rămâne o structură care păstrează forma nucleului de origine,
dar ea este compusă din fibrile proteice subţiri care se încrucişează pe suprafaţa spaţiului nuclear.
Această reţea fibrilară insolubilă este matricea nucleară
Matricea nucleară nu este numai un schelet care menţine forma nucleului sau un eşafodaj
pe care se organizează buclele de cromatină; ea serveşte şi în vederea fixării pentru mecanismele
care intervin în diferite activităţi ale nucleului, cum sunt transcripţia, maturarea ARN şi replicarea.
De exemplu, dacă celulele sunt incubate în prezenţă de precursori radioactivi ai ARN sau ADN în
timpul unei scurte perioade, găsim că aproape toţi acizii nucleici sintetizaţi sunt asociaţi fibrilelor
matricei nucleare.
15
 SLIDE 47. Cromozomii. Structura cromozomului mitotic Figura. Comparaţie între
starea cromatinei în interfază şi a cromatinei compactate în mitoză: a) micrografie electronică
prezentând starea dispersată a cromatinei în interfază; b) micrografie electronică a unui
cromozom mitotic (după Molecular Cell Biology Lodish H., et. al., 2000)
Cromozomii se individualizează structural la începutul mitozei şi „par să dispară” din nou
la sfârşitul acesteia. Aceştia sunt constituiţi dintr-un complex de ADN şi proteine numit cromatină.
Cromatina există în diverse stări în diferite faze ale ciclului celular. Cromozomii sunt mult mai
scurţi decât lungimea moleculelor de ADN pe care le conţin. În medie, un cromozom uman conţine
o moleculă de ADN de aproximativ 5 cm. Compactarea acestui material genetic, în structura
cromozomului, presupune existenţa unui sistem organizat de împachetare care să permită totuşi
funcţionarea genomului şi exprimarea genelor. Observate la microscopul electronic, cea mai mare
parte a organitelor intracelulare prezintă o structură care ne oferă informaţii interesante despre
funcţia lor. Totuşi, micrografiile electronice ale preparatelor fine ale nucleului oferă destul de
puţine informaţii privind natura cromozomilor în interfază. În această etapă, cromozomii sunt mult
mai puţin vizibili deoarece cromatina se află într-o stare mai relaxată.
SLIDE 48. Imagine electrono-microscopică a unui cromozom uman în metafază Cromozomii
eucariotelor, care constau într-un complex de ADN, ARN şi proteine numit cromatină, sunt
entităţi dinamice a căror aparenţă variază considerabil şi dramatic cu stagiul ciclului celular.
Cromozomii individuali se pot evidenţia sub formă condensată numai în timpul diviziunii
celulare (faza M a ciclului celular). În timpul interfazei, care formează restul ciclului celular,
când cromozomii sunt transcrişi şi replicaţi, cromozomii majorităţii celulelor devin foarte
dispersaţi. Nucleul Celular
În ciuda importanţei sale pentru stocarea şi utilizarea informaţiei genetice, nucleul celulei
eucariote posedă o morfologie destul de comună: conţinutul nuclear reprezintă o masă vâscoasă
amorfă de materie închisă într-un înveliş nuclear complex. În nucleul unei celule tipice, în interfază
(nemitotică), se evidenţiază:
i) cromozomii, prezenţi sub forma unor fibre nucleoproteice foarte alungite, cromatină;
ii) matricea nucleară care este formată dintr-o reţea fibrilară care conţine proteine;
iii) unul sau mai mulţi nucleoli, care sunt structuri amorfe opace la electronii şi care
intervin în sinteza ARN ribozomal şi în asamblarea ribozomilor;
iv) nucleoplasma, substanţă lichidă care conţine toate componentele şi elementele
nucleului eucariot . Cromozomii
Cromozomii par să apară la începutul mitozei şi să dispară din nou după mitoză, punând
astfel citologilor una dintre înntrebările cele mai importante dar în acelaşi timp şi una dintre cele
mai stimulante; care este natura cromozomilor în celulele ne-mitotice. Observate la microscopul
electronic, cea mai mare parte a organitelor infracelulare demonstrează o structură care ne oferă
informaţii interesante despre funcţia lor. Totuşi, micrografiile electronice ale preparatelor fine ale
nucleului evidenţiază puţine informaţii privind natura cromozomului în interfază.
16
Împachetarea genomului
O celulă umană normală conţine aproximativ 6 miliarde de perechi de baze repartizate între
46 de cromozomi (cantitatea prezentă în numărul diploid de cromozomi ne-replicaţi). Fiecare
cromozom conţine o singură moleculă de continuă de ADN; cu cât cromozomul este mai mare cu
atât mai lung este ADN pe care îl conţine. Dat fiind că fiecare pereche de baze ocupă aproximativ
0,34 nm dea lungul moleculei de ADN, 6 miliarde de perechi de baze corespund unei molecule
lungi de 2 metri. Pe de altă parte, în celulă, ADN este unit prin cantităţi mari de apă (aproximativ
6 molecule de apă pentru fiecare pereche de baze), care şi acestea duc la creşterea volumului.
Întrebarea care se ridică este: cum este posibilă intrarea a 2 m de ADN hidratat într-un nucleu al
cărui diametru nu depăşeşte 10 μm, asigurând şi accesul proteinelor şi enzimelor implicate în
reglare. O altă problemă la fel de importantă este modul în care molecula de ADN dintr-un
cromozom este organizată pentru a nu se înnoda cu moleculele altor cromozomi. Răspunsul la
toate aceste probleme îl găsim în modul remarcabil de împachetare al moleculei de ADN. De mult
timp se ştie că cromozomii sunt compuşi din fibre, numite cromatină, formate din ADN şi din
proteine asociate. Proteinele din structura cromatinei sunt în general împărţite în două grupe
principale: histonele şi proteinele cromozomale nehistonice. Histonele reprezintă o colecţie de
mici proteine bazice bine definite în timp ce nonhistonele conţin un număr mare de proteine
diferite: structurale, enzimatice şi reglatoare, dintre care cea mai mare parte nu au fost încă
caracterizate. Cromatina mai conţine şi un procentaj scăzut de ARN compus în principal din catene
de ARN în formare in diferite stadii de maturare şi din ARNsn care intervine în procesul de splicing
al ARNm.
SLIDE 49. Centromeri/Telomeri Figura. Hibridizarea fluorescentă în
situ (FISH) şi aplicaţiile ei: a) utilizarea de sonde fluorescente pentru marcarea regiunii
centromerice a cromozomului 16; b) exemplu de cariotip spectral; c) evidenţierea prezenţei
telomerilor la cromozomi de şoarece (adaptat după Molecular Cell Biology Lodish H., et. al.,
2000) Centromerii.
Se poate remarca căci toţi cromozomii reprezentaţi în figură posedă un situs unde suprafaţa
lor exterioară este net răscroită (scobită). Această scobitură reprezintă centromerul cromozomului.
Mai sus am arătat că centromerii conţin heterocromatină constitutivă. Centrometrii cromozomilor
umani conţin o secvenţă lungă de aproximativ 170 nucleotide (ADN satelit α) dispuse în tandem
şi repetate de 2 000 la 30 000 ori per centromer. ADN centromeric fixează proteine specifice, între
altele cele care servesc drept situs de fixare microtubulilor care separă cromozomii în timpul
diviziunii mitotice.
SLIDE 50. Telomerii Figura. Completarea capetelor ADN de
către telomerază: a) procesul de replicare şi evidenţierea formării capetelor incomplete ale
cromozomilor pentru catena întârziată; b) mecanismul de acţiune al telomerazei cu evidenţierea
motivelor repetitive de la capetele cromozomilor Telomerii
17
 Cele două extremităţi ale moleculei de ADN a fiecărui cromozom posedă un segment
particular de secvenţe repetitive numite telomeri, care formează un „coif” la fiecare capăt al
cromozomilor. La om telomerii posedă secvenţe TTAGGG/AATCCC repetitive de mii de ori.
Contrar celor mai multe tipuri de secvenţe repetitive, care variază mult între specii, chiar dacă ele
sunt înrudite şi apropiate, în cazul telomerilor de la om şi de la toate vertebratele studiate până în
prezent găsim aceeaşi secvenţă telomerică. La alte organisme cum sunt protozoarele şi drojdiile,
telomerii au secvenţe diferite dar, ca şi pentru vertebrate, o catenă este întotdeauna bogată în resturi
de guanozină iar complementara sa în resturi de citozină. Catena bogată în G este orientată în
sensul 5’-3’ către extremitatea cromozomului şi depăşeşte cu 12 la 15 nucleotide extremitatea
catenei bogată în C. Datorită existenţei acestui dezechilibru catena bogată în G formează o scurtă
coadă monocatenară la cele două extremităţi ale cromozomului. Această dispoziţie persistă de la
o generaţie celulară la alta datorită unei enzime speciale, telomeraza, care poate adăuga noi unităţi
repetitive la extremitatea 3’ a catenei bogate în G.
Telomeraza, ale cărei proprietăţi au fost bine studiate de către Elisabeth Blackburn şi
colegii săi de la Universitatea din California, San Francisco, este o transcriptază inversă care
asamblează fragmente de ADN folosind o catenă (matriţă) de ARN. Telomeraza este o enzimă
foarte neobişnuită în sensul în care ARN care serveşte drept model, face în realitate parte din
enzimă. Secvenţele telomerice sunt şi situsuri de fixare a mai multor proteine specifice.
Telomerii au roluri importante: i) sunt necesari replicării complete a cromozomului; ii)
protejează cromozomii de nucleaze şi de alte influenţe destabilizatoare; iii) împiedică fuziunea
dintre extremităţile cromozomilor în procesele de recombinare;
iv) facilitează interacţiile dintre extremităţile cromozomilor şi anvelopa nucleară în
anumite tipuri celulare.
De asemenea, telomerii şi activitatea telomerazei par să fie unii dintre principalii actori
implicaţi în procesul de îmbătrânire. Celulele normale, în cultură, nu sunt capabile să se dividă
decât de un număr limitat de ori înainte de a da semne de „îmbătrânire” şi de a muri în final. Dintre
ipotezele propuse pentru a explica această observaţie este şi scurtarea progresivă a telomerilor.
Experienţe recente sugerează alte roluri. Celulele normale nu sunt capabile să se dividă în cultură
decât de un număr limitat de ori înainte de a da semne de „îmbătrânire” şi în final de a muri.
Au fost propuse diferite ipoteze pentru a explica această observaţie: cea mai recentă este
scurtarea progresivă a telomerilor. Telomerii se scurtează deoarece cea mai mare parte a celulelor
umane par a fi lipsite de telomeraze. Contrar celulelor normale celulele canceroase nu încetează
să crească în cultură; spunem că acestea devin „nemuritoare”. Unul dintre factorii care ar putea
contribui la imortalizarea celulelor maligne este reactivarea telomerazei, care conservă lungimea
telomerilor de- a lungul generaţiilor. De fapt, o seri de cercetări au demonstrat că un anumit număr
de cancere la om au o activitate a telomerazei care nu poate fi evidenţiată în celulele normale.
Această descoperire a declanşat cercetarea inhibitorilor specifici ai acestei enzime sperând că
aceştia ar putea opri creşterea anumitor tumori.
SLIDE 51. Nucleozomii: primul nivel de organizare al cromozomului Figura. Schema generală
a organizării cromatinei cu evidenţierea principalelor nivele cunoscute de organizare
(Campbell, et al., Biology 2002). Imagine electrono-microscopică a unui cromozom uman în
metafază
18
 Cromozomii eucariotelor, care constau într-un complex de ADN, ARN şi proteine numit
cromatină, sunt entităţi dinamice a căror aparenţă variază considerabil şi dramatic cu stagiul
ciclului celular. Cromozomii individuali se pot evidenţia sub formă condensată numai în timpul
diviziunii celulare (faza M a ciclului celular). În timpul interfazei, care formează restul ciclului
celular, când cromozomii sunt transcrişi şi replicaţi, cromozomii majorităţii celulelor devin
foarte dispersaţi. Nucleul Celular
În ciuda importanţei sale pentru stocarea şi utilizarea informaţiei genetice, nucleul celulei
eucariote posedă o morfologie destul de comună: conţinutul nuclear reprezintă o masă vâscoasă
amorfă de materie închisă într-un înveliş nuclear complex.
În nucleul unei celule tipice, în interfază (nemitotică), se evidenţiază: i) cromozomii, prezenţi sub
forma unor fibre nucleoproteice foarte alungite, cromatina;
ii) matricea nucleară care este formată dintr-o reţea fibrilară care conţine proteine;
iii) unul sau mai mulţi nucleoli, care sunt structuri amorfe opace la electronii şi care
intervin în sinteza ARN ribozomal şi în asamblarea ribozomilor;
iv) nucleoplasma, substanţă lichidă care conţine toate componentele şi elementele
nucleului eucariot . Cromozomii
Cromozomii par să apară la începutul mitozei şi să dispară din nou după mitoză, punând
astfel citologilor una dintre înntrebările cele mai importante dar în acelaşi timp şi una dintre cele
mai stimulante; care este natura cromozomilor în celulele ne-mitotice. Observate la microscopul
electronic, cea mai mare parte a organitelor infracelulare demonstrează o structură care ne oferă
informaţii interesante despre funcţia lor. Totuşi, micrografiile electronice ale preparatelor fine ale
nucleului evidenţiază puţine informaţii privind natura cromozomului în interfază (fig 12.1a).
Împachetarea genomului
O celulă umană normală conţine aproximativ 6 miliarde de perechi de baze repartizate între
46 de cromozomi (cantitatea prezentă în numărul diploid de cromozomi ne-replicaţi). Fiecare
cromozom conţine o singură moleculă de continuă de ADN; cu cât cromozomul este mai mare cu
atât mai lung este ADN pe care îl conţine. Dat fiind că fiecare pereche de baze ocupă aproximativ
0,34 nm dea lungul moleculei de ADN, 6 miliarde de perechi de baze corespund unei molecule
lungi de 2 metri. Pe de altă parte, în celulă, ADN este unit prin cantităţi mari de apă (aproximativ
6 molecule de apă pentru fiecare pereche de baze), care şi acestea duc la creşterea volumului.
Întrebarea care se ridică este: cum este posibilă intrarea a 2 m de ADN hidratat într-un nucleu al
cărui diametru nu depăşeşte 10 μm, asigurând şi accesul proteinelor şi enzimelor implicate în
reglare. O altă problemă la fel de importantă este modul în care molecula de ADN dintr-un
cromozom este organizată pentru a nu se înnoda cu moleculele altor cromozomi. Răspunsul la
toate aceste probleme îl găsim în modul remarcabil de împachetare al moleculei de ADN. De mult
timp se ştie că cromozomii sunt compuşi din fibre, numite cromatină, formate din ADN şi din
proteine asociate. Proteinele din structura cromatinei sunt în general împărţite în două grupe
principale: histonele şi proteinele cromozomale nehistonice. Histonele reprezintă o colecţie de
mici proteine bazice bine definite în timp ce nonhistonele conţin un număr mare de proteine
diferite: structurale, enzimatice şi reglatoare, dintre care cea mai mare parte nu au fost încă
caracterizate. Cromatina mai conţine şi un procentaj scăzut de ARN compus în principal din catene
de ARN în
19
formare in diferite stadii de maturare şi din ARNsn care intervine în procesul de splicing al
ARNm.
In interfază cromozomii sunt sub forma unor fibre lungi de fibre de 30 nm sub forma unui
eşafod extins. In metafază, eşafodul este pliat intr-un helix şi apoi într-o structură mult mai
compactată a cărei geometrie precisă nu a fost determinată.
SLIDE 52. Un model de împachetare a cromozomilor metafazici Comentariu figura - in
interfază cromozomii sunt sub forma unor fibre lungi de fibre de 30 nm sub forma unui eşafod
extins In metafază, eşafodul este pliat intr-un helix şi apoi într-o structură mult mai compactată
a cărei geometrie precisă nu a fost determinată
O altă problemă este modul în care un nucleu cu un diametru de 10 μm poate conţine o
cantitate de ADN a cărei lungime este de 200 000 de ori mai mare decât această valoare.
Formarea nucleozomilor reprezintă prima etapă importantă a procesului de condensare. Dacă
întinderea ar fi completă, cele 200 perechi de baze ale unui nucleozom individual de 10 nm
diametru ar ocupa aproximativ de 70 nm, pentru o valoare a planului nucleotidelor de 0,34 nm.
În consecinţă, raportul că de condensare a ADN, din structura nucleozomilor este de aproximativ
7:1. Nivelurile structurale superioare ale cromatinei.
Deci, cel mai redus nivel de organizare al cromatinei este răsucirea moleculei de ADN în
jurul inimii nucleozomului şi are un de diametru 10 nm. Totuşi, cromatina nu se găseşte în celulă
sub această formă relativ răsucită de „şirag de mătănii”. Micrografiile electronice ale secţiunilor
de nucleu relevă un umăr de pete minuscule cu un diametru de aproximativ 30 nm care reprezintă
secţiuni transversale la nivelul fibrelor de cromatină. Dacă se separă cromatina din nucleu, în
prezenţa ionilor divalenţi, se observă prezenţa unor filamente de aceeaşi grosime.
Structura acestui filament de 30 nm rămâne încă un subiect discutabil. În figură este
prezentat modelul solenoid de suprarăsucire a filamentului subţire al nucleozomilor (10 nm) pentru
a forma un filament de ordin superior, mai gros. Se presupune că, fibrele condensate se formează
prin împachetarea nucleozomilor într-o structură spiralată (aranjament solenoid) care conţine şase
nucleozomi pentru fiecare tur de răsucire. Acest nivel suplimentar de organizare al cromatinei
creşte de şase ori raportul de condensare. Filamentul de 30 nm este conservat prin interacţiunea
între moleculele de histonă H1 ale nucleozomilor vecini.
Dacă sunt extrase selectiv moleculele H1, filamentele groase de cromatină se derulează şi
se transformă în „mărgele” (mătănii) mai subţiri şi mai înguste. Readăugarea histonei H1
restabileşte structura de ordin superior. Studii recente de microscopie electronică sugerează că
fibrele de 30 nm sunt mai puţin uniforme decât modelul solenoid imaginat. Cromatina condensată
poate fi de fapt foarte dinamică fiind formată din structuri parţial depliate care se pot replia rapid
în structuri solenoide ocazionale.
Cromatina din regiunile cromozomiale care nu sunt transcrise frecvent este predominant în
forma condensată de 30 nm, în timp ce regiunile transcrise activ se consideră că adoptă forma
relaxată de „şirag de mătănii”.
 Următoarea etapă de condensare a ADN, în nucleu, o reprezintă organizarea filamentelor
de 30 nm într-o serie de bucle mari suprarăsucite. Se estimează că fiecare buclă conţine între 10 şi
150 kilobaze ADN. Se pare că acestea sunt fixate la bază cu proteine specifice printre care şi o
topoizomerază de tip II care intervine pentru a controla gradul de spiralizare al ADN la nivelul
buclei. Topoizomeraza eliberează
20
moleculele de ADN dacă o buclă se încurcă. Buclele de ADN ar putea împărţi genomul în
„domenii”, fiecare conţinând un lot mic de gene care sunt exprimate printr-un mecanism comun
de reglare. Normal, buclele de cromatină sunt etalate la interiorul nucleului şi nu sunt vizibile, dar
prezenţa lor poate fi evidenţiată în anumite circumstanţe. De exemplu, dacă tratăm cromozomii
mitotici izolaţi cu reactivi care extrag histonele, putem observa că ADN eliberat de histone se
pliază sub formă de bucle plecând de la eşafodaj proteic, format din proteine nehistonice.
SLIDE 53. Câteva caracteristici ale histonelor Figura: Secvenţa aminoacizilor
histonei H4 din timus de viţel. Această proteină de 102 aminoacizi posedă 25 de resturi de
arginină şi lizină. Histona H4 de la mazăre diferă de aceasta numai prin două resturi: Val 60 şi
Lys 77. Aminoacizii subliniaţi sunt subiectul unor modificări post-translaţionale
Capul spermatozoidului este bogat în spermină şi în spermidină (de unde şi numele acestor
poliamine), şi în particular, pentru peşti, în protamine. Acestea sunt polipeptide care nu depăşesc
5 kDa (30-40 aminoacizi), foarte bazice datorită conţinutului ridicat de arginină: 21 din cei 31 de
aminoacizi ai clupeinei de hering sunt reprezentaţi de arginină. O parte (proporţie) din aceste
molecule este fixată pe ADN. (Se consideră că protaminele se fixează probabil la nivelul fosei
mari determinând o conformaţie cu o mare proporţie de elice alfa. ADN plasat în capul
spermatozoizilor este cel mai condensat).
În celulele somatice, ADN este asociat în proporţii egale cu proteine: histonele (H)
majoritare şi proteinele ne-histonice. Complexul nucleoproteic care rezultă îşi datorează numele
reacţiei sale cu coloranţi bazici. Cromatina este un «şirag de mătănii» unde fiecare mărgea,
nucleozomul, reprezintă asocierea spaţială precisă a două componente. Nucleozomii Uniformi şi
repetitivi, se formează prin răsucirea sub formă de serpentină a ADN pe corpi sau nuclee de
histone (figura 3.2). 1. Nucleul (inima) este o asociere cuaternară, prin intermediul domeniului
lor hidrofob, format din 2 copii de histone H2a, H2b, H3 şi H4. Octamerul are aspectul unui
cilindru plat. 2. Prin formarea de legături de hidrogen între resturile lor şi sarcinile negative ale
grupărilor fosfat (din structura moleculei ADN), helixurile terminale ale histonelor H3 şi H4, se
ajustează strâns la nivelul fosei mici a ADN. Ca rezultat, pe o lungime de aproximativ 200 pb,
dubla elice se contorsionează la suprafaţa cilindrului sub forma unei elice «de stânga» cu două
suprarăsuciri. Astfel împachetat, ADN prezintă fosa mare către exterior, secvenţele bazelor fiind
accesibile. Regiunea formată din ADN de legătură între fiecare nucleozom are lungime foarte
variabilă în funcţie de tipul celular (o la o sută de perechi de baze). 3. Histona H1 intervine în
determinarea gradului superior de organizare. Prin conformaţia sa terţiară cu trei domenii prinde
nucleozomii între ei prin trei tipuri de contacte prezentate în figură: H1/ADN la intrare şi la
ieşire; H1/suprafaţa nucleului (mai ales prin intermediul H2a); H1/H1 următoare.
ADN supra-răsucit din nucleozom este protejat de acţiunea hidrolitică a nucleazelor, în
timp ce regiunile de legătură dintre nucleozomi sunt foarte sensibile.
Cu toate că supra-răsucirea este foarte eficientă aceasta nu reprezintă decât primul grad
(nivel) de compactare necesar pentru ADN. Sunt necesare stivuiri în coloane ale nucleozomilor şi
formarea unor tururi (ture) complexe de ordin superior ale cromatinei, pentru a obţine arhitectura
finală a cromozomului.
21
 Modificările post-traducţionale reversibile ale histonelor, pe de o parte, şi cele ale bazelor,
pe de altă parte (metilarea), conferă supleţe moleculei. Acestea modifică densitatea şi repartiţia
sarcinilor şi grupărilor hidrofobe, modulează interacţiile ADN- histone şi histone-histone necesare
adaptării cromozomului la funcţiile sale. Citologii au denumit heterocromatină, regiunile foarte
condensate şi eucromatină, regiunile mai difuze. Prima este inertă, iar în cea de a doua genele au
capacitate de exprimare.
SLIDE 54. Structura nucleozomală “core” a octamerului histonic Figura. Structura a fost
modelată ca urmare a studiilor cu raze X. Acelaşi model al structurii centrale a nucleozomului
(“core”) fiind identificată poziţia histonelor
În 1974, Roger Kornberg, de la Universitatea Harvard, a propus un nou tip de structură
secundară pentru cromatină bazându-se pe rezultatele digestiei cu nucleaze asupra cromatinei din
diferite surse. Astăzi, se cunoaşte că nucleozomii conţin o particulă care constituie nucleul
nucleozomului, compus din 146 perechi de baze de ADN suprarăsucit, care face aproape două
spire în jurul unui miez proteic central care conţine 8 molecule din patru histone: H2A, H2B, H3
şi H4. Particulele de nucleozomi sunt unite unele de altele printr-un segment de ADN de legătură,
de lungime variabilă, dar care are în general 60 de perechi de baze. ADN din structura unui
nucleozom şi din braţul de legătură reprezintă aproximativ 200 de perechi de baze, ceea ce
corespunde valorii fragmentelor găsite în cursul primelor experienţe cu nucleaze. Nucleele
nucleozomilor, care au un diametru de aproximativ 10 nm, şi ADN de legătură, cu un diametru de
2 nm, apar pe micrografiile electronice asemeni „unui şirag de mătănii”. Pentru fiecare nucleozom,
o moleculă de histonă H1 este poziţionată în exteriorul nucleului fiind asociată la cele două
extremităţi ale ADN care intră şi ies de pe suprafaţa complexului proteic. Dacă se realizează
eliminarea selectivă a moleculelor de histone H1, printr-un tratament al fibrelor cu soluţii saline
de concentraţie scăzută, cromatina capătă un aspect mult mai dezorganizat.
In general, resturile de aminoacizi bazici ale histonelor nucleului sunt grupate la
extremităţile moleculei, restul structurii păstrând un caracter relativ hidrofob. Această separare
convine perfect organizării nucleozomului. Regiunile neîncărcate şi hidrofobe ale histonelor ocupă
centrul particulei şi favorizează agregarea într-un nucleu strâns. Porţiunile polare, bazice, ale
moleculelor din nucleu formează cozi flexibile orientate către exteriorul particulei, unde resturile
încărcate pozitiv pot stabili interacţii ionice cu grupările fosfat negative din structura scheletului
ADN. Cu toate că, molecula de ADN este strâns asociată nucleului format din histone prin
suprafaţa internă a fibrei elicoidale, suprafaţa sa externă rămâne expusă şi poate interacţiona cu
moleculele de reglare.
Studii de cristalografie cu raze X au demonstrat că resturile încărcate pozitiv sunt reunite
sub formă de perechi la suprafaţa octamerului histonic. Situsurile pereche formează un fel de
spirală pe drumul pe care se presupune că îl urmează elicea ADN care înconjoară nucleul
nucleozomului. Acestea servesc drept „puncte de fixare” pentru cele două catene ale helixului.
Deoarece toate moleculele ADN, indiferent de origine şi secvenţa nucleotidică, posedă un schelet
riboză-fosfat identic cu cel cu care interacţionează histonele, nu trebuie să ne surprindă extrema
conservare a moleculelor aminoacizilor din structura histonelor.
Dacă pentru spiralizarea a 200 de perechi de baze de ADN sunt necesare aproximativ nouă
molecule de histone, o celulă umană care conţine 6 miliarde de perechi de baze de ADN, poate
conţine aproximativ 300 milioane de histone necesare împachetării primare a materialului genetic.
Astfel se explică, necesitatea unui număr mare de exemplare de gene care codifică pentru histone
în celulele care se divid rapid.
22
 Interacţia dintre histone şi ADN este, în principal, de natură structurală şi relativ
independentă de secvenţa nucleotidică. In vitro, un fragment de ADN care în mod normal nu este
asociat cu histone, cum este cazul bacteriofagilor sau a polinucleotidelor bicatenare sintetice,
formează subunităţi nucleozomale dacă este incubat cu histone purificate care provin de la plante
şi animale. Experienţele de acest tip ilustrează clar capacitatea de autoasamblare a nucleozomilor.
Chiar dacă asamblarea histonelor cu ADN nu depinde de secvenţă, aceasta nu semnifică
neapărat că pentru o anumită genă, nucleele nucleozomilor sunt localizate la situsuri aleatoare. De
fapt, s-a demonstrat că anumite părţi ale genelor manifestă interacţiuni constante cu regiunile
vecine. Exemplul prezentat în micrografia electronică din figură demonstrează că pe cromozomul
virusului SV40 particulele nucleozomale sunt distribuite periodic, cu excepţia unei regiuni care
este lipsită de asocierea cu histonele.
SLIDE 55. Structura în aminoacizi a histonei H4 Histonele
Valorile de pH acide sau sărurile determină dezorganizarea legăturilor ionice şi separă
cromatina în ADN şi fracţiune proteică. Prin cromatografie de excluziune, de schimb ionic sau
prin electroforeză (tehnica SDS-PAGE în geluri cu porozitate redusă), au fost identificate la nivelul
fracţiilor proteice 5 specii de histone.
Punctele comune ale acestora sunt: - mărime mică (au numai 100 la 200 de resturi de
aminoacizi); - conţinut bogat în aminoacizi bazici: arginina şi lizina reprezintă aproximativ 1/4
din totalul de resturi. La valorile pH celular aceste proteine sunt încărcate pozitiv, policationi; -
modificările post-traducţionale ale anumitor resturi, deci a aminoacizilor bazici, sunt reversibile
enzimatic: acetilare, metilare, fosforilare...; - o structură terţiară cu un grad înalt de helix α. **:
perioadă unitară de evoluţie: durata necesară pentru o schimbare de 1% din secvenţă după
divergenţa a două specii.
Studiile comparative de secvenţe şi de structură tridimensională conduc la divizarea
familiei histonelor în două grupuri, heterogenitate care este subliniată şi de poziţia lor în
nucleozom: H2, H3 şi H4 pe de o parte şi H1 pe de altă parte.
De fapt, histonele H4 şi H3, şi într-un grad mai mic H2a şi H2b, sunt proteine foarte
conservate evolutiv. Se dă întotdeauna exemplul frapant al histonei H4 de la bovine şi de mazăre,
ale căror secvenţe nu diferă decât prin două resturi, aceste diferenţe având influenţe puţin
perturbatoare: o Lys în locul unei arginine şi o Leu în locul unei Val (doi aminoacizi hidrofobi).
Există aceste diferenţe minore în condiţiile în care acest animal şi această plantă au suferit
divergenţă acum un miliard de ani. Structura histonei H1 este mult mai variabilă de la o specie la
alta.
Structura terţiară a celor patru histone din primul grup demonstrează existenţa a două
domenii: un domeniu central globular, hidrofob; un domeniu N-terminal, hidrofil, încărcat pozitiv
şi flexibil.
Histona H1, mai lungă, posedă un al treilea domeniu la nivelul capătului C- terminal,
hidrofil şi flexibil.
 Se consideră că histona H1 se leagă la unuitate nucleozomală de 166 pb. ADN face două
ture complete şi poate lega H1 la intrare şi la ieşire de pe structura nucleozomului. H1 se comportă
ca o agrafa care reuneşte cele două treceri.
23
 SLIDE 56. Gel electroforeza SDS a unui amestec de histone H3 şi H4 Figura. Electroforeza în
SDS a unui amestec de histome H3 şi H4 de la viţel. Histonele H3 şi H4 din timus de viţel conţin
toate benzile anticipate pentru tetramerul (H3)
2

(H4)
2

SLIDE 57. Nucleosomii sunt complexe ADN-histone Figura.

Modelarea structurii nucleozomului. Împachetarea genomului eucariot
După cum am evidenţiat mai sus, o celulă umană normală conţine aproximativ 6 miliarde
de perechi de baze repartizate între 46 de cromozomi (cantitatea prezentă în numărul diploid de
cromozomi ne-replicaţi). Fiecare cromozom conţine o singură moleculă continuă de ADN. Cu cât
cromozomul este mai mare cu atât este mai lungă molecula de ADN pe care o conţine. Deoarece
fiecare pereche de baze ocupă aproximativ 0,34 nm, 6 miliarde de perechi de baze corespund unei
molecule lungi de 2 metri. De asemenea, în celulă, ADN este hidratat cu cantităţi importante de
apă (aproximativ 6 molecule de apă pentru fiecare pereche de baze), care şi acestea duc la creşterea
volumului. Problema cheie a fost identificarea modalităţilor prin care este posibilă localizarea a
2m de ADN hidratat într-un nucleu al cărui diametru nu depăşeşte 10 μm, asigurând în acelaşi
timp, accesul proteinelor şi enzimelor implicate în procesele de reglare. O altă problemă, la fel de
importantă, se referă la modul în care molecula de ADN, dintr-un cromozom, este organizată
pentru a nu se înnoda cu moleculele altor cromozomi. Răspunsurile la toate aceste probleme îl
găsim în modul remarcabil de împachetare al moleculei de ADN. Se cunoaşte de mult timp că
fibrele care formează cromatina, şi intră în structura cromozomilor, sunt formate din ADN în
asociere cu proteine. Proteinele din structura cromatinei sunt împărţite în două grupe principale:
histonele şi proteinele cromozomiale nehistonice. Histonele reprezintă o colecţie de mici proteine
bazice bine definite, în timp ce proteinele nehistonice sunt compuse dintr-un număr mare de
proteine diferite cu rol structural, enzimatic şi reglator. Cromatina mai conţine şi un procentaj
scăzut de ARN compus, în principal, din catene de ARNhn in diferite stadii de maturare şi din
ARNsn care intervine în procesul de „splicing” al ARNm.
În celulele eucariote, unitatea de bază a organizării cromatinei este nucleozomul. Acesta
reprezintă o entitate în care 146 pb sunt răsucite în două ture de super-elice stângă în jurul unui
octamer de histone care conţine câte două exemplare din moleculele H2A, H2B, H3 şi H4.
Nucleozomii sunt organizaţi în filamente de 10 nm în diametru prin interacţiuni cu histona H1,
care se legă la ADN care intră şi iese din nucleozom. Un al treilea nivel de organizare este obţinut
prin răsucirea unui filament de 10 nm într-o elice care conţine 6 nucleotide pe tur, cu formarea
unui solenoid cu un diametru de 30 nm. Structuri mai complexe ale cromatinei sunt realizate prin
condensarea filamentelor de 30 nm, dar detaliile privind aceste structuri sunt mai puţin cunoscute.
Microscopia electronică a furnizat dovezi decisive privind organizarea cromatinei în
regiuni, bucle şi domenii distincte de 30 la 300 kpb, fixate fiecare pe o matrice bogată în proteine.
Fiecare buclă pare să aibă doar o singură origine de replicare şi să se comporte ca o unitate de
replicare. Buclele, sunt unităţi de supra- răsucire independente, structura topologică a fiecăreia
fiind independentă de starea celorlalte. Se pare că acest lucru este posibil datorită fixării
extremităţilor buclelor în
24
matrice. Cu toate că fiecare buclă conţine mai multe unităţi de transcripţie, activitatea întregii
regiuni poate fi coordonată pentru a fi reprimată sau potenţial activată. Nucleozomii: primul
nivel de organizare al cromozomului
Împachetarea precisă a ADN de la eucariote depinde de histone, grup remarcabil de
proteine bazice care se împarte în cinci subgrupe, în principal în funcţie de conţinutul lor în lizină
şi arginină care reprezintă aproximativ 1⁄4 din totalul aminoacizilor. La pH fiziologic, aceste
proteine sunt încărcate pozitiv şi posedă o structură terţiară cu un grad mare de elice alfa.
Aminoacizii bazici din structură suferă modificări post-traducţionale (acetilare, metilare,
fosforilare) reversibile enzimatic. Studiile comparative de secvenţă şi de structură tridimensională
au condus la divizarea familiei histonelor în două grupuri: H2A, H2B, H3 şi H4 pe de o parte şi
H1 pe de altă parte. Această eterogenitate este subliniată şi de poziţia lor în nucleozom.
De fapt, histonele H4 şi H3, şi într-un grad mai mic H2A şi H2B, sunt proteine foarte
conservate evolutiv. Exemplul cel mai frapant este al histonei H4 de la bovine şi de la mazăre, care
au acelaşi număr de aminoacizi (102) şi ale căror secvenţe primare nu diferă decât prin doi
aminoacizi: o lizină în locul unei arginine şi o leucină în locul unei valine. Aceste diferenţe minore
sunt prezente în condiţiile în care divergenţa dintre animal şi plantă s-a produs acum un miliard de
ani. Structura histonei H1 este mult mai variabilă de la o specie la alta. Această conservare extremă
sugerează că toţi aminoacizii au un rol bine definit în funcţionarea proteinei.
Structura terţiară a histonelor din primul grup demonstrează existenţa a două domenii: un
domeniu central globular, hidrofob şi un domeniu N-terminal, hidrofil, încărcat pozitiv şi flexibil.
Histona H1, mai lungă, posedă un al treilea domeniu la nivelul capătului C-terminal, hidrofil şi
flexibil.
La începutul anilor 1970, s-a putut observa că în urma tratamentului cromatinei, cu
nucleaze nespecifice, cea mai mare parte a ADN era transformată în fragmente de aproximativ 200
perechi de baze sau în multipli ai acestora.
Din contră, acelaşi tratament aplicat moleculelor de ADN „nud” determină obţinerea unei
populaţii de fragmente de mărimi aleatoare. Această descoperire i-a făcut pe cercetători să
considere că fragmentele uniforme de ADN cromozomial erau protejate de atac enzimatic probabil
prin asocierea lor periodică cu o proteină.
SLIDE 58. Structura şi dimensiunile nucleozomilor Figura. Structura şi dimensiunile
nucleozomilor: a) sedimentarea nucleozomilor în gradient de sucroză duce la obţinerea unei
serii de picuri care corespund formelor monomere, dimere, trimere, etc., ale nucleozomilor; b)
ADN extras din fracţiile individuale este supus electroforezei împreună cu un martor ADN
digerat cu nucleaze; c) micrografie electronică a cromatinei eliberată dintr-un nucleu al unei
celule de Drosophila. Se observă că fibrele de cromatină sunt formate din nucleozomi conectaţi
între ei prin segmente scurte de ADN; d) schemă care demonstrează structura unei particule
nucleozomale cu o moleculă de histonă H1 asociată; e) electroforeză în SDS a unui amestec de
histone H3 şi H4 din timus de viţel. Se observă toate benzile corespunzătoare componentelor
tetramerului (H3)2(H4)2
 SLIDE 59. Modul de legare al histonei H1 în structura nucleosomului Figura. Două ture
complete ale moleculei de ADN sunt conectate prin legarea histonei H1 care vine în contact cu
molecula la capete şi în mijloc. Octamerul histonic este reprezentat printr-o sferă. Se consideră
că histona H1 se leagă la unuitate nucleozomală de 166 pb. ADN face două ture complete şi
poate lega H1 la
25
intrare şi la ieşire de pe structura nucleozomului. H1 se comportă ca o agrafa care reuneşte cele
două treceri
SLIDE 60. Modelul solenoid de organizare a fibrelor de cromatină condensată de 30 nm Figura.
Modelul solenoid de organizare a fibrelor de cromatină condensată de 30 nm: a) micrografia şi
modul de organizare a nucleozomilor din structură; b) micrografie prezentând fibrele de 30 nm
şi modelul de împachetare solenoid cu caracteristicile sale structurale (adaptat după Molecular
Cell Biology Lodish H., et. al., 2000)
SLIDE 61. Cromatina există în forme condensate şi relaxate Figura.
Cromatina în formă condensată şi relaxată
a) Cromatina izolată la putere ionică scăzută apare sub forma unor lanţuri de mărgele.
Mărgelele sunt nucleosomii cu un diametru de 10nm diametru Cromatina izolată in tampon cu
putere inică fiziologică (o,15 M KCl) apare ca o fibră condensată de 30nm diametru Influenţe
globale asupra expresiei genelor
Până în prezent atenţia ne-a fost îndreptată către reglarea transcripţiei genelor şi asupra
maturării transcripţilor primari. Viteza, momentul şi localizarea acestor procese sunt determinate
de către proteinele care nu recunosc decât secvenţe scurte de ADN şi/sau suprafeţele altor
proteine. Aceste interacţii influenţează iniţierea sau terminarea transcripţiei sau chiar maturarea
transcripţilor. Prezenţa sau starea funcţională a acestor proteine sunt adesea determinantul
principal al expresiei genelor. Totuşi, este de asemenea evident că modificările reversibile ale
stării ADN pot influenţa expresia genelor, şi în particular competenţa acestora în realizarea
transcripţiei. De exemplu, modificarea gradului de super—helicitate a ADN, adică a stării sale
topologice, şi modificările conformaţionale care decurg din aceasta (de ex. trecerea de la
topologie B la Z sau la alte forme de ADN) pot influenţa puternic activitatea de transcripţie.
Starea cromatinei în care se găseşte gena, în particular gradul de compactare a nucleozomilor,
adaugă un grad de complexitate suplimentară în exprimarea genelor. În general, activarea din
timpul transcripţiei este în raport cu trecerea cromatinei de la o structură foarte condensată către
o formă derulată, sau formă «deschisă». Activitatea de transcripţie este de asemenea influenţată
de către gradul de metilare a citozinei din structura dinucleotidului 5’-CG-3’. Reprimarea
transcripţiei este adesea asociată cu o hipermetilare la nivelul genei sau în apropierea acesteia,
activarea fiind însoţită de demetilare. Compactarea ADN
Unitatea de bază a organizării cromatinei în celulele eucariote este nucleosomul, o entitate
în care 145 pb sunt răsucite în două ture de super-helix stâng în jurul unui octamer de histone care
conţine două exemplare din moleculele H2A, H2B, H3 şi H4. Nucleozomii sunt organizaţi în
filamente de 10 nm în diametru prin interacţiuni cu hostona H1, legată de ADN care intră şi iese
din nucleosom. Un al treilea nivel de organizare este obţinut prin răsucirea unui filament de 10 nm
într-o elice care conţine 6 nucleotide pe tur: este vorba de formarea unui solenoid cu un diametru
de 30 nm. Structuri mai complexe ale cromatinei sunt realizate prin condensarea filamentelor de
30 nm, dar detaliile privind aceste structuri sunt mai puţin cunoscute.
26
 Microscopia electronică a furnizat dovezi decisive privind faptul că cromatina este
organizată în regiuni, bucle şi domenii distincte de 30 la 300 kpb, fixate fiecare pe o matrice bogată
în proteine. Fiecare buclă pare să aibă doar o singură origine de replicare şi să se comporte ca o
unitate de replicare. Buclele sunt unităţi de supra- răsucire independente, structura lor topologică
fiind independentă de starea buclelor vecine. Acest lucru este probabil posibil datorită fixării
extremităţilor buclelor în matrice. Cu toate că fiecare buclă conţine mai multe unităţi de
transcripţie, activitatea întregii regiuni poate fi coordonată pentru a fi reprimată sau potenţial
activă.
Cromatina reprimată. Numeroase gene de la organismele eucariote multicelulare nu sunt
exprimate decât în anumite momente ale dezvoltării şi/sau în anumite ţesuturi. Aceasta semnifică
că celulele trebuie să posede modalităţi eficace pentru a reprima expresia tuturor acestor gene
care nu sunt caracteristice unui anumit tip de celule. Represarea unor regiuni (blocuri) mari de
gene prin limitarea disponobilităţii factorilor de transcripţie este un mecanism destul de puţin
probabil pentru o astfel de reglare. Ideea este susţinută de faptul că genele care nu sunt exprimate
în mod normal într-o celulă, pot fi produse dacă sunt introduse în aceasta prin transfecţie. De
exemplu, genele globinei, induse prin transfecţie în fibroblaste, sunt exprimate de o mie de ori
mai puternic decât genele rezidente ale globinei; în plus această diferenţă persistă în cursul
diviziunilor succesive dacă genele transfectate sunt integrate la nivelul unor situsuri
cromozomice. De fapt, acesta este un efect destul de obişnuit dar nu universal, ca genele
transfectate să aibă o activitate mai mare decât genele endogene. Este general admis că acestă
represie este rezultatul sechestrării genelor «silenţioase» în structuri de cromatină superior
structurate care le fac inaccesibile maşinăriei de transcripţie.
În absenţa informaţiei privind organizarea acestei structuri a cromatinei, este imposbil de
descris starea de tranziţie care separă cromatinele reprimate şi exprimate. O indicaţie este furnizată
prin corelaţia care există între momentul în care gena este replicată şi cel în care ea poate fi
transcrisă. Genele de menţinere, exprimate în permanenţă în toate celulele, cum este cea pentru
dihidrofolat-reductază, actină citoplasmatică sau glucozo-6-fosfat dehidrogenază, sunt replicate în
prima jumătate a fazei S; genele ne-exprimate tind să fie replicate mai târziu. În plus, replicarea
genelor este precoce în ţesuturile în care ele sunt exprimate şi târzie în ţesuturile în care acestea
sunt «silenţioase». La fel, la mamifere, cromozomul X inactiv este replicat după cromozomul X
activ. Aceste corelaţii sugerează că replicarea precoce creează o stare mai accesibilă maşinăriei de
transcripţie sau mai eficace pentru fixarea factorilor de transcripţie.
SLIDE 62. Modelul solenoid al cromatinei condensate Figura. Modelul solenoid de
organizare a fibrelor de cromatină condensată de 30 nm: a) micrografia şi modul de organizare a
nucleozomilor din structură; b) micrografie prezentând fibrele de 30 nm şi modelul de împachetare
solenoid cu caracteristicile sale structurale (adaptat după Molecular Cell Biology Lodish H., et. al.,
2000)
SLIDE 63. Nivelurile structurale superioare ale cromatinei Figura. Nivelurile structurale
superioare ale cromatinei: a) micrografie electronică prezentând domenii de cromatină, în bucle
la cromozomii în perie izolaţi dintr-un ovocit de amfibian; b) model de structurare a buclelor
fibrelor de cromatină de 30 nm imaginat în urma experienţelor de hibridare in situ cu sonde (A
la H) situate la distanţe variabile pe ADN liniar; c) micrografie electronică a unui cromozom
27
metafazic din celule HeLa, lipsit de histone ca urmare a unui tratament moderat cu detergenţi
Micrografia electronică din figură evidenţiază buclele lungi de ADN ancorate la un schelet
cromozomial compus din proteine nehistonice obţinut prin îndepărtarea histonelor din structura
cromozomilor din celule HeLa, în metafază. Acest eşafodaj flexibil are forma cromozomului
metafazic şi persistă chiar şi atunci când ADN este digerat cu nucleaze.
Acelaşi tip de bucle se pot evidenţia în cromozomii politeni interfazici din celulele insectelor şi
în cromozomii meiotici „în perie” („lamp-brush”) din ovocitele de amfibieni, ceea ce
demonstrează că acestea nu sunt proprii cromozomilor mitotici. O serie de experimente de
hibridizare „in situ”, realizate pe celule umane în interfază, utilizând diferite sonde fluorescente,
au dus la imaginarea modelului prezentat. Astfel, s-a evidenţiat că o serie de sonde (A la H) care
recunoşteau secvenţe situate la milioane de perechi de baze distanţă, în structura ADN linear,
erau poziţionate foarte aproape unele de altele în structura cromozomului interfazic. Se consideră
că apropierea dintre aceste situsuri, numite şi „regiuni asociate scheletului” (denumite SARs de
la „scaffold-associated regions” sau MARs de la „matrix- attachment regions”) este posibilă
datorită asocierii lor la scheletul cromozomului. În general, regiunile asociate scheletului se
găsesc între unităţile de transcripţie. Deci, genele sunt localizate prioritar la nivelul buclelor de
cromatină ale căror baze sunt ataşate scheletului cromozomului.
Cromozomul mitotic reprezintă etapă ultimă de condensarea a cromatinei. De obicei, un
μm de cromozom mitotic conţine un cm de ADN. Această condensare, realizată ca urmare a unui
proces încă puţin cunoscut, este însoţită de fosforilarea practic a tuturor moleculelor de histone H1
la nivelul celor cinci resturi de serină din moleculă.
SLIDE 64. Demonstraţie experimentală a formării buclelor de cromatină la cromozomii
interfazici Figura. Hibridizarea in situ a celulelor în interfază a fost realizată cu diferiţi markeri
fluorescenţi (sonde) specifici pentru secvenţe separate prin distanţe cunoscute pe cromozomul
linear. Literele din figură reprezintă sondele care pot fi identificate prin culoarea lor diferită.
Acestea arată că secvenţele A şi B care sunt separate între ele printr-un milion de baze sunt
evidenţiate în nucleu ca fiind foarte apropiate. Siturile A-F sunt separate de milioane de perechi
de baze de secvenţe lineare dar sunt fizic apropiate unele de altele în nucleul în interfază
SLIDE 65. Prezentare generala a structurii cromozomilor si genelor. ADN de la
eucariotele superioare consta in secvente unice si repetitive
SLIDE 66. Micrografie electronică a cromatinei la Drosofila melanogaster
Fibrele de 100 A sunt separate de şnururi între nucleosomi
Cromatina în formă condensată şi relaxată O imagine electronomicroscopică a cromatinei de la
Drophila melanogaster evidenţiind fibrele de 100A care leagă nucleosomii între ei. Topologia şi
conformaţia ADN
28
Influenţa super-helicităţii asupra reglării transcripţiei Numeroase observaţii indică că expresia
genelor eucariote este modulată de starea de super-helicitate a ADN. Mutaţii care afectează
topoizomerazele sau inhibitorii acestora, care la rândul lor influenţează starea de super-helicitate
a ADN, activează transcripţia anumitor gene înhibând expresia altora. Deoarece legătura
proteinelor cu ADN supra-răsucit negativ este facilitată printr-o modificare favorabilă a energiei
libere, şi este posibil ca variaţiile super-helicităţii ADN să influenţeze accesul ARN polimerazei
sau a proteinelor activatoare sau represoare la secvenţele reglatoare. Alterările stării de super-
helicitate sau gradul de supra-răsucire pot şi ele să afecteze replierea ADN şi astfel capacitatea sa
de a interacţiona cu proteinele implicate în transcripţie.
Am văzut că cromatina de la eucariote este organizată într-o serie de bucle de lungimi
variabile, ale căror extremităţi sunt ancorate în matricea proteică. Această organizare conferă
fiecărei bucle o super-helicitate proprie şi independentă de cea a buclelor vecine. Este interesant
de reţinut că topoizomeraza II, responsabilă de relaxarea ADN supra-răsucit este o proteină majoră
a structurii cromozomiale la care sunt acroşate buclele. Efectele negative sau pozitive asupra
transcripţiei structurilor care se intercalează în ADN sau inhibă topoizomerazele şi alterează astfel
întreaga superhelicitate a ADN, au contribuit şi ele la noţiunea că topologia ADN este un parametru
important, care guvernează reglarea transcripţiei. Totuşi, absenţa fenotipului care să afecteze
transcripţia la mutanţi de drojdii deficienţi în topoizomeraza I sau II sugerează că, dacă o activitate
topoizomerazică este necesară transcripţiei ADN de la eucariote, una dintre aceste activităţi poate
fi suficientă.
Cea mai mare parte a indicaţiilor care implică topoizomeraze şi efectele lor asupra
topologiei ADN în reglarea transcripţiei, sunt indirecte şi puţin concludente. De fapt, nu există nici
o probă pentru sau contra ideii că modificarea super-helicităţii unei bucle a cromozomului
influenţează activitatea de transcripţie a întregii regiuni sau a genelor care sunt localizate la acest
nivel.
Conformaţiile B şi Z ale ADN şi transcripţia ADN poate prezenta o conformaţie de dreapta (B)
sau de stânga (Z). La echilibru proporţiile relative ale celor două forme sunt influenţate de
secvenţele de ADN, superhelicitatea sa şi diversele condiţii de mediu, cum sunt forţa ionică,
temperatura şi prezenţa metalelor. În circumstanţe adecvate regiunile de dreapta şi se stânga pot
fi intercalate într-un segment de ADN. În acest caz, secvenţele situate la joncţiuni, sau apropiate
de acestea, se comportă ca substrate anormale pentru diferite enzime.
Cu toate că formarea ADN-Z a fost stabilită in vitro, de o varietate de metode fizice,
existenţa sa in vivo, fiind până de curând problematică. Prezenţa sa este acum bine verificată atât
în celule de pro şi eucariote. Cum a fost prevăzut, proporţia de ADN-Z este puternic influenţată,
in vivo, de către gradul de super-helicitate al ADN. Formarea sa este de asemenea favorizată de
secvenţele nucleotidice care conţin o alternanţă de purine şi pirimidine. De exemplu, segmentele
de secvenţe repetitive d(CA)n d(GT)n au tendinţa să adopte conformaţia Z. În plus, metilarea
resturilor C în semente care conţin o alternanţă de C şi G (5’-CGCGCG-3’) favorizează
conformaţia Z corespunzătoare situsurilor de hipersensibilitate prezente în regiunile de reglare ale
anumitor gene,
29
 Proteinele care se fixează specific la ADN-Z au fost identificate şi purificate. Astfel, mai
multe proteine care se fixează la ADN-Z sunt asociate cu elementul activator (enhancer) al
promotorului regiunii precoce a SV40. Totuşi, în ciuda punerii în evidenţă a segmentelor ADN-Z
în sau în apropierea regiunilor de reglare astfel încât proteinele care acopera această structură, rolul
său în reglarea transcripţiei rămâne speculativ. În acest caz, o proteină care se leagă la ADN-Z a
fost implicată în recombinarea ADN, dar rolurile conformaţiei ADN şi a proteinei în acest proces
nu sunt înţeledse.
SLIDE 67. Imagini electrono-microscopice ale cromatinei
SLIDE 68. Proteinele ne-histonice furnizează un schelet pe toată lungimea buclelor de cromatină
Figura: Imagine electrono-microscopică a cromozomilotr în metafază lipsiţi de histone preparaţi
din celulele HeLa prin tratament cu detergenţi. Se poate observa prezenţa unor proteine ne-
histonice care formează un anumit tip de eşafodaj de-a lungul buclelor de ADN extinse.
Masa totala a histonelor asociate cu ADN în cromatină este aproximativ egală cu cea a
ADN. Cromatina în interfază şi cromozomii în metafază conţin şi mici cantităţi dintr-un set
complex de alte proteine. De exemplu, multi dintre factorii transcripţionali au fost identificati ca
fiind asociati cu cromatina din interfază. Structura şi funcţia acestor proteine nehistonice critice,
implicate în realizarea transcripţiei va fi detaliata mai departe. Alte proteine nehistonice puţin
abundente sunt cele implicate in realizarea replicării.
Câteva proteine nehistonice sunt considerate a fi prezente în cantităţi mai mari decât
factorii de transcripţie şi de replicare. Unele dintre acestea manifestă o mobilitate electroforetică
mare şi au fost denumite: proteine HMG (high mobility group). Câteva dintre aceste HMG se
consideră că se leagă cooperativ la ADN cu factorii de transcripţie, stabilizând complexele multi-
proteice care reglează transcripţia genelor învecinate.
SLIDE 69. În timpul interfazei cromozomii umani rămân plasaţi în domenii specifice în nucleu.
Limfocitele fixate în interfază au fost hibridizate in situ cu sonde specifice marcate cu biotină
pentru secvenţe complementare cu lungimea întregului cromozom 7 şi apoi vizualizate cu
sistemul avidină marcată cu fluoresceină. În celulele diploide prezentate în figură, fiecare dintre
cei doi cromozomi 7s este restricţionat într-un anumit teritoriu sau domeniu în interiorul
nucleului mai degrabă decât să fie dispersate în întregul nucleu.
SLIDE 70. Evidenţierea heterocromatinei Figura. Evidenţierea
heterocromatinei: a) micrografie electronică a unei celule stem din măduva spinării. Regiunile
închise de la periferia nucleului şi din afara nucleolului reprezintă heterocromatină; b) prezenţa
cromozomului X inactivat sub forma corpusculului Barr într-o celulă de femeie
Heterocromatina şi eucromatina
După terminarea mitozei, cea mai mare parte a cromatinei care compune cromozomii
mitotici foarte condensaţi se dispersează şi revine la starea sa interfazică
30
difuză. Totuşi, în cea mai mare parte a celulelor, aproximativ 10% din materialul cromozomial îşi
păstrează forma condensată compactă pe tot parcursul interfazei, cromatina condensată putând fi
evidenţiată la periferia nucleului. Termenul de heterocromatină desemnează cromatina care
rămâne condensată în timpul interfazei pentru a o distinge de eucromatina care desemnează starea
dispersată. Dacă celulele sunt puse în prezenţa unui precursor ARN radiomarcat, la nivelul uridinei
(uridină 3H), şi apoi fixate, secţionate şi observate după autoradiografie, se constată că regiunile
de heterocromatină rămân nemarcate deoarece acestea sunt puţin transcrise sau chiar netranscrise.
Cercetările din ultimii ani demonstrează clar posibilitatea trecerii reversibile dintr-o formă în alta,
această clasificare fiind mai degrabă didactică.
Numeroase gene de la eucariotele multicelulare nu sunt exprimate decât în anumite
momente ale dezvoltării şi/sau în anumite ţesuturi. Deci, celulele trebuie să posede modalităţi
eficace pentru a reprima expresia tuturor genelor care nu sunt caracteristice unui anumit tip de
celulă într-o anumită etapă a dezvoltării sale. Represia unor blocuri mari de gene, prin limitarea
disponibilităţii factoriilor de transcripţie, este un mecanism destul de puţin probabil pentru o astfel
de reglare. Ideea este susţinută de faptul că unele gene, care nu sunt exprimate în mod normal într-
o celulă, pot fi transcrise dacă sunt introduse prin transfecţie în aceasta. De exemplu, genele
globinei, induse prin transfecţie în fibroblaste, sunt exprimate de o mie de ori mai puternic decât
genele rezidente ale globinei. Această diferenţă persistă în cursul diviziunilor succesive dacă
genele transfectate sunt integrate la nivelul unor situsuri cromozomiale. De fapt, posibilitatea ca
genele transfectate să aibă o activitate mai mare decât genele endogene este un efect destul de
obişnuit dar nu universal. Este general admis că această represie este rezultatul sechestrării genelor
„silenţioase” în complexe de cromatină superior structurate care le fac inaccesibile maşinăriei de
transcripţie.
În absenţa informaţiei privind organizarea acestei structuri a cromatinei, este imposibil de
descris starea de tranziţie care separă cromatinele reprimate şi exprimate. O indicaţie este
furnizată de corelaţia care există între momentul în care gena este replicată şi cel în care ea poate
fi transcrisă. Genele de menţinere, exprimate în permanenţă în toate celulele (exemplu:
dihidrofolat-reductază, actină citoplasmatică, glucozo-6-fosfat dehidrogenaza) sunt replicate în
prima jumătate a fazei S. În acelaşi context, genele neexprimate tind să fie replicate mai târziu.
De asemenea, replicarea genelor este precoce în ţesuturile în care ele sunt exprimate şi târzie în
ţesuturile în care acestea sunt „silenţioase". DE exemplu, la mamifere cromozomul X inactiv este
replicat după cromozomul X activ. Aceste corelaţii sugerează că replicarea precoce creează o
stare mai accesibilă maşinăriei de transcripţie crescând eficienţa fixării factorilor de transcripţie.
Heterocromatina
Heterocromatina poate fi divizată în două categorii: constitutivă şi facultativă, în funcţie
de permanenţa stării condensate. Heterocromatina constitutivă rămâne condensată tot timpul şi
reprezintă regiunile din structura ADN care rămân silenţioase permanent. În celulele de mamifere,
cea mai mare parte a heterocromatinei constitutive se găseşte în apropierea centromerului tuturor
cromozomilor şi în alte câteva regiuni particulare, cum este braţul distal al cromozomului Y la
masculi. La multe plante, extremităţile cromozomului (telomerii) sunt şi ele formate din
heterocromatină constitutivă. În principal, ADN din structura heterocromatinei constitutive este
format din secvenţe înalt repetitive şi se presupune că este lipsit de gene care codifică pentru
proteine. Se consideră că, heterocromatina conţine elemente
31
a căror influenţă se face simţită la o anumită distanţă şi poate afecta starea fiziologică a genelor
învecinate. Astfel, dacă unele gene active, care şi-au schimbat poziţia ca urmare a unei transpoziţii
sau a unei translocări, se află poziţionate în apropierea heterocromatinei, ele prezintă tendinţa de
a deveni inactive. Acest fenomen poartă numele de efect de poziţionare.
Contrar formei constitutive, heterocromatina facultativă este inactivată specific în cursul
anumitor stadii de viaţă ale organismului. Un exemplu tipic de heterocromatină facultativă este
furnizat de inactivarea unui cromozom X în celulele femele de la mamifere. Celulele masculine au
un mic cromozom Y şi un cromozom X mult mai mare. Cromozomii X şi Y au puţine gene în
comun astfel încât bărbaţii nu posedă decât un exemplar al genelor situate pe cromozomii sexuali.
Deşi, celulele de la femele conţin doi cromozomi X, unul singur este funcţional în procesul de
transcripţie. Celălalt cromozom rămâne condensat sub forma unei mase de heterocromatină, numit
corpuscul Barr, după numele cercetătorului care l-a descoperit în anul 1949. Se consideră că,
producerea corpusculului Barr este un mecanism normal, graţie căruia celulele femele şi mascule
dispun de acelaşi număr de cromozomi X activi şi sintetizează cantităţi echivalente de produşi
codificaţi de genele situate pe cromozomul X.
SLIDE 71. Heterocromatină este compusă din regiuni cromozomiale ne-desfăşurate
Heterocromatina şi eucromatina - După terminarea mitozei, cea mai mare parte a cromatinei care
compune cromozomii mitotici foarte condensaţi se dispersează şi revine la starea sa interfazică
difuză. În cea mai mare parte a celulelor totuşi, aproximativ 10% din materialul cromozomic îşi
păstrează forma condensată compactă pe tot parcursul interfazei (această cromatină condensată
se vede la periferia nucleoidului). Termenul de heterocromatină desemnează cromatina care
rămâne condensată în timpul interfazei pentru a o distinge de eucromatină care desemnează
starea dispersată. Dacă celulele sunt puse în prezenţa unui precursor de ARN radiomarcat la
nivelul uridinei (uridină 3H) şi apoi fixate, secţionate şi observate după autoradiografie se
constată că pachetele de heterocromatină rămân ne-marcate; deci acestea sunt puţin transcrise
sau netranscrise.
Heterocromatina poate fi divizată în două categorii: constitutivă şi facultativă , în funcţie
de permanenţa stării condensate. Heterocromatina constitutivă rămâne condensată tot timpul şi
reprezintă ADN care rămâne silenţios în mod permanent. În celulele de mamifere, cea mai mare
parte a heterocromatinei constitutive se găseşte în apropierea centromerului tuturor cromozomilor
şi în câteva locuri particulare, cum este braţul distal al cromozomului Y la masculi. La multe
plante, extremităţile cromozomului (telomerii) sunt şi ele formate din heterocromatină
constitutivă. ADN din structura heterocromatinei constitutive este în principal format din secvenţe
înalt repetitive şi se presupune că este lipsit de gene care codifică pentru proteine. De fapt, dacă
gene, în mod normal active, se află în apropierea heterocromatinei (după ce şi-au schimbat poziţia
ca urmare a unei transpoziţii sau a unei translocări), ele prezintă tendinţa de a deveni inactive: este
ceea ce numin efect de poziţionare. Se presupune că heterocromatina conţine elemente a căror
influenţă se face simţită la o anumită distanţă şi poate afecta starea fiziologică a genelor învecinate.
Contrar formei constitutive, heterocromatina facultativă este inactivată specific în cursul
anumitor stadii de viaţă ale organismului. Putem găsi un exemplu de heterocromatină facultativă
comparând celulele unei femele cu cele ale unui mascul
32
de la mamifere. Celulele masculine au un mic cromozom Y şi un cromozom X mult mai mare.
Cromozomii X şi Y au puţine gene în comun astfel încât bărbaţii nu posedă decât un exemplar al
genelor situate pe cromozomii sexuali. Cu toate că celulele de la femele conţin doi cromozomi
X, unul singur este funcţional pentru transcripţie. Celălalt cromozom rămâne condensat sub
forma unei mase de heterocromatină, numit corpuscul Barr, numele venind de la cercetătorul
care l-a descoperit în anul 1949. Se consideră că producerea corpusculului Barr este un
mecanism graţie căruia celulele femele şi masculine dispun de acelaşi număr de cromozomi X
activi şi sintetizează deci cantităţi echivalente de produşi codificaţi de genele situate pe
cromozomul X. Inactivarea cromozomului X
În 1961, geneticiana britanică Mary Lyon emite ipoteza că un cromopzom X devine
heterocromatic în toate celulele de la femelele de mamifere într-un stadiu precoce al dezvoltării
embrionare. Acest mecanism este numit inactivarea cromozomului X şi s-a demonstrat ulterior că
acest fenomen se produce în embrioni în momentul gastrulaţiei. Inactivarea în embrion este un
proces aleator în sensul că cromozomul X de origine maternă sau paternă prezintă aceeaşi
probabilitate de a fi inactivaţi în oricare dintre celule. În consecinţă, cromozomul X patern poate
fi inactivat într-o celulă embrionară în timp ce cromozomul X maternal poate fi inactivat într-o
celulă vecină. Din acel moment, totuşi, acelaşi cromozom X este inactiv în toată descendenţa unei
celule particulare. Cel de al doilea cromozom X este reactivat în celulele germinale înainte de
începutul meiozei. Cei doi cromozomi X sunt deci activi în timpul ovogenezei şi toţi gameţii
primesc un cromozom X activ.
Cum cromozomii X pot proveni de la tată şi de la mamă pot purta alele diferite pentru
acelaşi caracter, femelele adulte sunt, într-un anumit sens, un mozaic genetic, deoarece alele
diferite funcţionează în celule diferite. Mozaicismul cromozomului X se traduce prin pete de
culoare la blana anumitor mamifere, cum sunt pisicile „calico” . La om, genele de pigmentare nu
sunt localizate pe cromozomul X, de unde absenţa „femeilor calico”. Existenţa mozaicismului
datorată inactivării cromozomului X la femei a fost totuşi demonstrată. De exemplu, cei doi ochi
ai unei femei heterozigote pentru daltonism roşu-verde sunt luminaţi de un fascicol de lumină roşie
sau verde, se poate detecta în retină, plaje de celule care prezintă o proastă percepţie a culorilor,
dispersate printre plajele unde vederea este normală.
Mecanismul responsabil de inactivarea cromozomului X a atras atenţia după ce în 1992 o
publicaţie a sugerat că inactivarea este iniţiată de o moleculă de ARN mai degrabă decât o proteină,
transcrisă plecând de la gena Xist localizată pe cromozomul X de altfel inactiv. (Gena omologă a
cromozomului X activ nu este transcrisă, ceea ce reprezintă un exemplu rar de expresie într-o
porţiune cromozomică devenită heterocromatină). Această descoperire, şi multe altele, au stat la
originea idei conform căreia moleculele de ARN pot funcţiona direct ca reglatori ai genelor, ceea
ce reprezenta o funcţie încă necunoscută a ARN. De când biologii consideră ARN ca o
macromoleculă primitivă purtătoare de informaţie, s-au prezis noi roluri pentru ARN care sunt şi
demonstrate.
SLIDE 72. Sensibilitatea la nucleaze Figura. Structura genomului SV40. Se
evidenţiază regiunea lipsită de nucleozomi în partea superioară a figurii. Micrografiile
electronice ale minicromozomilor izolaţi de la SV40 evidenţiază o zonă liberă de nucleozomi în
ADN
Absenţa particulelor nucleozomale, la nivelul acestui fragment, care conţine şi originea
de replicare a cromozomului viral, presupune legarea în acel loc, a unei
33
proteine nehistonice situs-specifică care poate influenţa poziţionarea particulelor nucleozomale.
Poziţionarea nucleozomilor poate fi influenţată şi de capacitatea ADN de a se răsuci în
jurul nucleului histonelor. Astfel, segmentele de ADN bogate în A-T sunt mai flexibile şi se
curbează mult mai uşor decât regiunile bogate în G-C. În consecinţă, nucleozomii au tendinţa să
se formeze în regiunile în care raportul A-T şi G-C este optim deoarece este diminuată energia
necesară pentru răsucirea ADN în jurul octamerilor de histone. S-a constatat că regiunile bogate
în A-T se găsesc preferenţial în locurile unde fosa mică a dublei elice este orientată către nucleul
histonic, în timp ce regiunile bogate în G-C se găsesc, cu predilecţie, în zonele în care fosa mică
este orientată către exterior. De fapt, poziţionarea nucleozomilor poate fi foarte importantă
pentru exprimarea genelor. Regiuni lipsite de nucleozomi
Situsurile de hipersensibilitate la nucleaze apar probabil acolo unde există o discontinuitate
în aranjarea nucleozomilor. Acest fapt a fost demonstrat pentru prima dată, prin corelaţiile care
există între situsurile de hipersensibilitate şi zonele lipsite de nucleozomi în genomul SV40.
Micrografiile electronice ale minicromozomilor izolaţi de la SV40 evidenţiază o zonă liberă de
nucleozomi în ADN. Această zonă se întinde de la situsul de iniţiere a transcripţiei genei precoce
la extremitatea în amont a elementului activator (enhancer). Când segmentul de 400 pb este
transferat într-o altă regiune a genomului SV40 sau este integrat în ADN plasmidial ne-înrudit, se
formează o zonă liberă de nucleozimi şi de situsuri de hipersensibilitate la DN-aza I în aceste
locuri. Acesta indică că cele două proprietăţi sunt probabil consecinţa secvenţei nucleotidice a
acestui segment de ADN. Totuşi, sensibilitatea la nuclează este probabil modulată de proteine ne-
histonice legate la această regiune, probabil proteine care se fixează la ADN-Y şi factori de
transcripţie legaţi la elementul activator (enhancer).
Judecând după sensibilitatea la DN-aza I sau la nucleaza din Micrococus, regiunile
cromatinei activă transcripţional sunt mai puţin compacte decât cele ale genelor silenţioase. Acestă
sensibilitate la nucleaze se întinde adesea pe mai multe mii de perechi de baze de o parte şi de alta
a unităţii de transcripţie. Bazele acestei sensibilităţi diferite nu au fost stabilite, dar studiile
biochimice sugerează că nucleosomii genelor active sunt săraci în histone H1 şi bogaţi în histone
acetilate, legate prin ubicuitină şi complexate cu mai multe tipuri de proteine foarte acide (HMG
pentru High Mobility Group). Aceste modificări alterează asocierea histonelor cu ADN şi ar putea
favoriza separarea neregulată a nucleosomilor, făcând ADN mai sensibil la digestie. Astfel,
periodicitatea normală a situsurilor de clivare cu nucleaze ale genelor proteinelor de şoc termic
este modificată în timpul inducerii acestora de către căldură. Aceeaşi variaţie a situsurilor de
clivare se poate observa şi pentru gena ovalbuminei în oviduct şi în ficat şi a genelor IgL (k) din
limfocite după reorganizare într-o formă transcripţională activă.
SLIDE 73. Hipersensibilitatea la nucleaze Genele transcrise activ prezintă, pe lângă sensibilitatea
lor la nucleaze, situsuri de hipersensibilitate în jurul unităţii lor de transcripţie. O astfel de hiper-
sensibilitate la DN-aza I nu apare într-un ADN «nud» corespunzător. În general, situsurile de
hipersensibilitate sunt situate imediat în amont de situsul de iniţiere a transcripţiei, dar sunt
adesea situate şi la extremitatea 3’ a unităţii de transcripţie; trebuie să ne amintim că aceste
 situsuri pot să conţină secvenţe de amplificare sau de terminare. În plus, anumite gene posedă
situsuri de hipersensibilitate la DN-aza I situate la distanţe mari
34
în amont de situsul de adăugare a coifului (la mai multe kb în amont de genele β- globinei umane).
În cea mai mare parte a cazurilor, această hipersensibilitate este restrânsă la ţesuturile sau celulele
în care genele sunt exprimate sau programate să fie exprimate. Situsul de hipersensibilitate situat
în 5’ de gena pre-proinsulinei, de exemplu, este prezent în insulele β ale celulelor pancreatice dar
nu se găsesc în celulele hepatice. La fel, situsurile de hipersensibilitate sunt asociate genelor
reorganizate ale imunoglobulinelor rearanjate în celulele B, dar nu în ţesuturile hematopoietice.
Situsurile de hipersensibilitate la nucleaze şi lipsite de nucleozomi sunt prezente şi în
elementele activatoare ale genelor IgH şi IgL(k) şi în secvenţele UAS asociate extremităţii 5’ a
genelor GAL ale metalotioneinei. Situsuri de hipermetilare apar în elementele genelor care răspund
la glucocorticoizi în minutele care urmează adăugării de hormon la celule şi dispar rapid după
eliminarea acestuia. Situsuri de hipersensibilitate la DN-aza I sunt asociate şi cu activarea
transcripţiei ADNr şi apar în amont de situsul de iniţiere şi în apropierea regiunilor separatorilor
intergenici. Astfel, hipersensibilitatea la nucleaze a devenit un indicato al regiunilor de reglare a
transcripţiei.
Deoarece localizarea secvenţelor care reglează transcripţia coincide cu situsurile de
hipersensibilitate la nucleaze şi cu situsurile lipsite de nucleozomi, considerăm că aceste
caracteristici sunt corelate. Fixarea factorilor de transcripţie deplasează probabil nucleozomii sau
alterează împachetarea acestora având drept consecinţă un «vid» vizibil în aranjarea cromatinei
sau chiar perturbări mai subtile care permit nucleoliza. Dacă totuşi, împachetarea densă a
nucleozomilor este stabilizată de către histona H1 sau prin replierea sub forma unei structuri mai
aerate, accesul proteinelor esenţiale transcripţiei la secvenţele semnal poate fi restrânsă,
împiedicând astfel iniţierea transcripţiei.
În acest domeniu al cercetărilor privind diferenţele dintre cromatina exprimată şi cea
reprimată, precum şi a trecerii de la o stare la altă rămân o serie întreagă de întrebări care nu si-au
găsit răspuns. Până în prezent ştim că există regiuni ale cromatinei care pot fi menţinute în stare
condensată şi ne-exprimată timp de mai multe cicluri de replicare după care sunt apoi disociate şi
devim exprimabile sub acţiunea unor stimuli adecvaţi, exogeni sau endogeni. Pentru moment nu
putem spune dacă activarea regiunilor specifice ale cromatinei implică intervenţia proteinelor care
acţionează pozitiv, sau eliminarea unor proteine care joacă rol de represor sau ambele situaţii.
Modelul solenoid al fibrei de 30nm condensată Octamerul de histone este prezentat ca un disc
oranj. Fiecare nucleozom asociat cu o molecula de H1 şi cu fibrele care sunt răsucite într-o
structură solenoidă cu un doametru de 30 nm.
Hibridizarea in situ a celulelor în interfază a fost realizată cu diferiţi markeri fluorescenţi
(sonde) specifici pentru secvenţe separate prin distanţe cumoscute pe cromozomul linear. Literele
din figură reprezintă sondele care pot fi identificate prin culoarea lor diferită.Acestea arată că
secvenţele A şi B care sunt separate între ele printr-un milion de baze sunt evidenţiate în nucleu
ca fiind foarte apropiate.
SLIDE 74. Cromozomii politeni de la Drosophila Evidenţierea benzilor de la
cromozomii politeni din glandele salivare de la Drosophila. Toţi cei 4 cromozomi sunt ţinuţi
împreună de cedntromerii lor.
35
 SLIDE 75. CARIOTIP Etapele realizarii unui cariotip. Figura.
Cariotipul cromozomilor mitotici de la om: a) tehnică folosită pentru obţinerea de preparate de
cromozomi mitotici din leucocitele sângelui periferic; b) după obţinerea unei fotografii a
cromozomilor eliberaţi din nucleu,
aceştia sunt aranjaţi perechi şi după mărime.
Dispersarea cromatinei în celulele în interfază face mult mai uşoară replicarea şi
transcripţia ADN. Din contră, cromatina celulelor mitotice este sub forma cea mai condensată,
care uşurează „livrarea” unui pachet intact de ADN fiecărei celule fiice. Cromozomii mitotici sunt
foarte utili, atât pentru biologi cât şi pentru medici, deoarece ei conţin un lot complet de material
genetic celular şi pot fi puşi în evidenţă prin tehnici simple. Când un cromozom se condensează în
timpul profazei mitotice, el adoptă o formă distinctă şi constantă determinată, în principal, de
lungimea moleculei de ADN şi de poziţia centromerului. Se pot evidenţia cromozomii mitotici ai
unei celule în diviziune prin tehnica descrisă în figura a. În această tehnică, celulele sunt sparte
după oprirea diviziunii celulare în mitoză în urma folosirii colchicinei. Cromozomii mitotici sunt
fixaţi la suprafaţa unei lame unde ocupă o suprafaţă foarte mică şi coloraţi cu diferite tipuri de
reactivi. De exemplu, tehnica în care se realizează o proteoliză limitată şi colorarea cu reactiv
Giemsa poartă numele de “bandare G”. Prin aceasta se evidenţiază prin benzi închise la culoare
regiunile bogate în AT şi prin benzi pale cele bogate în GC.
După fotografiere cromozomii individuali sunt decupaţi şi aranjaţi în perechi. Se realizează
un cariotip în care cromozomii omologi sunt dispuşi în ordinea descrescătoare a mărimii aşa cum
se prezintă în figură. Celulele somatice de la om conţin 46 cromozomi care pot fi grupaţi în 22 de
perechi omologe şi cromozomii sexuali care sunt XX la femei şi XY la bărbaţi. Studiul cariotipului
este o tehnică de bază pentru citogeneticieni. Cu colorantul Giemsa se obţin între 400 şi 800 benzi
pentru un set haploid de cromozomi. Preparatele de cromozomi mitotici sunt curent realizate
pornind de la culturi de celule sanguine pentru a identifica indivizii purtători de anomalii
cromozomale. Există posibilitatea determinării cromozomilor suplimentari, absenţa lor sau o serie
de alte modificări vizibile la microscopul optic.
SLIDE 76. Tehnici de colorare folosite pentru bandarea cromozomilor
O altă modalitate de prelucrare o reprezintă colorarea cu quinacrină (bandarea Q) care
evidenţiază striuri transversale. Deoarece distribuţia benzilor Q este caracteristică, fiecărui
cromozom de la fiecare specie, tehnica permite identificarea rapidă a cromozomilor şi realizarea
unor comparaţii între specii. De asemenea, se pot detecta anomalii minime din structura
cromozomului prin identificarea modificărilor care apar în repartiţia benzilor. Benzile Q
strălucitoare conţin, de obicei, secvenţe de ADN bogate în A-T şi un număr redus de gene care
codifică pentru proteine.
Braţul scurt al cromozomului este desemnat cu litera p („petit”), iar braţul lung cu litera q
(următoarea literă din alfabet). În tehnicile de bandare, fiecare braţ al cromozomului este împărţit
în două sau mai multe regiuni prin benzi mari. Regiunile sunt numerotate cu 1, 2, 3 pornind de la
centromeri către capete. Fiecare regiune este divizată în benzi şi subdiviziuni ale benzilor. De
exemplu, Xp21.2 se referă la segmentul cromozomial localizat pe braţul scurt al cromozomului X,
în regiunea 2, banda 1 şi sub-banda 2.
36
 SLIDE 77. Elementele morfologice şi funcţionale ale cromozomilor de la eucariote Figura: In
ciuda diferenţei privind numărul de cromozomi de la aceste animale, cele două genoame conţin
aproximativ aceeaşi cantitate de ADN. Un cariotip se obţine prin tratarea celulelor în metafază
cu un reactiv de colorare a ADN urmat de întinderea (etalarea) cromozomilor pe o lamă de
microscop. Cromozomii omologi identificaţi în fotografie sunt decupaţi şi cuplaţi în perechi.
Fiecare număr desemnează o pereche de cromozomi omologi iar întregul consdtituie cariotipul.
Structura cromozomului mitotic
Dispersarea cromatinei în celulele în interfază face mult mai uşoară replicarea şi
transcripţia ADN. Din contră, cromatina celulelor mitotice este sub forma cea mai condensată,
care uşurează „livrarea” unui pachet intact de ADN fiecărei celule fiice. Cromozomii mitotici sunt
foarte utili atât pentru biologi cât şi pentru medici deoarece ei conţin un lot complet de material
genetic celular şi pot fi puşi în evidenţă prin tehnici simple.
Când un cromozom se condensează în timpul profazei mitotice, el adoptă o formă distinctă
şi constantă, determinată în principal de lungimea moleculei sale de ADN şi de poziţia
centromerului. Se pot evidenţia cromozomii mitotici ai unei celule în diviziune prin tehnica
descrisă în figura. În această tehnică, celulele sunt sparte şi cromozomii mitotici ai unuia dintre
nuclei sunt fixaţi la suprafaţa unei lame unde ocupă o suprafaţă foarte mica. Dacă decupăm
cromozomii individuali din această fotografie este posibilă dispunerea lor pe perechi (23 la om) şi
realizarea unui cariotip în care cromozomii omologi sunt dispuşi în ordinea descrescătoare a
mărimii aşa cum se prezintă în figura. Preparatele de cromozomi mitotici sunt curent realizate
pornind de la culturi de celule sanguine pentru a identifica indivizii purtători de anomalii
cromozomale. Există posibilitatea determinării cromozomilor suplimentari, absenţa lor sau
modificările grosiere.
Cromozomii din figura au fost coloraţi cu „quinacrine” colorant florescent care face să
apară pe cromozomi striuri transversale. Distribuţia acestor benzi Q, cum au fost numite, este
foarte caracteristică, fiecărui cromozom al fiecărei specii; acestea permit identificarea rapidă a
cromozomilor şi realizarea unor comparaţii de la o specie la alta. De asemenea se poate detecta
anomaliile relativ minime din structura cromozomului prin identificarea modificărilor care apar
repartiţia benzilor. Benzile Q strălucitoare conţin de obicei secvenţe de ADN bogate în A-T şi un
număr redus de gene care codifică pentru proteine.
O metodă dezvoltată relativ recent pentru diferenţierea distinctă a fiecărui cromozom uman
numită “Colorarea cromozomilor” simplifică mult distincţia dintre cromozomii cu mărimi şi forme
similare. Acedastă tehnică foloseşte sonde specifice pentru siturile dispuse de-a lungul lungimii
fiecărui cromozom. Sondele sunt colorate cu unul din doi coloranţi fluorescenţi care prezintă
lungimi de undă diferite. Sondele specifice pentru fiecare cromozom sunt marcate cu o fracţie
predeterminată pentru fiecare din cei doiu coloranţi. După ce sondele sunt hibridizate cu
cromozomii şi excesul îndepărtat, proba este plasată la un microscop fluorescent unde un detector
determină fracţia fiecărui colorant prezent în fiecare poziţie fluorescentă din câmpul microscopic.
Informaţiile sunt acumulate de un computer unde un program special furnizează o imagine a
fiecărui tip de cromozom. Combinarea dintre colorarea cromozomilor şi hibridizarea in situ
fluorescentă, numită FISH multicolor, poate detecta translocarile cromozomale.
37
Centromerii.
Se poate remarca căci toţi cromozomii reprezentaţi în figura posedă un situs la unde
suprafaţa lor exterioară este net răscroită (scobită). Această scobitură reprezintă centromerul
cromozomului. Mai sus am arătat că centromerii conţin heterocromatină constitutivă.
Centrometrii cromozomilor umani conţin o secvenţă lungă de aproximativ 170 nucleotide (ADN
satelit α) dispuse în tandem şi repetate de 2 000 la 30 000 ori per centromer. ADN centromeric
fixează proteine specifice, între altele cele care servesc drept situs de fixare microtubulilor care
separă cromozomii în timpul diviziunii mitotice. Telomerii
Cele două extremităţi ale moleculei de ADN a fiecărui cromozom posedă un segment foarte
particular de secvenţe repetitive numite telomeri, care formează un „coif” la fiecare capăt al
cromozomilor. La om telomerii posedă secvenţe TTAGGG/AATCCC repetitive de mii de ori.
Contrar celor mai multe tipuri de secvenţe repetitive, care variază mult între specii, chiar dacă ele
sunt înrudite şi apropiate, în cazul telomerilor de la om şi de la toate vertebratele studiate până în
prezent găsim aceeaşi secvenţă telomerică. La alte organisme cum sunt protozoarele şi drojdiile,
telomerii au secvenţe diferite dar, ca şi pentru vertebrate, o catenă este întotdeauna bogată în resturi
de guanozină iar complementara sa în resturi de citozină. Catena bogată în G este orientată în
sensul 5’-3’ către extremitatea cromozomului şi depăşeşte cu 12 la 15 nucleotide extremitatea
catenei bogată în C. Datorită existenţei acestui dezechilibru catena bogată în G formează o scurtă
coadă monocatenară la cele două extremităţi ale cromozomului. Această dispoziţie persistă de la
o generaţie celulară la alta datorită unei enzime speciale, telomeraza, care poate adăuga noi unităţi
repetitive la extremitatea 3’ a catenei bogate în G.
Telomeraza, ale cărei proprietăţi au fost bine studiate de către Elisabeth Blackburn şi
colegii săi de la Universitatea din California, San Francisco, este o transcriptază inversă care
asamblează fragmente de ADN folosind o catenă (matriţă) de ARN. Telomeraza este o enzimă
foarte neobişnuită în sensul în care ARN care serveşte drept model face în realitate parte din
enzimă. Secvenţele telomerice sunt şi situsuri de fixare a mai multor proteine specifice.
Telomerii au roluri importante: ei sunt necesari replicării complete a cromozomului;
protejează cromozomii de nucleaze şi de alte influenţe destabilizatoare; împiedică fuziunea dintre
extremităţile cromozomilor şi facilitează interacţiile dintre extremităţile cromozomilor şi anvelopa
nucleară în anumite tipuri celulare. Experienţe recente sugerează alte roluri. Celulele normale nu
sunt capabile să se dividă în cultură decât de un număr limitat de ori înainte de a da semne de
„îmbătrânire” şi în final de a muri. Au fost propuse diferite ipoteze pentru a explica această
observaţie: cea mai recentă este scurtarea progresivă a telomerilor. Telomerii se scurtează deoarece
cea mai mare parte a celulelor umane par a fi lipsite de telomeraze. Contrar celulelor normale
celulele canceroase nu încetează să crească în cultură; spunem că acestea devin „nemuritoare”.
Unul dintre factorii care ar putea contribui la imortalizarea celulelor maligne este reactivarea
telomerazei, care conservă lungimea telomerilor de-a lungul generaţiilor. De fapt, cercetări recente
au demonstrat că un anumit număr de cancere la om au o activitate a telomerazei care nu poate fi
evidenţiată în celulele normale. Această descoperire a declanşat cercetarea inhibitorilor specifici
ai acestei enzime sperând că aceştia ar putea opri creşterea anumitor tumori.
38
 La ADN de la eucariote, originile de replicare au fost pentru prima dată identificate prin
funcţiile lor în studiile de transformare la drojdii. Dacă celulelor de drojdii le lipseşte o genă
particulară (ex, una dintre genele implicate în biosinteza leucinei), ele pot fi transformate cu
plasmide care conţin clonată gena lipsă (ex, gena LEU). Transformanţii LEU+, care pot creşte pe
mediu fără leucină sunt obţinuţi cu o frecvenţă mai mare dacă plasmida conţine mai multe
secvenţe din genomul de drojdie de aproximativ 100 pb, numite secvenţe replicative autozomale
(ARS). O ARS acţionează ca o origine de replicare, permitând plasmidei circulare să se replice
în nucledul de drojdii. Centromerii. Într-o cultură celulele transformate cu o plasmidă simplă
circulară care conţine fragmentul LEU/ARS, numai aproximativ 5-20 % dintre progenituri conţin
plasmida datorită segregării mitotice greşite a plasmidelor; ca rezultat, majoritatea plasmidelor
ADN nu intră în înmugurire. Totuşi, dacă fragmentele de restricţie ale ADN genomic de la
drojdii sunt clonate într-o astfel de plasmidă circulară, o mică fracţiune dintre fragmente conferă
o segregare egala a plasmidelor atât în celulele mamă cât şi fiice după mitoză. Deoarece
fragmentele cu acest efect au fost găsite ca facând parte din centromerii fiecărui cromozom de
drojdie, ei au fost numiţi secvenţe CEN. Astfel de experimente au condus la izolarea secvenţelor
care folosesc segregarea mitotică pentru extinderea la mai mult de 90% a numărului
progeniturilor Leu- care conţin plasmida LEU. Aceste celule şi majoritatea descendenţilor lor
cresc foarte bine pe mediu fără leucină.
Dacă plasmidele circulare care conţin atât secvenţe CEN cât şi ARS sunt tăiate cu o enzimă
de restricţie, ele devin lineare. Astfel de plasmide lineare nu se replică în drojdii decât dacă ele
conţin secvenţe telomerice speciale ligate la capetele lor. Primul experiment de succes care a
implicat transfecţia celulelor de drojdie cu plasmide lineare a fost realizat folosind capetele unei
molecule de ADN care este cunoscută ca replicându-se liniar în protozoarul ciliat Tetrahymena.
Cercetările au arătat că ADN telomeric posedă un tip de structură caracteristică care este
adăugată la capetele moleculelor de ADN de către o enzimă specială telomer terminal transferază
sau telomerază. Au fost determinate structurile telomerilor pentru o serie de organisme, inclusiv
la om; majoritatea sunt secvenţe oligomere repetitive cu un conţinut ridicat în G la nivelul catenei
orientate 5’-3’ către telomer. Aceste secvenţe simple sunt repetitive la capetele terminale ale
cromozomilor şi variază de la câteva sute de de perechi de baze la drojdii şi protozoare la câteva
mii la vertebrate. Capătul 3’ ale catenelor bogate în G sunt extinse cu 12-16 nucleotride dincolo
de capătul 5’ al catenei complementare bogate in C. Această regiune este legată de proteine
specifice care protejează capetele cromozomilor lineari de atacul exonucleazelor.
Enzimele care adaugă secvenţe telomerice sunt complexe formate atât din proteine cât şi
din ARN. Deoarece secvenţa ARN serveşte drept matriţă pentru adăugarea de
dezoxiribonucleotide la capetele telomerilor, sursa de enzimă şi nu sursa primerului ADN
telomeric determină secvenţa adăgată. Astfel telomeraza este o formă specializată de revers-
transcriptază care posedă propria sa matriţă ARN pentru a realiza sinteza directă a ADN.
Acţiunea telomerazei este importantă pentru prevenirea scurtării cromozomilor în timpul
replicării ADN. Şoarecii “knockout” care nu pot produce ARN-ul asociat telomerazei nu exprimă
activitate telomerazică şi telomerii lor se scurtează considerabil cu fiecare generaţie. Astfel de
şoareci se pot reproduce normal timp de trei generaţii înainte ca absenţa telomerilor să determine
fuziunea terminală a
39
cromozomilor şi pierderea acestora. După patru generaţii potenţialul de reproducere a acesto
şoareci knockout intră în declin şi se opreşte la a şasea generaţie.
O dată ce regiunile centromerice de la drojdii care conferă segregare mitotică au fost
clonate, secvenţele lor pot fi determinate si comparate. Compararea centromerilor diferiţi de la
drojdii au evidenţiat trei regiuni (I, II şi III) care sunt necesare unui centromer să funcţioneze.
Regiunea II pare să aibă o lungime constantă (78-86 baze) şi conţine secvenţe consens nedefinite
dar bogate în resturi A şi T. O secvenţă simplă de la Drosphila care provine din regiunea
centromerică prezintă unelele similitudini cu regiunile I şi III de la drojdii, sugerând că mecanisme
similare con trolează segregarea la drojdii şi la eucariotele superioare.
SLIDE 78. Colorarea diferenţiată a cromozomilor furnizează posibilitatea evidenţierii fiecărei
perechi de cromozomi O altă tehnică, mult mai recentă, dar care a intrat în setul analizelor de de
rutină pentru stabilirea cariotipului este hibridizarea fluorescentă, in situ - FISH (“Fluorescence
In Situ Hybridization”). O metodă dezvoltată relativ recent pentru diferenţierea distinctă a
fiecărui cromozom uman numită “Colorarea cromozomilor” simplifică mult distincţia dintre
cromozomii cu mărimi şi forme similare. Această tehnică foloseşte sonde specifice pentru
siturile dispuse de-a lungul lungimii fiecărui cromozom. Sondele sunt colorate cu unul din doi
coloranţi fluorescenţi care prezintă lungimi de undă diferite. Sondele specifice pentru fiecare
cromozom sunt marcate cu o fracţie predeterminată pentru fiecare din cei doi coloranţi. După ce
sondele sunt hibridizate cu cromozomii şi excesul îndepărtat, proba este plasată la un microscop
fluorescent unde un detector determină fracţia fiecărui colorant prezent în fiecare poziţie
fluorescentă din câmpul microscopic. Informaţiile sunt acumulate de un computer unde un
program special furnizează o imagine a fiecărui tip de cromozom. Combinarea dintre colorarea
cromozomilor şi hibridizarea in situ fluorescentă, numită FISH multicolor, poate detecta
translocarile cromozomiale.
Metoda prezintă o limitare tehnică pentru stabilirea cariotipului deoarece nu poate fi
aplicată decât celulelor în diviziune sau celor la care diviziunea este indusă, in vitro. Această
problemă poate fi depăşită dacă se folosesc sonde ADN care recunosc secvenţe specifice de pe
cromozomi. Astfel de sonde, marcate fluorescent, sunt folosite pentru tratarea nucleelor interfazici.
Sondele se leagă la secvenţele complementare de pe cromozomi şi marchează specific cromozomii
care pot fi vizualizaţi prin microscopie de fluorescenţă. Astfel, FISH poate fi folosită pentru
identificarea cromozomilor din nucleii în interfază. Aplicaţiile nu se limitează numai la acest
aspect. Prin folosirea unor sonde specifice, pentru regiuni bine definite de pe cromozom, FISH se
foloseşte pentru identificarea microdeleţiilor fine şi translocărilor complexe care nu pot fi detectate
prin tehnici clasice. De asemenea, FISH reprezintă o metodă de cartare a genelor, de interes clinic,
nou izolate. O variantă extinsă a tehnicii FISH, numită „Chromosome Painting”, permite
identificarea tuturor cromozomilor unei celule prin folosirea unor seturi de sonde marcate
fluorescent care recunosc secvenţe particulare de-a lungul cromozomilor. Numărul cromozomilor
care pot fi detectaţi simultan poate fi limitat numai de disponibilitatea coloranţilor fluorescenţi
care pot fi excitaţi la diferite lungimi de undă. De exemplu, tehnica nu poate fi folosită pentru
vizualizarea simultană a tuturor celor 46 de cromozomi de la om. Această limită a fost depăşită
prin introducerea „cariotipului spectral” care presupune folosirea unor combinaţii de cinci
fluorocromi şi semnale adecvate controlate de computer. În acest fel este posibilă vizualizarea
fluorescentă a tuturor cromozomilor.
40
 SLIDE 79. Aberaţiile cromozomiale Aberaţiile cromozomiale
Mutaţiile modifică informaţia conţinută în genele individuale, dar cromozomii suportă, între
altele, modificări importante care apar cel mai adesea în timpul diviziunilor celulare. Astfel, bucăţi
de cromozomi se pot pierde sau segmente se pot schimba între cromozomi diferiţi. Aceste aberaţii
cromozomiale apar ca urmare a unor rupturi, frecvenţa lor fiind crescută prin expunerea la agenţi
capabili să modifice ADN: infecţiile virale, radiaţiile X sau agenţii chimici. Există printre altele la
cromozomii unor indivizi, zone „fragile” care sunt particular susceptibile la rupere. Anumite
maladii ereditare rare, ca sindromul Bloom, anemia Fanconi şi ataxia telangiectazică induc o
instabilitate a cromozomilor care creşte mult tendinţa de rupere.
Consecinţa unei aberaţii cromozomiale depinde de genele afectate şi de tipul de celulă
atinsă. Dacă modificarea (alterarea) intervine într-o celulă somatică ne- reproducătoare,
consecinţele sunt în general minore deoarece numai câteva celule ale organismului vor fi afectate.
Totuşi, în cazuri rare o celulă purtătoare de aberaţii se poate transforma într-o celulă malignă şi
poate dezvolta o tumoră canceroasă.
Aberaţiile cromozomiale care apar în timpul meoizei, particular după un crossing-over
anormal pot fi transmise generaţiei următoare. Dacă un cromozom anormal este transmis printr-
un gamet, toate celulele descendenţei sale vor avea aberaţia şi individul nu depăşeşte în general
stadiul dezvoltării embrionare. Există mai multe tipuri de anomalii cromozomiale: Inversiunile.
Un cromozom este adesea rupt în două locuri şi segmentul situat între cele două poziţii este
reataşat dar în ordine inversă. Această aberaţie este o inversie. Pană la 1% din indivizii umani
sunt purtători ai unei inversii care poate fi detectată într-un cariotip. Deoarece un cromozom care
conţine o inversie posedă, de obicei, toate genele cromozomului normal, individul nu este afectat
defavorabil. Totuşi, dacă o celulă cu o inversie cromozomială intră în meioză, cromozomul
aberant nu se poate împerechia corect cu omologul său normal deoarece ordinea genelor este
diferită. În acest caz, împerecherea cromozomială este însoţită de formarea unei bucle. Dacă se
produce un crossing-over în buclă, ca în figură, gameţii rezultanţi din meioză posedă o copie
suplimentară a anumitor gene (duplicare). Când un gamet care conţine un cromozom modificat
fuzionat cu un gamet normal în momentul fecundării, zigotul care rezultă este dezechilibrat la
nivelul numărului de cromozomi care de obicei este invariabil. Translocările. Dacă un cromozom
sau un fragment de cromozom se ataşează la altul, anomalia se numeşte translocare. Ca şi
inversiunile, o translocare care survine într-o celulă somatică nu are efect deloc asupra
funcţionării celulei şi a descendenţei sale. Totuşi, anumite translocări cresc probabilitatea ca
celulele să devină canceroase. Exemplul cel mai bine cunoscut este cel al cromozomului
Philadelphia, pe care îl găsim în celulele maligne (dar nu şi în celulele normale) ale indivizilor
care suferă de anumite forme de leucemie. Cromozomul Philadelphia, denumit astfel deoarece a
fost descoperit în acest oraş în 1960, reprezintă o versiune scurtată a cromozomului 22 de la om.
De-a lungul anilor, s-a crezut că segmentul care lipsea reprezenta o simplă deleţie dar, odată cu
ameliorarea tehnicilor de observare a cromozomilor, s-a demonstrat că fragmentul care lipsea era
transferat unui alt cromozom (nr. 9). Cromozomul 9 posedă o genă care codifică pentru o protein
kinază care intervine în proliferarea celulară. Ca urmare a translocării, o mică parte a acestei
proteine este
41
înlocuită prin aproximativ 600 aminoacizi suplimentari codificaţi de către fragmentul translocat
care provine de pe cromozomul 22. Această nouă proteină mult mai lungă conservă activitatea
catalitică a formei originale, dar nu mai este supusă mecanismelor de reglare normală ale celulei.
Ca şi inversiunile, translocările sunt o sursă probleme în procesul de meioză. Conţinutul genetic
al unui cromozom alterat prin translocare este diferit de cel al omologului său. În consecinţă,
gameţii formaţi în urma meiozei posedă copii suplimentare ale anumitor gene sau sunt lipsite de
aceste gene. S-a demonstrat că translocările joacă un rol important în evoluţie producând
modificări de mare anvergură care pot fi la originea separării liniilor evolutive distincte provenite
dintr-un strămoş comun. Acest accident genetic s-a produs probabil în timpul propriei noastre
istorii evolutive recente. Comparaţia celor 23 perechi de cromozomi ale celulelor somatice de la
om cu cele 24 perechi de cromozomi de la cimpanzeu, gorilă şi urangutan evidenţiază asemănări
frapante. Observarea precisă a doi cromozomi de maimuţă care nu au echivalenţă la om
demonstrează că în ansamblu aceştia corespund bandă cu bandă cromozomului 2 de la om. Într-
un anumit moment, în cursul evoluţiei către om, un cromozom întreg a fost translocat către altul
pentru a da naştere unui singur cromozom prin reducerea numărului haploid de la 24 la 23.
Deleţiile: reprezintă pierderea unui fragment de cromozom. În funcţie de localizare acestea pot
fi: i) terminale care sunt rezultatul unei singure rupturi la nivelul unui braţ al cromozomului,
producând un fragment fără centromer care este înlăturat; ii) interstiţiale care sunt rezultatul a
două ruperi şi care se soldează cu pierderea regiunii dintre acestea. Cum am văzut mai sus, zigoţi
cu o deleţie cromozomială se formează adesea când un gamet provine dintr-o meioză anormală.
Pierderea unei porţiuni cromozomiale antrenează de obicei pierderea de gene esenţiale şi are
consecinţe severe, chiar dacă cromozomul omolog este normal. Cea mai mare parte din
embrionii umani purtători ai unei deleţii semnificative nu ajung la termen iar cei care reuşesc
demonstrează existenţa a numeroase malformaţii. Jerome Lejeune a fost primul, în 1963, care a
stabilit o relaţie între o malformaţie la om şi o deleţie cromozomială; acest genetician francez
descoperise mai înainte cauza genetică a sindromului Down. Lejeune a găsit că un copil cu
diferite malformaţii ale feţei şi o dezvoltare anormală a laringelui (organ vocal) era lipsit de o
parte a cromozomului 5. Datorită unei deficienţe a larinxului, ţipătul copilului seamănă cu cel al
unui pisoi (pisică) care suferă. Din această cauză cercetătorii au numit boala „ţipătul pisicii”.
Duplicările. O duplicare provine din repetarea unei porţiuni de cromozom. S-a pus problema
rolului acestor duplicaţii în formarea familiilor multigenice. Alte duplicaţii cromozomiale mai
importante sunt responsabile de prezenţa a trei exemplare ale mai multor gene în locul a două
copii normale (trisomie parţială). Activităţile celulare sunt foarte sensibile la numărul de copii
ale genelor şi exemplarele suplimentare pot avea deci consecinţe negative grave. Aberaţiile
cromozomiale. O serie de mutaţii accidentale care modifică informaţia conţinută în genele
individuale apar cel mai adesea în cursul replicării ADN sau datorită acţiunii unor agenţi de
mediu. Fără a minimaliza importanţa acestora, pentru buna funcţionare a organismului, trebuie să
arătăm că modificări mult mai importante pot suporta cromozomii, cel mai adesea în timpul
diviziunilor celulare. Astfel, bucăţi de cromozomi se pot pierde sau segmente importante se pot
schimba între cromozomi diferiţi. Aceste aberaţii cromozomiale apar ca urmare a unor rupturi iar
frecvenţa lor este crescută în urma expunerii la agenţi de mediu capabili să modifice ADN:
42
infecţiile virale, radiaţiile X, agenţii chimici, etc. De asemenea, cromozomii unor indivizi prezintă
zone „fragile” care au o susceptibilitate particulară la rupere. Anumite maladii ereditare rare, ca
sindromul Bloom, anemia Fanconi, şi ataxia telangiectazică induc o instabilitate a cromozomilor
care creşte mult această instabilitate.
Consecinţa unei aberaţii cromozomiale depinde de genele afectate şi de tipul de celulă
atinsă. Dacă modificarea intervine într-o celulă somatică ne-reproducătoare, consecinţele sunt în
general minore, deoarece numai câteva celule ale organismului vor fi afectate. Totuşi, în cazuri
rare, o celulă purtătoare de aberaţii se poate transforma într-o celulă malignă şi poate dezvolta o
tumoră canceroasă.
Pot fi transmise generaţiei următoare, aberaţiile cromozomiale care apar în timpul meiozei,
particular după un crossing-over anormal. Dacă un cromozom anormal este transmis printr-un
gamet, toate celulele descendenţei sale vor avea aberaţia şi, în general, individul nu depăşeşte
stadiul dezvoltării embrionare.
Există mai multe tipuri de anomalii cromozomiale: Inversiuni: un cromozom este adesea
rupt în două locuri şi segmentul situat între cele două poziţii este reataşat în ordine inversă. Până
la 1% din oameni sunt purtători ai unei inversii care poate fi detectată în urma realizării unui
cariotip. Inversiunile pot fi de două tipuri: i) paracentrică, dacă implică numai un braţ al
cromozomului; ii) pericentrică, dacă rupturile se produc de o parte şi de alta centromerului.
Deoarece, de obicei, un cromozom care conţine o inversie posedă toate genele cromozomului
normal, individul nu este întotdeauna afectat defavorabil. Totuşi, dacă o celulă cu o inversie
cromozomială intră în meioză, cromozomul aberant nu se poate împerechea corect cu omologul
său normal deoarece ordinea genelor este diferită. În acest caz, împerecherea cromozomială este
însoţită de formarea unei bucle. Dacă în buclă se produce un crossing-over, gameţii rezultaţi din
meioză posedă o copie suplimentară a anumitor gene şi apare o duplicare. Dacă un gamet care
conţine un cromozom modificat fuzionează cu un gamet normal în momentul fecundării, zigotul
rezultat poartă un dezechilibru la nivelul numărului de cromozomi, care de obicei este invariabil.
Translocări: ataşarea unui cromozom sau a unui fragment de cromozom la un altul. Ca şi
inversiunile, translocările care survin într-o celulă somatică pot să nu aibă deloc efect asupra
funcţionării celulei şi a descendenţei sale. Totuşi, anumite evenimente de acest tip cresc
probabilitatea ca celulele să devină canceroase. Exemplul cel mai bine cunoscut este cel al
cromozomului Philadelphia, pe care îl găsim în celulele maligne (nu şi în celulele normale) ale
indivizilor care suferă de anumite forme de leucemie. Cromozomul Philadelphia, denumit astfel
deoarece a fost descoperit în acest oraş în 1960, reprezintă o versiune scurtată a cromozomului
22 de la om. De-a lungul anilor, s-a crezut că segmentul care lipsea reprezenta o simplă deleţie
dar, odată cu ameliorarea tehnicilor de observare a cromozomilor, s-a demonstrat că fragmentul
care lipsea era transferat unui alt cromozom (nr. 9). Cromozomul 9 posedă o genă care codifică
pentru o protein-kinază care intervine în proliferarea celulară. Ca urmare a translocării, o mică
parte a acestei proteine este înlocuită prin aproximativ 600 aminoacizi suplimentari codificaţi de
către fragmentul translocat care provine de pe cromozomul 22. Această nouă proteină, mult mai
lungă, conservă activitatea catalitică a formei originale, dar nu mai este supusă mecanismelor de
reglare normală ale celulei. Ca şi inversiunile, translocările sunt o sursă de probleme în procesul
de meioză. Conţinutul genetic al unui cromozom alterat prin translocare este diferit de cel al
omologului său. În consecinţă, gameţii formaţi în urma meiozei posedă copii
43
suplimentare ale anumitor gene sau sunt lipsite de acestea. În figura sunt prezentate două tipuri de
translocări: i) translocare reciprocă balansată, în care se produce câte o singură ruptură pe cei doi
cromozomi, cu schimb de material genetic. O astfel de translocare nu poate fi evidenţiată fără
utilizarea unor tehnici de bandare avansate; ii) fuziune centrică sau translocare robertsoniană, care
presupune fuziunea dintre doi cromozomi acrocentrici. De obicei, ruperile apar în apropierea
centromerilor fiecărui cromozom. Transferul de segmente duce la formarea unui cromozom foarte
mare şi a unuia foarte mic care se pierde.
S-a demonstrat că translocările joacă un rol important în evoluţie producând modificări
de mare anvergură care pot fi la originea separării liniilor evolutive distincte provenite dintr-un
strămoş comun. Acest accident genetic s-a produs probabil în timpul propriei noastre istorii
evolutive recente. Comparaţia celor 23 perechi de cromozomi ale celulelor somatice de la om cu
cele 24 perechi de cromozomi de la cimpanzeu, gorilă şi urangutan evidenţiază asemănări
frapante. Observarea precisă a doi cromozomi de maimuţă, care nu au echivalenţă la om,
demonstrează că în ansamblu aceştia corespund, bandă cu bandă, cromozomului 2 de la om. Se
presupune că, într-un anumit moment al evoluţiei, un cromozom întreg a fost translocat către
altul şi a dat naştere unui singur cromozom prin reducerea numărului haploid de la 24 la 23.
Cromozomul sub formă de inel reprezintă o formă specială de deleţie. Această anomalie apare
când la ambele capete ale cromozomului se produc rupturi urmate de fuziunea regiunilor
afectate. Dacă se pierd fragmente importante apar anomalii fenotipice. Din păcate, cromozomii
sub formă de inel nu se normalizează nici în meioză şi nici în mitoză, având drept rezultat
consecinţe serioase asupra organismului. Duplicările: presupun repetarea unei porţiuni de
cromozom. Se discută problema rolului acestora în formarea familiilor multi-genice. Unele
duplicări cromozomiale, mai importante, sunt responsabile de prezenţa mai multor exemplare ale
anumitor gene (ex, trisomie parţială). Cele mai cunoscute duplicări afectează genele globinei.
Deoarece echilibrul activităţilor metabolice ale organismului este foarte sensibil, existenţa unor
exemplare suplimentare pentru anumite gene poate avea consecinţe negative grave.
Izocromozomii: se obţin când unul dintre braţele cromozomului este pierdut şi braţul care
rămâne este duplicat. Se obţine un cromozom care conţine două braţe scurte sau două lungi,
identice. Cele mai frecvente cazuri se întâlnesc pentru cromozomul X.
SLIDE 80. Analiza translocărilor cromozomiale prin bandare Figura: Analiza
translocărilor cromozomale prin bandarea şi colorarea cromozomilor (a) şi prin marcarea
fluorescentă a cromozomilor (b). Se observă formarea cromozomului Philadelfia datorită
translocării unei regiuni din cromozomul 22 pe cromozomul 9
Anumiti coloranţi colorează selectiv anumite regiuni ale cromozomilor metafazici mult
mai intens decât alte regiuni producând benzi specifice fiecărui cromozom individual. Cu toate că
bazele moleculare ale regularităţii benzilor cromozomilor rămân necunoscute, aceste benzi sunt
foarte utile. Când cromozomii coloraţi sunt vizualizaţi la microscopul optic, aceste benzi servesc
drept repere de-a lungul fiecărui cromozom şi folosesc și la diferenţierea cromozomilor cu mărimi
şi profil diferit.
 Quinarina, un colorant fluorescent care se intercalează între perechile de baze ale helixului
ADN, produce benzile Q. Totuşi, deoarece benzile Q se estompează cu timpul, în laborator sunt
preferate alte tehnici. De exemplu cromozomii sunt supuși
44
unei încălziri şi proteolize uşoare şi apoi coloraţi cu reactiv Giemsa, un colorant permanent care
produce benzile G. Tratamentul cromozomilor cu soluţie alcalină caldă înainte de colorare cu
Giemsa produce benzile R cu un profil care este aproximativ invers decât cel al benzilor G.
Diferenţele între aceste profile permite citologilor să identifice părţi specifice ale cromozomilor şi
să localizeze situsurile de rupere cromozomală şi translocare. De asemenea diferite sonde care
hibridizează specific cu secvenţele cromozomilor pot fi localizate în benzi particulare.
Translocările caracteristice cromozomilor sunt asociate cu unele maladii genetice şi cu
unele tipuri specifice de cancer. De exemplu, aproape la toţi pacienţii cu leucemie cronică
mieloidă, celulele leucemice conţin cromozomul Philadelphia 22 anormal şi un cromozom 9
anormal. Acesta rezultă din traslocările care apar între cromozomii 9 şi 22. Translocările pot fi
evidenţiate prin tehnici clasice de bandare sau prin hibridizare in situ - tehnica FISH.
SLIDE 81. Numărul de cromozomi la diferite organisme (celula haploidă) Genoamele nucleare
eucariote au mărimi variabile care pot varia de la 10 Mpb la peste 100 000 Mpb. Adesea,
mărimea acestora coincide cu complexitatea organismelor, genoamele organismelor eucariote
fiind mai mari decât cele ale eucariotelor inferioare. Totuşi, mărimea nu este determinată numai
de numărul de gene, ci şi de cantitatea de secvenţe de ADN repetitiv. Cele mai mari genoame au
un număr de copii de secvenţe repetitive este foarte mare.
SLIDE 82. Mărimea genoamelor, numărul de gene şi distribuţia acestora După cum am constatat
în paragrafele anterioare, la eucariote genomul nuclear este împărţit într-un set de molecule de
ADN lineare, fiecare fiind împachetată în structura unui cromozom. Din acest punct de vedere nu
au fost evidenţiate excepţii în lumea eucariotelor, toate organismele cunoscute având cel puţin
doi cromozomi în care molecula de ADN este liniară. Variabilitatea la acest nivel se manifestă
numai în ceea ce priveşte numărul de cromozomi, care pare să nu fie corelat cu trăsăturile
biologice ale organismului.
De exemplu, drojdia Saccharomyces cerevisiae, un eucariot relativ simplu are de patru ori
mai mulţi cromozomi decât musculiţa Drosophila melanogaster. De asemenea, numărul
cromozomilor nu pare să fie corelat cu mărimea genomului sau cu poziţia evolutivă a
organismului. Anumite salamandre posedă genoame de aproximativ 30 de ori mai mari decât omul,
dar au un număr de cromozomi redus la jumătate. O situaţie similară se poate consta şi în cazul
unor plante, cum este porumbul. Aceste comparaţii sunt foarte interesante, dar din păcate nu sunt
destul de informative pentru genoamele în sine. Adesea, ele reprezintă numai o reflectare a
neuniformităţii evenimentelor evolutive care au modificat arhitectura genomică la diferite
organisme.
SLIDE 83. Mărimea conţinutului în ADN a genomului haploid de la diferite organisme Mărimea
conţinutului în ADN a genomului haploid de la diferite organisme. Complexitatea morfologică a
organismelor, estimată în funcţie de numărul tipurilor celulare pe care le prezintă, creşte de jos în
sus Figura. Mărimea conţinutului în ADN a genomului haploid de la diferite organisme.
45
Complexitatea morfologică a organismelor, estimată în funcţie de numărul tipurilor celulare pe
care le prezintă, creşte de jos în sus (după Molecular Cell Biology Lodish H., et. al., 2000)
Complexitatea morfologică a ADN se poate corela cu valoarea C, care reprezintă cantitatea
de ADN din genomul haploid. Pe de altă parte complexitatea morfologică a unui organism ar trebui
să reflecte complexitatea genetică. Cu toate acestea, corespondenţa dintre cei doi parametrii este
cunoscută drept „Paradoxul Valorii C”, deoarece unele organisme au valori C neaşteptat de mari.
De exemplu genomul peştelui "plămân" este de 10-15 ori mai mare decât cel de la mamifere.
Adesea paradoxul valorii C este aplicabil şi unor specii înrudite (de exemplu valorile C de la
diferite specii de Drosophile sunt uneori foarte diferite).
SLIDE 84. Clasificarea secvenţelor ADN de la eucariote Analiza moleculară încearcă să
explice şi paradoxul aparent pe care îl reprezintă faptul că genoamele eucariotelor par să conţină
o cantitate însemnată de ADN care nu este necesar celulei. Acum mai bine de 30 de ani se
consideră că eucariotele conţin aproximativ 50 000 gene. Cum fiecare secvenţă codantă era
considerată ca având, în medie, 1 200 pb, genomul acestora ar fi trebuit să conţină numai
aproximativ 6 x 107 pb. Acum se cunoaşte că genoamele unor ciuperci sunt mai mici decât
această valoare şi că cea mai mare parte a genoamelor de mamifere şi de plante conţin de 50 la
100 ori mai mult ADN.
SLIDE 85. Variabilitatea numărului de introni şi exoni şi mărimea acestora la diferite specii
Iniţial, pentru estimarea numărului de gene, o serie de cercetători au extrapolat situaţia cunoscută
de la E. coli unde de 4,7 milioane pb codifică pentru 3000 de gene. Păstrând proporţionalitatea,
ei considerau că genomul haploid uman de 2,9 miliarde pb trebuia să aibă un număr mult mai
mare de gene (de 600 ori mai mare). Odată cu încheierea secvenţializării genomului uman a fost
posibilă identificarea tuturor fazelor de lectură şi realizarea unei estimări cât mai corecte a
numărului genelor de la om. În prezent se discută de 30-40 000 în loc de 60-80 000 gene cum se
considera în momentul începerii acestui program. De asemenea, evoluţia tehnicilor de biologie
moleculară şi utilizarea unor aparate de secvenţializare performante permite definitivarea
secvenţializării unui număr din ce în ce mai mare de organisme şi estimarea din ce în ce mai
corectă a numărului genelor conţinute de acestea. În tabel se realizează o prezentare a mărimii
unora dintre cele mai cunoscute genoame, a numărului genelor precum şi a distribuţiei
acestora/Mb.
Această variaţie inexplicabilă a mărimii genoamelor apare deoarece cromozomii
eucariotelor conţin, pe lângă informaţia genetică din structura genelor, cantităţi variabile de ADN,
plasate în: i) introni; ii) în regiunile intra-genice şi inter- genice; iii) regiuni repetitive în tandem
sau dispersate pe toată lungimea genomului. Acest ADN, a cărui funcţie nu a fost încă demonstrată,
este adesea compus din repetiţii de secvenţe, unele dintre ele nefiind niciodată transcrise. El mai
este denumit şi „ADN nefuncţional”. În tabel sunt trecute în revistă principalele tipuri de secvenţe
prezente în structura genomului eucariotelor.
Mărimea, adesea excesivă a genoamelor eucariote se poate datora următoarelor aspecte:
i) cea mai mare parte a genelor care codifică pentru polipeptide posedă cel puţin un
intron, un număr mare de gene având mai mulţi. Totuşi, prezenţa intronilor
46
nu este obligatorie existând şi gene lipsite de aceştia. Genele care codifică pentru moleculele de
ARN funcţionale cum sunt ARNt şi ARNr pot să posede şi ele secvenţe intercalate, dar
întreruperile la nivelul acestora sunt mai puţin frecvente. În general, cantitatea de ADN prezentă
în introni depăşeşte cu mult pe cea din exoni.
ii) anumite gene apar de mai multe ori într-un genom eucariot şi contribuie la creşterea
taliei. Existenţa de copii multiple ale unei anumite gene nu este însă o proprietate exclusivă a
eucariotelor. De exemplu, E. coli posedă şapte gene pentru ARNr, probabil pentru a satisface
necesităţile, în ribozomi, ale unei creşteri rapide. Eucariotele posedă şi ele gene în copiii multiple
pentru a rezolva astfel de probleme.
iii) o altă cauză a mărimii excesive a genoamelor eucariote este prezenţa unor familii mari
de secvenţe de ADN repetitiv a căror funcţie este, pentru moment, necunoscută. Astfel de familii
reprezintă adesea între 10% la 50% din genom . Aceste secvenţe au fost pentru prima dată
identificate în urma analizei cineticii de reacţiei de renaturare a ADN. Astfel, s-a demonstrat că
mari cantităţi de ADN se reasociază mult mai rapid decât era prevăzut pentru secvenţele unice.
Viteza mare de reasociere indică faptul că genoamele conţin segmente care se repetă de sute de
mii sau de milioane de ori. Curbele de reasociere Cot sunt informative pentru identificarea
regiunilor care conţin secvenţe repetitive sau sateliţi. Clonarea moleculară şi secvenţializarea au
confirmat existenţa unor astfel de secvenţe înalt repetitive care, asemenea genelor repetitive, sunt
aranjate în tandem sau sunt dispersate la nivelul a numeroase locusuri necorelate.
SLIDE 86. Prezentare comparativă a structurii genice a cromozomului III de la Saccharomyces
cerevisiae Figura Prezentare comparativă a structurii genice a cromozomului III de la
Saccharomyces cerevisiae (a) şi clusterului β globinei de la om situat pe cromozomul 11(b).
Dreptunghiurile albastre marchează fazele de lectură. Se poate constata că genomul de S.
cerevisiae are un număr foarte mic de secvenţe nefuncţionale. La om clusterul globinei conţine
secvenţe intergenice necodante, pseudogene (ψβ1 şi ψβ2) şi secvenţe repetitive dispersate lungi
(secvenţele Alu care aparţin tipului SINES) (după Molecular Cell Biology Lodish H., et. al.,
2000)
La mamifere există mai multe sute de gene care codifică pentru ARNr. O altă parte
importantă din excesul de ADN este determinat de prezenţa copiilor nefuncţionale ale genelor. În
general, aceste copii sunt numite pseudogene şi sunt inactive din cauza existenţei unor deleţii sau
altor alterări ale secvenţei ADN. Numărul pseudogenelor pentru un anumit tip de genă variază
foarte mult. Astfel, în genoamele eucariotelor, o genă poate fi prezentă o singură dată, sau foarte
bine, poate să facă parte dintr-o familie de gene funcţionale strâns înrudite. Acestea pot fi
exprimate în momente diferite sau în ţesuturi şi celule diferite. Astfel de familii pot include şi
pseudogene. În figură este prezentat clusterul β-globinei care conţine două pseudogene. De
asemenea, se remarcă cantitatea mare de „ADN nefuncţional” prezentă la om comparativ cu
drojdia Saccharomyces cerevisiae.
ADN repetitiv constă în secvenţe scurte repetitive sub forma unor copii identice sau
înrudite în genom. Componenta care se renaturează cel mai rapid în genomul eucariotelor este
reprezentată de secvenţele „înalt repetitive”, şi constă în secvenţe foarte scurte care se repetă de
multe ori în tandem formând „clustere” mari. Datorită unităţilor repetitive scurte, aceste secvenţe
de ADN sunt adesea denumite „secvenţe ADN simple” sau „secvenţe satelit”.
47
SLIDE 87. Curbele de reasociere (Cot) pentru ADN dublu catenar din sursele indicate pe grafic Figura.
Curbele de reasociere (Cot) pentru ADN dublu catenar din sursele indicate pe grafic. Se observă
procesul de renaturare rapidă a secvenţelor repetitive sau care conţin sateliţi (după Molecular Cell
Biology Lodish H., et. al., 2000)
Acest tip de secvenţe sunt prezente în aproape toate genoamele eucariote, dar cantitatea lor
totală este extrem de variabilă. În genoamele mamiferelor acestea reprezintă, în mod normal, <
10% dar la Drosophila virilis, cantitatea este de ≈50%.
SLIDE 88. Tipuri de secvenţe ADN repetitive şi distribuţia acestora
Secvenţele repetitive în tandem pot fi corelate cu modificarea alinierilor care apar în urma
împerecherii cromozomilor. Astfel, mărimea „clusterelor în tandem” tinde să fie foarte polimorfă,
cu variaţii largi între indivizi. De fapt, clusterele mai mici, formate din astfel de secvenţe, pot fi
folosite pentru caracterizarea genoamelor individuale folosind tehnica „fingerprinting” sau
„genotiparea automată”. Compararea secvenţelor simple de ADN, de la diferite specii, oferă
informaţii interesante despre mecanismele procesului de evoluţie. Pentru moment nu putem spune
cu precizie dacă aceste secvenţe au o funcţie structurală.
Mari familii de repetiţii dispersate în genomul mamiferelor Analiza clasică a profilelor de
dispersie demonstrează că genomul uman şi genoamele altor mamifere posedă profile de
dispersie apropiate. Aceste concluzii sunt confirmate de detaliile moleculare furnizate prin
analiză de restricţie, clonare şi secvenţializare. Cu toate că există diferite familii şi sub-familii de
repetiţii dispersate, un număr mic dintre acestea prezintă un număr foarte mare de copii şi
domină genoamele. O familie dominantă poate reprezenta mai mult de 5% din ADN total, iar
totalitatea familiilor pot reprezenta 20% din acesta. Unele familii sunt constituite din secvenţe de
100 la 500 pb şi sunt denumite „secvenţe SINEs” (‘Short Interspersed Repeats). Altele, ale căror
membri pot avea 6 kpb sau mai mult, sunt denumite LINES (Long Interspersed Repeats).
Organisme cum sunt miomicetele, lăcustele, echinodermele, peştii şi amfibienii conţin repetiţii
dispersate care se aseamănă cu SINES de la mamifere. La plante şi la nevertebrate există
secvenţe comparabile cu LINES de la mamifere.
Fiecare specie (ordin) posedă „un joc” caracteristic de familii de secvenţe SINES. Una
dintre familiile SINES cele mai bine studiate este familia ALU de la primatele lumii vechi,
denumită aşa datorită prezenţei în această secvenţă a unui situs de restricţie Alu I. Unităţile Alu se
găsesc în regiuni care flanchează genele, în introni, în ADN satelit şi grupate cu alte secvenţe
repetitive dispersate.
Pe lângă multiplele familii SINES, genoamele mamiferelor posedă toate o abundentă
familie LINES, familia LINE-1, ale cărei membri pot avea 6 la 7 kpb. În unele dintre aceste
genoame, există şi alte familii LINE dar ele nu sunt la fel de frecvente. Familiile LINE-1 de la
diferite mamifere sunt toate înrudite dar divergente: cu cât speciile sunt mai apropiate cu atât
familiile sunt mai similare. Secvenţele LINE-1 sunt prezente în regiunile care flanchează genele,
în introni şi inserate în repetiţiile ADN satelit.
48
SLIDE 89. Trei elemente funcţionale sunt necesare replicării şi moştenirii stabile a
cromozomilor de la eucariote Centromerii: se poate remarca că toţi cromozomii posedă un situs
la unde suprafaţa lor exterioară este net răscroită (scobită). Această scobitură reprezintă
centromerul cromozomului. Mai sus am arătat că centromerii conţin heterocromatină
constitutivă. Centrometrii cromozomilor umani conţin o secvenţă lungă de aproximativ 170
nucleotide (ADN satelit α) dispuse în tandem şi repetate de 2 000 la 30 000 ori per centromer.
ADN centromeric fixează proteine specifice, între altele cele care servesc drept situs de fixare
microtubulilor care separă cromozomii în timpul diviziunii mitotice. Telomerii: cele două
extremităţi ale moleculei de ADN a fiecărui cromozom posedă un segment foarte particular de
secvenţe repetitive numite telomeri, care formează un „coif” la fiecare capăt al cromozomilor. La
om telomerii posedă secvenţe TTAGGG/AATCCC repetitive de mii de ori. Contrar celor mai
multe tipuri de secvenţe repetitive, care variază mult între specii, chiar dacă ele sunt înrudite şi
apropiate, în cazul telomerilor de la om şi de la toate vertebratele studiate până în prezent găsim
aceeaşi secvenţă telomerică. La alte organisme cum sunt protozoarele şi drojdiile, telomerii au
secvenţe diferite dar, ca şi pentru vertebrate, o catenă este întotdeauna bogată în resturi de
guanozină iar complementara sa în resturi de citozină. Catena bogată în G este orientată în sensul
5’-3’ către extremitatea cromozomului şi depăşeşte cu 12 la 15 nucleotide extremitatea catenei
bogată în C. Datorită existenţei acestui dezechilibru catena bogată în G formează o scurtă coadă
monocatenară la cele două extremităţi ale cromozomului. Această dispoziţie persistă de la o
generaţie celulară la alta datorită unei enzime speciale, telomeraza, care poate adăuga noi unităţi
repetitive la extremitatea 3’ a catenei bogate în G.
Telomeraza, ale cărei proprietăţi au fost bine studiate de către Elisabeth Blackburn şi
colegii săi de la Universitatea din California, San Francisco, este o transcriptază inversă care
asamblează fragmente de ADN folosind o catenă (matriţă) de ARN. Telomeraza este o enzimă
foarte neobişnuită în sensul în care ARN care serveşte drept model face în realitate parte din
enzimă. Secvenţele telomerice sunt şi situsuri de fixare a mai multor proteine specifice.
Telomerii au roluri importante: ei sunt necesari replicării complete a cromozomului;
protejează cromozomii de nucleaze şi de alte influenţe destabilizatoare; împiedică fuziunea dintre
extremităţile cromozomilor şi facilitează interacţiile dintre extremităţile cromozomilor şi anvelopa
nucleară în anumite tipuri celulare. Experienţe recente sugerează alte roluri. Celulele normale nu
sunt capabile să se dividă în cultură decât de un număr limitat de ori înainte de a da semne de
„îmbătrânire” şi în final de a muri. Au fost propuse diferite ipoteze pentru a explica această
observaţie: cea mai recentă este scurtarea progresivă a telomerilor. Telomerii se scurtează deoarece
cea mai mare parte a celulelor umane par a fi lipsite de telomeraze. Contrar celulelor normale
celulele canceroase nu încetează să crească în cultură; spunem că acestea devin „nemuritoare”.
Unul dintre factorii care ar putea contribui la imortalizarea celulelor maligne este reactivarea
telomerazei, care conservă lungimea telomerilor de-a lungul generaţiilor. De fapt, cercetări recente
au demonstrat că un anumit număr de cancere la om au o activitate a telomerazei care nu poate fi
evidenţiată în celulele normale. Această descoperire a declanşat cercetarea inhibitorilor specifici
ai acestei enzime sperând că aceştia ar putea opri creşterea anumitor tumori.
49
 SLIDE 90. Experiment pentru evidenţierea importanţei originii de replicare (a) La ADN
eucariotelor, originile de replicare au fost pentru prima dată identificate prin funcţiile lor în
studiile de transformare la drojdii. Dacă celulelor de drojdii le lipseşte o genă particulară (ex. una
dintre genele implicate în biosinteza leucinei), ele pot fi transformate cu plasmide care conţin
clonată gena lipsă (ex. gena LEU). Transformanţii LEU+, care pot creşte pe mediu fără leucină
sunt obţinuţi cu o frecvenţă mai mare dacă plasmida conţine mai multe secvenţe din genomul de
drojdie de aproximativ 100 pb, numite secvenţe replicative autozomale (ARS). O ARS
acţionează ca o origine de replicare, permitând plasmidei circulare să se replice în nucleul de
drojdii.
SLIDE 91. Experiment pentru evidenţierea importanţei centromerilor (b) Centromerii. Într-o
cultură, celulele sunt transformate cu o plasmidă simplă circulară care conţine fragmentul
LEU/ARS. Se constata ca numai aproximativ 5-20 % dintre progenituri conţin plasmida datorită
segregării mitotice greşite a plasmidelor. Rezultatul este ca majoritatea plasmidelor ADN nu
intră în înmugurire. Totuşi, dacă fragmentele de restricţie ale ADN genomic de la drojdii sunt
clonate într-o astfel de plasmidă circulară, o mică fracţiune dintre fragmente conferă o segregare
egala a plasmidelor atât în celulele mamă cât şi fiice după mitoză. Deoarece fragmentele cu acest
efect au fost găsite ca facând parte din centromerii fiecărui cromozom de drojdie, ei au fost
numiţi secvenţe CEN. Astfel de experimente au condus la izolarea secvenţelor care folosesc
segregarea mitotică pentru extinderea la mai mult de 90% a numărului progeniturilor Leu- care
conţin plasmida LEU. Aceste celule şi majoritatea descendenţilor lor cresc foarte bine pe mediu
fără leucină.
SLIDE 92. Experiment pentru evidenţierea importanţei telomerilor (c)
Dacă plasmidele circulare care conţin atât secvenţe CEN cât şi ARS sunt tăiate cu o enzimă
de restricţie, ele devin lineare. Astfel de plasmide lineare nu se replică în drojdii decât dacă ele
conţin secvenţe telomerice speciale ligate la capetele lor. Primul experiment de succes care a
implicat transfecţia celulelor de drojdie cu plasmide lineare a fost realizat folosind capetele unei
molecule de ADN care este cunoscută ca replicându-se liniar în protozoarul ciliat Tetrahymena.
Cercetările au arătat că ADN telomeric posedă un tip de structură caracteristică care este
adăugată la capetele moleculelor de ADN de către o enzimă specială telomere-terminal transferază
sau telomerază. Au fost determinate structurile telomerilor pentru o serie de organisme, inclusiv
la om; majoritatea sunt secvenţe oligomere repetitive cu un conţinut ridicat în G la nivelul catenei
orientate 5’-3’ către telomer. Aceste secvenţe simple sunt repetitive la capetele terminale ale
cromozomilor şi variază de la câteva sute de de perechi de baze la drojdii şi protozoare la câteva
mii la vertebrate. Capătul 3’ ale catenelor bogate în G sunt extinse cu 12-16 nucleotride dincolo
de capătul 5’ al catenei complementare bogate in C. Această regiune este legată de proteine
specifice care protejează capetele cromozomilor lineari de atacul exonucleazelor.
Enzimele care adaugă secvenţe telomerice sunt complexe formate atât din proteine cât şi
din ARN. Deoarece secvenţa ARN serveşte drept matriţă pentru adăugarea de
dezoxiribonucleotide la capetele telomerilor, sursa de enzimă şi nu sursa primerului ADN
telomeric determină secvenţa adăgată. Astfel telomeraza este o
50
formă specializată de revers-transcriptază care posedă propria sa matriţă ARN pentru a realiza
sinteza directă a ADN.
Acţiunea telomerazei este importantă pentru prevenirea scurtării cromozomilor în timpul
replicării ADN. Şoarecii “knockout” care nu pot produce ARN-ul asociat telomerazei nu exprimă
activitate telomerazică şi telomerii lor se scurtează considerabil cu fiecare generaţie. Astfel de
şoareci se pot reproduce normal timp de trei generaţii înainte ca absenţa telomerilor să determine
fuziunea terminală a cromozomilor şi pierderea acestora. După patru generaţii potenţialul de
reproducere a acestor şoareci knockout intră în declin şi se opreşte la a şasea generaţie.
SLIDE 93. Secvenţe “consens” la drojdii O dată ce regiunile centromerice de la
drojdii care conferă segregare mitotică au fost clonate, secvenţele lor pot fi determinate și
comparate. Compararea centromerilor diferiţi de la drojdii au evidenţiat trei regiuni (I, II şi III)
care sunt necesare unui centromer să funcţioneze. Regiunea II pare să aibă o lungime constantă
(78-86 baze) şi conţine secvenţe consens nedefinite, dar bogate în resturi A şi T. O secvenţă
simplă de la Drosphila care provine din regiunea centromerică prezintă unele similitudini cu
regiunile I şi III de la drojdii, sugerând că mecanisme similare controlează segregarea la drojdii
şi la eucariotele superioare.
SLIDE 94. Concluzii Cromozomii eucariotelor pot fi vizualizaţi în timpul mitozei când ei
condensează în metafază. Setul de cromozomi, în metafază, al unei celule se numeşte cariotip.
Speciile înrudite pot prezenta diferenţe importante la nivelul cariotipului, indicând că informaţii
genetice similare pot fi organizate în diferite feluri;
Fiecare cromozom este compus dintr-o singură moleculă de ADN, împachetată în
nucleozomi şi pliată în fibre de 30 nm, care este ataşată cu o proteină agrafă care se leagă la anumite
situsuri. Plieri suplimentare conduc la formarea unei structuri mult mai compacte care se
condensează suplimentar odată cu formarea cromozomilor metafazici;
Când cromozomii metafazici decondensează în timpul interfazei, anumite regiuni, numite
heterocromatină, rămân mult mai condensate decât regiunile de cromatină numite eucromatină;
Trei tipuri de secvenţe sunt necesare moleculelor lineare lungi de ADN pentru a funcţiona
ca un cromozom în celulele de drojdii: o origine de replicare (ARS la drojdii) o secvenţă
centromerică (CEN) şi două secvenţe telomerice (TEL) situate la capete;
Toţi cromozomii eucariotelor conţin una sau mai multe origini de replicare, secvenţe TEL,
care sunt necesare replicării ADN, şi o secvenţă CEN, care este utilă pentru segregarea eficientă a
cromozomilor în cele două celule fiice;
Descoperirea elementelor funcţionale de la nivelul cromozomilor de drojdii, care permit
construcţia unor cromozomi artificiali (vectorii YAC), face posibilă clonarea unor fragmente de
ADN de aproximativ un milion de pb.
SLIDE 95. Organitele care conţin ADN Deşi majoritatea ADN de la eucariote se află dispus în
nucleu, anumite cantităţi de ADN sunt prezente şi în mitocondriile animalelor, plantelor şi
fungilor şi în cloroplastele plantelor. Aceste organite sunt principalele situri de producere a ATP,
 în timpul fosforfilării oxidative din mitocondrie şi a fotosintezei din cloroplaste.
51
Multe dovezi indică evoluţia cloroplastelor şi mitocondriilor din bacterii printr-un proces de
endocitoză ancestrală, cu formare de endosimbionţi. O dată cu evoluţia, o parte a genelor
bacteriene au fost transferate nucleului. Totuşi, mitocondriile şi cloroplastele actuale au păstrat o
molecule de ADN circular care codifică pentru proteine esenţiale funcţionării organitelor şi
pentru ARNr necesar procesului de transcripţie de la acest nivel. Mitocondriile conţin mai multe
molecule de ADNmt
Mitocondriile sunt destul de mari pentru a putea fi vizualizate la microscopul optic, iar
ADN mitocondrial poate fi evidenţiat prin microscopie de fluorescenţă. ADNmt este localizat în
interiorul mitocondriei, în regiunea numită matriţă. Dacă judecăm după numărul de puncte
fluorescente galbene dintr-o celulă de Euglena gracilis, aceasta conţine cel puţin 30 de molecule
de ADNmt.
Dacă coloranţii folosiţi pentru a vizualiza ADN nuclear şi mitocondrial, nu afectează
creşterea celulară şi diviziunea, replicarea ADNmt şi diviziunea reţelei mitocondriale poate fi
urmărită microscopic.
Astfel de studii demonstrează că ADNmt se replică în timpul interfazei. În mitoză fiecare
celulă fiică primeşte aproximativ acelaşi număr de mitocondrii, dar cum nu există mecanisme
pentru împărţirea exactă a mitocondriilor, unele celule conţin mai mult ADNmt decât altele. Toate
mitocondriile din celulele eucariote conţin mai multe molecule de ADNmt. Astfel numărul total
de ADNmt într-o celulă depinde de numărul de mitocondrii, de mărimea ADNmt şi de numărul de
ADNmt per mitocondrie.
SLIDE 96. Dual staining reveals the multiple mitochondrial DNA molecules in a
growing Euglena gracilis cell
SLIDE 97. Genoamele mitocondriale de la om si la Saccharomyces cerevisiae
SLIDE 98. Caracteristicile genelor mitocondriale
SLIDE 99. Moştenirea citoplasmatică a mitocondriilor mutante Moştenirea
citoplasmatică a mitocondriilor mutante
Studiile asupra mutanţilor de drojdii şi a altor organisme unicelulare indică că mitocondria
exprimă moştenire citoplasmatică şi deci trebuie să conţină propriul său sistem genetic. De
exemplu, mutaţiile “petite” de drojdii manifestă anormalităţi structurale la nivelul mitocondriilor
şi sunt incapabile să realizeze forforilare oxidativă. Ca rezultat, celulele mici cresc mult mai încet
decât tipul sălbatic şi formează colonii mici. Încrucişarea genetică între diferitele tulpini haploide
de drojdii demonstrează că mutaţia “petite” nu segregă cu nici o genă sau cromozom nuclear
cunoscut. În ultimile studii, s-a constatat că la majoritatea mutanţilor “petite” există deleţii la
nivelul ADNmt.
Moştenirea mitocondrială la drojdii este biparentală: în timpul fuziunii celulelor haploide,
ambii părinţi contribuie egal cu citoplasmă la formarea diploidului. La mamifere şi la majoritatea
altor animale, totuşi sperma contribuie cu puţină citoplasmă la zigot, virtual toate mitocondriile
din embrion sunt derivate din cele ale ovulului şi nu din spermă. Studiile pe şoareci au demonstrat
că 99,99% din ADNmt este moştenit pe cale maternă. La plantele superioare ADNmt este moştenit
exclusiv într-o manieră uniparentală de la părintele femel (oul) şi nu mascul (polenul).
52
 Întregul genom mitocondrial de la un număr mare de organisme a fost deja clonat şi
secvenţializat. ADNmt din aceste surse codifică pentru ARNr, ARNt şi proteine mitocondriale
esenţiale. Toate proteinele codificate de către ADNmt sunt sintetizate la nivelul ribozomilor
mitocondriali. Toate polipeptidele sintetizate mitocondrial nu sunt enzime complete ci numai
subunităţi ale unor complexe multimere implicate în transportul electronilor şi în sinteza ATP.
Majoritatea proteinelor localizate în mitocondrie, cum sunt ADN şi ARN polimerazele, sunt
sintetizate de ribozomii citoplasmatici şi sunt importate în organite. Mutaţiile în ADNmt
determină diferite boli genetice
Severitatea bolii cauzate de o mutaţie în ADNmt depinde de natura mutaţiei şi de proporţia de
mutanţi si de tip sălbatic prezente într-un tip particular de celulă. În general, când se detectează
mutaţii în ADNmt, celulele conţin amestecuri de ADNmt sălbatec şi mutant – condiţie numită
heteroplasmie. De fiecare dată când se divide o celulă germinală sau somatică de mamifere, tipul
mutant şi sălbatec vor segrega aleator în celulele fiice, aşa cum se întâmplă la drojdii. Astfel,
genotipul ADNmt fluctuează de la o generaţie şi de la o diviziune celulară la alta şi se poate
deplasa fie spre tipul sălbatec dominant, fie spre tipul mutant. Dacă toate enzimele pentru
replicare şi creştere, cum sunt ADN şi ARN polimerazele, sunt importate din citoplasmă,
ADNmt mutant nu va prezenta vreun dezavantaj replicativ; mutanţii care presupun deleţii mari
ale ADNmt pot chiar să prezinte un avantaj selectiv în replicare. Toate celulele au mitocondrii,
dar mutaţiile în ADNmt afectează numai anumite ţesuturi. Cele mai afectate care necesită mult
ATP produs prin fosforilare oxidativă, şi ţesuturile care necesită ca majoritatea sau întreg
conţinutul de ADNmt din celulă pentru a sintetiza preteine mitocondriale funcţionale. De
exemplu, neuropatia optică ereditară Leber (degenerarea nervului optic acompaniată de orbire)
este cauzată de o mutaţie “missense” în ADNmt al genei care codifică subunitatea 4 a NADH-
CoQ reductaza.
Unele din deleţiile mari ale ADNmt cauzează un alt set de maladii care include
oftalmopplegia externă cronică progresivă şi sindromul Kearns-Sayre care sunt caracterizate prin
defecte ale ochiului şi în sindrom prin degenerarea sistemului nervos. O a treia condiţie care
determină fibre musculare “neregulate” (cu mitocondrii asamblate impropriu) şi mişcări bruşte
necontrolate asociate, este datorată unei singure mutaţii în bucla TYCG a ARNt pentru lizină. Ca
rezultat al acestei mutaţii, translaţia mai multor proteine mitocondriale este aparent blocată.
Aşa cum am discutat anterior structura cloroplastelor este similară în multe privinţe cu
aceea a mitocondriilor. Ca şi acestea, cloroplastele conţin mai multe copii de ADN şi ribozomi
care codifică pentru proteine ale cloroplastelor folosind codul genetic standard. Alte proteine din
cloroplaste sunt fabricate în citosol şi sunt încorporate în cloroplaste după translaţie.
ADN din cloroplaste sunt molecule circulare de aproximativ 120 000-160000 pb, în funcţie
de specie. Completa secvenţializare a a ADN din mai multe cloroplaste de exemplu plămân
(121024 pb) şi tutun (155844). Genomul cloroplastelor din plămân prezintă două secvenţe
repetitive inverse fiecare constând în 10058 pb care conţin genele ARNr şi alte câteva gene
duplicate. În ciuda diferenţei de mărime, întreaga organizare şi compoziţia genelor de la plămân şi
de la tutun este foarte similar. Diferenţa de mărime provine în primul rând repetiţiilor inversate în
care anumite gene sunt duplicate.
Din aproximativ 120 de gene din cloroplaste, aproape 60 sunt implicate în transcripţia şi
translaţia ARN şi include genele care codifică pentru ARNr, ARNt, subunităţile ARN polimerazei
şi proteinele ribozomale. Aproximativ 20 de gene
53
codifică pentru subunităţile complexelor transportoare de electroni din cloroplast şi pentru
complexul FoF1 ATP-azic. De asemenea sunt codificate de către genomul cloroplastelor cele două
subunităţi mari ale ribulozo 1,5 difosfat carboxilaza, care este implicată în fixarea dioxidului de
carbon în timpul fotosintezei.
Reflectând originea endosimbiotică a cloroplastelor unele regiuni ale ADN din cloroplaste
sunt similare cu cele ale ADN actual de bacterii. De exemplu, ADN din cloroplaste codifică patru
subunităţi ale ARN polimerazei care sunt omologe cu subunităţile ARN polimerazei de la E. coli.
Un alt segment al ADN din cloroplaste codifică 8 proteine care sunt omologe cu 8 proteine
ribozomale de la E. coli; ordinea acestor gene este similară în cele două tipuri de ADN. ADN din
cloroplastele plămânului posedă câteva gene care nu sunt în ADN din cloroplastele tutunului şi
invers. Acest lucru indică probabil existenţa unui schimb ancestral de gene între ADN din
cloroplaste şi din nucleul plantelor studiate.
SLIDE 100. ADN mitocondrial uman Surprinzător, mărimea moleculelor de
ADNmt, numărul şi natura proteinelor pe care acestea le codifică, şi chiar codul genetic
mitocondrial, variază mult între diferitele organisme.
ADNmt uman, o moleculă circulară care a fost complet secvenţializată, este printre cele
mai mici molecule de ADNmt cunoscute deoarece conţine 16 569 perechi de baze. Acesta codifică
pentru două molecule de ARNr prezenţi în robozomii mitocondriali şi pentru cei 22 ARNt folosiţi
în procesul de translaţie mitocondrial. ADNmt uman conţine 13 secvenţe care încep cu codonul
ATG (metionină) şi terminate cu un codon STOP şi sunt destul de lungi pentru a codifica o
polipeptidă mai mare de 50 aminoacizi; toate proteinele posibil codificate de aceste faze de lectură
au fost identificate. ADNmt de la mamifere, spre deosebire ADN nuclear, este lipsit de introni şi
nu conţine secvenţe necodante.
ADNmt de la nevertebrate are aproximativ aceeaşi mărime cu ADNmt uman, dar ADNmt
de la drojdii este de aproximativ de 5 ori mai mare (78 000 pb). Moleculele de ADNmt de la drojdii
şi alte eucariote superioare codifică mulţi dintre produşii aceloraşi gene ca şi cele de la mamifere,
ca şi pentru alte gene care la mamifere sunt dispuse în nucleii celulelor de mamifere.
In contrast cu alte eucariote, care conţin un singur tip de ADNmt, plantele conţin mai multe
tipuri de ADNmt care par să se recombine unele cu altele. ADNmt de la plante este mult mai mare
ca mărime decât la alte organisme. Se poate întâmpla ca la o singură specie să existe diferenţe
foarte mari în mărimea ADNmt (la pepenele verde 330 000 pb; la pepenele galben 2 500 000 pb).
Spre deosebire de animale, drojdii şi fungii, ADNmt de la plante conţin gene care codifică
ARNr 5S, care este prezent numai în ribozomii mitocondriilor plantelor şi a subunităţii alfa a ATP-
azei F1. ARNr de la plante este mult mai mare decât cel de la alte eucariote. Secvenţializarea
recentă a uneia dintre cele mai mici molecule de ADNmt de la plante a evidenţiat că mărimea este
datorată existenţei regiunilor necodante şi a secvenţelor duplicate.
Diferenţele de mărime şi de capacitate codantă a ADNmt de la diferite organisme
reflectează mişcarea ADN între mitocondrie şi nucleu în timpul evoluţiei. Dovezi directe ale
acestei mişcări vin de la observaţia că multe proteine codificate de ADNmt de la diferite specii
sunt codificate de ADN nuclear la altele. Se pare că este vorba de o deplasare a genelor de la
mitocondrie la nucleu şi invers, în timpul evoluţiei.
54
 Cel mai elocvent exemplu este cel al genei cox II, care codifică subunitatea 2 a citocrom
c oxidazei. Această genă se găseşte în ADNmt de la toate organismele studiate cu excepţia unei
specii de legume numită Bob (mung bean) unde gena cox II este nucleară.
Multe molecule de ARN transcripţi de la plante sunt procesate (editate) prin acţiunea unei
enzime care catalizează transformarea unor resturi selecţionate C în U şi ocazional a U în C. Gena
nucleară cox II de la mung bean corespunde mai bine transcripţilor procesaţi decât genei
mitocondriale cox II prezentă în alte legume. Aceste date sunt dovezi clare ale deplasării genei cox
II din mitocondrie în nucleu printr-un proces care implică participarea unei molecule de ARN.
Probabil, un mecanism de revertranscripţie similar celui prin care pseudogenele procesate sunt
generate în genomul nuclear prin intermediul ARNm codificat nuclear.
SLIDE 101. Codul genetic mitocondrial diferă de codul genetic standard Toţi transcripţii ARN
mitocondriali şi produşii lor de translaţie rămân în mitocondrie. Unele proteine ribozomale (una
sau două) depinzând de specie sunt importate din citosol.
Reflectând vechimea bacteriană a mitocondriilor, ribozomii mitocondriali se aseamănă cu
cei de la bacterii şi diferă de ribozomii citoplasmatici prin moleculele de ARN şi prin compoziţia
în proteine. De exemplu cloramfenicolul blochează sinteza proteică la bacterii dar şi în
mitocondrii, dar nu şi ribozomii citoplasmatici. Cicloheximida inhibă sinteza proteică a
ribozomilor citoplasmatici dar nu o afectează pe cea de la bacterii sau din mitocondrii. În culturile
de celule de mamifere numai proteinele sintetizate în prezenta cicloheximidei sunt codificate de
ADNmt şi produse de ribozomii mitocondriali.
Codul genetic folosit în mitocondriile animale şi ale fungilor este diferit de codul standard
folosit de toate genele procariote şi eucariote; de remarcat că acest cod diferă chiar şi pentru
mitocondrii de la specii diferite. Cum a apărut acest fenomen în cursul evoluţiei este misterios. De
exemplu, UGA, este în mod normal un codon STOP, dar este citit ca triptofan în mitocondriile
umane şi de fungi; totuşi în mitocondriile plantelor UGA este încă un codon STOP. AGA şi AGG,
codonii nucleari standard pentru arginină codifică de asemenea pentru arginină în mitocondriile
fungilor şi plantelor, dar reprezintă codoni STOP pentru ADNmt de la mamifere şi pentru serină
la ADNmt de la Drosophila.
Mitocondriile plantelor par să utilizeze codul genetic standard. Totuşi, comparaţiile
secvenţelor în aminoacizi ale proteinelor mitocondriale de la plante cu secvenţa nucleotidică a
ADNmt sugerează că CGG poate codifica fie pentru arginină (aminoacidul standard) sau triptofan.
Această nespecificitate aparentă a codului mitocondrial este explicată prin editarea transcripţilor
ARN mitocondriali, care pot transforma resturile de citozină în uracil. Dacă o secvenţă CGG este
editată în UGG, codonul specifică triptofanul, aminoacidul standard pentru UGG, în timp ce
codonii CGG ne-editaţi codifică pentru arginină. Astfel sistemul de translaţie în mitocondriile
plantelor utilizează codul genetic standard.
SLIDE 102. Mărimea genoamelor mitocondriilor şi cloroplastelor Genoamele
organitelor din celulele eucariote
 Majoritatea celulelor eucariote posedă genoame mitocondriale şi toate eucariotele
capabile de fotosinteză au genoame în structura cloroplastelor. Iniţial, s-a
55
considerat că genoamele organitelor sunt molecule de ADN circulare. Aceasta deoarece hărţile
genetice şi fizice obţinute, prin analiza de restricţie a genoamelor din mitocondrii şi din cloroplaste,
erau circulare. În anumite organite, studiile de microscopie electronică au evidenţiat atât molecule
circulare cât şi liniare. La început, s-a presupus că formele liniare ar putea reprezenta fragmente
ale genoamelor circulare care s-au rupt în procesul de preparare. Din 1998 a fost admis că unele
eucariote inferioare (Paramecium, Chlamydomonas şi multe suşe de drojdii) posedă structuri
lineare la nivelul genoamelor mitocondriale.
Surprinzător, mărimea moleculelor de ADN mitocondrial (ADNmt), numărul şi natura
proteinelor pe care acestea le codifică, şi chiar codul genetic mitocondrial, variază mult între
diferitele tipuri de organisme.
Majoritatea animalelor multicelulare au genoame mitocondriale mici cu o organizare
genetică compactă, genele fiind separare numai de spaţii foarte reduse. ADNmt uman este tipic
pentru această categorie. Genomul mitocondrial este o moleculă circulară care a fost complet
secvenţializată şi care conţine 16 569 perechi de baze, fiind printre cele mai mici molecule de acest
tip. Acesta codifică pentru două molecule de ARNr prezente în ribozomii mitocondriali şi pentru
cei 22 ARNt folosiţi în procesul de translaţie de la acest nivel. ADNmt uman conţine 13 secvenţe
care încep cu codonul ATG (metionină) şi se termină cu un codon STOP. Aceste faze de lectură,
destul de lungi pentru a codifica polipeptide de aproximativ 50 aminoacizi, au fost identificate cu
proteinele codificate. ADNmt de la mamifere, spre deosebire ADN nuclear, este lipsit de introni
şi nu conţine secvenţe necodante.
ADNmt de la nevertebrate are aproximativ aceeaşi mărime cu cel uman, în timp ce ADNmt
de la drojdii este de aproximativ de 5 ori mai mare (78 000 pb). Moleculele de ADNmt de la drojdii
şi de la alte eucariote superioare posedă gene care la mamifere sunt dispuse în nucleii celulelor.
In contrast cu alte eucariote, care conţin un singur tip de ADNmt, plantele conţin mai multe
tipuri de ADNmt care par să se recombine unele cu altele. Aceste molecule de la plante sunt mult
mai mari decât la alte organisme. Se poate întâmpla ca la o singură specie să existe diferenţe foarte
mari în mărimea ADNmt (la pepenele verde 330 000 pb; la pepenele galben 2 500 000 pb).
Spre deosebire de animale, drojdii şi fungii, ADNmt de la plante conţine gene care codifică
pentru ARNr 5S, care este prezent numai în ribozomii mitocondriilor plantelor, şi pentru
subunitatea α a ATP-azei F1. ARNr de la plante este mult mai mare decât cel de la alte eucariote.
Secvenţializarea recentă a uneia dintre cele mai mici molecule de ADNmt de la plante a evidenţiat
că mărimea este datorată existenţei de regiuni necodante şi de secvenţe duplicate.
Diferenţele de mărime şi de capacitate codantă a ADNmt de la diferite organisme poate
reflecta un anumit schimb de ADN, între mitocondrie şi nucleu, în cursul evoluţiei. Dovezi directe,
în favoarea acestei afirmaţii au fost furnizate de evidenţierea unor proteine ale căror gene sunt la
unele specii localizate în nucleu şi la altele în mitocondrie. Se pare că este vorba de o deplasare a
genelor din mitocondrie în nucleu şi invers, în timpul evoluţiei. Cel mai elocvent exemplu este cel
al genei cox II, care codifică subunitatea 2 a citocrom c oxidazei. Pentru toate organismele studiate,
această genă se găseşte în ADNmt, cu excepţia unei specii de legume numită Bob (mung bean)
unde gena cox II este nucleară.
SLIDE 103. Caracteristicile genelor mitocondriale Multe molecule de ARN transcrise de la
plante sunt procesate prin acţiunea unei enzime care catalizează transformarea unor resturi
selecţionate C în U şi
56
ocazional a U în C. Gena nucleară cox II de la bob este mai apropiată structural de moleculele de
ARN procesate decât de gena mitocondrială cox II prezentă la alte legume. Aceste date sunt dovezi
ale deplasării genei cox II din mitocondrie în nucleu printr-un proces care implică participarea unei
molecule de ARN. Este posibil un mecanism de reverstranscripţie similar celui prin care
pseudogenele procesate sunt generate în genomul nuclear prin intermediul ARNm.
Structura cloroplastelor este similară în multe privinţe cu aceea a mitocondriilor. Ca şi
acestea, cloroplastele conţin mai multe copii de ADN şi ribozomi care codifică pentru proteine din
cloroplaste, folosind codul genetic standard. Alte proteine specifice din cloroplastelor sunt
fabricate în citoplasmă şi sunt transportate, după traducere.
ADN din cloroplaste sunt molecule circulare de aproximativ 120 000-160 000 pb, în
funcţie de specie. Multe dintre moleculele de ADN din cloroplaste au fost complet secvenţializate.
Genomul cloroplastelor din planta a cărei denumire populară este „plămân” prezintă două secvenţe
repetitive inverse fiecare constând în 10 058 pb care conţin genele ARNr şi alte câteva gene
duplicate. În ciuda diferenţei de mărime (plămân – 121 024 pb; tutun – 155 844), întreaga
organizare şi compoziţia genelor de la plămân şi de la tutun este foarte similară. Diferenţa de
mărime apare, în primul rând, de la repetiţiile inversate provenite din duplicarea anumitor gene.
Din aproximativ 120 de gene codificate de ADN din cloroplaste, aproape 60 sunt implicate
în transcripţia şi translaţia ARN şi includ genele care codifică pentru ARNr, ARNt, subunităţile
ARN polimerazei şi proteinele ribozomale. Aproximativ 20 de gene codifică pentru subunităţile
complexelor transportoare de electroni din cloroplast şi pentru complexul FoF1 ATP-azic. De
asemenea, sunt codificate de către genomul cloroplastelor cele două subunităţi mari ale ribulozo
1,5 difosfat carboxilaza, care este implicată în fixarea dioxidului de carbon în timpul fotosintezei.
Reflectând originea endosimbiotică a cloroplastelor unele regiuni din genomul acestora
sunt similare cu cele ale ADN de la bacteriile actuale. De exemplu, ADN din cloroplaste codifică
patru subunităţi ale ARN polimerazei care sunt omologe cu subunităţile ARN polimerazei de la E.
coli. Un alt segment al ADN din cloroplaste codifică 8 proteine care sunt omologe cu 8 proteine
ribozomale de la E. coli. Ordinea genelor este similară în cele două tipuri de ADN. ADN din
cloroplastele plămânului posedă câteva gene care nu sunt în ADN din cloroplastele tutunului şi
invers. Acest lucru poate indica un posibil schimb ancestral între cloroplaste şi nucleu.
SLIDE 104. CONCLUZII Se consideră că mitocondriile au evoluat din
bacterii care prezintă o relaţie simbiotică cu celulele ancestrale care conţin un nucleu eucariot.
Majoritatea genelor originale din aceste organite au fost transferate genomului nuclear în timpul
evoluţiei, organitele diferitelor organisme păstrând diferite gene;
ADNmt de la mamifere are numai aprox 16 kb; acesta nu conţine introni şi prezintă numai
o mică regiune neconcordantă. ADNmt de la plante şi drojdii este mult mai mare. Toate tipurile
de ADNmt codifică pentru ARNr, ARNt şi pentru câteva proteine implicate în transportul
mitocondrial al electronilor şi în sinteza ATP;
Majoritatea ADNmt este moştenit mai degrabă din ou (ovul) decât din spermă, mutaţiile
în ADNmt fiind moştenite pe linie maternă;
Ribozomii mitocondriali se aseamănă cu ribozomii bacterieni, ca structură, sensibilitate la
cloramfenicol şi rezistenţă la cicloheximidă;
Codul genetic pentru ADNmt de la animale şi fungi diferă de cel bacterian şi de cel al
genomului nuclear prin aceea că numeroşi codoni codifică pentru aminoacizi
57
sau semnale STOP alternative; Mitocondriile plantelor par să folosească codul standard nuclear
şi bacterian;
Mutaţiile ADNmt pot determina maladii neuromusculare umane, probabil datorită
necesităţii crescute de ATP a acestor ţesuturi. În general, pacienţii prezintă, în celule, un amestec
de mitocondrii care conţin ADNmt normal şi mutant (heteroplasmie). Severitatea fenotipică este
mai mare cu cât proporţia de ADNmt este mai mare;
ADN din cloroplaste este circular şi conţine aproximativ 120-160 kb, în funcţie de
speciile de plante. Acestea codifică pentru aproximativ 120 de proteine şi folosesc codul genetic
standard. Aşa cum am discutat anterior structura cloroplastelor este similară în multe privinţe cu
aceea a mitocondriilor. Ca şi acestea, cloroplastele conţin mai multe copii de ADN şi ribozomi
care codifică pentru proteine ale cloroplastelor folosind codul genetic satndard. Alte proteine din
cloroplaste sunt fabricate în citosol şi sunt incorporate în cloroplaste după translaţie.
ADN din cloroplaste sunt molecule circulare de aproximativ 120 000-160000 pb, în funcţie
de specie. Completa secvenţializare a a ADN din mai multe cloroplaste de exemplu plămân
(121024 pb) şi tutun (155844). Genomul cloroplastelor din plămân prezintă două secvenţe
repetitive inverse fiecare constând în 10058 pb care conţin genele ARNr şi alte câteva gene
duplicate. În ciuda diferenţei dee mărime, întreaga organizare şi compotiţia genelor de la plămân
şi de la tutun este foarte similară; Diferenţa de mărime provine în primul rând repetiţiilor inversate
în care anumite gene sunt duplicate.
Din aproximativ 120 de gene din cloroplaste, aproape 60 sunt implicate în transcripţia şi
translaţia ARN şi include genele care codifică pentru ARNr, ARNt, subunităţile ARN polimerazei
şi proteinele ribozomale. Aproximativ 20 de gene codifică pentru subunităţile complexelor
transportoare de electroni din cloroplast şi pentru complexul FoF1 ATP-azic. De asemenea sunt
codificate de către genomul cloroplastelor cele două subunităţi mari ale Ribulozo 1,5 difosfat
carboxilaza, care este implicată în fixarea dioxidului de carbon în timpul fotosintezei.
Reflectând originea endosimbiotică a cloroplastelor unele regiuni ale ADN din cloroplaste
sunt similare cu cele ale ADN actual de bacterii. De exemplu, ADN din cloroplaste codifică patru
subunităţi ale ARN polimerazei care sunt omologe cu subunităţile ARN polimerazei de la E. Coli.
Un alt segment al ADN din cloroplaste codifică 8 proteine care sunt omologe cu 8 proteine
robozomale de la E. Coli; ordinea acestor gene este similară în cele două tipuri de ADN. ADN din
cloroplastele plămânului posedă câteva gene care nu sunt în ADN din cloroplastele tutunului şi
invers. Acest lucru indică probabil existenţa unui schimb ancestral de gene între ADN din
cloroplaste şi din nucleul plantelor studiate.
58
NOTE DE CURS BM2
ORGANIZAREA MOLECULARĂ, EXPRESIA ŞI REGLAREA
GENELOR EUCARIOTE
SLIDE 2. Structura şi expresia genelor eucariote
Pot fi obţinute segmente de ADN pur şi specific din orice genom, în cantitate suficientă
astfel încât să permită o caracterizare chimică completă; utilizarea endonucleazelor de restricţie şi
analiza secvenţelor nucleotidice au făcut din aceste caracterizări nişte analize de rutină.
Mărimea şi complexitatea genoamelor eucariote este formidabilă. Secvenţa nucleotidică a
unei gene şi a segmentelor care o flanchează nu ne furnizează informaţii privind: i) modul de
acţiune al genei; ii) modului de reglare a expresiei sale în timpul dezvoltării şi diferenţierii celulare
şi nici în cazul adaptării la modificările de mediu; iii) modul în care expresia genelor este
coordonată pentru a asigura echilibrul fiziologic caracteristic al celulelor şi organismelor
sănătoase; iv) modul în care, apariţia unui produs al genei sau variaţia vitezei de expresie a unei
gene pot afecta funcţionarea normală sau pot determina maladii.
Informaţii suplimentare: genele clonate sunt introduse într-o celulă prin transfecţie sau
microinjecţie, ele sunt adesea exprimate şi pot chiar răspunde unor influenţe reglatoare specifice.
Permite: a) analiza activităţilor relative ale genelor normale şi mutante şi a semnalelor de
reglare; b) evidenţierea alelelor mutante spontan; c) construirea de mutanţii experimental care pot
fi analizaţi.
Consecinţa reală a dezvoltării tehnicilor ADN recombinat este realizarea de studii de
interdependenţă între structură şi funcţie.
Mărimea şi complexitatea genoamelor eucariote este formidabilă, aceasta nu mai reprezintă
o barieră în cunoaşterea detaliilor moleculare de organizare şi structură. Singurele obstacole
existente sunt timpul şi resursele necesare unei cercetări de o asemenea amploare. La început au
fost necesare cinci persoane, timp de un an, pentru a determina secvenţa de 50 kpb a genomului
fagului λ. Acum, folosind metodele perfecţionate de secvenţializare au fost înregistrate progrese
substanţiale reuşindu-se deja determinarea celor 4 milioane de perechi de baze din genomul E.
coli, secvenţializarea genomului Saccharomices cerevisiae şi demararea cu succes a
secvenţializării genomului uman (de 10 ori mai mare decât E. coli).
Secvenţa nucleotidică a unei gene şi a segmentelor care o flanchează nu ne furnizează
informaţii privind modul de acţiune al genei, asupra modului de reglare a expresiei sale în timpul
dezvoltării şi diferenţierii celulare şi nici în cazul adaptării la modificările de mediu. Secvenţa nu
relevă nici modul în care expresia genelor este coordonată pentru a asigura echilibrul fiziologic
caracteristic al celulelor şi organismelor sănătoase şi nici cum apariţia unui produs al genei sau
variaţiei vitezei de expresie a unei gene pot afecta funcţionarea normală sau pot determina maladii.
Pentru a înţelege semnificaţia fiziologică a detaliilor moleculare este necesară o analiză
biochimică. În aceste situaţii tehnicile de biologie moleculară furnizează o
59
abordare experimentală puternică. Dacă genele clonate sunt introduse într-o celulă prin transfecţie
sau microinjecţie, ele sunt adesea exprimate şi pot chiar răspunde unor influenţe reglatoare
specifice. Aceasta permite analiza activităţilor relative ale genelor normale şi mutante şi a
semnalelor de reglare; alelele mutante spontan şi mutanţii construiţi experimental pot fi analizaţi.
Astfel, consecinţa reală a dezvoltării tehnicilor ADN recombinat este faptul că permite realizarea
de studii de interdependenţă între structură şi funcţie. Această abordare analitică, genetica inversă,
înlocuieşte numeroasele metode ale geneticii clasice şi amplifică extraordinar posibilităţile
cercetărilor genetice.
Aplicaţiile geneticii clasice şi abordările citogenetice sunt în mod necesar limitate pentru
organisme de tipul omului, dar genomul acestora poate fi studiat actualmente la nivel fundamental,
ceea ce acum un deceniu nu era imaginabil decât pentru bacterii. Câteva micrograme de ADN
izolat din limfocite şi transformat într-o bancă pot fi utilizate pentru a determina relaţia care există
între genotip şi fenotip. Mai mult, universalitatea tehnicilor ADN recombinat semnifică că
genoamelor tuturor organismelor contemporane (şi chiar a organismelor vechi sau dispărute, dar
din ale căror resturi se poate prepara ADN) sunt accesibile şi că este posibilă stabilirea diferenţelor
dar şi similitudinilor existente între acestea. Se pot obţine indicaţii importante relativ la evoluţia
diferitelor genoame plecând de la aceste comparaţii, adăugând astfel modalităţi de analiză geneticii
clasice care studiază problemele de evoluţie.
Cu toată evoluţia metodelor de biologie moleculară şi progreselor deosebite realizate în
domeniu este necesară o muncă susţinută deoarece marea majoritate a caracteristicilor sistemelor
genetice eucariote rămâne de descoperit. Cu toate aceste în cei peste 20 de ani de când aceste
metode au fost dezvoltate au fost elucidate o serie de aspecte unice ale genoamelor organismelor
eucariote.
Primele noţiuni relativ la structura moleculară a genelor şi a organizării lor în genomul
eucariotelor au fost rezultatul studiului iniţial pe organisme procariote.
Structura şi expresia genelor eucariote Chiar înainte de cunoaşterea structurii genelor eucariote şi
procariote, se ştia că sistemele genetice procariote şi eucariote posedă proprietăţi fundamentale
comune. În cele două cazuri materialul genetic este ADN, replicarea este semiconservativă,
fluxul de informaţie genetică este direcţionat de la ADN către ARN şi proteine şi codul genetic
este universal. Pare rezonabil să considerăm că organismele eucariote, mai ales cele
multicelulare, conţin mai multe gene decât procariotele şi că posedă mecanisme de control
suplimentare care permit reglarea proceselor de dezvoltare pentru a realiza integrarea diferitelor
lor funcţiuni. Dar, era general admis că structura de bază a genelor şi organizarea informaţiei
genetice este asemănătoare în cele două tipuri de genoame. Aceste convingeri au dispărut după
primele analize ale genelor şi genoamelor eucariote.
SLIDE 3. Definiţia moleculară a unei gene; gene întrerupte
Gene întrerupte
La sfârşitul anilor 1970, era evident că secvenţele care codificau pentru proteine în genele
de mamifere nu erau, în mod necesar, furnizate de un singur segment de ADN, cum este cazul
virtual al tuturor genelor procariote. Din contră, regiunile codante sunt discontinue, întrerupte de
segmente de ADN care nu codifică (necodante); acestea au fost denumite secvenţe intercalare sau
introni iar secvenţele codante sunt numite exoni. În continuare, a devenit evident faptul că intronii
sunt
60
prezenţi la marea majoritate a genelor de mamifere dar, în acelaşi timp, sunt prezente în
genoamele altor eucariote şi a anumitor virusuri animale.
Primele suspiciuni privind existenţa intronilor au apărut în momentul studierii virusurilor
animale. La acestea s-a demonstrat lipsa de colinearitate între secvenţa nucleotidică a ADN şi cea
a ARNm care derivă din acesta; de fapt se părea că ARNm este obţinut din fragmente de ADN
viral care nu prezintă continuitate. În acelaşi mod, secvenţele ARNm pentru globină erau capabile
să se hibridizeze cu o colecţie de fragmente din genom obţinute prin acţiunea endonucleazelor de
restricţie care, asociate, formau un segment mult mai lung decât lungimea mesagerului însuşi.
Această descoperire sugera că segmentele care constituiau mesagerul erau diseminate de-a lungul
genomului corespunzător.
SLIDE 4. Comparaţie ARNm la procariote şi eucariote Procariote: operonii
bacterieni – ARNm este policistronic; Eucariote: ARNm este monocistronic şi conţine exoni şi
introni. Figura: ARN transcris de la nivelul unei unităţi complexe (albastru) poate fi procesat pe
mai multe căi pentru a conduce la unul sau la mai multe unităţi ARNm monocistronice
funcţionale. Liniile punctate marcheză înlăturarea intronilor. a) O unitate de transcripţie al
cărui transcript primar posedă două situsuri poli(A) poate da naştere la două molecule de
ARNm diferite prin folosirea alternativă a exonilor sitiuaţi în 3’. b) O unitate transcripţională
complexă al cărei transcript primar suferă înlăturarea exonilor în timpul procesării produce
molecule alternativede ARNm care au aceeaşi exoni în 5’ şi în 3’. În acest exemplu, unele tipuri
celulare exprimă ARNm care conţine exonul 3 în timp ce altele exonul 2 este alipit exonului 4 în
care lipseşte exonul 3. Mutaţiile produse în (a) şi (b) afectează proteinele ambelor forme
alternative de ARNm. În contrast, mutaţiile (desemnate prin c şi d) prezente în interiorul
exonului unic al uneia dintre formele alternative de ARNm afectează numai proteina codificată
de către acest ARNm.
Cea mai mare parte a genelor care codifică pentru polipeptide posedă cel puţin un intron,
un număr mare de gene având mai mulţi. Totuşi, prezenţa intronilor nu este obligatorie existând şi
gene lipsite. Genele care codifică pentru moleculele de ARN funcţionale cum sunt ARNt şi ARNr
pot să posede şi ele secvenţe intercalare, dar întreruperile la nivelul acestor gene sunt mai puţin
frecvente. În general, cantitatea de ADN prezentă în introni depăşeşte cu mult pe cea din exoni.
Existenţa intronilor şi enorma diversitate a numărului şi a mărimii lor explică numărul mare de
molecule de ARN nuclear la eucariote şi totodată eterogenitatea foarte pronunţată şi lungimea lor
considerabilă. Moleculele de ARN nuclear eterogen (ARNh) reprezintă o colecţie de transcripţi
pentru numeroase gene nucleare. Unii dintre aceştia sunt transcripţi primari, mărimea lor fiind
identică cu cea a genei, iar alţii sunt molecule parţial maturate care sunt lipsite de un număr variabil
de introni. Este foarte interesant că moleculele de ARNm citoplasmatic sunt produsul unei astfel
de colecţii complexe de precursori.
SLIDE 5. Genomul eucariotelor: unităţi de transcripţie simple şi complexe Moleculele de ARN
nuclear heterogen (ARNh) reprezintă o colecţie de transcripţi pentru numeroase gene nuclare:
61
i) transcripţi primari, mărimea lor este identică cu cea a genei; ii) molecule parţial maturate
care sunt lipsite de un număr variabil de introni. Moleculele de ARNm citoplasmatic sunt
produsul unei astfel de colecţii complexe de precursori. Figura: ARN transcris de la nivelul unei
unităţi complexe (albastru) poate fi procesat pe mai multe căi pentru a conduce la unul sau la
mai multe unităţi ARNm monocistronice funcţionale. Liniile punctate marcheză înlăturarea
intronilor. a) O unitate de transcripţie al cărui transcript primar posedă două situsuri poli(A)
poate da naştere la două molecule de ARNm diferite prin folosirea alternativă a exonilor sitiuaţi
în 3’. b) O unitate transcripţională complexă al cărei transcript primar suferă înlăturarea
exonilor în timpul procesării produce molecule alternativede ARNm care au aceeaşi exoni în 5’
şi în 3’. În acest exemplu, unele tipuri celulare exprimă ARNm care conţine exonul 3 în timp ce
altele exonul 2 este alipit exonului 4 în acre lipseşte exonul 3. Mutaţiile produse in (a) şi (b)
afectează proteinele ambelor forme alternative de ARNm. În contrast, mutaţiile (desemnate prin
c şi d) prezente în interiorul exonului unic al uneia dintre formele alternative de ARNm afectează
numai proteina codificată de către acest ARNm.
Cea mai mare parte a genelor care codifică pentru polipeptide posedă cel puţin un intron,
un număr mare de gene având mai mulţi. Totuşi, prezenţa intronilor nu este obligatorie existând şi
gene lipsite. Genele care codifică pentru moleculele de ARN funcţionale cum sunt ARNt şi ARNr
pot să posede şi ele secvenţe intercalare, dar întreruperile la nivelul acestor gene sunt mai puţin
frecvente. În general, cantitatea de ADN prezentă în introni depăşeşte cu mult pe cea din exoni.
Existenţa intronilor şi enorma diversitate a numărului şi a mărimii lor explică numărul mare de
molecule de ARN nuclear la eucariote şi totodată eterogenitatea foarte pronunţată şi lungimea lor
considerabilă. Moleculele de ARN nuclear eterogen (ARNh) reprezintă o colecţie de transcrpţi
pentru numeroase gene nucleare. Unii dintre aceştia sunt transcripţi primari, mărimea lor fiind
identică cu cea a genei, iar alţii sunt molecule parţial maturate care sunt lipsite de un număr variabil
de introni. Este foarte interesant că moleculele de ARNm citoplasmatic sunt produsul unei astfel
de colecţii complexe de precursori.
SLIDE 6. Variabilitatea numărului de introni şi exoni şi mărimea acestora la diferite specii
Analizele de structură şi funcţie ale genelor eucariote au evidenţiat că genele procariote şi
eucariote suferă puternic din punct de vedere al complexităţii secvenţelor scurte (motive)
responsabile de reglarea transcripţiei. Au fost evidenţiate trei tipuri de motive în genele
procariote. Un prim tip include secvenţele care determină debutul transcripţiei: în E. coli,
promotorii sunt definiţi prin două regiuni de ADN prezente la 10 şi 35 perechi de baze în amonte
faţă de situsul de iniţiere a transcripţiei. Un al doilea tip de element marchează terminarea genei
sau a unui grup de gene şi favorizează terminarea transcripţiei. În sfârşit, există secvenţe de ADN
adiacente sau încălecate în raport cu promotorii, care sunt recunoscute de efectori specifici cum
sunt represorii, activatorii şi terminatorii, care modulează transcripţia. Toate aceste secvenţe de
reglare specifică depind de interacţiunile care le realizează cu proteinele specifice care au rolul
de a influenţa expresia secvenţelor codante vecine.
62
 SLIDE 7. Reglarea expresiei genelor procariote Analizele de structură şi funcţie ale genelor
eucariote au evidenţiat că genele procariote şi eucariote suferă puternic din punct de vedere al
complexităţii secvenţelor scurte (motive) responsabile de reglarea transcripţiei. Au fost
evidenţiate trei tipuri de motive în genele procariote. Un prim tip include secvenţele care
determină debutul transcripţiei: în E. coli, promotorii sunt definiţi prin două regiuni de ADN
prezente la 10 şi 35 perechi de baze în amont faţă de situsul de iniţiere a transcripţiei. Un al
doilea tip de element marchează terminarea genei sau a unui grup de gene şi favorizează
terminarea transcripţiei. In sfârşit, există secvenţe de ADN adiacente sau încălecate în raport cu
promotorii, care sunt recunoscute de efectori specifici cum sunt represorii, activatorii şi
terminatorii, care modulează transcripţia. Toate aceste secvenţe de reglare specifică depind de
interacţiunile care le realizează cu proteinele specifice care au rolul de a influenţa expresia
secvenţelor codante vecine.
SLIDE 8. Reglarea expresiei genelor eucariote (a) La eucariote: i) secvenţe cu localizări
variabile, situate la distanţe variabile şi cu orientări diverse în raport cu situsul de demarare şi de
oprire a transcripţiei.
ii) 3 polimeraze diferite, I, II şi III, transcriu trei clase de gene distincte fiecare asociată
cu semnale specifice de control a transcripţiei şi terminării acesteia.
Secvenţele reglatoare: suită complexă de motive de ADN relativ scurte. Fiecare motiv - situsul
de fixare al unei proteine specifice, un factor de transcripţie (ex).
Concluzie: reglarea transcripţiei fiecărei gene reflectă cooperarea particulară (asortarea) şi
aranjamentul anumitor motive, prezenţa factorilor de transcripţie adecvaţi şi modul în care aceşti
factori influenţează iniţierea transcripţiei.
Fixarea mai multor factori de transcripţie în regiunea de reglare facilitează fie asamblarea
ARN polimerazei într-un complex de transcripţie, fie activarea acestui complex, fie ambele.
Studii de genetică moleculară şi de biochimie au evidenţiat temele care guvernează reglarea
transcripţiei şi care furnizează bazele de înţelegere a expresiei diferenţiate a genelor. Astfel,
secvenţele reglatoare sunt formate dintr-o suită complexă de motive de ADN relativ scurte. Fiecare
motiv este situsul de fixare al unei proteine specifice, un factor de transcripţie. De exemplu, genele
care nu sunt transcrise decât în celulele limfoide conţin o serie de motive care sunt recunoscute de
factori de transcripţie specifici acestor celule. La fel, genele care nu sunt transcrise decât în anumite
momente şi în condiţii particulare conţin motive de reglare care interacţionează cu proteine
specifice care nu sunt prezente sau active decât în aceste momente sau în aceste circumstanţe. În
consecinţă, reglarea transcripţiei fiecărei gene reflectă cooperarea particulare (asortarea) şi
aranjamentul acestor motive, prezenţa factorilor de transcripţie adecvaţi şi de modul în care aceşti
factori influenţează iniţierea transcripţiei. Fixarea mai multor factori de transcripţie în regiunea de
reglare facilitează fie asamblarea ARN polimerazei într-un complex de transcripţie, fie activarea
acestui complex, fie ambele procese.
Secvenţele de ADN care reglează expresia genelor eucariote au localizări variabile, sunt
situate la distanţe variabile şi au orientări diverse în raport cu situsul de demarare şi de oprire a
transcripţiei. În plus, trei polimeraze diferite, I, II şi III, transcriu trei clase de gene distincte fiecare
asociată cu semnale specifice de control a
63
transcripţiei şi terminării acesteia. Studii de genetică moleculară şi de biochimie au evidenţiat
temele care guvernează reglarea transcripţiei şi care furnizează bazele de înţelegere a expresiei
diferenţiate a genelor. Astfel, secvenţele reglatoare sunt formate dintr-o suită complexă de motive
de ADN relativ scurte. Fiecare motiv este situsul de fixare al unei proteine specifice, un factor de
transcripţie. De exemplu, genele care nu sunt transcrise decât în celulele limfoide conţin o serie de
motive care sunt recunoscute de factori de transcripţie specifici acestor celule. La fel, genele care
nu sunt transcrise decât în anumite momente şi în condiţii particulare conţin motive de reglare care
interacţionează cu proteine specifice care nu sunt prezente sau active decât în aceste momente sau
în aceste circumstanţe. În consecinţă, reglarea transcripţiei fiecărei gene reflectă cooperarea
particulare (asortarea) şi aranjamentul acestor motive, prezenţa factorilor de transcripţie adecvaţi
şi de modul în care aceşti factori influenţează iniţierea transcripţiei. Fixarea mai multor factori de
transcripţie în regiunea de reglare facilitează fie asamblarea ARN polimerazei într-un complex de
transcripţie, fie activarea acestui complex, fie ambele procese.
O caracteristică extraordinară a acestor mecanisme o reprezintă universalitatea lor. Este
remarcabil faptul că aceste mecanisme cu origini foarte diverse (cum este cazul drojdiei,
Drosophilei sau celulelor de mamifere) să fie interschimbabile. Astfel, un factor de la drojdii sau
de la Drosophila poate interacţiona cu motive nucleotidice de la mamifere şi cu celelalte proteine
ale complexului de transcripţie la fel de bine ca şi factorii de transcripţie de la mamifere. Situaţie
inversă este adesea adevărată. Aceasta implică o conservare certă a acestor structuri în cursul
evoluţiei.
Mecanismul de terminare a transcripţiei este diferit pentru cele trei ADN polimeraze:
fiecare depinde de motivele de secvenţă situate la, sau aproape de extremitatea unităţii de
transcripţie. La acest nivel, motivele interacţionează cu proteine adecvate, factorii de terminare.
Reglarea terminării este consecinţa aranjamentului motivelor ADN şi formarea unui ansamblu
multiproteic care facilitează terminarea şi modificarea extremităţii ARN.
SLIDE 9. Reglarea expresiei genelor eucariote (b) O caracteristică extraordinară a acestor
mecanisme o reprezintă universalitatea lor.
Remarcabil - mecanisme cu origini foarte diverse (drojdie, Drosophila, celule de mamifere) sunt
interschimbabile → o conservare evolutivă certă a acestor structuri. Mecanismul de terminare a
transcripţiei este diferit pentru cele 3 ADN polimeraze. Motivele interacţionează cu proteine
adecvate, factorii de terminare. Reglarea terminării este consecinţa aranjamentului motivelor
ADN şi formarea unui ansamblu multiproteic care facilitează terminarea şi modificarea
extremităţii ARN.
Expresia anumitor gene este afectată de schimbări epigenetice care alterează capacitatea
unei gene de a se exprima fără a fi afectată secvenţa sa nucleotidică.
O formă de modificare epigenetică identificată este asociată cu gradul de metilare a
citozinelor la nivelul secvenţelor 5’-CG care flanchează regiunea 5’ a unei gene: a) creşterea
metilării este corelată cu o reducere sau chiar cu o absenţă a expresiei genei sau genelor vecine; b)
reducere a metilării se traduce printr-o expresie crescută.
 Modificările de structură intrinsecă a cromatinei (acetilare, fosforilare) pot influenţa
nivelul expresiei genelor apropiate.
Nivel crescut de expresie există numai în regiunile «decondensate» ale cromatinei.
Expresia anumitor gene este afectată de schimbări epigenetice care alterează capacitatea
unei gene de a se exprima (de a fi exprimată) fără a fi afectată secvenţa sa
64
nucleotidică. O formă de modificare epigenetică identificată este asociată cu gradul de metilare a
citozinelor la nivelul secvenţelor 5’-CG care flanchează regiunea 5’ a unei gene. O creştere a
metilării în această regiune este corelată cu o reducere sau chiar cu o absenţă a expresiei unei gene
vecine, în timp ce o reducere a metilării se traduce printr-o expresie crescută. Modificările de
structură a cromatinei (în structura sa intrinsecă), cu toate că nu sunt încă bine caracterizate pentru
moment, pot influenţa, de asemenea, nivelul expresiei genelor apropiate, un nivel ridicat de
expresie neexistând decât în regiuni «decondensate» ale cromatinei.
SLIDE 10. Comparaţie între operonul lac (a) şi gena ovalbuminei Figura: a) hartă genetică
a operonului lac de la E. Coli, care reprezintă genele care mediază metabolismul lactozei şi
situsurile genetice care controlează expresia acestora. Genele Z, Y şi A codifică pentru beta-
galactozidază, galactozid permează, tiogalactozid transacetilază. I = regiunea genelor
reglatoare; P = regiunea promotoare şi O = regiunea operatoare b) Secvenţa etapelor de
producere a ARNm matur în cazul genei ovalbuminei de pui. După transcriere, transcriptului
primar i se adaugă structura “coif” şi coada poli(A). În continuare sunt excizaţi intronii pentru
a forma molecula matură de ARNm.
Caracteristicile neaşteptate ale genelor eucariote au favorizat discuţiile privind
subiectul definiţiei unei gene ca unitate de informaţie ereditară. Mai multe definiţii sunt
posibile dar nici una dintre ele nu este total satisfăcătoare sau adecvată tuturor genelor. În
optica acestui curs am adoptat o definiţie moleculară. O genă eucariotă este o combinaţie de
segmente de ADN care, împreună, formează o unitate de expresie, aceasta conducând la
formarea unuia sau mai multor produşi specifici, ARN, polipeptide. Segmentele unei gene
conţin: regiunea transcrisă (unitatea de transcripţie) care conţine secvenţele codante,
secvenţele intercalare, secvenţele din regiunea 5’ «leader» şi 3’ «trailer» netraduse, care
flanchează aceste secvenţe codante şi segmentele reglatoare incluse în unitatea de
transcripţie astfel că secvenţele reglatoare care flanchează unitatea de transcripţie sunt
necesare expresiei sale specifice.
La procariote, iniţierea şi oprirea transcripţiei par să fie primul nivel de control al expresiei
genelor, chiar dacă în anumite cazuri pot să intervină alte mecanisme: atenuarea, terminarea, anti-
terminarea, controlul traducerii sau reglarea proporţiei de reînnoire a ARN şi a proteinelor. De
altfel, aceste mecanisme de iniţiere (pornire) şi de oprire a transcripţiei sunt elemente critice pentru
reglarea expresiei genelor eucariote. Maturarea şi particular schema de maturare (excizie-
epissage), influenţează natura mesagerilor formaţi şi în consecinţă natura proteinelor produse.
Există, de asemenea, argumente foarte bune în favoarea reglării prin atenuare sau terminare a
transcripţiei şi există şi indicaţii că traducerea şi reînnoirea ARN intervin de asemenea în reglarea
producerii de proteine. În plus, caracteristicile unice ale celulelor eucariote şi structura genelor lor
furnizează posibilităţi particulare de control al fluxului de informaţie genetică. De exemplu,
transcriptul unei gene nu este funcţional atâta timp cât intronii nu au fost eliminaţi convenabil. De
altfel, chiar şi transcripţii destinaţi să devină ARNm trebuie să fie modificaţi la extremitatea lor 5’
şi 3’: numai astfel moleculele de ARNm pot traversa membrana nucleară către citoplasmă înainte
de a fi traduşi. Fiecare dintre aceste evenimente poate constitui un punct de control.
65
 SLIDE 11. Genoamele eucariotelor superioare conţin mult ADN “ne- funcţional” Figura:
Diagramele regiunii de aprox 80 kb de pe cromozomul III al S. cerevisiae şi a clusterului genei
globinei umane situat pe cromozomul 11.
a) La cromozomul de drojdie, ADN (căsuţele albastre) indică fazele deschise de lectură; nu
este clar dacă toate aceste secvenţe care codifică potenţial pentru prtoteine sunt gene funcţionale.
b) În ADN uman, dreptunghiurile albastre reprezintă regiuni transcrise care codifică
proteinele tip globină indicate. Fiecare genă tip globină are un aranjament similar de exoni şi
introni (care nu sunt evidenţiaţi). Clusterul genei Beta-globinei umană conţine două pseudogene
(marcate cu diagonale); aceste regiuni sunt înrudite cu genele funcţionale ale globinelor dar nu
sunt transcrise. Săgeţile roşii indică localizarea secvenţelor Alu (secvenţe repetitive de
aproximativ 300 pb care sunt relativ abundente în genomul uman). De reţinut proporţia mare a
secvenţelor necodante în raport cu cele codante în structura genomului uman faţă de cel al
dojdiilor.
Structura genomului eucariotelor
Cu toate că genele procariote diferă puternic de genele procariote, prin structura lor,
organizarea informaţiei genetice este foarte diferită în cele două grupe de organisme. În genomul
bacterian, genele sunt continue (contigue) dea lungul ADN, adesea chiar secvenţele lor se încalecă.
Genele care codifică pentru enzime care participă la aceeaşi cale metabolică, ale căror activităţi
sunt apropiate, sunt frecvent asociate într-o singură unitate de transcripţie. Acest aranjament
permite o utilizare foarte eficace a secvenţei ADN. Economia pare să fie mult mai puţin importantă
în cursul evoluţiei eucariotelor. În ciuda enormei cantităţi de ADN prezentă în introni, genele
eucariotelor sunt separate şi de secvenţe necodante foarte lungi. Cum s-a menţionat mai înainte,
sunt rare genele multiple într-o singură unitate de transcripţie.
Repartiţia ADN în mai mulţi cromozomi este un punct fundamental în organizarea
genomului eucariotelor. Cromozomii celulari conţin probabil întotdeauna ADN bicatenar linear
chiar dacă de formează bucle de ADN duplex care dau naştere unor domenii circulare situate de-
a lungul scheletului linear. În timpul interfazei fiecare cromozom conţine o singură dublă elice
ADN, ca cele două cromatide surori ale unui cromozom în metafază. Genoamele a numeroase
virusuri ale eucariotelor, ca şi cromozomii cloroplastelor şi marea majoritate a mitocondriilor,
sunt unităţi de ADN circular. Există tipuri de ADN eucariot care nu sunt niciodată transcrise
Abundenţa secvenţelor necodante în genoamele organismelor superioare este ilustrată în
figură. Clusterul genelor beta-globinei este neobişnuit de bogat în secvenţe codante pentru
proteine în comparaţie cu alte secvenţe de la vertebrate. De ex: în regiunea de 50 kb care conţine
gena de pui pentru lizozim, totalul exonilor este de mai puţin de 500 pb.
Deoarece pentru majoritatea ADN ne-codant nu au fost încă identificate funcţii, este
foarte uşor să îl considerăm ca nefuncţional.
66
 SLIDE 12. Duplicarea genelor - rezultatul crossing-over-ului inegal [Link]
genelor rezultată în urma unui crossing-over inegal. Fiecare cromozom parental conține o genă
ancestrală pentru globină ce prezintă 3 exoni si 2 [Link]ța repetitivă homoloagă
necodantă L1 se găsește între genele globinei 3 și 5. Cromozomii parentali sunt dispuși relaviv
unul față de celălalt, în așa fel încât secvențele L1 să fie aliniate. Recombinarea omoloagă între
secvențele L1, după cum se poate observa ar trebui să genereze un cromozom recombinant cu
câte două copii ale genelor globinei și un cromozom cu o deleție în una dintre genele pentru
globină. Mutații subsecvențiale independente la nivelul genelor duplicate pot conduce la ușoare
modificări în secvență, ce ar putea avea ca rezultatproprietăți modificate ale proteinelor
codificate. Un crossing-over inegal poate avea drept rezultat recombinări rare între secvențe
neînrudite. [See D. H. A. Fitch et al., 1991, Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 88:7396.]
SLIDE 13. Există tipuri de ADN eucariot care nu sunt niciodată transcrise Abundenţa
secvenţelor necodante în genoamele organismelor superioare este ilustrată în figură. Clusterul
genelor beta-globinei este neobişnuit de bogat în secvenţe codante pentru proteine în comparaţie
cu alte secvenţe de la vertebrate. De ex: în regiunea de 50 kb care conţine gena de pui pentru
lizozim, totalul exonilor este de mai puţin de 500 pb.
Deoarece pentru majoritatea ADN ne-codant nu au fost încă identificate funcţii, este
foarte uşor să îl considerăm ca nefuncţional.
Nu există un principiu determinant al distribuţiei genelor de-a lungul cromozomilor. Acest
lucru a fost sugerat în timpul cartografiei genelor de la Drosophila melanogaster prin tehnici
genetice şi citogenetice. Totuşi, aceste hărţi nu ţin cont decât de o cantitate scăzută din ADN total,
hărţile genetice ale genoamelor de mamifere fiind încă destul de incomplete. În 1973, erau
localizate numai 60 de gene umane la nivelul autozomilor şi în 1981 un număr de 400. În ultimul
timp, graţie clonării segmentelor de ADN, acest număr a crescut la peste 1000 în 1992 şi la
secvednţierea genomului uman în anul 2000. Totuşi, cărţile genetice cele mai complete nu
furnizează şi nu evidenţiază o localizare sistematică a genelor. Gene înrudite sau gene prezente în
mai multe copii pot fi grupate sau dispersate pe mai mulţi cromozomi. Astfel, genele care codifică
pentru actinele cardiace şi scheletice se găsesc, respectiv pe cromozomii 15 şi 1. De altfel, cu toate
că genele care codifică pentru cinci tipuri diferite de polipeptide de β-globine umane sunt grupate
pe cromozomul 11, cele care specifică polipeptidele α-globinelor sunt grupate pe cromozomul 16,
cu toate că aceste gene sunt înrudite şi că cele două tipuri de polipeptide sunt necesare la formarea
hemoglobinei.
Genele clonate sunt adesea obţinute împreună cu fragmente lungi de ADN care le
flanchează. Un segment care se încalecă poate fi clonat plecând de la o bancă genomică şi un
segment de ADN unic prezent la nivelul ADN flancant este sub-clonat şi folosit drept sondă. Prin
repetarea acestei operaţii se pot obţine hărţi detaliate pentru regiuni cromozomice lungi. Aceste
hărţi conţin informaţii structurale şi funcţionale. De exemplu: cele 65 kpb care conţin cele cinci
gene ale β-globinei umane au fost clonate în segmente încălecate şi secvenţa nucleotidică este
cunoscută în întregime, permiţând localizarea regiunilor codante, a regiunilor de reglare şi a
intronilor.
67
Hărţile se restricţie ale unei regiuni cromozomice sunt foarte utile pentru detectarea variaţiilor de
secvenţă de la o alelă la alta, mai ales în cazul alelelor modificate (alterate). Astfel, folosind ca
sondă de hibridizare un segment de β-globină umană clonat specific, putem examina la numeroşi
indivizi, regiunea ADN care codifică pentru β-globină, doar efectuând o digestie cu endonucleaze
de restricţie şi un transfer de ADN (Southern blotting). O modificare a mărimii segmentului care
se hibridizează cu sonda indică fie o alterare a unui situs de restricţie m fie o deleţie sau o inserţie
între două situsuri de restricţie. Absenţa hibridizării cu o anumită sondă indică deleţia (lipsa)
întregii regiuni studiate. Astfel de modificări sau polimorfism de restricţie, RFLP (Restriction
Fragment Lengh Polymorfism), chiar dacă sunt lipsite de consecinţe fenotipice, furnizează markeri
genetici, la fel de utili ca şi markerii clasici, pentru analiza genetică a unor familii mari în populaţia
umană. Această tehnică a fost utilizată pentru studierea transmiterii hemoglobinopatiilor şi altor
maladii genetice. În plus, o serie de fragmente polimorfe obţinute cu ajutorul endonucleazelor de
restricţie pornind de la diferite porţiuni de cromozom pot fi utilizate ca markeri pentru o analiză
de legătură genetică, făcând posibilă construcţia unei hărţi genetice chiar şi în absenţa markerilor
fenotipici. Acest tip de analiză a fost utilizat pentru ordonarea mai multor gene pe braţul scurt al
cromozomului 11 uman: centromer * catalază hormon paratiroidian - ε-globină - β-globină -
insulină - pepsinogen.
Una dintre surprizele care au derivat din aceste analize este marea frecvenţă a diferenţelor
de secvenţe nucleotidice între indivizi. Prin definiţie, analizele mutaţiilor realizate prin genetica
clasică utilizează modificările genomice cu evidente consecinţe fenotipice. Era normal să
considerăm că genoamele indivizilor normali (sălbatici) să prezinte puţine diferenţe. aceste mod
de abordare simplist a fost adesea accentuat prin accentul pus pe existenţa alelelor dominante şi
recesive, considerându-se că nu pot exista decât două sau cel mult un număr redus de alele pentru
un anumit tip de genă. Totuşi, polimorfismul lungimii fragmentelor de restricţie este foarte
frecvent atât la nivelul regiunilor codante cât si necodante, demonstrând marea diversitate a
genoamelor indivizilor unei specii, fără consecinţe fenotipice identificabile. Unele dintre aceste
polimorfisme pot avea efecte subtile, dar marea majoritate a acestora se relevă a nu avea consecinţe
detectabile.
SLIDE 14. Experimentele de reasociere evidenţiază trei fracţii majore pentru ADN eucariot
Copii ADN unice (singulare) (50-60%) – o copie/genom haploid; - Secvenţe ADN moderat
repetitive/intermediar (< 106 copii/genom haploid) repetitive (25-40%); sunt incluse elementele
de ADN mobile;
- Secvenţe înalt repetitive (> 106/genom haploid) - secvenţe simple de ADN sau “ADN
satelit” (10-15%) (repetiţiile în tandem ale secvenţelor scurte crează adesea adesea o fracţiune
distinctă cu proprietăţi fizice care permit izolarea sa);
- Secvenţe inversate sau “fold back structures” În concluzie: cantitatea totală de ADN de la
diferite animale şi plante nu variază concordant cu complexitatea organismelor. De asemenea
cantitatea de ADN poate varia şi între specii înrudite. Secvenţe repetitive în genom
ADN repetitiv este definit prin rata sa rapidă de renaturare. Tipic acesta constă în secvenţe
scurte care sunt repetitive în copii identice sau înrudite în genom. Componenta care se renaturează
cel mai rapid în genomul eucariotelor este reprezentată de secvenţele ‘înalt repetitive’, şi constă în
secvenţe foarte scurte care se
68
repetă de multe ori în tandem sub forma unor clustere mari. Datorită acestor unităţi repetitive
scurte, aceste secvenţe de ADN sunt adesea denumite ‘secvenţe simple de ADN’. Acest tip de
secvenţe ADN sunt prezente în aproape toate genoamele eucariote, dar cantitatea lor totală este
extrem de variabilă. În genoamele mamiferelor acestea reprezintă, în mod normal, < 10%m dar
(de exemplu) la Drosophila virilis, cantitatea este de ≈50%. Pe lângă clusterele mari în care au fost
descoperite iniţial aceste secvenţe, există clustere mao mici separate de secvenţe de ADN
nerepetitive.
Repetiţiile în tandem ale secvenţelor scurte crează adesea adesea o fracţiune distinctă cu
proprietăţi fizice care permit izolarea sa. În unele cazurim secvenţa repetitivă posedă o compoziţie
în baze distinctă faţă de compozoţia normală a genomului care îi permite formarea unei fracţii
separate şi distincte datorită densităţii sale. O fracţie de acest tip este numită ‘ADN satelit’.
Termenul ‘satelit’ este sinonimul esenţial pentru ‘secvenţe simple ADN’.
Secvenţele repetitive în tandem sunt special corelate cu modificarea alinierilor care apar în
urma împerecherii cromozomilor, şi astfel mărimea clusterelor în tandem tinde să fie foarte
polimorfă, cu variaţii largi între indivizi. De fapt, cele mai mici clustere de astfel de secvenţe pot
fi folosite pentru a caracteriza genoame individuale folosind tehnica ‘fingerprinting’.
Comparaţii ale regiunilor corespunzătoare secvenţelor simple de ADN din interiorul
speciilor ne oferă informaţii despre mecanismele implicate în manipularea secvenţelor ADN din
perioade evolutive diferite. Pentru moment nu putem spune cu precizie dacă aceste secvenţe au o
funcţie structurală.
SLIDE 15. Variabilitatea în cadrul unei familii de secvenţe repetitive
Aşa cum am discutat secvenţele nucleotidice ale membrilor unei anumite familii de gene
pot fi identice sau pot varia prin una sau mai multe perechi de baze. În ultimul caz se consideră
că familia este polimorfă. După cum am constatat în unele cazuri divergenţa poate fi
considerabilă. Termeni de sub-familii şi super-familii sunt adesea desemnaţi sunt folosiţi pentru
a numi grupuri de membri ai unei familii care prezintă o similitudine mai mare sau mai mică.
Divergenţa dintre membrii unei familii poate fi estimată prin patru metode a căror sensibilitate
este din ce în ce mai mare: a) compararea hărţilor de restricţie; b) compararea capacităţii de a
forma hibrizi; c) măsurarea termostabilităţii hibriziolor duplex formaţi între membrii familiei; d)
compararea secvenţelor lor nucleotidice.
Condiţii stricte de hibridizare (de obicei o temperatură ridicată de 650C, şi concentaţie
salină destul de slabă, în jur de 0,45 M NaCl) nu permit în general formarea unui duplex între
segmentele de ADN care posedă mai puţin de 85% complementaritate Prin reducerea temperaturii
şi creşterea concemtrației saline (reducerea sensibilităţii testului), este posibilă hibridarea unor
segmente mai puţin înrudite, dar limita inferioară de detectare se situează în jur de 70%
complementaritate. Stabilitatea heteroduplexului format este estimată măsurând transformarea în
monocatene în funcţie de temperatură. Regula reste ca temperatura de fuziune Tm (melting) să fie
diminuată cu 100C pentru 100 de baze ne- împerechiate.
 Segmentele de ADN bicatenar se numesc omologe dacă secvenţele lor sunt identice.
Totuşi, termenul de omolog este adesea folosit pentru a descrie segmentele de ADN similare dar
nu şi identice. Frecvent, un calificativ este folosit pentru a indica gradul de identitate. Dacă
secvenţele sunt cunoscute, este posibilă realizarea de comparaţii cantitative. Astfel, dacă două
segmente de ADN sunt descrise ca
69
reprezentând 70% omologie (sau 70% similitudine) înseamnă că 70% din bazele lor (resturi de
nucleotide) sunt identice şi colineare. Această modalitate de exprimare decurge din conceptul de
cromozom omolog, dar se distanţează de cel folosit clasic în literatură asupra evoluţiei biologice.
Aici, omolog semnifică, în general, că structuri morfologice sau de secvenţă ADN provin dintr-
un strămoş comun, şi în acest caz termenul de procentaj de omologie este lipsit de sens. Deci,
folosirea frecventă a termenului de procentaj de omologie este un pic ambiguă în lucrările de
genetică moleculară. Termenul de procentaj de similitudine evită mai bine ambiguitatea cu toate
că este rar întâlnit în litaratură. Secvenţe consens
Atunci când o familie de secvenţe repetitive posedă numeroşi membri, unde fiecare nu
diferă de ceilaţi decât prin câteva poziţii în secvenţa nucleotidică, este adesea comod să definim
un fel de secvenţă medie sau consens sau canonică pentru membrii familiei. O secvenţă consens
conţine baza cel mai frecvent întâlnită la fiecare poziţie în ansamblul membrilor familiei şi nu este
neapărat identică cu secvenţa oricăruia dintre membri. Există două moduri de a obţine o secvenţă
consens. Adesea este posibilă izolarea unei populaţii mari de unităţi repetitive, lipsite de secvenţe
ne- împerechiate şi apoi realizarea unei analize de secvenţă a amestecului. Chiar dacă fiecare
moleculă din populaţie diferă de celelalte în câteva poziţii, se obţine adesea o secvenţă nucleotidică
unică deoarece metodele de secvenţializare nu detectează concentraţiile mici de nucleotide pentru
fiecare poziţie. Într-un alt tip de abordare se realizează compararea unui anumit număr de secvenţe
ai membrilor unei familii care au fost clonate individual, îar baza cea mai frecventă din fiecare
poziţie este determinată folosind un anumit soft pe calculator.
Este util să amintim că definiţia unei familii de secvenţe repetitive este pragmatică. În
absenţa datelor despre secvenţa reală, o familie este în general considerată ca un ansamblu de
secvenţe care se hibridizează între ele, sau cu un membru clonat din familie, aceasta în condiţii
stricte. În general, aceasta semnifică că secvenţele care prezintă diferenţe de 15-20% de o secvenţă
consens sunt abia decelabile, şi că secvenţe mai divergente nu pot fi considerate membri ai familiei.
Printre altele, identificarea prin hibridizare a familiilor de secvenţe repetitive exclude sistematic
toate familiile ale căror membri sunt prea scurţi pentru a se reasocia. Astfel, membri familiei de
secvenţe 5’ ACT(A sau T)nTA care preced genele ARNt nu pot fi adesea detectate. Adesea,
rezultatele secvenţializărilor evidenţiază că două secvenţe de ADN care nu se hibridizează între
ele se aseamănă suficient (30 la 50%) pentru a fi grupate în cadrul unei familii sau a unei super-
familii.
SLIDE 16. Secvenţele simple de ADN sunt concentrate specific la nivelul cromozomilor Figura:
cromozomi umani în metafază coloraţi fluorescent şi hibridizaţi in situ cu o secevţă ADN
monocatenară particulară marcată cu un derivat fluorescent al biotinei. Când se iluminează cu
o lungime de undă adecvată, ADN apare roşu şi în poziţia la care se hibridizează secvenţa
monocatenară apare o bandă galbenă pe cromozomul 16, indicând localizarea secvenţei numai
intr+un singur loc din genom. Analiza moleculară a relevat că anumite tipuri de secvenţe de
ADN sunt asociate cu caracteristici morfologice particulare ale cromozomilor. Regiunile numite
organizator nucleolar conţin genele pentru ARNr. Regiunile telomerice şi centromerice ale
cromozomilor eucariotici conţin secvenţe repetitive (repetate) în tandem. Aşa cum am arătat, cu
toate că adesea aceste reprezintă peste 10% din genom, funcţiile lor nu sunt cunoscute. Astfel de
secvenţe ar putea să nu fie
70
importante în funcţionarea centromerilor deoarece ele lipsesc la cromozomii de drojdii
(Saccharomyces cerevisiae) unde centromerii funcţionează normal în cursul mitozei sau meiozei.
Rearanjamentul secvenţelor ADN
Aranjamentul genelor şi a marii majorităţi a segmentelor ADN în cromozomi este virtual
stabilă ceea ce face posibilă stabilirea hărţilor genetice. Informaţia genetică poate fi redistribuită
între cromozomii omologi, fie în timpul meiozei fie în timpul mitozei, prin crossing-over reciproc.
Cu toate că aceste evenimente creează noi combinaţii de alele, ele nu determină rearanjamente ale
secvenţelor ADN. De fapt, numeroase grupuri de gene sunt mult mai vechi decât speciile
individuale, şi gene sintenice situate pe acelaşi cromozom la un anumit mamifer, sunt adesea
prezente şi la alte mamifere care nu sunt înrudite din punct de vedere evolutiv. Totuşi, acestei
stabilităţi a organizării genomului i se suprapune o capacitate de reorganizare a informaţiei
genetice. Rearanjarea se poate face la întâmplare, provocând cel mai adesea mutaţii dăunătoare,
dar anumite rearanjamente sunt procese normale care influenţează expresia genelor în mod ordonat
şi programat.
De mult timp se cunosc aberaţii cromozomiale cum sunt rupturile, translocările unor
porţiuni de cromozom pe un cromozom neomolog sau formarea de cromozomi dicentrici sau
acentrici. La nivel molecular, toate aceste modificări morfologice se manifestă prin modificări ale
structurii ADN. Toate organismele posedă în programul lor genetic informaţia pentru maşinăria
enzimatică (angrenajul enzimatic) necesară acestor rearanjamente. Acest proces cuprinde:
1) crossing-over omolog nereciproc şi nealelic şi conversii genetice; 2) transpoziţii de segmente
de ADN de la un locus la altul; 3) formarea de copii suplimentare de secvenţe de ADN fie în
tandem fie dispersate, proces numit amplificare;
4) deleţia de secvenţe de ADN; 5) recombinării neomoloage. Recunoaşterea instabilităţii
organizării genomice este una din cele mai mari descoperiri ale geneticii moleculare şi este în
mod particular remarcabilă deoarece rearanjamentele sunt evenimente rare. Aceasta deoarece
pentru cea mai mare parte consecinţa combinării preciziei geneticii moleculare cu modalităţile
foarte selective ale analizei genetice clasice. Rearanjamentele genomice aleatoare
Rearanjamentele neprogramate sunt, de obicei, rezultatul hazardului atât în ceea ce priveşte
momentul în care se produc cât şi secvenţele implicate. Astfel de rearanjamente produc adesea
mutaţii nefaste. Totuşi, ele pot furniza sau au putut furniza, în trecut ocazia unor răspunsuri noi
mediului şi au putut astfel facilita modificările evolutive. Evident, pentru ca aceste rearanjamente
aleatorii să influenţeze evoluţia, ele trebuie să aibă loc în celulele germinale sau în precursorii
acestora; aceleaşi evenimente dacă au loc în celule somatice rămân fără consecinţe pentru
organismul individual. Totuşi, dacă celula somatică este o celulă suşă (celulă stem)
rearanjamentele aleatoare pot împiedica formarea unei descendenţe funcţionale şi diferenţiate sau
modificarea poate fi oncogenă şi poate conduce la formarea unei tumori.
Printre tipurile cunoscute de rearanjamente genomice aleatoare, unul particular a atras
atenţia cercetătorilor şi anume transpoziţia segmentelor de ADN de la un situs la altul. «Genele
mobile» au fost vedete chiar şi pentru literatura ştiinţifică de popularizare. Existenţa elementelor
ADN mobile a pornit de la studiile genetice şi citogenetice asupra porumbului care au demarat
pentru prima dată în anii ’40. Douăzeci de ani mai târziu, geneticieni care se ocupau de bacterii au
obţinut rezultate
71
experimentale care au condus la aceleaşi concluzii: anumite segmente de ADN se pot deplasa. În
cele din urmă, a fost stabilit că mai multe tipuri de elemente mobile există în genomul celulelor
eucariote. Clonarea moleculară a făcut posibilă determinarea structurilor multora dintre aceste
elemente şi a permis elucidarea mecanismelor prin care se realizează schimbarea poziţiei în
genom. Elementele mobile sunt factori de modificare genetică şi sunt responsabile de diferite
mutaţii la eucariote cât şi la procariote. Când acestea se inseră în secvenţa codantă a unei gene,
funcţia acesteia se pierde. Când elementul se inseră în vecinătatea unei gene expresia acesteia poate
fi influenţată complex. De fapt, multe dintre mutaţiile care s-au dovedit utile, la începutul
secolului, pentru studiul D. melanogaster sunt la ora actuală cunoscute ca fiind rezultatul inserării
unor elemente mobile în gene.
Rearanjamente programate
Acum este evident că expresia genelor poate fi modificată profund prin modificarea
mediului lor genomic. O genă poate fi «silenţioasă» când se află în vecinătatea unui anumit tip de
secvenţă şi poate fi exprimată când secvenţa de ADN care o flanchează se modifică. Astfel de
rearanjamente sunt utile pentru o mare varietate de organisme pentru reglarea expresiei genelor şi
stabilirea astfel a unor funcţiuni specifice în celulele diferenţiate. De exemplu, există programe
genetice care provoacă rearanjarea anumitor segmente ADN în momente oportune sau în tipuri
specifice de celule.
Mult timp înainte de a putea analiza genele şi genoamele la nivel molecular, geneticienii
presupuneau că anumite fenomene biologice neaşteptate pot fi explicate prin rearanjamente
specifice. Unul dintre acestea era alternanţa a două tipuri de flageli diferiţi la nivelul celulelor de
Salmonella thyphimurium. Un alt caz, cu implicaţii mult mai profunde, era extraordinara
diversitate a anticorpilor pe care îi pot produce mamiferele. Analiza moleculară a demonstrat în
prezent că cele două fenomene, ca şi multe altele, sunt rezultatul rearanjamentelor programate ale
secvenţelor ADN (exemplul imunoglobulinelor). În aceste două exemple, reorganizarea
genomului este folosită pentru a proteja organismul. Prin schimbarea flagelilor, Salmonella scapă
de apărarea imunologică a organismului gazdă. Prin crearea de noi anticorpi organismul se apără
mai bine de agenţii externi.
Implicaţii evolutive
Istoria evoluţiei organismelor este înscrisă în genomul lor. Mutaţiile şi rearanjamentele
furnizează variaţiile genetice de care depinde procesul evolutiv. În trecut, relaţiile evolutive nu
puteau fi studiate decât prin raportare la consecinţele asupra informaţiei genetice oglindite în
fenotipurile organismelor. Astfel, informaţia biologică era furnizată de studiul anatomic al fosilelor
şi de anatomia, fiziologia şi embriologia comparată a speciilor contemporane. La mijlocul acestui
secol, chimia comparativă a proteinelor a introdus o altă măsură fenotipică a relaţiilor filogenetice.
Descoperirea că structura anumitor proteine este conservată la un larg spectru de organisme a
asamblat mai multe ramuri (philum) în căi de evoluţie comune într-un mod în care studiul fosilelor
nu îl putea face. De exemplu, citocromul C, este prezent în mitocondriile tuturor plantelor şi
animalelor. El este indispensabil respiraţiei şi trebuie să fie printre primele molecule proteice
esenţiale. În cursul evoluţiei, citocromul C s-a modificat foarte puţin; numai 35 din cei 104
aminoacizi ai citocromului C s-au modificat de la drojdii la mamifere (fără a ţine cont de
aminoacizii terminali suplimentari care există în proteina de la drojdii).
Citocromul C şi alte proteine foarte conservate nu sunt utile în analiza genetică a relaţiilor
filogenetice între specii foarte înrudite deoarece în acest caz nu există prea multe variaţii: este
cazul citocromului C de la om şi de la cimpanzeu. Dar
72
alte proteine evoluează mult mai rapid. Un exemplu este anhidraza carbonică: diferenţele din
structura sa la nivelul primatelor sunt suficiente pentru a putea stabili un arbore filogenetic.
Această metodă se bazează pe observaţia că numărul aminoacizilor diferiţi este groso-modo
proporţional cu timpul scurs între divergenţa de strămoşul comun, aşa cum o demonstrează şi
datele obţinute prin analiza fosilelor.
În fine, toate metodele de analiză a procesului evolutiv care se bazează pe expresia
fenotipică sunt indirecte deoarece responsabile de apariţia unor noi fenotipuri sunt modificările
pe care le suferă genele şi genoamele. Chiar dacă studiul formelor străvechi se va continua prin
studiul fosilelor, compararea structurilor ADN va suplini rapid celelalte metode în studiul
relaţiilor existente între speciile contemporane. Astfel, tehnica ADN recombinat a avut deja un
impact major asupra biologiei evoluţiei şi cu siguranţă influenţa sa în acest domeniu va fi enormă
în viitor. Genatica moleculară comparativă
Chiar înainte de a avea posibilitatea de a clona şi secvenţializa, importanţa comparării
diferitelor secvenţe de ADN în studiul evoluţiei era evidentă, diferite metode de măsurare a
gradului de înrudire dintre genoame fiind dezvoltate pe parcurs (în timp). Aceste tehnici includeau
compararea stabilităţii dublului helix ADN format din monocatene de origini diferite
(heteroduplex) sau a catenelor cu aceeaşi origine (homoduplex). Cu toate că erau utile, studiile de
acest tip nu dădeau decât valori medii pentru divergenţa dintre două tipuri de ADN. Alelele nu pot
rivaliza cu bogăţia detaliilor obţinute prin anatomie comparată sau biochimia proteinelor. În aceste
condiţii comparaţiile directe ale secvenţelor nucleotidice ADN furnizează detalii importante şi
clarifică aspectele care înainte nu puteau fi abordate evolutiv. Astăzi, este mult mai uşor tehnic să
se realizeze clonarea şi secvenţializarea unui grup omolog de gene decât să se izoleze şi să se
determine secvenţa în aminoacizi a produşilor peptidici ai acestora.
În ceea ce priveşte regiunile codante, secvenţa ADN furnizează mai multe informaţii decât
secvenţa peptidică deoarece degenerescenţa codului genetic permite o modificare a structurii genei
fără modificarea secvenţei în aminoacizi corespunzătoare. De altfel, faptul că putem şti că un
aminoacid s-a schimbat nu indică neapărat numărul de modificări care au intervenit la nivelul
perechilor de baze; nu este permisă decât o estimare a numărului minim de modificări necesare
înlocuirii unui aminoacid de către altul. Astfel, înlocuirea unei alanine cu o valină în poziţia 11 a
citocromului C poate fi rezultatul modificării uneia (GCU GUU) sau a două (GCU GUA) perechi
de baze.
Un avantaj unic al secvenţelor ADN este că se poate realiza compararea secvenţelor
necodante, implicit a secvenţelor reglatoare. Acest lucru poate avea o importanţă foarte mare
pentru faptul, deja recunoscut, că evoluţia proteinelor şi evoluţia morfologică se realizează cu
viteze diferite în grupe diferite de organisme. Modificări fenotipice importante pot reprezenta nu
numai rezultatul structurii proteinelor dar şi, de exemplu, a abundenţei relative a proteinelor
individuale în momentul expresiei genelor. Compararea secvenţelor ADN poate elucida rolul
reglării unei gene în evoluţia speciilor prin analiza elementelor situate în vecinătatea secvenţelor
genice luate în studiu. Aceste modificări pot, în anumite cazuri, implica numai modificarea unei
singure perechi de baze dar pot exista şi rearanjamente genomice importante cum ar fi
transpoziţiile de elemente mobile.
Secvenţele de ARNr, şi particular cele de ARN 16 şi 18S care intră în constituţia
subunităţilor mici ale ribozomilor, sunt foarte utile pentru determinarea relaţiilor filogenetice. Cum
ribozomii sunt abundenţi la toate speciile, molecule de ARN funcţional pot fi izolate şi
secvenţializate direct după trecerea lor în ADNc. Cu
73
toate că funcţia subunităţii mici este aceeaşi la toate organismele vii, regiunile moleculei posedă
grade variabile de conservare. Regiunile cele mai conservate pot fi utilizate pentru a compara
organismele cu grade de înrudire slabe (îndepărtate evolutiv) şi segmentele care evoluează mai
rapid în compararea organismelor cu grad de înrudire mai mare. Astfel, toate speciile pot fi
comparate folosind un singur tip de moleculă a cărei funcţie a fost foarte bine conservată. Astfel,
au fost analizate specii virtual reprezentative pentru toate clasele taxonomice putând fi analizate
relaţiile filogenetice detaliate și realizându-se clarificarea unor momente ale procesului evolutiv.
Istoria evoluţiei genelor
Până în prezent, evoluţia a fost analizată din punct de vedere al relaţiilor cu istoria
diferitelor specii. Dar o altă istorie biologică este înscrisă în structura ADN, în cunoaşterea originii
genelor. Două sau mai multe gene (sau secvenţe de ADN) înrudite în aceeaşi specie derivă adesea
dintr-o singură secvenţă ancestrală. Dacă segmentul ADN ancestral a fost amplificat (ca urmare a
unor evenimente aleatoare), o singură copie poate fi suficientă pentru realizarea funcţiei originale.
Mutaţiile ce pot să apară în copiile suplimentare şi care sunt libere de constrângerea ce determină
limitarea acumulării mutaţiilor în gena funcţională pot conduce la noi capacităţi funcţionale, care
la rândul lor, pot fi păstrate de către selecţie. Copiile suplimentare pot de asemenea achiziţiona
semnale de reglare noi sau modificate care le pot permite să se exprime în momente diferite ale
evoluţiei sau în ţesuturi particular diferenţiate. O altă posibilitate este ca copiile suplimentare să
fie inactivate prin mutaţie şi să fie menţinute sub formă de pseudogene. Familia genelor globinei
conţine exemple pentru toate cele trei posibilităţi.
Anumite gene par să se fi format prin asocierea copiilor de secvenţe codante (cazul
exonilor). În anumite cazuri aceasta implică amplificare în tandem a unui singur exon, structura
repetitivă a genei regăsindu-se în multiplele repetiţii ale segmentelor peptidice înrudite în proteină.
În alte cazuri, genele par să fie o construcţie în mozaic formată din exonii prelevaţi din diferite.
Astfel, exonii având un strămoş comun pot să apară în mai multe gene care nu par a avea un grad
de înrudire. Exonii existenţi în mai multe proteine codifică probabil pentru domenii care dau
acestor proteine diferite proprietăţi structurale sau funcţionale înrudite, cum ar fi o structură
secundară particulară sau capacitatea de a fixa un anumit ligand (ex., ATP).
O ipoteză interesantă privind asamblarea genelor prin repetiţia sau amestecul exonilor
propune existenţa anumitor recombinări la nivelul intronilor care servesc la asocierea exonilor,
lăsând intacte regiunile codante. Această manieră de a vedea lucrurile implică acceptarea faptului
că intronii sunt structuri străvechi, prezente încă în primele gene şi celule şi care au fost pierdute
în cursul evoluţiei procariotelor. O altă ipoteză total diferită consideră că intronii reprezintă inserţii
la nivelul regiunilor codante preexistente printr-un mecanism mai frecvent la eucariote decât la
procariote. Ideea că intronii sunt străvechi rezolvă multe probleme inerente privind explicarea
modelului de inserţie, şi printre altele problema mutaţiilor care pot interveni în cazul inserării
generalizate şi la întâmplare a segmentelor necodante şi a necesităţii de a elabora simultan un
mecanism de excizie. Din contră, dacă intronii erau prezenţi în primele genoame, excizia şi episajul
trebuia să fie procese străvechi. Descoperirea că anumiţi introni provoacă propria lor eliminare
fără ajutorul proteinelor a crescut şansele ipotezei existenţei anumitor introni din timpuri foarte
străvechi. Totuşi, deplasarea intronilor de pe un segment de ADN pe altul a fost bine caracterizată
în multiple cazuri. exemplele cunoscute, care se referă la intronii genelor mitocondriale de la
drojdii şi genelor pentru ARNr de la Mixobacterii, formează o clasă aparte de
74
introni (grupul I). Inserţia pare să fie rezultatul unei conservări genetice specifice unui anumit
situs. Intronii putea să apară în diferite moduri.
Compararea structurilor proteice a furnizat suficiente date pentru a permite formularea de
diverse ipoteze privind rolul procesului de amplificare în evoluţia genomului. Totuşi, de când
există posibilitatea clonării genelor, aceste ipoteze au fost puternic extinse şi îmbogăţite. Unul
dintre punctele importante, demonstrate prin analiză moleculară, este că procesul de amplificare,
de divergenţă, de repetiţie şi de amestec de exoni nu sunt rare şi nu constituie numai contribuţii
ocazionale în evoluţia genomului. Istoria unei părţi importante a ADN de la eucariote, secvenţele
codante sau necodante contopite reflectă un astfel de proces. Varietatea rearanjamentelor observate
în genoamele contemporane reflectă procese străvechi care au fost, şi probabil sunt încă, motoarele
esenţiale ale modificărilor apărute în cursul evoluţiei.
Originea sistemelor genetice
Întrebarea care se pune este dacă vechimea intronilor poate furniza informaţii despre
primele sisteme genetice şi dacă poate răspunde întrebării privind natura primelor molecule
purtătoare de informaţie: ADN sau ARN. Există o serie de argumente în favoarea ipotezei că ARN
a apărut primul şi că a furnizat bazele primelor sisteme de codificare. De exemplu, moleculele de
ARNr, ARNt şi ARNm reprezintă elemente centrale în sistemul de translaţie, în aparatul de
traducere al întregului organism şi de interpretare a codului genetic. Aceasta sugerează că aceste
molecule au precedat divergenţa dintre procariote şi eucariote şi că trebuie să fi fost prezente în
primele sisteme genetice. În plus, molecule mici de ADN pot fi sintetizate de pe o matrice ARN,
într-o manieră pur chimică, în absenţa oricărei proteine. Deci, este posibil ca moleculele de ARN
să fi avut capacităţi autoreplicative şi să fi putut fi transcrise şi traduse după mecanisme primitive.
Moleculele de ARN pot de asemenea reacţiona ca enzime pentru a modifica alte molecule de ARN.
Fracţia ARN a RN-azei din E. coli catalizează clivarea specifică a unui situs la nivelul precursorilor
ARNr. Aşa cum s-a menţionat deja, intronii precursorilor ARNr de la anumite protozoare şi drojdii
pot fi clivaţi fără intervenţia proteinelor. Din contră, moleculele de ADN nu sunt capabile de astfel
de reacţii.
Deci, strămoşul sistemelor genetice contemporane se poate să fi utilizat molecule ARN
informaţionale. În aceste molecule de ARN, scurte regiuni codante formate la întâmplare (exonii
primitivi) puteau alterna cu regiuni necodante (intronii primitivi). La un moment dat au apărut
polipeptide mici care facilitau maturarea ARN şi replicarea acestuia. Una dintre aceste ar fi putut
avea activitate de transcriptază inversă, catalizând formarea de molecule de ADN care au putut
deveni, mai târziu, formele de stocarea informaţiei genetice celulare. Aceste molecule de ADN au
putut conserva alternanţa exon-intron existentă în ARN. Sistemul genetic care conţine ADN a
devenit astfel strămoşul organismelor celulare. O evoluţie divergentă ar fi putut da naştere liniilor
de eucariote şi de procariote în care reţinerea sau pierderea intronilor au fost respectiv favorizate.
După acest model, mu este surprinzător să găsim ocazional un intron prezent într-un genom
procariot. De fapt, în genomul bacteriofagului T4 al E. coli există introni, la fel ca şi în genele
ARNt de la archeobacterii (în ultimul timp au fost descoperiţi şi alţi introni la procariote şi
archeobacterii).
Unul dintre aspectele cele mai tulburătoare ale modelului este originea independentă,
plecând de la celule ancestrale, a procariotelor şi eucariotelor. Anterior, cea mai mare parte a
speculaţiilor referitor la debuturile evoluţiei presupuneau că eucariotele derivă din procariote.
Această ipoteză se baza pe ideea că celulele procariote contemporane, relativ simple, se aseamănă
cu celulele primitive în timp ce
75
celulele eucariote, rezultate din procariote mai simple, au devenit în cursul evoluţiei mai mari şi
mai complexe. Descoperirea intronilor, a maturării (splicing) fenomenelor de transcripţie celulară
inverse şi a proprietăţilor catalitice ale ARN au forţat cercetătorii să reevalueze vechile concepte.
Cu siguranţă capacitatea noastră de a analiza aspectele moleculare ale sistemelor biologice
informaţionale ne va ajuta din ce în ce mai mult să răspundem întrebărilor esenţiale pe care le
ridică biologia evoluţiei.
SLIDE 17. Generarea diferențelor de lungime a unei secvențe ADN simple prin crossing-over
inegal în timpul meiozei Exemplu de crossing-over inegal în interiorul unei secvențe de ADN
care conține 6 copii ADN (1–6) dintr-o anumitî secvență repetitivă simplă conduce la apariția de
celule germinale cu 8 și 4 unități repetitive aranjate în tandem
SLIDE 18. Tehnica “fingerprinting” se bazează pe diferenţa de lungime a secvenţelor simple de
ADN Figura: Secvenţe consens ale unităţii repetitive a minisateliţilor umani numiţi λ33.1 şi
λ33.5 bazate pe analiza a mai mult de zece seturi de unităţi repetitive pentru fiecare caz. Literele
roşii indică poziţiile la nivelul cărora au fost identificate diferenţe. Punctele roşii indică deleţii.
Unitatea de 62 pb a λ33.1 este mult mai conservată decât unitatea de 17 pb a minisatelitului
λ33.5 Minisateliţii sunt folositori în cartarea genetică
Secvenţele care se aseamănă sateliţilor prin faptul că sunt constituite din repetiţii în tandem
ale unei unităţi scurte, dar mult mai scurte, constând în (de exemplu) 5-50 repetiţii, sunt comune
genoamelor de la mamifere. Acestea au fost descoperite din întâmplare ca fragmente a căror
mărime este extrem de variabilă în băncile genomice de ADN genomic uman. Variabilitatea se
poate constată (vedea) când o populaţie conţine fragmente de mărimi diferite care reprezintă
aceeaşi regiune genomic; când indivizii sunt examinaţi, se evidenţiază existenţa unui polimorfism
extins şi faptul că pot fi găsite alele diferite.
Aceste secvenţe sunt numite minisateliţi sau regiuni VNTR (variable number of tandem
repeats). Cauza variaţiilor este aceea că alelele individuale au numere diferite de unităţi repetitive.
De exemplu, un astfel de minisatelit are o lungime repetitivă de 64 pb, şi se găseşte în populaţie
având următoarea distribuţie:
7% 18 repetiţii 11% 16 repetiţii 43% 14 repetiţii 36% 13 repetiţii 4% 10 repetiţii Cauza acestei
variaţii este recombinarea genetică între unităţile repetitive necomplementare (misaligned), în
acelaşi mod în care am discutat deja pentru ADN satelit. Rata de modificare genetică a
secvenţelor minisatelit este mare, ~10-4 per kb de ADN. (Frecvenţa modificărilor per locus
actual se consideră a fi proporţională cu lungimea unui minisatelit). Această rată este de ~10x
mai mare decât rata recombinării omologe în meioză, care este caracteristică oricărei secvenţe
ADN aleatoare. Deci sateliţii pot fi consideraţi puncte fierbinţi pentru recombinarea meiotică.
Adesea prezenţa unui minisatelit este corelată cu o rată crescută (ridicată) de modificare
(schimb) în vecinătate, dar în umele cazuri evenimente de recombinare apar între cromatide surori
(în astfel de cazuri se modifică lungimea minisatelitului
76
dar nu sunt afectaţi markerii care îl flanchează pe acesta, deoarece sunt identici pentru ambele
molecule recombinate de ADN).
Variabilitatea crescută a minisateliţilor îi face pe aceştia extrem de utili pentru cartarea
genomică, deoarece există o mare probabilitate ca indivizii să prezinte variaţii ale alelelor prezente
la nivelul unor astfel de locusuri. Un exemplu de cartare cu ajutorul minisateliţilor este ilustrat. SE
prezintă un caz extrem în care doi indivizi, ambii heterozigoţi pentru un locus minisatelit, şi de
fapt pentru toate cele patru alele sunt diferiţi. În mod normal, toţi descendenţii vor moşteni o alelă
de la fiecare părinte fiind astfel posibilă fără ambiguitate determinarea sursei fiecărei alele ale
progeniturii. În terminologia geneticii umane, meiozele descrise în această figură sunt foarte
informative, datorită variaţiei dintre alele.
O familie de minisateliţi a fost determinată în genomul uman ca prezentând o secvenţă
‘core’ comună. Secvenţa ‘core’ este o secvenţă bogată într-o secvenţă de 10- 15 pb bogată în G-
C, cu o asimetrie a distribuţiei prinelor/pirimidinelor pe cele două catene. Fiecare minisatelit
individual conţine o variantă a secvenţei ‘core’, dar ~ 1000 minisateliţi pot fi detectaţi pe Southern
blot cu ajutorul unei sonde care constă în secvenţa ‘core’.
Să considerăm că situaţia prezentată în figură trebuie multiplicată cu 1000x. Efectul
variaţiei la nivelul locilor individuali este de a crea un profil unic pentru fiecare individ. Aceasta
face posibilă desemnarea fără ambiguitate a eredităţii dintre părinţi şi progenitură, arătând că 50%
dintre benzile oricărui individ sunt derivate de la un anumit părinte. Acestea stau la baza tehnicii
numite ‘ADN fingerprinting’
Sumar
ADN satelit constă din secvenţe foarte scurte repetate de mai multe ori în tandem.
Proprietăţile distincte manifestate la centrifugare reflectă compoziţia în baze. ADN satelit este
concentrat în heterocromatină, dar funcţia sa este necunoscută. Unităţile repetitive individuale din
sateliţii artropodelor sunt identice. Cele ale sateliţilor de la mamifere sunt corelate, şi pot fi
organizate într-o anumită ierarhie care reflectă evoluţia satelitului prin amplificarea şi divergenţa
secvenţelor alese la întâmplare. Crossing-overul inegal pare să fie un determinant major în
organizarea ADN satelit. Fixarea crossing-over explică capacitatea variaţiilor de a se întinde într-
un cluster. Minisateliţii au proprietăţi similare sateliţilor, dar sunt mult mai mici; ei sunt foarte utili
pentru cartarea genomică.
SLIDE 19. Imagini “fingerprint” ADN uman Sondele de minisateliți ADN pot fi folosite
pentru evidențierea fragmentelor unice de restricție (DNA fingerprints) care pot identifica
indivizi diferiți. Probe ADN de la 3 indivizi (1, 2 si 3) au fost supuse analizei Southern blot
folosind enzima de restricție Hinf1 și trei minisateliți marcați diferit ca sonde (liniile a, b si c).
ADN de la fiecare individ produce un profil de benzi unice pentru fiecare individ. Condițiile de
electroforeză pot fi ajustate astfel încât pentru fiecare persoană să se evidențieze cel puțin 50 de
benzi cu această enzimă de restricție. Lipsa de identitate între cele 3 probe poate fi ușor
diferențiată. [From A. J. Jeffreys et al., 1985, Nature 316:76; courtesy of A. J. Jeffreys.]
SLIDE 20. Mari familii de repetiţii dispersate în genomul mamiferelor
Analiza clasică a profilelor de dispersie demonstrează că genomul uman şi genoamelor
altor de mamifere posedă profile de dispersie apropiate. Aceste concluzii sunt confirmate de
detaliile moleculare furnizate prin analiză de restricţie şi prin
77
clonare şi secvenţializare. Cu toate că există diferite familii şi sub-familii de repetiţii dispersate,
un număr mic dintre acestea prezintă un număr foarte mare de copii şi domină genoamele. O
familie dominantă poate reprezenta mai mult de 5% din ADN total, iar totalitatea familiilor pot
reprezenta 20% din acesta. Anumite familii sunt constituite din secvenţe de 100 la 500 pb şi sunt
denumite ‘secvenţe SINEs’ (‘Short Interspersed Repeats). Altele, ale căror membri pot avea 6 kpb
şi mai mult, sunt denumite LINES (Long Interspersed Repeats). Alte organisme cum sunt
miomicetele, lăcustele, echinodermele, peştii şi amfibienii conţin repetiţii dispersate care se
aseamănă cu SINEs de la mamifere. La plante şi la nevertebrate există secvenţe comparabile cu
LINEs de la mamifere.
SINEs Secvenţele scurte, foarte repetitive şi dispersate de la mamifere au fost încă de la început
adunate sub denumirea SINEs pur şi simplu pe baza lungimii şi abundenţei lor. O proprietate
comună mai semnificativă a fost descoperită recent. SINEs par să fie pseudogene mature derivate
din genele din clasa III care codifică pentru mici molecule de ARN citoplasmatic, printre care şi
moleculele de ARNt şi cele pentru ARN 7SL. Deci, SINEs sunt omologe cu secvenţele acestor
ARN (sau ale genelor lor). SINEs sunt adesea flancate de repetiţii directe care sunt duplicate ale
secvenţelor ţintă inserate şi posedă secvenţe 3’ terminale bogate în A.
Fiecare specie (sau fiecare ordin) posedă ‘un joc’ caracteristic de familii de secvenţe
SINEs. Pentru a ilustra complexitatea şi diversitatea acestor secvenţe vom da câteva exemple. Una
dintre familiile SINEs cele mai bine studiate este familia ALU de la primatele lumii vechi,
denumită aşa datorită prezenţei în această secvenţă a unui situs de restricţie Alu I. Unităţile Alu se
găsesc în regiuni care flanchează genele, în introni, în ADN satelit şi grupate cu alte secvenţe
repetitive dispersate. Pentru o anumită specie determinată, secvenţele Alu diverg una de alta cu
aproximativ 15% : Când primatele lumii vechi sunt comparate între ele, secvenţele membrilor
familiei Alu variază la fel ca în interiorul unei singure specii.
Secvenţele Alu tipice primatelor sunt dimere, compuse din două secvenţe de aproximativ
130 pb. Cei doi monomeri repetitivi nu sunt identici iar diferenţa cea mai marcantă este prezenţa
unui segment suplimentar de 31 pb în cea de a doua unitate. Fiecare monomer se termină, în poziţia
3’ a catenei superioare, cu o serie de resturi A de lungime variabilă. Monomerii Alu conţin secvenţe
omologe cu regiuni 5’ şi 3’ ale moleculelor ARN 7SL; cele 155 pb centrale ale ARN 7SL sunt
absente în secvenţele Alu.
Primele secvenţe din familia Alu au fost izolate şi clonate plecând de la ADN uman. A fost
stabilită o secvenţă consens. Membrii clonaţi din familia Alu au fost apoi folosiţi ca sonde pentru
a determina numărul de copii folosind metoda de analiză a cineticii de reasociere. Rezultatele
indică prezenţa a aproximativ 9 x 105 copii par genom haploid (aproximativ 9% din totalul ADN
de la om). În medie, o secvenţă Alu este prezentă la fiecare 5 kpb în genomul uman şi în cel al
altor primate ale Lumii vechi. Mai mult de 90% dintre fagii prezenţi într-o bancă genomică umană
tipică se hibridizează cu o sondă Alu, şi cea mai mare parte a segmentelor de 15 -20 pb clonate
conţin mai mult de un membru al acestei familii. Secvenţele Alu vecine pot avea orientări opuse.
Acestea pot fi incluse în fracţia de ‘ADN genomic pliat’. De exemplu, cinci din opt secvenţe Alu
prezente într-un fragment de 65 kpb de ADN uman care conţine familia multigenică a β-globinei
sunt orientate în direcţia ‘sens’ şi trei în direcţia ‘antisens’.
Dacă considerăm că nu există decât trei gene funcţionale care codifică pentru ARN 7SL
în ADN uman, caracterul ubicuitar al secvenţelor Alu este remarcabilă. În
78
plus, apariţia acestor secvenţe Alu la primate trebuie să se fi produs după divergenţa majoră a
ordinelor mamiferelor în cursul evoluţiei. Această afirmaţie este susţinută şi de faptul că familia
SINE la rozătoare care este omologă cu genele pentru ARN 7SL, este net diferită de familiile Alu
de la primate. Cele 105 copii ale familiei de tip I de la răzătoare au aproximativ 130 pb, adică sunt
echivalentul unuia dintre cei doi monomeri repetitivi direcţi tipici familiei Alu de la primate. Alte
secvenţe SINES de la rozătoare, cum sunt familiile de tip II şi ID sunt omologe cu diferite gene
pentru ARNt.
Omologia dintre membrii familiei SINE şi genele din clasa III cu care acestea sunt înrudite
includ elemente promotoare interne, cum sunt cutiile A şi B, unităţile SINEs conţinute în segmente
de ADN clonate fiind adesea transcrise in vitro de către ARN polimeraza III. Transcripţia începe
foarte precis la extremitatea 5’ a unităţii şi se termină la nivelul primului grup care conţine patru
resturi A sau mai multe de pe catena considerată matrice. Totuşi, în ciuda faptului că unităţile
SINE pot fi transcrise efectiv in vitro, cea mai mare parte dintre ele nu sunt matriţe active pentru
ARN polimerază III in vivo. Modelele cele mai interesante care au fost propuse pentru a explica
modul de amplificare a secvenţelor SINEs şi inserarea lor în ADN fac apel la intervenţia unui
proces de transcripţie inversă realizat de către ARN polimeraza III.
Secvenţele SINE sunt transcrise şi de către ARN polimeraza II. Este cazul SINE prezente
în introni, la nivelul secvenţei ‘5’ leader sau a cozii ’3’ a unei unităţi de transcripţie din clasa II
ne-înrudită. Din această cauză, moleculele de ARNhn conţin numeroşi transcripţi ai secvenţelor
SINE repartizaţi printre alte secvenţe. În urma maturării unui transcript primar în ARNm, secvenţa
SINE este în general eliminată astfel încât ARN citoplasmatic conţine de două ori mai puţine
secvenţe SINE decât ARN nuclear.
LINEs Pe lângă multiplele familii SINEs, genoamele mamiferelor posedă toate o abundentă
familie LINEs, familia LINE-1, ale cărei membri pot avea 6 la 7 kpb. Alte familii LINE există în
unele dintre aceste genoame dar ele nu sunt la fel de frecvente. Familiile LINE-1 de la diferite
mamifere sunt toate înrudite dar divergente: cu cât speciile sunt mai înrudite cu atât familiile sunt
mai similare. Mai mulţi membri ai familiei LINE-1au mai puţin de 6 la 7 kpb. Astfel de
segmente trunchiate sunt în general deposedate de secvenţele situate la extremitatea 5’. Adesea,
secvenţa internă lipseşte (secvenţele reprezintă o deleţie în raport cu membrii mai lungi ai
familiei). În plus, toţi membri familiei nu sunt colineari. La unii dintre aceştia, există regiuni
inversate sau rearanjate unele în raport cu altele. Există mult mai mulţi membri trunchiaţi decât
membri cu lungime normală în genoamele de şoarece şi de la primate. În consecinţă, numărul de
copii par genom ale sub-regiunilor secvenţelor lungi LINE- 1 variază, şi creşte de la extremitatea
stângă la extremitatea dreaptă. De exemplu, la om există aproximativ 3,5 x 103 copii de secvenţe
la extremitatea stângă şi aproximativ 105 copii de secvenţe la extremitatea dreaptă.
Secvenţele LINE-1 sunt prezente în regiunile flancante ale genelor, în introni şi inserate în
repetiţiile ADN satelit. Analiza membrilor familiei LINE-1 pe segmente genomice clonate, ca şi
hibridizarea in situ a sondelor LINE-1 cu cromozomi întregi, demonstrează că secvenţele LINE
sunt dispersate în numeroase situsuri cromozomice. Nu se ştie dacă dispersia este aleatoare sau nu.
Anumite situsuri pot conţine grupe de LINE-1. De exemplu, există un număr surprinzător de
membri ai familiei într-un segment de 65 kpb de ADN uman care conţine genele β-globinei.
79
 Asemeni secvenţelor SINE, unităţile LINE-1 sunt adesea înconjurate de repetiţii directe
scurte care par să fie duplicări ale situsurilor ţintă, şi ele posedă un segment 3’ terminal bogat în
A. Totuşi, contrar SINE, unităţile LINE-1 nu par să fie versiuni pseudo-genice ale unor gene
ordinare. Unele din unităţile cele mai lungi ale LINE-1 pot fi mai degrabă elemente mobile care
au fost amplificate şi transpozate într-un situs nou în genom printr-un mecanism care implică
transcripţia într-un ARN intermediar, apoi transcripţia inversă în ADN. Transcriptaza inversă
poate fi codificată de o regiune de aproximativ 4 kpb a unităţii LINE-1, o porţiune care este relativ
bine conservată printre speciile de mamifere şi care conţine un cadru de lectură lung la nivelul
celor două catene. Unităţile LINE-1 trunchiate şi rearanjate ar putea proveni din transcripţi sau din
transcripţi inverşi aberanţi sau incompleţi, sau în urma unor evenimente aleatoare de recombinare
care însoţesc inserarea.
Secvenţele familiei LINE-1 sunt transcrise în momentul în care ARN polimeraza II citeşte
regiunea ne-codantă a unei gene, în care un membru al familiei este inserat. În consecinţă, molecule
omologe de ARN cu fiecare catenă a secvenţelor LINE-1 sunt relativ abundente în ARNhn. Nu au
fost detectaţi transcripţi în ARN citoplasmatic poliadenilat decât în linii celulare de teratocarcinom
uman sau de limfocite de şoarece care conţin transcripţi compleţi ai catenei purtătoare de fază
deschisă de lectură. Nu a fost identificată nici o proteină codificată de acest ARN.
SLIDE 21. Organizarea diferitelor gene pentru ARNr Genele pentru ARNr
conţin o unitate repetitivă în tandem
În majoritatea cazurilor discutate, există diferenţe între membrii individuali ai unui cluster
de gene care permit presiunii selective să acţioneze independent asupra fiecărei gene. O situaţie
inseră este furnizată de două cazuri de clustere mari de gene care conţin multe copii identice ale
aceleiaşi sau aceloraşi gene. O astfel de situaţie ridică câteva întrebări interesante asupra evoluţiei.
Majoritatea organismelor conţin mai multe copii ale genelor care codifică pentru proteinele
histonice care sunt componente majore ale cromozomilor; există puţine organisme care nu conţin
copii multiple ale genelor care codifică pentru ARN ribozomal.
ARN ribozomal este indiscutabil produsul predominant al transcripţiei, constituind 80-90%
din masa totală de ARN celular atât la procariote cât şi la eucariote. Există mai multe molecule de
ARNt, dar cu siguranţă că acestea sunt mai mici decât ARNs ribozomal. Atât ARNr cât şi ARNt
sunt reprezentaţi de către gene multiple.
Numărul genelor pentru ARNr major variază de la 7 la E. coli, la 100-200 pentru
eucariotele inferioare, la mai multe sute în cazul eucariotelor superioare. Aproape în toate cazurile,
genele pentru moleculele de ARNr ale subunităţii mari şi a celei mici formează un tandem (singura
excepţie a fost evidenţiată la mitocondriile de la drojdii).
La bacterii şi la unele eucariote inferioare, genele pentru ARN 5S fac parte din aceeaşi
unitate, astfel încât numărul total al genelor 5S este acelaşi cu numărul genelor pentru ARNs
ribozomal major; la eucariote, acesta este transcris independent. La eucariotele superioare, genele
pentru ARNr 5S sunt organizate separat în propriul lor cluster, numărul lor depăşind pe cel al
genelor pentru ARNr major.
 Numărul exact al genelor pentru ARNt este dificil de determinat, deoarece structura
secundară extinsă a moleculei creează dificultăţi tehnice reacţiilor de hibridizare. Probabil că
numărul actual este sub-estimat.
Lipsa oricărei variaţii detectabile în secvenţele moleculelor ARNr implică identitatea
tuturor copiilor fiecărei gene, sau existenţa unor diferenţe care să se
80
manifeste sub pragul de detecţie pentru ARNr (~1%). Un punct de interes major este acela privind
mecanismele care sunt utilizate pentru a împiedica variaţiile care ar putea să apară la nivelul
secvenţelor individuale.
La bacterii, perechile de gene multiple ARNr 16S-23S sunt dispersate. În majoritatea
nucleilor de la eucariote, genele pentru ARNr sunt conţinute într-un cluster sau clustere în tandem.
Adesea aceste regiuni sunt numite ADNr (În unele cazuri, proporţia de ADNr din ADN total,
împreună cu compoziţia sa atipică în baze este destul de mare pentru a permite separarea directă a
fracţiilor). O trăsătură a clusterului în tandem este că acesta generează o hartă de restricţie
circulară.
Presupunem că fiecare unitate repetitivă are 3 situsuri de restricţie. Fragmentele A şi B sunt
în întregime conţinute într-o unitate repetitivă, şi fragmentul C conţine capătul unei unităţi
repetitive şi începutul următoarei. Când cartografiem aceste fragmente prin metode convenţionale,
găsim că A îi urmează lui B, B îi urmează lui C, care îi urmează lui A, generând o hartă circulară.
Dacă clusterul este mare, fragmentele interne (A, B, C) vor fi prezente în cantităţi mult mai mari
decât fragmentele terminale (X, Y) care conectează clusterul la regiunea de ADN adiacentă. Într-
un cluster cu 100 de repetiţii, X şi Y vor fi prezente la un nivel de 1% din nivelul lui A, B, C. Acest
lucru face dificilă obţinerea capetelor unui cluster de gene în scopul construirii unei hărţi.
Regiunea nucleului unde are loc sinteza ARNr prezintă o caracteristică aparte; este o
regiune ‘core’ (miez) de natură fibrilară înconjurată de un cortex granular. Miezul fibrilar
reprezintă regiunea în care ARNr este transcris de pe matriţa ADN; cortexul granular este format
din ribonucleoparticulele în care este asamblat ARNr. Întreaga suprafaţă este numită nucleol.
Regiunile particulare ale cromozomului asociate nucleolului se numesc organizatori
nucleolari. Fiecare organizator nucleolar corespunde unui cluster de gene ARNr repetitive în
tandem situate pe un cromozom. Nucleolii au o morfologie caracteristică datorită concentraţiei
mari a genelor repetitive în tandem şi a intensităţii lor de transcriere.
Perechea de sARNr este transcrisă ca un singur precursor atât la bacterii cât şi în nucleii
eucariotelor. După transcripţie, precursorul este clivat pentru a elibera moleculele individuale de
ARNr. Transcriptul începe la capătul 5’ ‘leader’, este urmat de secvenţa pentru ARNr mic, apoi
de o regiune numită ‘transcribed spacer’ (‘spacer transcris’), şi în final de secvenţa moleculei de
ARNr mare care este orientată către capătul 3’ al moleculei. (‘Spacerul transcris’ nu trebuie
confundat cu ‘nontranscribed spacer’ care separă unităţile de transcripţie. Numele său reflectă
faptul că acesta este parte a unităţii de transcripţie, dar nu este reprezentat în produşii maturi ARN).
Unitatea de transcripţie este mai lungă decât lungimea totală a moleculelor de sARNr. În
tabelul sunt prezentate câteva exemple ale relaţiei dintre transcriptul primar şi moleculele de
sARNr.
Unitatea transcripţională este mai scurtă la bacterii, unde secvenţele ARNr constituie 80%
din lungimea totală de 6 kb. Nu se observă nici o caracteristică sistematică la nivelul eucariotelor
la care lungimea transcriptului variază de la 7 la 8 kb, 70-80% din secvenţă reprezentând sARNr.
Precursorul este mai lung la mamifere (unde este cunoscut ca ARN 45S, în funcţie de viteza de
sedimentare). Aici secvenţele ARNr matur ocupă numai un pic mai mult de 50% din transcriptul
complet.
Ce se întâmplă cu regiunile ne-ribozomale ale precursorului ARN ? *leaderul’ şi regiunile
‘spacer’ transcrise sunt înlăturate în timpul maturării ARNr. ‘Spacerul’ transcris conţine câteva
secvenţe scurte care sunt eliberate prin clivare. La mamifere
81
şi amfibieni, o secvenţă scurtă formează ARN 5,8S, o secvenţă scurtă care se leagă în ribozom,
prin legături de hidrogen, cu ARNr 28S. La bacterii, secvenţele ARNt sunt localizate în spacerul
transcris şi (adesea) de asemenea la capătul 3’ al transcriptului primar. Restul ‘spacerului transcris,
şi toate secvenţele ‘leader’ sunt probabil degradate în nucleotide.
Clusterul ADNr conţine multe unităţi de transcripţie, fiecare separată de următoarea printr-
un ‘spacer’ ne-transcris. Alternanţa unităţilor de transcripţie şi a spacerului (separatorului) ne-
transcris se poate observa direct la microscopul electronic. În cazul tritonului N. viridescens fiecare
unitate de transcripţie este intens exprimată, astfel încât mai multe ARN polimaraze sunt angajate
simultan în transcripţia unei unităţi repetitive. Polimerazele sunt atât de aproape localizate încât
alungire produşilor lor formează o matriţă caracteristică care se deplasează de-a lungul unităţii de
transcripţie. Separatorul netranscris variază destul de mult ca lungime (uneori) chiar în interiorul
aceleiaşi specii.
La drojdii există un separator netranscris scurt, relativ constant ca lungime. La D.
melanogaster, există variaţii mari ale lungimii separatorului netranscris prezent între diferite copii
ale unităţii repetitive. O situaţie similară este caracteristică X. laevis. În fiecare dintre aceste cazuri,
toate unităţile repetitive sunt prezente sub forma unui singur cluster în tandem poziţionat pe un
anumit cromozom (în cazul D. melanogaster acesta este cromozomul sexual. Clusterul de pe
cromozomul X este mai mare decât cel de pe cromozomul Y, astfel încât femelele posedă mai
multe copii ale genelor ARNr decât masculii).
La mamifere unitatea repetitivă este foarte mare, cuprinzând unitatea de transcripţie de ~
15 kb şi un separator netranscris de ~ 30 kb. În mod normal, genele sunt localizate în mai multe
clustere dispersate-în cazul omului şi a şoarecelui este vorba de cinci şi şase cromozomi.
O întrebare interesantă: cum reuşesc mecanismele de corecţie, care se presupune că
funcţionează în interiorul unui singur cluster pentru a asigura o secvenţă ARN constantă, să se
manifeste şi în cazul existenţei mai multor clustere ?
Variaţiile lungimii separatorului netranscris într-un singur cluster contrastează cu ideea
conservării unei unităţi de transcripţie. În ciuda acestei variaţii, secvenţele separatorilor
netranscrişi mai lungi rămân omologe cu cele ale separatorilor netranscrişi mai scurţi. Aceasta
implică că fiecare separator ne-transcris prezintă repetiţii interne, astfel încât variaţiile de lungime
sunt rezultatul modificărilor numărului de repetiţii ale unora dintre subunităţi.
Natura generală a separatorului ne-transcris este ilustrată cu ajutorul exemplului de la X.
laevis. Regiunile care sunt fixe ca lungime alternează cu regiunile care variază. Fiecare dintre cele
trei regiuni repetitive cuprind un nunăr variabil de repetiţii ale unei secvenţe scurte. Un tip de
regiune repetitivă este cea care conţine unităţi repetitive de 97 pb; cealaltă care are două localizări,
are o unitate repetitivă în două forme (din două componente), de 60 pb şi respectiv 81 pb. Variaţia
numărului de unităţi repetitive la nivelul regiunilor repetitive influenţează variaţia lungimii totale
a separatorului.
Una dintre regiunile fixe (de la începutul unităţii) este unică ca lungime şi secvenţă.
Celelalte sunt secvenţe scurte constante numite insule Bam. (Această regiune are acest nume
datorită enzimei de restricţie cu ajutorul căreia a fost izolată). Din acest tip de organizare, se poate
observa evoluţia clusterului prin duplicări în care a fost implicată regiunea promotor.
Separatorul ne-transcris are rol în transcripţie. Repetiţiile 60/81 pb au rol de iniţiere,
probabil comparabil cu rolul pe care activatorii îl au pentru genele transcrise
82
de către ARN polimeraza II. Prezenţa unui separator creşte frecvenţa de iniţiere, aparent prin faptul
că determină mai multe ARN polimeraze I să se lege succesiv la promotor. Nu putem încă înţelege
natura exactă a acestei relaţii, şi cât de mult depinde ea de similitudinile de secvenţă dintre
separator ţi promotor.
SLIDE 22. Organizarea clusterului genelor histonelor la diferite organisme Genele pentru
histone: conservarea secvenţei codante şi divergenţă la nivelul organizării genei
Proprietăţile generale ale genelor pentru histone Structurile primare ale histonelor sunt bine
conservate, chiar şi la eucariote foarte diferite. Acest lucru nu este surprinzător, dat fiind rolul
fundamental şi comun pe care histonele îl au în strutura cromatinei. Totuşi, histonele variază.
Secvenţele histonelor H1 sunt cele care posedă cel mai mare grad de divergenţă, cele ale H3 şi
H4 fiind cele mai puţin divergente. Pentru o anumită specie, în diferite etape de dezvoltare sau
ale ciclului celular sau în ţesuturi diferite pot fi sintetizate molecule de histone uşor diferite. De
exemplu, expresia majorităţii genelor pentru histone în faza S a ciclului celular şi deci în timpul
replicării. Alte gene, numite gene de înlocuire, se exprimă într-o proporţie redusă în timpul
întregului ciclu celular. În contrast cu conservarea secvenţelor polipeptidice, numărul de
aranjamente ale genelor pentru histone diferă considerabil între specii. Aceasta subliniază, cum o
face de altfel şi organizărea genelor pentru ARNt, că păstrarea (conservarea) secvenţelor codante
nu presupune neapărat conservarea numărului de copii sau a organizării genomice.
Genele diferitelor familii de histone au tendinţa de a fi legate (unitate de linkage) dar
contrar genelor pentru ARNr, unde trei gene sunt prezente într-o singură unitate de transcripţie,
fiecare genă pentru histone este transcrisă ca o unitate separată, adesea chiar de pe o catena opusă.
O altă diferenţă faţă de genele pentru ARNr este că ordinea genelor pentru histone nu este neapărat
aceeaşi de la o specie la alta şi nici chiar în aceeaşi specie. În plus, cu toate că genele ‘legate’
pentru histone sunt repetitive în anumite organisme, ele sunt dispersate la păsări şi mamifere. Cea
mai mare parte a genelor pentru histonele de tip replicativ (care sunt exprimate în faza replicării
ADN) sunt lipsite de introni iar moleculele de ARNm nu posedă coadă poliA.
Pentru obţinerea de informaţii privind organizarea genelor pentru histone înainte de apariţia
tehnicilor ADN recombinat au fost folosite două abordări experimentale. În primul rând, separarea
genelor pentru histone la nivelul benzilor sateliţilor după centrifugarea ADN total în gradient de
densitate a dus la evidenţierii numărului de copii şi a organizării în tandem la ariciul de mare. Apoi
a fost posibilă purificarea parţială a ARNmpentru histone pornind de la o sursă îmbogăţită.
Clonarea genelor pentru histone În primele zece ore după fecundare, ouălele de arici de mare se
divid de 2x109 la 2x1010 ori. Aceste diviziuni celulare sunt însoţite de o replicare rapidă a ADN
şi de o sinteză importantă de histone. În timpul acestei perioade, 30% dintre proteinele sintetizate
sunt proteine nucleare iar moleculele de ARNm care codifică pentru histone sunt foarte
abundente. Mărimea lor caracteristică face ca acestea să se concentreze în fracţia de ARNm care
sedimentează la 9S. Prin electroforeză în gel de poliacrilamidă se pot separa moleculele de
ARNm pentru histonele individuale care pot fi apoi identificate prin traducere in vitro.
Moleculele de ARNm de arici de mare au putut fi astfel folosite drept sonde pentru clonarea
genelor de histone de la plante, ciuperci şi animale.
83
 La ariciul de mare genele pentru histone sunt un grup particular de gene care asigură sinteza
rapidă a histonelor în timpul stadiilor embrionare foarte precoce. După formarea stadiului de
blastulă, are loc stimularea unui alt grup de gene care este responsabil de sinteza histonelor în
timpul următoarei perioade de dezvoltare şi la organismul adult. Aceste două grupe sunt denumite
ca grupul de ‘gene precoce’ şi grupul de ‘gene tardive’ de la ariciul de mare. Organizarea lor
variază de la o specie de arici de mare la alta. În continuare vom exemplifica cu situaţia genelor
de la Strongylocentrotus purpuratus.
Segmentele genomice care conţin genele histonelor precoce au fost clonate plecând de la
o bancă de fragmente de ADN obţinute prin digestie cu EcoRI şi folosind drept sondă ARNm total
de histone. Au fost obţinute două fragmente care nu se hibridizează între ele Totuşi, prin
cartografie genomică s-a constat că aceste două fragmente sunt ‘legate’ (linkate) într-un interval
de 7 kb în genom. Prezenţa şi ordinea celor cinci gene pentru histone în cele două clone, a fost
stabilită prin hibridizarea ADN cu ARNm separat prin electroforeză. Heteroduplexurile formate
au fost analizate prin microscopie electronică.
De asemenea, fiecare moleculă de ARNm a fost testată prin hibridizare cu catenele separate
ale segmentelor clonate; moleculele de ARNm se hibridizează toate pe aceeaşi fibră, ceea ce
demonstrează că cele cinci gene sunt transcrise în acelaşi sens. În continuare, analiza secvenţei
nucleotidice a confirmat toate concluziile şi a stabilit mărimea exactă a regiunilor codante şi a
separatorilor dintre acestea. Cele câteva sute de exemplare ‘linkate’ de gene pentru histone precoce
sunt formează lungi alinieri în tandem. Aranjamente comparabile se regăsesc la mai multe specii
de arici de mare.
Genele histonelor ‘tardive’ nu sunt repetate decât de aproximativ 10 ori, situaţia fiind
diferită de cea a genelor precoce. În afară de numărul lor redus de copii, genele ‘tardive’ se
diferenţiază de cele ‘precoce’ din multe ale puncte de vedere. În primul rând, ele nu sunt ‘linkate’
în grupe de cinci şi nici organizate în repetiţii în tandem. Anumite gene sunt vecine (de exemplu,
H3 şi H4) situate la 1 kb una de alta, în timp ce altele sunt mult mai ‘izolate’, separate prin cel
puţin 6 kb de orice alte gene pentru histone. Nici ordinea genelor, nici sensul de transcriere al
acestora nu sunt corelate cu aranjamentul genelor precoce echivalente. În plus, organizarea genelor
‘tardive’ este variabilă de la o specie la alta de arici de mare.
Genele histonelor ‘precoce’ şi ‘tardive’ clonate corespunzătoare nu se hibridizează între
ele în condiţii stricte de hibridizare cu toate că produşii genelor au structuri foarte asemănătoare
(uneori chiar identice). Diferenţele dintre secvenţele codante reflectă folosirea unor codoni diferiţi
pentru acelaşi aminoacid. Secvenţele care flanchează genele ‘precoce’ şi ‘tardive’ corespunzătoare
sunt şi mai divergente, cu excepţia secvenţelor nucleotidice esenţiale necesare transcrierii de către
ARN polimeraza II.
Genele pentru histone la alte specii. La Drosophila, hibridizarea in situ a genelor clonate
cu cromozomii politeni, a permis localizarea tuturor genelor pentru histone într-o regiune a
cromozomului 2. Cele 5 gene sunt ‘legate’ în cadrul uneu unităţi repetitive de aproximativ 100 de
ori; ordinea şi sensul de transcripţie a genelor sunt total diferite de cele ale genelor de la ariciul de
mare. Trecerea de la o sinteză ridicată de histone la cantităţi scăzute în timpul embriogenezei la
Drosophila nu se bazează aparent pe expresia unor gene difeite, ca la arici, ci este rezultatul
modulării expresiei aceluiaşi grup de gene.
ADN de la drojdii (S. cerevisiae) conţine două copii ale unui segment care conţine o genă
pentru H2A şi o genă pentru H2B, şi două copii ale unui alt segment
84
care conţine o genă pentru H3 şi una pentru H4. Genele omologe în perechile de segmente pot
codifica pentru proteine puţin diferite (de ex pentru H2A) sau identice (ex. H3). Nu se ştie dacă
aceste variaţii prezintă semnificaţie funcţională.
Ca şi la nevertebrate, vertebratele prezintă o diversitate foarte mare a organizării genelor
pentru histone. La Xenopus, există mai multe grupe de gene ’legate’ pentru cele cinci histone, dar
genele sunt ordonate diferit, Două dintre grupe se disting prin variaţii ale genei H1. Fiecare dintre
aceste gene H1 se hibridizează cu molecule ARNm diferite din ovocit, şi cei doi mesageri produc,
prin traducere in vitro, proteine H1 diferite. De asemenea, genomul de Xenopus conţine mai multe
aliniamente în tandem ale grupelor de gene pentru histone, dar contrar genelor precoge pentru
histone de la arici, grupele vecine din interiorul aceleiaşi alinieriprezintă polimorfism de restricţie.
Localizarea celor aproximativ 700 de gene pentru histone de la Triton demonstrează că
poziţia genelor are importanţă scăzută pentru anumite aspecte ale expresiei acestora. Segmentele
de ADN care conţin genele celor cinci histone au o lungime de 9 kpb şi fiecare este situat într-o
lungă serie de repetiţii în tandem ale unei secvenţe ne-înrudite situată pe acelaşi braţ al
cromozomului. Se pot observa între 50 la 100 kpb din această secvenţă repetitivă în tandem între
fiecare grupă de gene pentru histone. Aceeaşi secvenţă repetitivă în tandem apare şi la nivelul
centromerilor.
Animalele cu sânge cald au relativ puţine gene pentru histone. Acestea nu sunt nici grupate
sistematic şi nici repetate în tandem, dar se pot evidenţia adesea gene vecine
SLIDE 23. Două mecanisme posibile pentru menţinerea omogenităţii unei
familii multigenice în tandem O dilemă evolutivă: Cum pot fi menţinute mai
multe copii active
Aceeaşi problemă se pune şi atunci când gena a fost duplicată. Cum poate selecţia să
prevină acumularea de mutaţii modificatoare?
Duplicarea unei gene are ca rezultat o relaxare imediată a presiunii evolutive asupra
secvenţei sale. Acum există două copii identice, modificarea secvenţei uneia nu va lipsi organismul
de o proteină funcţională, atâta timp cât secvenţa originală în aminoacizi continuă să fie codificată
de o altă copie. Astfel presiunea selectivă asupra celor două gene este difuzată, până când una
dintre ele achiziţionează un număr suficient de mutaţii şi se îndepărtează destul de mult de funcţia
sa originală încât toată presiunea selectivă să se reflecte asupra celeilalte.
Imediat după o duplicare genică, modificările se pot acumula mult mai rapid într-una din
copii, conducând eventual la o funcţie nouă (sau la modificarea genei sub forma unei pseudogene).
Dacă se dezvoltă o nouă funcţie, gena va evolua cu aceiaşi viteză scăzută ca şi funcţia sa originală.
Probabil acesta este tipul de mecanism responsabil de separarea funcţiilor genelor embrionare şi
adulte ale globinei.
Există şi situaţii în care genele duplicate rămân cu aceeaşi funcţie, codificând pentru
proteine identice sau aproape identice. Genele α-globinei umane codifică proteine identice, iar
între cele două proteine şi γ-globină există numai un singur aminoacid diferit. Cum se exercită
presiunea selectivă pentru a menţine secvenţe identice?
Au fost propuse două tipuri generale de mecanisme. Ele se bazează pe principiul că genele
nealelice nu sunt moştenite independent, dar trebuie regenerate continuu după una dintre copiile
generaţiei anterioare. În cazul cel mai simplu a două
85
gene identice, când o mutaţie apare în una dintre copii, fie este eliminată din întâmplare (deoarece
secvenţa altor copii este eliminată), fie aceasta este extinsă la cele două replici (gene duplicate)
(deoarece copia mutantă devine versiunea dominantă). Această extindere expune mutaţia selecţiei.
Rezultatul este că cele două gene evoluează împreună. Acest fenomen se numeşte evoluţie
concertată (coincidentă) (coevoluţie ocazională). Ea este aplicabilă unei perechi de gene identice
sau unui cluster care conţine multe gene.
Unul dintre mecanisme presupune că secvenţele genelor ne-alelice sunt comparate direct
una cu cealaltă şi omogenizate de enzime care recunosc orice diferenţă. Acest lucru poate fi realizat
prin schimbarea monocatenelor între ele, pentru a forma gene ale căror catene derivă dintr-o copie
şi cealată dintr-o altă copie. Orice diferenţă care apare între secvenţe şi care determină o
împerechere necorespunzătoare, poate atrage atenţia unor enzime capabile să înlăture şi să
înlocuiască o bază, astfel încât numai împerecherile A-T şi G-C să fie viabile. Acest tip de
eveniment este numit conversie genică şi este asociat cu procesele de recombinare genetică.
Apare necesitatea certificări (stabilirii) scopului unor astfel de evenimente prin compararea
secvenţelor genelor duplicate. Dacă ele sunt subiectul unei evoluţii concertate, nu trebuie să
constatăm acumularea unor substituţii la nivelul situsurilor silenţioase ale acestora (deoarece
procesul de omogenizare se aplică şi acestora la fel de bine caşi în cazul situsurilor de substituţie).
Se ştie că extinderea mecanismului de menţinere nu se extinde dincolo de gena însăşi, astfel încât
cazuri de gene duplicate ale căror secvenţe flancante sunt total diferite. Întradevăr, se poate
constata existenţa unoe catene ‘abrupte’ care marchează capetele secvenţelor care au fost
omogenizate.
Trebuie să ne reamintim că existenţa unui astfel de mecanism poate invalida povestea
(determinarea) istoriei unor astfel de gene prin intermediul divergenţei lor, deoarece divergenţa
reflectă numai timpul de la ultimul eveniment de omogenizare/regenerare, şi nu duplicarea
originală.
Când există mai multe copii ale genei, efectele imediate al mutaţiei pentru orice copie
trebuie să fie foarte uşoare. De exemplu, în cazul clusterului ADNr, există sute de copii de gene,
aproape toate identice. Consecinţele unei mutaţii individuale sunt diluate de numărul mare de copii
ale genei care păstrează secvenţa sălbatică. Aceasta sugerează că o proporţie apreciabilă de copii
muante se pot acumula înainte ca efectul să devină destul de puternic pentru a fi eliminate de către
evoluţie.
Letalitatea devine cantitativă, concluzie susţinută de observaţia că se poate realiza
înlăturarea a jumătate dintre unităţile clusterului ADNr de la X. laevis şi D. melanogaster fără nici
un efect. Deci cum se realizează prevenirea acumulării unor mutaţii modificatoare? Ce şansă au
mutaţiile favorabile să îşi demonstreze avantajele în cadrul unui cluster?
Concluzia inevitabilă este că anumite mecanisme trebuie să permită anumitor variante să
fie analizate de către evoluţie (să fie cântărite în procesul evolutiv). Şi în acest caz au fost propuse
două tipuri de mecanisme.
 Modelul corectării neaşteptate (sudden corection) presupune că destul de frecvent un
cluster de gene este înlocuit de un nou set de copii derivat din una sau din mai multe copii prezente
în generaţia anterioară. Pentru a se putea realiza (impune) o forţă selectivă, ‘destul de frecvent
(‘every so often’) trebuie să fie de câteva generaţii (trebuie să reprezinte câteva generaţii); dar în
termeni practici, orice mecanism trebuie să fie structurat pe baze periodice regulate, ceea ce
înseamnă la fiecare generaţie.
Numărul mic de copii care dau naştere unui nou cluster formează un set ‘master’ asupra
căruia acţionează selecţia; copiile înlăturate sunt irelevante pentru
86
selecţie. Copiile ‘master’ pot constitui un set particular care poate fi ales la întâmplare. Mecanismul
se poate presupune că este asemănător celui de amplificare, sau de conversie pozitivă a genelor.
Dificultatea acestui model este că el presupune regenerarea unui cluster din câteva unităţi
repetitive. Aceasta înseamnă că atât unităţile de transcripţie cât ţi separatorii trebuie regeneraţi,
astfel încât întreaga unitate repetitivă să fie omogenă ca secvenţă (sau cel puţin, să nu aibă o
variabilitate mai mare decât numărul mic de copii master). Dar de fapr separatorii manifestă o
variabilitate continuă, în timp ce numai unităţile de transcripţie sunt constante.
Celălalt model, crossover fixation, presupune că întregul cluster este supus unui mecanism
de rearanjare continuă prin crossing-over inegal. În esenţă, este vorba de aplicarea la nivelul unui
cluster în tandem a mecanismului deja discutat pentru genele globinei pe baze mult mai restrictive
şi ocazionale. Astfel de evenimente pot explica evoluţia concertată a genelor multiple dacă prin
intermediul unui crossing- over se poate determina regenerarea fizică pornind de la o copie.
Urmând mecanismul descris, de exemplu, cromozomul care poartă un locus triplu poate
suferi deleţia uneia dintre gene. Din cele două gene rămase, 11/2 reprezintă secvenţa uneia din
copiile originale şi numai 1/ secvenţa celellalte copii originale. Orice mutaţie existentă în prima
regiune va exista acum în ambele gene şi va fi subiectul presiunii selective.
Analizînd consecinţele crossing-overului inegal este evident că clusterele în tandem
furnizează şanse frecvente pentru ‘împerecherea neadecvată’ a genelor ale căror secvenţe sut
aproximativ aceleaşi, dar care sunt situate în diferite poziţii ale clusterului. Prin expansiune
continuă şi contractare a numărului de unităţi prin crossing-over inegal, este posibil ca toate
unităţile să derive dintr-o regiune mică a unui cluster ancestral. Lungimea variabilă a separatorilor
este concordantă cu ideea că crossing-overul inegal care loc cu implicarea unor separatori între
care se realizează ă imperechere inadecvată internă. Aceasta poate explica omogenitatea genelor
comparativ cu variabilitatea separatorilor. Genele sunt supuse selecţiei când unităţile repetitive
individuale sunt amplificate în interiorul unui cluster; dar separatorii sunt irelevanţi şi pot acumula
modificări.
SLIDE 24. Evoluţia sintezei genelor globinei în dezvoltarea embrionară şi fetală
Gene esenţiale şi numărul total al genelor
Câte gene sunt esenţiale? O altă abordare a chestiunii numărului de gene este să
determinăm numărul genelor esenţiale prin analize mutaţionale. Dacă se realizează saturarea unor
regiuni specifice de pe cromozom cu mutaţii care sunt letale, numărul grupurilor de
complementare în care aceste mutaţii sunt distribuite va identifica numărul total de ‘loci’ letali din
acea regiune. Prin extrapolare la întregul genom, putem calcula numărul total de gene esenţiale.
Cele mai extinse analize asupra numărului esenţial de gene au fost realizate la Drosophila
unde s-a putut realiza corelarea aspectului vizibil al cromozomilor cu numărul de unităţi genetice.
Acest lucru a fost posibil prin urmărirea prezenţei benzilor la nivelul cromozomilor politeni de la
D. melanogaster. (Aceşti cromozomi pot fi evidenţiaţi în anumite stadii de dezvoltare şi reprezintă
o formă fizică neobişnuit de extinsă, în care se pot vedea serii de benzi, denumite mai mult formal
cromomere). Pornind de la conceptul iniţial că benzile pot reprezenta o ordine lineară a genelor,
s-a ajuns la ideea corelării organizării genelor cu organizarea benzilor. Exista peste 5 000
87
de benzi în setul haploid de la D. melanogaster; acestea variază adesea cu un ordin de mărime,
dar media este poate fi de aprox 20 kb/bandă.
Abordarea de bază este de a satura o regiune cromozomiala cu mutaţii. De obicei mutaţiile sunt
colectate simplu ca letale, fără a analiza cauza letalităţii. Orice mutaţie care este letală este luată
în seamă (în evidenţă) pentru a identifica un locus care este esenţial pentru organism. Când
mutaţiile sunt plasate într-un grup de complementare, numărul acestora poate fi comparat cu
numărul benzilor prezente în regiune, sau grupuri individuale de complementare pot fi alocate
unor benzi individuale. Scopul acestor experienţe este determinarea existenţei unei corelaţii
consistente între benzi şi gene; de exemplu dacă fiecare bandă conţine o singură genă? Un
exemplu de regiune cartografiată, în care 12 grupuri de complementare au fost cartografiate într-
o regiune rosy de 16 benzi. În acest caz, grupul a fost cartografiat cu ajutorul unor markeri ADN
de mărime cunoscută, astfel încât a fost posibilă constatarea că întreaga regiune conţine 300 kb.
Această distribuţie a grupurilor de complementare este în general paralelă cu distribuţia benzilor,
dar nu se poate spune că există o corelaţie de 1:1. Se demonstrează o corelaţie rezonabilă între
numărul de benzi (265) şi numărul de grupuri de complementare (215). Aceasta corespunde la
aproximativ 5% din genomul D. melanogaster. În cazurile în care grupurile au fost cartografiate
folosind ADN, se constată existenţa unei regiuni de 10- 20 kb pentru un grup de complementare
letală, distanţă care este de două ori mai mare decât mărimea medie a unei gene.
Diferenţa dintre numărul total de gene şi numărul de gene letale adusă din nou în discuţie
datorită datelor genetice şi biochimice. La nivel molecular, se cunoaşte că multe gene sunt
localizate în aceeaşi vecinătate, de exemplu, ele pot fi linkate pe aceleaşi fragmente genomice.
Aceasta înseamnă că astfel de gene sunt localizate în interiorul aceleiaşi benzi. Aceasta este totuşi
un contrast între echivalenţa aparentă a locilor letali şi a benzilor şi prezenţa mai multor gene într-
o bandă. Există posibilitatea ca o bandă să conţină mai multe gene, dar multe dintre acestea sau
chiar toate să nu fie gene esenţiale. Până în prezent nu putem spune că există posibilităţi clare de
definire a unor criterii după care să se poată decide care sunt genele esenţiale şi care cele ne-
esenţiale.
Un experiment care a încercat să determine ce proporţie din genele actuale este esenţială
s-a soldat cu rezultate foarte interesante în cazul S. cerevisiae. Genomul acestei drojdii este relativ
mic, şi o mare parte este transcris (>50% dacă comparăm cu eucariotele superioare). În urma
introducerii unor inserţii la întâmplare în genom, s-a constatat că numai 12% dintre acestea sunt
letale, şi alte 14% împiedică creşterea. Majoritatea inserţiilor (70%) nu au avut nici un efect. Dacă
toate inserţiile utilizate conţineau semnale de terminare a transcripţiei ne puteam aştepta ca acestea
să împiedice expresia oricărei gene în care se integrau.
Se presupune că toate întreruperile care nu aveau nici un efect erau poziţionate în regiuni
netranscrise. Proporţia întreruperilor de acest tip poate fi de 50% astfel încât rămâne o proporţie
de 20% din întreruperi fără efect cu toate că sunt poziţionate în regiuni transcrise (Regiunile
transcrise reprezintă 50% din genom dar reprezintă conţinutul tuturor genelor). În urma acestor
rezultate se poate considera că întreruperea a 20% din regiuni reprezintă întreruperea a 40% dintre
gene. Aceasta implică că 40% dintre genele exprimate la drojdii nu sunt esenţiale.
Cum pot fi explicate aceste rezultate? O posibilitate o reprezintă existenţa unei redundanţe
extinse, astfel încât multe gene sunt prezente în mai multe copii. Acest punct de vedere este cu
siguranţă adevărat pentru anumite cazuri, în care mai multe gene trebuie inactivate pentru a obţine
un efect. Pentru moment nu avem la îndemână
88
nici o modalitate de control (supraveghere) sistematică cu ajutorul căreia să determinăm câte dintre
genele actuale posedă funcţii unice şi câte sunt redundante sau pur şi simplu organismul se poate
dispensa de ele. Ideea că anumite gene nu sunt esenţiale (sau cel puţin că nu pot fi evidenţiate
efecte serioase asupra fenotipului) ridică câteva întrebări importante. Conţine genomul gene
autentic dispensabile, sau au aceste gene actuale efect semnificativ asupra fenotipului cel puţin în
timpul lungului progres al evoluţiei? Are fiecare genă o funcţie unică (aşa cum ne putem aştepta
dacă este esenţială) sau există redundanţă: sunt prezente unele gene sub forma mai multor copii?
Nu ne putem pronunţa dacă la eucariotele superioare există funcţii de care celula să se
poată dispensa, dar dacă există, trebuiesc re-gândite unele din întrebările asupra evoluţiei. Ştim că
unele gene par să fie redundante. Există multe cazuri în care mutaţiile locilor individuali de la
drojdii şi Drosophila nu prezintă efecte aparente, dar în prezenţa altor mutaţii la nivelul altor loci
devin letale. Întrebarea dacă există cu adevărat gene redundante este foarte dificilă şi ea la rândul
ei conduce la o altă întrebare dificilă: cum se realizează presiunea selectivă pentru aceste gene?
Alte întrebări cheie sunt: care este proporţia de gene esenţiale din numărul total de gene;
ce număr de mutaţii produce până la urmă efecte detectabile; există gene care sunt autentic
dispensabile? Dacă acesta este cazul în care se găsesc multe gene şi anume de a nu codifica pentru
proteine specifice care nu sunt esenţiale pentru supravieţuirea organismului (în sensul în care
modificări mutaţionale nu determină nici un efect detectabil), trebuie să răspundem de ce aceste
continuă să fie exprimate. Alte întrebări secundare despre genom ca întreg sunt: are ADN vreo
funcţie (dacă există vreuna) care nu este codificată de gene (care nu rezidă în structura genelor)?
Ce efect are o modificare importantă (este cazul amfibienilor) a mărimii totale asupra operabilităţii
genomului?
SLIDE 25. Organizarea structurală a diferitelor gene pentru globine Genele globinei sunt
organizate în două clustere Exemplul cel mai bine caracterizat pentru un cluster de gene este
reprezentat de genele globinei, care constituie o familie veche, şi responsabile de o funcţie cu rol
central în lumea animală: transportul oxigenului de către sânge. Constituentul major al celulelor
roşii ale sângelui este tetramerul de globină, asociat cu gruparea hem (ion binding-care leagă
fierul) pentru a forma hemoglobina. Genele funcţionale ale globinei de la toate speciile au
aceeaşi structură, fiind împărţite în trei exoni. Putem concluziona că toate genele globinei derivă
dintr-o singură genă ancestrală; astfel încât trasând (urmărind) dezvoltarea (evoluţia) genelor
individuale în interiorul unei specii şi între acestea, putem înţelege (învăţa) despre mecanismele
implicate în evoluţia familiilor de gene.
În celulele adulte, tetramerul de globină constă în două lanţuri α şi două β identice. Genele
α şi β sunt poziţionate la nivelul unor loci genetici diferiţi a căror exprimare trebuie coordonată
pentru a asigura o sinteză echivalentă a ambelor polipeptide. Acest sistem furnizează în consecinţă
un exemplu de control simultan a unor gene dispersate pentru a genera un anumit fenotip celular.
Celulele roşii embrionare conţin tetrameri de hemoglobină care sunt diferiţi de formele
adulte. Fiecare tetramer conţine două catene asemănătoare lanţurilor α şi două lanţuri identice cu
β, fiecare dintre acestea fiind înrudite cu polipeptidul caracteristic adultului fiind mai târziu
înlocuit de acesta. Acesta este un exemplu de control al dezvoltării, în care diferite gene sunt
supuse procesului de ‘switched on and
89
off’ (de schimbare a direcţiei/orientării) pentru a furniza produşi alternativi care îndeplinesc
aceeaşi funcţie în diferite etape de timp.
Detaliile asupra relaţiilor dintre hemogobinele adulte şi embrionare variază în funcţie de
organism. Etapele urmate la om constau în trei stadii: embrionar, fetal, şi adult. Distincţia dintre
embrionar şi adult este comună la mamifere, dar numărul de stadii pre-adulte variază. La om
catenele zeta şi alfa sunt cele două lanţuri asemănătoare cu α (like α), şi beta sunt chiar lanţurile β
obişnuite. Catenele exprimate în diferite stadii de dezvoltare sunt prezentate în tabel.
ζ (zeta) este prima catenă like-α exprimată, dar este foarte repede înlocuită de către
adevărata catena α. La nivelul căi sintezei lanţurilor de tip β, sunt exprimate mai întâi catenele ε
(epsilon) şi γ (gama), fiind înlocuite cu δ (delta) şi β (beta) mai târziu. La adulţi, formele α2β2
constituie 97% din totalul structurii hemoglobinei, α2δ2 aproximativ 2%, şi 1% este reprezentat
de persistenţa formei de la fetus α2γ2.
Divizarea lanţurilor globinei în lanţuri like-α şi like-β reflectă organizarea genelor într-un
singur cluster. Structurile celor două clustere prezente la primatele superioare sunt prezentate în
figura.
Într-o regiune de peste 50 kb, clusterul β conţine cinci gene diferite (ε, două γ, δ şi β) şi o
pseudogenă (βΨ). Cele două gene γ diferă în secvenţa codantă prin numai doi aminoacizi; varianta
G posedă o glicină în poziţia 136 unde varianta A are o alanină.
Tabel. Hemoglobinele umane se modifică în cursul dezvoltării Stadiu de dezvoltare
Hemoglobine Embrionar (< 8 săptămâni) ζ2ε2, ζ2γ2, α2ε2 Fetal (3-9 luni) α2γ2 Adult (după
naştere) α2δ2, α2β2
Clusterul α este mult mai compact şi include într-o regiune de peste 28 kb, o genă activă ζ
(zeta), o pseudogenă ζ (zeta), două gene α, două pseudogene αm şi o genă θ (teta) a cărei funcţie
nu este cunoscută. Cele două gene α codifică pentru aceeaşi proteină. Două sau (mai multe) gene
identice prezente pe acelaşi cromozom sunt considerate copii ne-alelice.
Genele funcţionale sunt definite prin expresia lor în ARN, şi până la urmă prin proteinele
pe care le codifică. Pseudogenele sunt denumite astfel datorită incapacităţii lor de a codifica
proteine; motivaţia inactivităţii variază iar deficienţele pot fi la nivel transcripţional sau
translaţional (sau la ambele). Câteodată (din când în când) una dintre gene nu poate fi plasată în
nici una din clase. De exemplu structura genei θ a fost descoperită la unul dintre capete după ce s-
a considerat că structura clusterului α era bine definită. Nu a fost nici o problema ca aceasta să fie
clasificată ca o pseudogenă, atâta timp cât nu a fost posibilă identificarea unui produs de reacţie.
De asemenea rolul său rămâne neclar.
O organizare similară a fost găsită pentru clusterele genelor globinei de la alte vertebrate,
dar detalii ca tipul, numărul şi ordinea genelor pot varia. în poziţia în care la o specie este localizată
o pseudogenă la altă specie poate fi localizată o genă activă; de exemplu, pseudogena βψ de la
primatele superioare este localizată într-o poziţie echivalentă cu o genă embrionară activă de la
capră.
 Caracterizarea acestor clustere de gene marchează un punct general foarte important. Pot
exista mai mulţi membri ai unei familii de gene atât funcţionali cât şi ne-funcţionali, pe care îi
putem suspecta pe baza analizelor proteinelor. Genele extra-
90
funcţionale pot reprezenta duplicate care codifică pentru polipeptide identice; sau ele pot fi înrudite
cu proteine cunoscute, cu toate că sunt diferite de ele (şi care se presupune că sunt exprimate numai
o perioadă scurtă de timp şi în cantităţi mici). Ţinând cont de toate aceste trăsături, este greu să
fim siguri că toţi membrii unui cluster au fost identificaţi şi că regiunile care flanchează clusterul
reprezintă ultimii membri ai acestuia.
Cu privire la întrebarea cât de mult ADN este necesar pentru a codifica o anumită funcţie,
constatăm că pentru regiunea care codifică pentru catene like-β la mamifere sunt necesare între
20-50 kb. Această regiune este mult mai mare decât ne- am fi aşteptat analizând proteinele β-
globine cunoscute sau luând în considerare genele individuale. Regiunea clusterului β, pare să
codifice numai pentru β-globine, dar cu cât sunt descoperite mai multe gene sau clustere de gene
care codifică pentru proteine particulare, cu atât mai mult nu se va putea identifica rapid tipul de
aranjament caracteristic.
Crossing-overul inegal rearanjează clusterele de gene
Pentru rearanjarea unui cluster care conţine gene identice sau înrudite există diferite
oportunităţi. Chiar dacă clusterele codifică pentru aceeaşi funcţie, şi toate posedă aceeaşi
organizare generală, fiecare este diferit ca mărime, există variaţii ale numărului total şi a tipurilor
de gene care codifică pentru β-globine, şi este diferit numărul şi structura pseudogenelor. Toate
acest modificări au apărut de când a avut loc marea radiaţie a mamiferelor, acum 58 milioane de
ani în urmă (ultimul punct al evoluţiei comun tuturor mamiferelor).
Comparaţiile demonstrează că procese generale cum sunt duplicarea genelor, rearanjarea,
şi variaţia, reprezintă factori la fel de importanţi în evoluţie ca şi acumularea lentă a mutaţiilor
punctiforme în genele individuale. Ce tipuri de mecanisme sunt responsabile de reorganizarea
genelor ?
Un cluster de gene se poate mări sau contracta prin crossing-over inegal, când
recombinarea apare între gene ne-alelice. În mod normal, recombinarea implică secvenţe
corespunzătoare de ADN aliniate exact între doi cromozomi omologi. Totuşi, când există două
copii ale aceleiaşi gene pe fiecare cromozom, o este posibil ca o aliniere ocazională să permită
împerecherea acestora (Aceasta implica ca regiunile adiacente rămân neîmperechiate).
Când evenimentul de recombinare apare între copii nepotrivite ale genelor, se generează
cromozomi recombinaţi ne-reciproci (nonreciprocal recombinant chromosomes), unul dintre
aceştia având o duplicare a genei iar celălalt o deleţie. Primul recombinat are astfel o creştere a
numărului de copii ale genei de la 2 la 3, în timp ce al doilea descreşte de la 2 la 1.
În acest exemplu, noi am considerat copiile genelor ne-echivalente 1 şi 2 ca fiind în
întregime omologe. Totuşi, crossing-overul inegal poate să apară şi când genele adiacente prezintă
un grad ridicat de înrudire (deşi probabilitatea este mai mică decât în cazul genelor identice).
O problemă a crossing-overului inegal este reprezentată de întreruperea structurii genelor.
Într-un caz ca al globinelor, exonii corespunzători copiilor genelor adiacente se pare că sunt destul
de înrudite pentru a se împerechia; dar secvenţele intronilor prezintă o divergenţă apreciabilă.
Reducerea împerecherii numai la exoni reduce considerabil continuitatea lungimii ADN care poate
fi implicat. Aceasta înseamnă că există şanse mai mici să se producă un eveniment de crossing-
over inegal. Această divergenţă a intronilor (dintre introni) poate determina (controla) o stabilitate
a clusterelor de gene prin împiedicarea (potenţarea) apariţiei crossing- overului inegal.
91
 Talasemiile sunt rezultatul mutaţiilor care reduc sau împiedică sinteza lanţurilor α sau β.
Incidenţa crossing-overului inegal la nivelul clusterelor genelor globinei este evidenţiată prin
natura anumitor talasemii.
Multe din cele mai severe talasemii sunt rezultatul deleţiilor unei părţi a clusterului. Cel
puţin în unele cazuri, capetele deleţiei sunt poziţionate în regiuni omologe, deleţiile fiind exact aşa
cum ne aşteptam generate prin crossing-over inegal.
În cazul α-talasemiilor au fost determinate două tipuri de deleţii. Deleţia α- thal-1 elimină
ambele gene α. Numele se referă la cromozomul individual care poartă deleţia. În funcţie de
combinaţia diploidă a cromozomilor talasemici (purtătoare de modificări care generează
talasemia), un individ afectat poate avea orice număr de lanţuri α cuprins între zero şi trei. Indivizii
cu două sau trei gene α manifestă puţine modificări (diferenţe) faţă de tipul sălbatec (patru gene
α). În cazul celor cu o singură genă α se formează tetramerul anormal β4, care determină maladia
HbH. Absenţa completă a genelor α determină apariţia ‘hydrops fetalis’ (hidropsie fetală), care
este fatală înainte de naştere.
Deleţiile care pot cauza α-talasemii. Deleţiile α-thal-1 sunt lungi, variază ca localizare la
capătul stâng, poziţiile capetelor din dreapta fiind localizate între gene cunoscute. Deleţiile α-thal
2 sunt scurte. În cazul formei L sunt eliminate 4,2 kb din ADN, care includ gena α2. Acesta este
probabil rezultatul unui crossing-over inegal, deoarece capetele deleţiei sunt localizate în regiuni
omologe, chiar la dreapta genelor αψ şi respectiv α2. Forma R rezultă prin îndepărtarea a 3,7 kb
din ADN, distanţa exactă dintre genele α1 şi α2. Se pare că aceasta este şi ea generată prin crossing-
over inegal între genele α1 şi α2.
În acelaşi crossing-over inegal în urma căruia sunt generaţi cromozomii talasemici se
obţine şi un cromozom care posedă trei gene α. Indivizi cu astfel de cromozomi au fost identifici
în numeroase populaţii. În unele populaţii, frecvenţa locusului α triplu este aproape aceeaşi ca a
celor cu un singur locus α; în altele gena triplă α este mult mai puţin comună decât gena single α.
Aceasta sugerează factori selectivi necunoscuţi operează la nivelul diferitelor populaţii şi ajustează
nivelul genelor.
Variaţii ale numărului de gene α s-au observat relativ frecvent, ceea ce reprezintă un
argument că crossing-overul inegal la nivelul clusterului este destul de comun. El apare mult mai
frecvent în clusterul α decât în cel β, probabil deoarece intronii genelor α sunt mult mai scurţi
împiedicând mai puţin împerecherea inexactă dintre genele ne-omologe.
Deleţiile care provoacă β-talasemii. În unele cazuri (rare), este afectată numai gena β.
Aceasta prezintă o deleţie de 600 pb, care se întinde de la cel de al doilea intron către limita regiunii
3’. În alte cazuri, sunt afectate mai multe gene. Multe dintre deleţii sunt foarte lungi extinzându-
se către capătul 5’ (pe hartă sunt indicate ca depăşind 50kb spre dreapta).
Tipul Hb Lepore furnizează informaţia clasică că deleţiile pot rezulta în urma crossing-
overului dintre gene linkate (linked genes). Genele β şi δ diferă numai prin 7% din secvenţă. Prin
recombinare inegală se înlătură materialul genetic dintre ele, astfel încât genele fuzionează. Genele
fuzionate produc un singur lanţ proteic β care conţine la capătul N-terminal secvenţa polipeptidei
δ unită cu cea a polipeptidei β la capătul C-terminal.
În prezent sunt cunoscute diferite tipuri de hemoglobine Lepore, diferenţa dintre acestea
constând în poziţia punctului de tranziţie de la secvenţa δ la secvenţa β.
92
Astfel, când genele α şi β se împerechiază prin crossing-over inegal, punctul exact de recombinare
determină poziţia la care se trece (switch) de la secvenţa δ la cea β la nivelul lanţului de aminoacizi.
Forma reciprocă a acestui eveniment a fost găsită în hemoglobina Hb anti- Lepore, care
este produsă de către gena care are la capătul N-terminal o parte din gena β şi la capătul C-terminal
o parte din gena δ. Fuziunea se produce între genele normale δ şi β.
Dovada că un eveniment de crossing-over inegal poate avea loc şi între gene mult mai
îndepărtate (ca structură) a fost furnizată prin identificarea Hb Kenya, o altă hemoglobină
fuzionată. Aceasta conţine secvenţa N-terminală a genei γΑ şi secvenţa C-terminală a genei β.
Fuziunea trebuie să fi rezultat în urma unui crossing over inegal între γΑ şi β, care au o diferenţă
de secvenţă de peste 20%.
O varietate de deleţii care împiedică atât sinteza catenelor δ cât şi β determină formarea a
două fenotipuri. În cazul HPFH (hereditary persistence of fetal hemoglobin), în general nu există
simptome clinice; boala este ameliorată deoarece sintezele hemoglobinelor fetale (α2γ2) continuă
şi după perioada de dezvoltare în care în mod normal este dictată încheierea sa. În talasemia βδ
există simptome de anemie, deoarece deşi expresia genei γ continuă la adult, ea este mult mai slabă
decât în cazul HPFH. Diferenţa dintre HPFH şi talasemiile βδ depinde probabil de deleţia unor
secvenţe reglatoare prezente în interiorul clusterului, dar situate în afara structuri genelor δ şi β.
SLIDE 26. Arbore filogenetic stabilit prin analiza clusterului genelor pentru
beta-globine la diferite populaţii Clusterele de gene suferă reorganizări continue
Pornind de la diferenţele observate între clusterele genelor globinei de la diferite mamifere,
putem concluziona că duplicările urmate (uneori) de variaţie reprezintă o trăsătură importantă a
evoluţiei fiecărui cluster. Deleţiile prezente în talasemiile umane demonstrează că procesul de
crossing-overul inegal continuă să apară pentru ambele clustere ale genelor globinei. Fiecare astfel
eveniment de acest gen generează, în acelaşi timp, duplicare şi deleţie, fapt care trebuie luat în
consideraţie pentru ambele tipuri de loci din populaţie. Deleţiile pot să apară şi (în principiu) prin
recombinare între secvenţe omologe poziţionate pe acelaşi cromozom. Aceasta nu generează o
duplicare corespunzătoare.
Este dificil să estimăm frecvenţa naturală a acestor evenimente, deoarece forţele selective
ajustează rapid nivelele clusterelor variabile din populaţie. Se poate realiza o corelaţie grosieră
între nivelul crossing-overului inegal şi genele înrudite, cu cât acestea sunt mai înrudite (atât la
nivelul exonilor cât şi a intronilor), cu atât este mai mare şansa de împerechere imperfectă (totuşi,
unele evenimente de recombinare inegală nu implică genele însăşi, ci sunt determinate de secvenţe
apropiate de acestea).
În general o reducere a numărului genelor poate fi datorată apariţiei unei deleţii însoţită
apoi de selecţia acesteia. Totuşi, în unele populaţii, poate să existe un echilibru avantajos care să
menţină forma purtătoare de deleţie la o frecvenţă redusă.
Care este rezultatul unei astfel de expansiuni? Singurul exemplu care a fost bine
caracterizat este locusul α-triplu şi anti-Lepore. Indivizii care posedă 5 gene pentru globină (un
locus normal şi un locus triplu) nu manifestă nici o modificare în ceea ce priveşte sinteza
hemoglobinei. Totuşi, este posibil ca o creştere viitoare (al homozigotului triplu) poate să
determine modificări, prin dezechilibrarea sintezei
93
globinei către producerea unui exces de lanţuri α. Indivizii cu anti-Lepore posedă o gena de fuziune
δβ şi au şi una dintre genele normale β şi δ. Este posibil ca prezenţa unor lanţuri în plus să interfere
cu asamblarea normală a hemoglobinei.
Nu este de dorit ca aceste modificări particulare ale numărului de gene să aibă un avantaj
selectiv care le-ar putea asigura răspândirea în populaţie. Dar structurile actualelor clustere de la
om posedă numeroase duplicări care atestă importanţa acestui mecanism. Secvenţele funcţionale
includ două gene α care codifică pentru aceeaşi proteină, genele destul de bine înrudite β şi δm şi
genele aproape identice γ. Aceste duplicări independente relativ recente au apărut în populaţie fără
a mai menţiona duplicările mai îndepărtate (mai vechi) care au generat diferitele tipuri de gene
care codifică pentru globine. Alte duplicări au dat naştere pseudogenelor sau au fost pierdute. Este
de aşteptat ca duplicările continue şi deleţiile să fie o trăsătură a tuturor clusterelor de gene.
Pornind de la organizarea genelor globinei la o varietate de specii, se poate trasa evoluţia
actualelor gene care codifică pentru globine pornind de la o genă ancestrală
Dată fiind înclinaţia (orientarea/proprietatea) intronilor de a se pierde în timpul evoluţiei,
gena leghemoglobinei de la plante, care este înrudită cu genele globinelor, poate fi prezentată ca o
formă străveche. Aceasta are un intron în plus, care împarte domeniul de legare al hemului în două
părţi.
Ultima etapă în procesul evoluţiei genelor globinei, înainte de apariţia genelor actuale, este
cea reprezentată de secvenţa monocatenară a mioglobinei, care începe o evoluţie divergentă faţă
de linia globinei (diverge faţă de) acum aproximativ 800 milioane de ani. Gena mioglobinei are
aceeaşi organizare ca şi genele globinei, deci putem considera structura cu trei exoni ca
reprezentând structura strămoşului lor comun, generată într-o anumită etapă după separarea de
plante (după divergenţa de plante).
Anumite forme de ‘peşti primitivi’ au numai un singur tip de lanţ pentru globină, deci
aceştia trebuie să fi suferit o evoluţie divergentă de la linia evolutivă înainte ca gena ancestrală a
globinei să fi suferit procesele de duplicare care au dat naştere variantelor α şi β. Aceste fenomen
pare să fi avut loc acum aproximativ 500 milioane de ani în urmă, în timpul evoluţiei peştilor osoşi.
Următorul stadiu al evoluţiei este reprezentat de starea genelor globinei la broasca X.
laevis, care are două clustere pentru genele globinei. Totuşi, fiecare cluster conţine atât genele α
cât şi β, atât la formele adulte cât şi la formele larvare. Clusterul trebuie să fi evoluat aşadar prin
duplicarea grupelor de gene linkate α-β, proces urmat de divergenţa copiilor individuale. Mai
târziu întregul cluster a fost duplicat.
Amfibienii s-au separat de linia mamifere/păsări aproximativ acum 350 milioane de ani,
deci separarea genelor α şi β ale globinelor trebuie să fie rezultatul unei transpoziţii la nivelul unui
precursor al mamiferelor/păsărilor după etapa de separare a amfibienilor. Acest fenomen a apărut
probabil în perioada timpurie a evoluţiei vertebralelor. Odată ce s-au evidenţiat clustere separate
ale genelor care codifică pentru α şi β globine atât la păsări cât şi la mamifere, genele α şi β trebuie
să se fi separat fizic înainte de divergenţa mamiferelor şi păsărilor din acest strămoş comun. Un
astfel de eveniment este posibil să se fi produs acum aproximativ 270 milioane de ani.
Modificări la nivelul clusterelor α şi β globinelor au mai apărut destul de recent, aşa cum
vom vedea mai departe din descrierea divergenţei genelor individuale. Divergenţa secvenţelor
distinge două tipuri de situsuri la nivelul ADN
94
 Majoritatea modificărilor secvenţei proteice apar ca urmare a acumulării încep în timp de
mici mutaţii. Mutaţiile punctiforme (point mutation), inserţiile şi deleţii mici apar la întâmplare cu
o probabilitate mai mare sau mai mică în toate regiunile genomului, cu excepţia regiunilor fierbinţi
(“hotspots”) în care mutaţiile apar mult mai frecvent. Majoritatea mutaţiilor care schimbă un
aminoacid în secvenţa polipeptidică sunt vătămătoare (dăunătoare/deleterious) şi vor fi eliminate
de către selecţia naturală.
Puţine mutaţii pot fi avantajoase, dar acelea care se pot răspândi în populaţie, înlocuind
probabil secvenţele fondatoare/formatoare. Când o nouă variantă înlocuieşte versiunea anterioară
a genei, se spune despre aceasta că este fixată în populaţie.
Un problemă discutabilă este ce proporţie din mutaţiile care determină modificarea unui
aminoacid sunt neutre, adică fără nici un efect asupra funcţionalităţii proteinei, şi sunt capabile să
se acumuleze ca rezultat al ‘random drift and fixation’ (mişcării/evoluţiei întâmplătoare şi fixaţiei).
Viteza (rata) cu care se acumulează modificările determinate de mutaţii (mutaţionale) este
caracteristică fiecărui tip de proteină, şi se presupune că depinde cel puţin în parte de flexibilitatea
acesteia faţă de modificare. În interiorul unei specii, o proteină evoluează prin substituţii
mutaţionale, urmate de eliminarea sau fixarea în interiorul fondului de creştere individual. Prezenţa
în populaţie a două (sau mai multe) variante alelice este numită polimorfism. Polimorfismul poate
fi stabil, în care caz nici una din forme nu are nici un avantaj relativ, sau poate fi tranzitoriu,
cazurile în care o variantă este înlocuită cu alta. Când analizăm fondul de gene al unei specii
evidenţiem numai variantele care au supravieţuit.
Când o specie se separă în alte două specii noi, fiecare entitate nou constituită are un fond
independent pentru evoluţie. Dacă comparăm proteinele corespunzătoare de la două specii, vedem
diferenţele pe care acestea le-au acumulat între ele din momentul în care strămoşii lor au încetat
să se interpună. Anumite proteine sunt înalt conservate, fără sau cu mici diferenţe de la specie la
specii. Aceasta indică că aproape orice modificare este dezavantajoasă şi este eliminată prin
selecţie.
Diferenţa dintre două proteine este exprimată prin divergenţa lor, care reprezintă procentul
de aminoacizi diferiţi. Divergenţa dintre proteine poate fi diferită de cea dintre secvenţele
corespunzătoare de acizi nucleici. Sursa acestor diferenţe este dată de faptul că fiecare aminoacid
este codificat de un codon compus din trei baze, în care modificarea celei de a treia bază nu are
neapărat efect asupra citirii mesajului.
Secvenţa nucleotidică a unei regiuni codante poate fi împărţită în ‘replacement sites’
(situsuri de substituţie) şi ‘silent sites’ (situsuri mute/silenţioase): i) la nivelul ’replacement sites’,
o mutaţie modifică aminoacidul care este codificat. Efectul mutaţiei (deteriorat, neutru, avantajos)
depinde de rezultatul înlocuirii aminoacidului; ii) la nivelul ‘silent sites’, mutaţiile determină
înlocuirea unui codon sinonim cu altul, deci în acest caz nu este vorba de o modificare a proteinei.
De obicei situsurile în care se realizează substituţia constituie aproximativ 75% din secvenţa
codantă şi cele silenţioase numai 25%.
 Pe lângă secvenţa codantă o genă conţine şi regiuni ne-traduse. La acest nivel mutaţiile pot
de asemenea să fie potenţial neutre, în afară de cele care afectează structura secundară sau secvenţa
semnal reglatoare. Deşi mutaţiile silenţioase sunt neutre în ceea ce priveşte proteina, ele pot afecta
expresia genei datorită modificării secvenţei ARN. De exemplu, modificarea structurii secundare
poate influenţa transcripţia, procesarea sau translaţia. O altă posibilitate este că modificarea într-
un codon sinonim necesită un alt ARNt necesar pentru traducere, acest fapt putând influenţa
eficienţa translaţiei.
95
 Mutaţiile la nivelul situsurilor de substituţie pot să corespundă cu divergenţa aminoacizilor,
care în esenţă reprezintă procentajul de modificări. O divergenţă a secvenţelor de acizi nucleici de
0,45% la nivelul situsurilor de substituţie corespunde unei divergenţe în aminoacizi de 1% (luând
în considerare că media numărului situsuri de substituţie pentru un codon este 2,25). În realitate
divergenţa măsurată supraestimează diferenţele care au apărut în timpul evoluţiei, datorită
frecvenţei evenimentelor la nivelul unui codon. De obicei aceste estimări sunt supuse unei corecţii.
De exemplu, lanţurile globinelor β şi δ de la om, prezintă 10 diferenţe în 146 de resturi,
divergenţa fiind de 6,9% la nivelul proteinei. Secvenţa de ADN are 31 de modificări în 441 resturi
nucleotidice. Totuşi, aceste modificări sunt distribuite foarte diferit la nivelul situsurilor de
substituţie şi a celor silenţioase. Astfel, există 11 modificări pentru 330 situsuri de substituţie, şi
20 de modificări în 111 situsuri silenţioase. Ratele de divergenţă corecte sunt de 3,7% pentru
situsurile de substituţie şi de 32% pentru situsurile silenţioase, ceea ce reprezintă deja un ordin de
diferenţă.
Această impresionantă diferenţă în divergenţa constatată pentru situsurile de substituţie şi
cea pentru situsurile silenţioase demonstrează existenţa unor constrângeri mult mai mari la nivelul
poziţiilor nucleotidelor care influenţează constituţia proteinei relativ la cele nu o influenţează.
Astfel, probabil foarte puţine modificări ale aminoacizilor sunt neutre.
Ceasul evolutiv trasează dezvoltarea genelor globinei
Când o anumită proteină este analizată la o serie de specii, divergenţa dintre secvenţele
fiecărei perechi comparate este (mai mult sau mai puţin) proporţională cu perioada de timp de când
acestea sunt separate. Aceasta furnizează un ceas evolutiv care măsoară acumularea mutaţiilor la
o rată aparent egală în timpul evoluţiei unei proteine date. Rata divergenţei poate fi măsurată ca
procentul de diferenţă per milion de ani, sau prin reciproca sa, unitatea de perioadă evolutivă
(UEP), timpul în milioane de ani care este necesar pentru apariţia unui procent de divergenţă de
1%. Odată stabilit ceasul evolutiv prin comparaţii între perechi de specii (să ne amintim
dificultăţile practice de stabilire a timpului actual de speciaţie), el poate fi aplicat genelor înrudite
de la aceeaşi specie. Din divergenţa lor putem calcula timpul scurs de la evenimentul de duplicare
care le-a generat.
Prin compararea secvenţelor genelor omologe, se poate determina rata de divergenţă atât
a situsurilor de substituţie cât şi a celor silenţioase.
Pe baza comparării diferitelor perechi de gene (de la două specii), s-a constat existenţa unei
divergenţe medii de 10% la nivelul situsurilor de substituţie fie pentru genele α sau β-globinei de
la mamifere care au fost separate înainte de marea radiaţie a mamiferelor acum aproximativ 85 de
milioane ani. Aceasta corespunde unei rate a divergenţei de substituţie de 0,12% per milion de ani.
Rata este constantă când comparaţia este extinsă la gene a căror divergenţă este mult mai
veche (mai îndepărtată în timp). De exemplu, media divergentei de substituţie dintre genele
globinelor corespunzătoare de la mamifere şi păsări (pui) este de 20%. Raportat la separarea care
s-a produs acum aproximativ 270 milioane de ani, se ajunge la o rată de 0,09 per milion de ani.
 Întorcându-ne în timp putem compara genele α şi β globinelor în interiorul speciilor.
Acestea au suferit proces de divergenţă de când s-au separat tipurile de gene acum aprox 500
milioane de ani. Ele au o divergenţă medie de substituţie ~50%, care determină o rată de 0,1% per
milion de ani. Aceste date arată că divergenţa de substituţie în genele globinei prezintă o rată medie
de 0,096% per milion de ani (sau o UEP din 10,4). Luând în considerare incertitudinile care pot să
apară în estimarea
96
timpului la care s-a produs divergenţa speciilor, rezultatele constituie un suport bun pentru ideea
existenţei unui ceas linear.
Datele privind divergenţa la nivelul situsurilor silenţioase sunt mai puţin clare. În fiecare
caz, este evident că situsurile silenţioase au o divergenţă mai mare decât cea a situsurilor de
substituţie (variază după un factor 2 la 10). Deoarece divergenţa la nivelul situsurilor silenţioase
este prea mare în cazul comparaţiilor perechi consideram că nu poate fi aplicat un ceas evolutiv
acestor situsuri (trebuie să ne bazăm numai pe situsurile de substituţie)
Rata divergenţei situsurilor silenţioase nu este lineară în timp. Dacă considerăm că
divergenţa trebuie să fie zero la zero ani de separare, constatăm că rata de divergenţă pentru
situsurile silenţioase este mai mare în primele 100 de milioane de ani de la separare. O interpretare
este că o fracţie considerată, grosier ca reprezentând jumătate din situsurile silenţioase este rapid
(în aproximativ 100 milioane ani) saturată în mutaţii; această fracţie se transformă în situsuri
neutre. Cealaltă fracţiune acumulează mutaţii mult mai încet, la o rată de aproximativ egală cu cea
caracteristică situsurilor de substituţie; această fracţie se identifică situsurile care sunt silenţioase
în ceea ce priveşte proteina, dar care sunt supuse presiunii selective din alte motive.
Dacă inversăm modul de calcul aplicat pentru rata de divergenţă putem estima timpul de
separare a genelor într-o specie (de când s-au separat anumite gene în cadrul unei specii). Diferenţa
între genele umane α şi β este de 3,7% pentru situsurile de substituţie. Unei UEP (Unit
Evolutionary Period ) de 10,4, aceste gene trebuie să se fi separat (suferit divergenţă) 10,4 x 3,7
≈40 milioane de ani înainte de separarea liniilor care au condus la formarea maimuţelor Lumii Noi
(New World monkeys), maimuţelor Lumii Vechi (Old World monkeys), primatele mari şi omul.
Toate aceste primate mari au ambele tipuri de gene β şi δ, ceea ce sugerează că divergenţa acestor
gene a început imediat după acest punct evolutiv.
Dacă analizăm genele γ şi ε constatăm că divergenţa dintre situsurile de substituţie ale
acestora este de 10% şi corespunde unui timp de separare de ~100 milioane de ani. Separarea dintre
genele globinei embrionare şi fetale trebuie să fi precedat sau să fi însoţit radiaţia mamiferelor.
Arbore al evoluţiei genelor umane ale globinei. Caracteristici (trăsături) care s-au
dezvoltat înainte de radiaţia mamiferelor, cum este separarea formelor β/δ de γ, trebuie să fie
prezente la toate mamiferele. Caracteristicile care au evoluat după, cum este separarea genelor α
şi β ale globinei, vor fi regăsite în linii individuale ale mamiferelor. Se consideră că în fiecare
specie au avut loc modificări recente în structura clusterelor, atâta timp cât constatăm diferenţe în
numărul genelor (o singură genă β la omul adult şi două la şoarece) sau în tipul acestora (nu
există încă certitudinea existenţei unei separări a genelor embrionare sau β-like în cazul
globinelor de iepure şi şoarece). Este clar că evoluţia cercetărilor va furniza date suficiente
asupra secvenţelor unor gene particulare, şi atunci există mari şanse ca aceste argumente să fie
contrazise sau confirmate. Un lucru este totuşi sigur: comparaţiile dintre gene de la diferite specii
pot fi folosite pentru trasarea corelaţiilor taxonomice dintre specii pe baze moleculare.
Pseudogenele sunt capete moarte ale evoluţiei
Pseudogenele sunt definite prin faptul că posedă secvenţe înrudite cu cele ale genelor
funcţionale, dar care nu pot fi traduse într-o proteină funcţională. O pseudogenă este adesea notată
cu simbolul ψ.
97
 Unele pseudogene posedă aceeaşi structură generală ca şi genele funcţionale, cu secvenţe
care corespund exonilor şi intronilor din poziţiile normale. Acestea au devenit inactive prin mutaţii
care pot afecta unul sau mai multe etape ale expresiei genelor. Modificările pot fi semnale de
desfiinţare (întrerupere) a iniţierii transcripţiei, împiedicarea splicingului la nivelul joncţiunilor
exon-intron, sau terminarea prematură a translaţiei.
În mod normal o pseudogenă are numeroase mutaţii care provoacă modificări, deoarece
odată ce gena a încetat să mai fie activă, nu există nici un impediment ca ea să acumuleze în
continuare mutaţii. Pseudogene care reprezintă versiuni ale genelor active curent au fost
evidenţiate în multe sisteme, incluzând globinele, imunoglobulinele, antigenele de
histocompatibilitate, unde acestea sunt localizate în vecinătatea clusterului genelor active sau chiar
în interiorul acestuia intercalate între gene.
Un exemplu tipic este pseudogena de la iepure, βψ2, care are o organizare obişnuită în
exoni şi introni, şi este poziţionată foarte aproape de gena β1 a globinei. Eliminarea (deleţia) unui
perechi de baze la nivelul codonului 20 a βψ2 determină o modificare de fază care duce la
terminarea fazei deschise de lectură imediat după această poziţie (codon stop). În secvenţă există
şi alte numeroase mutaţii care determină modificarea altor codoni care semnifică aminoacizi bine
conservaţi în structura β-globinelor. De asemenea, nici unul dintre introni nu mai posedă capetele
de recunoaştere a separării lor de exoni, astfel încât este posibil ca intronii să nu mai poată fi
eliberaţi chiar dacă gena ar fi transcrisă. Totuşi, nu au fost evidenţiaţi transcripţi corespunzători
genei, probabil deoarece există modificări şi la nivelul regiunii 5’ care flanchează secvenţa
codantă.
Când există o astfel de listă de mutaţii care împiedică potenţial fiecare stadiu al expresiei
genei, nu există modalităţi prin care să putem detecta evenimentul original care a determinat
inactivarea acestei gene. Totuşi, prin divergenţa dintre o pseudogenă şi o genă funcţională, putem
estima când a apărut pseudogena şi când au început să se acumuleze mutaţiile la nivelul său.
Dacă pseudogena a devenit inactivă destul de repede după generarea sa prin duplicare din
forma β1, ne putem aştepta la o rată crescută de divergenţă (probabil aceeaşi) atât pentru situsurile
de substituţie cât şi pentru cele silenţioase (Nu mai este nici o motivaţie ca acestea să difere dacă
gena nu mai este tradusă). În acest caz sunt mai puţine substituţii/mutaţii în situsurile de substituţie
decât în cele silenţioase. Aceasta sugerează că în primul rând (în timpul în care gena era exprimată)
a existat o selecţie a mutaţiilor la nivelul situsurilor de substituţie. Din dispunerea/extinderea
relativă a modificărilor/mutaţiilor/substituţiilor la nivelul celor două situsuri, putem calcula că
pseudogena βψ2 s-a separat (a suferit divergenţă) de gena β1 acum ~55 milioane de ani, fiind o
genă funcţională timp de ~22 milioane de ani şi devenind pseudogenă de cel puţin 33 milioane de
ani.
Calcule similare pot fi făcute şi pentru alte pseudogene. Unele par să fi fost active un timp
înainte de a deveni pseudogene, dar altele se pare că au fost inactivate destul de repede după
generarea lor iniţială. Punctul general de vedere obţinut cu ajutorul structurilor acestor pseudogene
este că fiecare a evoluat independent în timpul dezvoltării clusterului genelor globinei la fiecare
specie. Aceasta întăreşte concluzia că crearea de noi gene, urmată de acceptarea lor ca duplicate
funcţionale, cu variaţii între apariţia unei noi gene funcţionale, sau inactivarea acestora ca
pseudogene, este un proces continuu într-un cluster de gene.
98
 Pseudogena αψ3 a genei globinei are o proprietate interesantă: îi lipsesc ambii introni.
Această secvenţă poate fi împerechiată cu ARNm pentru α-globină (ţinând cont de mutaţiile
acumulate/având în vedere). Timpul aparent de inactivare coincide cu duplicarea originală, ceea
ce sugerează că evenimentul de inactivare a fost asociat cu pierderea intronilor. Cum au fost
pierduţi intronii? Nu există nici o motivaţie ca sistemele de reconstituire a ADN să recunoască
graniţele exon-intron, acest fapt fiind un argument important pentru acceptarea idei implicării
ARNm în procesul de duplicare. Este probabil ca transcriptul invers al ARNm să fi fost inserat în
genom, probabil în urma acţiunii unui retrovirus.
Secvenţele genomice care se aseamănă unor molecule de transcript ARN sunt numite
pseudogene procesate/prelucrate (processed pseudogenes). Pornind de la ideea că acestea au luat
naştere prin inserarea unui produs derivat din ARN, la nivelul unui situs întâmplător, ele pot fi
localizate în orice regiune a genomului, şi nu neapărat pe acelaşi cromozom ca gena activă.
Ce trăsături sunt comune pseudogenelor? Majoritatea familiilor de gene posedă membrii
care sunt pseudogene. De obicei pseudogenele reprezintă o minoritate redusă din numărul total al
genelor. Într-un caz excepţional, totuşi, există o singură genă activă care codifică pentru o proteină
ribozomală la şoarece şi există ~15 pseudogene procesate relative. O astfel de situaţie trebuie luată
în considerare când se încearcă calcularea numărului de gene folosind rezultatele hibridizării
acestora.
Dacă pseudogenele sunt capete moarte din punct de vedere evolutiv, fiind simple secvenţe
ne-dorite care însoţesc genele funcţionale, de ce sunt ele încă prezente în genom? Îndeplinesc ele
vreo funcţie sau nu au nici un scop, în acest caz de ce nu sunt supuse presiunii selective pentru a
fi îndepărtate?
Trebuie să ne reamintim că noi putem detecta genele care au rezistat (sunt încă prezente)
în populaţiile actuale. Este posibil, ca în trecut un anumit număr de pseudogene să fi fost eliminat.
Această eliminare poate apărea prin eliminarea secvenţei sub forma unui eveniment neaşteptat sau
prin localizarea de mutaţi la unu asemenea nivel încât gena să nu mai poată fi recunoscută ca o
secvenţă membră a familiei originale (este probabil soarta finală a oricărei pseudogene care nu
este eliminată pe neaşteptate).
Este posibil ca relicve ale evoluţiei să fie duplicate. În cazul genelor pentru β globină de la
capră, există două specii adulte βA şi βC. Fiecare dintre acestea are o pseudogenă de câteva
kilobaze în amonte (numite βψZ şi βψX). Cele două pseudogene sunt mai bine înrudite una cu
cealaltă decât cu oricare dintre cele două gene β de la adult; în particular, ele manifestă multe
mutaţii care le inactivează. De asemenea, cele două gene pentru β-globină de la adult sunt mult
mai bine înrudite una cu alta decât cu pseudogenele. Aceasta implică că structura originală βψ-β a
fost duplicată, dând două gene funcţionale (care mai departe au suferit o evoluţie divergentă
ducând la βA şi βC) şi la două gene ne-funcţionale (care au suferit o evoluţie divergentă către
pseudogenele actuale).
Mecanismele responsabile pentru duplicarea genelor, deleţie, şi evenimente de
rearanjare/redistribuire acţionează asupra tuturor secvenţelor care sunt recunoscute ca membrii
ai unui cluster, în condiţiile în care aceştia sunt sau nu funcţionali. Este dificil ca selecţia să poată
discrimina între produşi.
SLIDE 27. Concluzii (1) Genoamele procariotelor şi eucariotelor inferioare conţin puţine
secvenţe nefuncţionale, în timp ce ale vertebratelor conţin multe secvenţe care nu codifică
99
pentru ARN sau care nu au nici o funcţie structurală sau funcţională. Numai 5% din ADN
genomic uman codifică pentru proteine sau ARN funcţional;
Lipsa unei relaţii consistente între cantitatea de ADN din genomul haploid de la animale şi
plante şi complexitatea sa filogenetică este denumită paradoxul valorii C;
Aproximativ jumătate din genele care codifică pentru proteine în genomul vertebratelor
sunt gene solitare, a căror secvenţă este prezentă numai o dată în genomul haploid. Restul sunt
gene duplicate, care au apărut prin duplicarea unei gene ancestrale urmată de mutaţii ulterioare
independente;
Genele duplicate cum sunt cele care codifică pentru familia genelor β- globinei, codifică
proteine înrudite şi în general apar sub forma unui cluster într-o anumită regiune a ADN. Proteinele
codificate de o familie de gene au o secvenţă de aminoacizi omologă dar nu identică şi exprimă
proprietăţi similare puţin diferite;
SLIDE 28. Concluzii (2) La nevertebrate cât şi la vertebrate moleculele de
ARNr, ARNt şi histone sunt codificate de copii multiple ale genelor care sunt localizate în
anumite regiuni ale ADN genomic
Copiile singulare de ADN constau în gene solitare care codifică pentru proteine, familii
de gene slab duplicate şi secvenţe ADN “spacer”;
Secvenţele moderat repetitive includ genele repetitive în tandem care codifică pentru
ARNr, ARNt şi histone; familii mari de gene duplicate şi elemente de ADN mobile;
Secvenţele de ADN simple, care constau în secvente scurte şi înalt-repetitive în regiuni
extinse în tandem, sunt preferenţial localizate la nivelul centromerilor, telomerilor sau prezintă
localizări specifice pe braţele anumitor cromozomi;
Lungimea regiunii tandem a anumitor secvenţe simple este destul de variabilă între
indivizii unei specii, probabil datorită crossing-overul inegal care apare în meioză. Diferenţele de
lungime ale acestor secvenţe simple în tandem stau la baza “fingerprinting-ului” ADN.
SLIDE 29. ADN mobil Secvenţele ADN moderat-repetitive şi
mobile sunt distribuite de-a lungul genomelor procariote, plante superioare şi animale. Sunt
formate din grupuri de sute la mii perechi de baze Secvenţele sunt copiate şi inserate în poziţii
noi prin procesul de transpoziţie Par să fie secvenţe “nefolositoare”
Secvenţele de ADN mobile care sunt presărate în genomul plantelor şi animalelor variind
de la câteva sute la câteva mii de pb au fost pentru prima dată descoperite la eucariote dar se găsesc
şi la procariote. Procesul prin care aceste secvenţe sunt copiate şi inserate într-un nou situs în
genom se numeste transpoziţie. Elementele mobile ADN sau elementele mobile simple sunt în
esenţă molecule parazite, care par să nu aibă funcţii specifice în funcţionalitatea gazdelor lor, dar
există numai pentru a se automenţine. Francis Crick le-a numit secvenţe “selfish”.
Transpoziţia elementelor ADN se crede că se datorează unei acumulări progresive (încete)
în genoamele eucariote în timpul unei perioade evolutive. Aceste elemente pot fi şi pierdute cu o
viteză foarte scăzută prin procesul de deleţie ale segmentelor de ADN care le conţin dar şi prin
acumularea mutaţiilor până când aceste nu mai sunt recunoscute ca fiind înrudite cu elementul
mobil original ADN. Deoarece elementele mobile sunt eliminate din genoamele eucariote destul
de încet, acestea
100
sunt acumulate până la punctul în care ele constituie a proporţie semnificativă a genoamelor
multor eucariote.
SLIDE 30. Două clase de elemente mobile Figura: a) inserţia secvenţelor şi
transpozomilor prin intermediarul ADN b) Retrotranspozomii sunt mai întâi transcrişi într-o
moleculă de ARN, care apoi este revers-transcrisă în ADN dublu-catenar. În ambele cazurim
intermediarii dublu catenari sunt integraţi la nivelul secvenţei ţintă ADN. Deplasarea
elementelor mobile implică ADN sau ARN ca intermediari.
Primul element mobil a fost descoperit de Barbara McClintock la porumb în 1940. Ea a
caracterizat aceste entităţi ca fiind capabile să intre şi să iasă din gene, modificând fenotipul
plantelor. Teoria sa a fost foarte controversată până când elementele mobile au fost descoperite la
bacterii, unde au fost caracterizate ca secvenţe specifice de ADN, şi bazele moleculare ale
transpoziţiei lor au fost descifrate. Când aceste elemente au fost descoperite, nu au fost corelate cu
secvenţele moderat repetitive, care au fost anterior identificate în experimentele de reasociere.
Astfel studiul elementelor mobile la eucariote a condus la detectarea elementelor mobile ADN la
bacterii cu toate că aparent nu existau conexiuni. O dată cu evoluţia cercetărilor elementele mobile
au fost împărţite de două categorii: 1) cele care sunt transpozate direct ca ADN; 2) cele care sunt
transpozate prin intermediul ARN transcris de pe structura elementului mobil de către o ARN
polimerază şi apoi transformat în ADN dublu catenar de către o revers-transcriptază.
Elementele mobile care transpozează prin intermediul unui ADN sunt denumite
transpozomi. Cele care transpozează la nivelul unor noi situsuri printr-un intermediar ARN sunt
numiţi retrotranspozomi deoarece deplasarea lor este analogă cu procesul de infecţie al
retovirusurilor. Intradevăr, retrovirusurile pot fi considerate ca retrotranspozomi care implică gene
care codifică anvelopa virală şi care permit acestora să transpozeze între celule. Atât transpozomii
cât şi retrotranspozomii pot fi clasificaţi în funcţie de mecanismul lor specific de transpoziţie
SLIDE 31. Elementele mobile sunt secvenţe ADN sau ARN La bacterii majoritatea elementelor
mobile sunt transpozate direct ca ADN. Din contră, majoritatea elementelor mobile de la
eucariote sunt retrotranspozomi dar au fost identificaţi şi transpozomi (ex cei iniţial descoperiţi).
SLIDE 32. Structura generală a elementelor bacteriene IS Prezenţa elementelor mobile la bacterii
a fost pentru prima dată evidenţiată la E. coli când au fost evidenţiate mutaţii ca urmare a
inserării spontane a unei secvenţe de aprox 1-2 kb, în mijlocul unei gene. Astfel de elemente se
numesc elemente IS (insertion sequences). Au fost vizualizate prima dată prin analiza
microscopică a hibrizilor (heteroduplexurilor) formate dintre tipul sălbatic şi cel mutant.
Deoarece elementul IS integrat într-o catenă mutantă nu găseşte complement pe catena sălbatică,
formând o buclă monocatenară extinsă care se evidenţiază relativ uşor la nivelul
heteroduplexului. Astfel, la E. coli au fost evidenţiate peste 20 de elemente IS diferite. Cu toate
acestea transpoziţiile elementelor IS este un eveniment foarte rar, care apare numai la 105-107
celule/per generaţie. Rate mai mari de transpoziţie vor mări ratele de mutaţii ale celulelor
bacteriene. Cu rate foarte scăzute de transpoziţie, majoritatea celulelor gazdă supravieţuiesc şi
astfel propagă elementul parazit IS. La transpoziţia elementului IS la nivelul unor situsuri
 aleatoare anumite secvenţe
101
transpozate se plasează în regiuni neesenţiale ale genomului (ex. regiunile dintre gene), crescând
numai numărul de elemente IS din celulă. Elementele IS se pot insera şi în plasmide sau virusuri
lizogene când sunt transferate în alte celule. Când se întâmplă acest lucru, elementele IS vor fi
transpozate în celule virgine.
Figura reprezintă structura generală a elementelor IS. Repetiţiile inversate, de aproximativ
50 pb sunt invariabil prezente la capetele IS şi au secvenţe caracteristice fiecărui tip de element.
Între repetiţiile inversate există o regiune codantă pentru proteine care codifică una sau două
enzime necesare transpoziţiei elementului într-un nou situs.
Un important semn distinctiv al al elementelor IS o reprezintă prezenţa repetiţiilor directe
scurte, care conţin 5-11 pb, imediat adiacente ambelor capete ale elementului inserat. Lungimea
repetiţiei directe este caracteristică fiecărui element IS, dar secvenţa sa depinde de situl secvenţei
ţintă la nivelul căreia elementul IS este inserat. Când secvenţa unei gene mutante care conţine un
element IS este comparată cu secvenţa sălbatecă dinainte de transpozare, se evidenţiază numai o
singură copie a secvenţei repetitive directe în gena sălbatică. Duplicarea acesteia pentru a da
naştere unei noi secvenţe repetitive adiacente elementului IS apare în timpul procesului de inserare.
SLIDE 33. Structura generală a transpozomilor bacterieni Enzima care caracterizează
transpoziţia unui element IS este numită transpozază. În cel mai simplu mecanism de
transpoziţie, un element IS este este excizat dintr-o anumită localizare şi este inserat într-o nouă
poziţie în cromozomul bacterian printr-un proces nereplicativ.
În acest mecanism, moleculele transpozabile leagă secvenţele repetitive inversate prezente
la fiecare capăt al elementului IS din ADN donor şi îl clivează cu precizie (la un situs precis).
Moleculele de transpozază se leagă şi ele şi fac tăieturi decalate într-o secvenţă scurtă din ADN
ţintă generând capete monocatenare. Această enzimă remarcabilă leagă apoi capetele terminale 3’
ale secvenţei ţintă, umplând breşele monocatenare şi generând o secvenţă repetitivă scurtă chiar la
capetele elementului IS nou inserat. Aceasta este originea repetiţiilor directe scurte care flanchează
elementele IS. Anumite elemente IS transpozează printr-un mecanism replicativ mult mai
complicat; în acest caz o copie a elementului IS original este generată în secvenţa ţintă în timp ce
copia originală este reţinută în secvenţa donoare ADN.
Transpozomii bacterieni. Pe lângă elementele IS, bacteriile conţin elemente genetice
mobile compuse care sunt mai mari decât elementele IS şi conţin una sau mai multe gene care
codifică pentru proteine, altele decât cele necesare pentru transpoziţie. Denumite transpozomi
bacterieni, aceste elemente sunt compuse din gene de rezistenţă la antibiotice flancate de două
copii ale aceluiaşi element IS. Inserarea unui transpozom într-o plasmidă sau în ADN cromozomial
este uşor detectabilă datorită achiziţionării rezistenţei la un anumit antibiotic. Transpoziţia produce
o repetiţie directă scurtă a secvenţei ţintă de fiecare parte a transpozomului nou integrat, ca şi
pentru elementele IS.
Transpozomii sunt unelte importante pentru genetica bacteriană. Acestea pot fi introduse
în plasmidele celulare sau în genoamele virale. O dată transferaţi într-o celulă, transpozomii
acţionează ca mutageni care afectează numai o singură genă celulară. Deoarece transpoziţia este
un eveniment rar, celulele mutante sunt izolate datorită, mai ales, rezistenţei la antibiotice pe care
o achiziţionează. Situsul unei transpoziţii poate fi determinat prin cartare de restricţie care
evidenţiază inserţia mai
102
ales în cazul transpozomilor mari ADN. Secvenţa precisă a ADN bacterian la nivelul situsului de
inserţie poate fi determinată prin secvenţiere, folosind un primer complementar cu secvenţa
cunoscută a repetiţiilor inversate de la capătul transpozomilor.
SLIDE 34. Model pentru transpozitia IS Etape: 1) Transpozaza, care este codificata de elementul
IS (IS10 in acest exemplu), taie ambele catene ale ADN donor în imediata proximitate a
repetiţiilor inversate (rosu închis), excizând elementul IS10. Transpozaza taie la nivelul unui
situs ADN ţintă ales aleator. În cazul IS10, cele două tăieturi sunt la o distanţă de 9 bp. 2)
Ligarea capetelor 3’ ale elementelor IS la capetele tăiate ale secventei ţintă este de asemenea
catalizată de către transpozază; 3) Cele 9-bp ale tăieturii monocatenare ADN, rămase în structura
intermediară formată, sunt umplute de către ADN polimeraza celulară; în final o ADN ligază
formează legături 3’-5’ fosfodiester între capetele 3’ ale secventei ADN ţintă extinse şi capetele
5’ ale elementului IS10. Acest proces are ca rezultat duplicarea secvenţei ţintă la fiecare dintre
capetele elementului IS inserat. De retinut ca elemental IS nu este figurat “la scală”. [See H. W.
Benjamin and N. Kleckner, 1989, Cell 59:373, and 1992, Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 89:4648.]
SLIDE 35. Retrotranspozomii virali conţin secvenţe LTR şi se
comportă în genom asemeni retrovirusurilor Transpozomii de la
eucariote.
Barbara McClintock care a descoperit prima elementele mobile a făcut observaţia că
anumite mutaţii spontane care afectează producerea unora dintre enzimele necesare formării
antocianiunei, un pigment purpuriu. O clasă din aceste mutaţii este reversibilă cu o frecvenţă destul
de mare în timp ce a doua clasă nu suferă reversii numai dacă ele apar în prezenţa primei clase de
muataţii. McClintock a numit agentul responsabil de prima clasă de mutaţii element activator (Ac)
şi l-a considerat responsabil de elementele celei de a doua clase elemente disociative (de disociere)
(Ds) deoarece aceste tind şi ele să se asocieze cu ruperile (scindările) cromozomale.
La mulţi ani după această descoperire, clonarea şi secvenţierea au evidenţiat că
elementele Ds sunt deletate de către elementul AC căruia îi lipseşte o regiune a secvenţei care
codifică pentru transpozază. Totuşi, la plantele care posedă elementul Ac şi care posedă o
tranpozază funcţională, elementele Ds nu se pot deplasa singure. Structura acestor elemente
eucariote este similară cu elementele IS de la bacterii şi par să se deplaseze printr-un mecanism
nereplicativ. O serie de elemente mobile au fost descoperite şi la alte eucariote. De exemplu,
aproximativ jumătate din mutaţiile spontane observate la Drosophila sunt datorate inserţiei
elementelor mobile. Totuşi majoritatea elementelor mobile de la Drosophila funcţionează ca
retrotranspozomi. Cel puţin unul-elementul P fucţionează ca un transpozom, deplasându-se
printr-un mecanism nereplicativ similar cu cel folosit de secvenţele de inserţie de la bacterii.
Metodele curente de contruire a drosophilelor transgenice depind de utilizarea expresiei crescute
a elementului P şi folosirea ţintelor repetitive terminale pentru transpoziţie. Retrotranspozomii
virali conţin LTR şi se comportă ca retrovirusurile în genom
Toate eucariotele studiate, de la drojdii la oameni, conţin retrotranspozomi, elemente
mobile ADN care transpozează prin intermediul ARN folosind o reverstranscriptază. Aceste
elemente mobile se pot împărţi în două categorii majore: retrotranspozomi virali şi nevirali.
Retrotranspozomii virali sunt abundenţi la drojdii (ex elementele Ty) şi la Drosophila (elementele
copia). La mamifere,
103
retrotranspozomii neretrovirali sunt cele mai comune tipuri de elemente mobile (vor fi descrise în
continuare). Cu toate acestea, se estimează că retrotranspşozomii umani reprezintă aproape 4% din
ADN uman.
Structura generală a retrotranspozomilor virali de la eucariote este prezentată în figură. În
plus, pe lângă repetiţiile directe scurte din 5’ şi 3’ toţi retrotranspozomii virali sunt marcaţi prin
prezenţă unor repetiţii terminale lungi (LTR-long terminal repeats) de 250-600 pb care flanchează
regiunea care codifică pentru proteină. LTR sunt caracteristice ADN retroviral integrat şi sunt
critice pentru ciclul de viaţă al retrovirusurilor. Mai mult, elementele Ty şi copia implică
mecanisme similare celor prin care ADN retroviral este integrat în gennomul unei celule gazdă şi
ARN retroviral este generat.
SLIDE 36. Generarea ARN genomic retroviral din ADN integrat retroviral Trebuie să ţinem
seamă de funcţiile distincte ale ale celor două LTR ale ADN retroviral integrat, în generarea
ARN genomic retroviral, care corespund intermediarului ARN implicat în transpoziţia
elementelor Ty şi copia. LTR din stânga funcţionează ca un promotor care direcţionează ARN
polimeraza II din celula gazdă pentru iniţierea transcripţiei începând de la capătul 5’ al secvenţei
R. După ce întregul ADN retroviral a fost transcris, secvenţa ARN corespunzătoare LTR din
partea dreaptă direcţionează enzimele care procesează ARN în celula gazdă pentru a cliva
transcriptul primar şi a adăuga coada poli (A) la capătul 3’ al secvenţei R. Genomul retroviral
rezultat este total lipsit de LTR. Totuşi, după ce virusul infectează celulele, revers-transcripţia
genomului ARN de către revers-transcrptaza codificată de către virus conduce la un ADN dublu-
catenar cu secvenţe LTR.
SLIDE 37. Generarea secvenţelor LTR în timpul revers-
transcripţiei ADN genomic retroviral (1) Figura: O serie complicată de 9 evenimente
generează o copie ADN dublu- catenară a genomului ARN al retrovirusului. ARN genomic este
împachetat într-un virion cu un ARNt retroviral specific hibridizat cu o secvenţă complementară
situată în apropierea capătului 5’ şi numită Primer Binging Site (PBS). ARN retroviral are o
secvenţă scurtă repetitivă la fiecare capăt al secvenţei R. Întreaga reacţie este catalizată de către
revers-transcriptază care realizează sinteza ADN şi digeră ARN din hibridul ADN/ARN. Întregul
proces conduce la o moleculă dublu-catenară de ADN care este mai lungă decât matriţa ARN şi
posedă LTR la fiecare capăt.
Integraza, o altă enzimă codificată de către retrovirus, inserează apoi ADN dublu-catenar
retroviral în genomul celulei gazdă; în acest proces, secvenţele repetitive scurte directe ale
secvenţei ţintă sunt generate la fiecare capăt al secvenţei virale inserate. Ca şi ADN retroviral,
elementele Ty şi copia codifică reverstranscriptaza şi integraza; se consideră că aceste enzime
funcţionează transformând intermediarl ARN în ADN şi inserând ADN în situsul ţintă într-o
manieră similară retrovirusurilor.
Elementele Ty transpozează într-o proporţie foarte scăzută, probabil datorită inserţiei
aleatoare a elementelor Ty în fiecare genom, care conţin un “spacer” relativ mic şi un intron ADN,
care adesea inactivează genele. Totuşi, când celulele de drojdii sunt transformate cu plasmide care
conţin elementul Ty clonat după un promoter
104
sensibil la galactoză, producerea ARNm pentgru Ty şi transpoziţia Ty este mai mare în prezenţa
galactozei decât în absenţa acesteia. Această creştere a fenomenului de transpoziţie a Ty este
rezultatul creşterii ARNm al Ty, care poate funcţiona ca o matriţă pentru revers-transcriptaza şi
integraza exprimată de Ty.
În contrast cu elementele Ty, regiunea codantă de a elementelor Ac de la porumb conţine
introni. Prezenţa intronilor în elementele Ac susţine concluzia că ei transpozează prin directa
deplasare a secvenţelor de ADN şi nu prin rfevers- transcrierea unui intermediar ARN.
SLIDE 38. Generarea secvenţelor LTR în timpul revers-
transcripţiei ADN genomic retroviral (2)
SLIDE 39. Plasmidele recombinante folosite pentru a demonstra ca
elementul Ty de la drojdii transpozeaza prin intermediul ARN
Când celulele de drojdii sunt transformate cu plasmida care conţine elementul Ty,
elementul Ty poate să fie transpozat în noi situsuri, proces care în mod normal apare cu o rată
scăzută. Folosind elementele diagramate în partea de sus a figurii, cercetatorii au obţinut doi
vectori plasmidiali diferiţi care conţin elementele Ty adiacente unui promotor sensibil la galactoza.
Aceste plasmide au fost utilizate pentru transformarea celulelor de drojdie care au fost crescute pe
mediu cu galactoza şi pe mediu fără galactoză. În experimentul 1, creşterea celulelor pe mediu cu
galactoză a determinat apariţia unui număr mai mare de transpoziţii decât în cazul celor crescute
pe mediu fără galactoză. Acest experiment demonstrează necesitatea existenţei unui transcript
ARNm intermediar în vederea transpoziţiei elementului Ty. În experimentul 2, un intron străin
(care nu are legătură cu gena de drojdie) a fost inserat în faza codantă de lectură care codifică
pentru proteina recombinantă galactoză-elementul Ty. Lipsa intronului în elementele Ty
transpozate reprezintă o evidenţă clară a faptului că mecanismul procesului de transpoziţie
presupune prezenţa unui intermediar ARNm care în urma procesului de maturare (splicing) pierde
intronul, aşa cum se poate vedea în figură. În contrast, transpozomii ADN de la eucariote, cum
este cazul elementului Ac de la porumb, conţin introni în gena care codifică pentru transpozază,
indicând astfel că aceştia nu se deplasează (nu transpozează) printr-un mecanism care necesită
prezenţa unui intermediar ARN [See J. Boeke et al., 1985, Cell 40:491.].
SLIDE 40. Retrotranspozomii ne-retrovirali sunt lipsiţi de
secvenţe LTR Retrotranspozomii ne-retrovirali nu posedă
LTR şi se deplasează printr-un mecanism neobisnuit
Cele mai abundente elemente mobile la mamifere sunt retrotranspozomii ne- retrovirali
cărora le lipsesc LTR. Multe dintre acestea aparţin la două clase de elemente moderat repetitive
care se găsesc la mamifere: Long Interspersed Elements - LINES şi Short Interspersed Eledments
– SINE. La mamifere a fost identificată o clasă de secvenţe SINE şi peste 10 clase de secvenţe
LINE. LINE au fost evidenţiate şi la protozoare, insecte şi plante dar din motive necunoscute
posedă o distribuţie mult mai largă la mamifere.
 Numărul mare de secvenţe SINE şi LINE la eucariotele superioare au fost acumulate
evolutiv prin copierea repetată a unei secvenţe la nivelul câtorva poziţii din genom şi inserarea
copiilor în noi poziţii. Nu conţin secvenţe LTR.
105
SLIDE 41. Retrotranspozomii ne-retrovirali se deplasează printr-
un mecanism “neobişnuit”. Elementele LINE L1 Cele mai comune elemente LINE la
mamifere sunt familia L1. În genomul uman sunt peste 600 000 copii ale L1 (aprox 15% toatal
genom). Structura generală a L1 se bazează pe o secvenţă consens (medie) prezentată în figură.
Elementele L1 sunt de obicei flancate de scurte repetiţii directe, marca elementelor mobile.
Secvenţa consens conţine două faze de lectură de aprox 1 kb şi 4 kb. ORF1 codifică pentru o
proteină de legarea a ARN iar ORF2 este similară cu secvenţa reverstranscriptazei din
retrovirusuri sau din retrotranspozomii virali.
Dovezile privind deplasarea elementelor L1 vin din analizele ADN uman clonat de la
pacienţii cu diferite maladii genetice. Analiza ADN de la aceşti pacienţi a evidenţiat că mutaţiile
pe care le purtau se datorau inserţiei unui element L1 la nivelul unei gene, fără ca un astfel de
elemt să fie prezent la părinţi.
Deoarece elementele L1 nu conţin secvenţe LTR înseamnă că mecanismul lor de
transpoziţie prin intermediul ARN trebuie să difere de cel al reztrotranspozomilor virali la care
LTR au rol crucial. Studiile in vitro au indicat că transcripţia lui L1 este direcţionată de secvenţe
promotoare localizate la capătul stâng al elementului. La capătul din dreapta a fost evidenţiată o
regiune bogată în A/T care se continuă cu resturi A în transcripţii ARN. Adesea secvenţele L1
conţin codoni STOP şi mutaţii “frameshift” la nivelul ORF1 şi ORF2, acestea fiind acumulate în
L1 în timpul evoluţiei. Menţinerea transpoziţiei L1 necesită ca măcar o secvenţă L1 să îşi
păstreze intacte fazele de lectură care codifică pentru reverstranscriptaze şi celelalte proteine
necesare transpoziţiei L1.
SLIDE 42. Structura generală a LINE, una din cele două clase de retrotranspozomi non-LTR în
ADN de mamifere Lungimea situsurilor ţintă care conţin repetiţii directe variază prin numărul de
copii pentru fiecare element la diferitele situsuri ţintă din genom. Deşi, lungimea totală a
secvenţei L1 este de 6kb, în 90% din situri de integrare în care acest element a fost evidenţiat, nu
au fost evidenţiate variaţii în regiunea 5’ (regiunea bogată în AT). Faza deschisă de lectură
1(ORF1), mai scurtă, de aproximativ 1kb, codifică pentru o proteina de legare la ARN (RNA-
binding protein). Faza deschisă de lectură 2 (ORF2), de aproximativ 4kb, codifică pentru o
proteină bifuncţională cu activitate reverstranscriptazică şi endonucleazică.
SLIDE 43-44. Mecanisme propuse pentru revertranscrierea si integrarea LINE Este prezentată
numai proteina produsă de ORF2. Secvenţele ADN LINE nou sintetizate sunt colorate în negru
[Adapted from D. D. Luan et al., 1993, Cell 72:595.]
SLIDE 45. Elementele ADN mobile au probabil o influenţă semnificativă în evoluţie Cu toate că
elementele ADN mobile nu par să aibă o funcţie directă alta decât menţinerea propriei existenţe,
prezenţa lor probabil a avut şi are un impact major în evoluţia organismelor.
106
De exemplu: - elementele mobile evidenţiate ca inducând mutaţii spontane la Drosophila ca
urmare a inserării într-o sau în apropierea unei unităţi de transcripţie;
- elemtele mobile detectate în genele mutante. În plus, recombinarea omologă între elementele
mobile disxpersate de-a lungul genoamelor ancestrale pot avea un important rol în duplicarea
genelor şi în alte rearanjamente de-a lungul evoluţiei. Clonarea şi secvenţializarea clusterului
beta- globinelor de la diferite specii de primate au evidenţiat că genele Gγ şi Aγ au apărut ca
urmare a crossing-overului omolog inegal dintre două secvenţe L1.
Astfel de duplicări şi rearanjamente ale ADN contribuie mult la evoluţia noilor gene. Se
poate considera că duplicarea genelor este anterioară evoluţiei unui număr mic de familii de gene
care ulterior au achiziţionat funcţii utile şi distincte.
ADN mobil a putut influenţa şi evoluţia genelor care conţin mai multe copii a unor exoni
similari care codifică domenii proteice similare (de ex gena fibronectinei). Recombinarea omologă
între elementele mobile inserate în introni contribuie probabil la evoluţia intronilor unor astfel de
gene. Unele studii sugerează că în timpul evoluţiei eucariotelor superioare, apare recombinare între
intronii unor gene distincte, generând noi gene formate din noi combinaţii de exoni pre-existenţi.
De exemplu, activatorul tisular al plasminogenului, receptorul Neu, factorul de creştere epidermală
conţin un domeniu EGF
SLIDE 46. “Amestecarea exonilor” (Exon shuffling) prin recombinare între repetiţii
interspaţiatoare omologe Recombinarea între repetiţii interspaţiatoare omologe situate între
intronii genelor separate determină producerea unor unităţi de transcripţie cu noi combinaţii de
exoni. În exemplul din figură, este demonstrat un dublu crossing-over între două poziţii care
conţin repetiţii Alu care determină schimbul de exoni între două gene.
SLIDE 47. Amestecarea exonilor (Exon shuffling) prin transpoziţie (a) Transpoziţia unui exon
flancat de transpozomi ADN omologi într-un intron al unei a doua gene. Asa cum se vede în
figură, într-o primă etapă transposaza poate recunoaşte şi cliva ADN la capetele repetitive
inversate ale transpozomului din gena 1 determinând eliberarea transpozomului. Tot transpozaza
este responsabilă de inserarea ulterioară a transpozomului în gena 2, într-un situs ţintă de inserţie
care se află la nivelul unui intron. Rezultatul net se traduce prin inserţia exonului din gena 1 în
gena 2. (b) Integrarea unui exon dintr-o genă în alta prin intermediul transpoziţiei secvenţelor
LINE. Anumite secvenţe LINE posedă semnale slabe poliA. În astfel de situaţii, este posibil ca
transcripţia acestor elemente LINE, în ARNm, să se continue şi cu exonul genei 1 poziţionat în
3’ fiind astfel trancrise şi semnalele de clivare şi de poliadenilare proprii genei 1. Această
moleculă de ARNm poate fi ulterior revers- transcrisă şi integrată de către LINE în faza deschisă
de lectură a proteinei 2 (ORF2) la nivelul unui intron al acestei gene, introducând astfel un nou
exon în 3’ la nivelul acestei gene.
SLIDE 48. Domeniile structurale şi funcţionale sunt module ale structurii terţiare Evoluţia
genelor care codifică aceste proteine ar fi putut implica recombinări între elemente mobile care
au avut drept rezultat inserţia unui exon care codifică EGF într-un intron al unei forme ancestrale
ale fiecăreia dintre aceste gene. Termenul
107
“exon shuffling” (amestecare a exonilor) a fost introdus pentru a defini acest tip de proces
evolutiv.
Recombinarea dintre elementele mobile poate să fi jucat un rol şi în determinarea genelor
specifice care sunt exprimate în anumite tipuri celulare particulare şi privind nivelul expresiei
acestora în anumite momente ale dezvoltării celulare sau a organismului.
Aşa cum am discutat genele eucariote posedă regiuni de control a transcripţiei, numite
ENHANCER care pot opera la o distanţă de mii de perechi de baze. De asemenea transcripţia unei
gene poate fi controlată prin efectul combinat a mai multor sevenţe “enhancer”. Recombinarea
elementelor mobile inserate aleator lângă “enhancer” poate contribui la evoluţia combinaţiilor de
“enhancers” care controlează genele la organismele moderne.
SLIDE 49. Concluzii (1) Majoritatea secvenţelor ADN “moderat repetitive” de la nivelul a
numeroase situsuri din genomul eucariotelor superioare provin din elementele ADN mobile;
Elementele ADN mobile codifică enzime care le inserează secvenţa în noi situsuri ale
ADN genomic;
Elementele ADN mobile care transpozează direct către noi situsuri sunt numite
transpozomi; cele care sunt mai întâi transcrise în ARN şi apoi sunt revers- transcrise în ADN sunt
denumite retrotranspozomi. Ambele tipuri produc secvenţe repetitive scurte la situsul de inserare,
care flanchează elementul mobil. Lungimea repetiţiilor directe depinde de tipul de element mobil.
Elementele mobile de la bacterii –IS- şi transpozomii bacterieni se deplasează prin
intermediari ADN. Ambii codifică pentru transpozază, dar trapozomii mai lungi conţin şi alte gene
care codifică pentru proteine, în general, gene pentru rezistenţă la antibiotice.
Transpozomi cu structură similară elementelor IS sunt prezenţi şi la eucariote (ex,
elementul P de la Drosophila), dar retrotranspozomii sunt mult mai abundenţi la eucariotele
superioare.
Retrotranspozomii virali sunt flancaţi de secvenţe repetitive terminale lungi (LTR),
similare celor de ADN retroviral şi care, asemeni retrovirusurilor, codifică revers-transcriptază şi
integrază. Ei se deplasează în genom prin transcriere în ARN, care suferă revers-transcriere şi
integrare în cromozomul celulei gazdă)
SLIDE 50. Concluzii (2) Retrotranspozomii “ne-virali” nu poseddă LTR şi
au a regiune bogată în A/T la unul din capete. Se consideră că aceste elemete mobile se
deplasează printr-un mecanism “ne-viral” neobişnuit;
Cele mai abundente elemente mobile la vertebrate sunt două tipuri de retrotranspozomi ne-
virali numite LINE şi SINE. Ambele par să cauzeze mutaţii asociate cu bolile genetice umane;
SINE manifestă o omologie crescută cu moleculele mici de ARN celular transcrise de ARN
polimeraza III. Cele mai comune secvenţe SINE, la oameni, conţin un situs de restricţie AluI şi
sunt numite secvenţe Alu. Acestea sunt secvenţe de aproximativ 300 pb dispersate în genomul
uman şi reprezintă 5% din acesta;
 Unele secvenţe de ADN sunt derivate din molecule de ARN celular care au fost revers-
transcrise şi inserate în ADN genomic, în timpul evoluţiei. Cele derivate din ARNm se numesc
pseudogene procesate şi le lipsesc intronii (aceasta fiind o
108
trasătură care le diferenţiază de pseudogene care au apărut prin deriva unor secvenţe ale genelor
duplicate);
Deşi elementele mobile par nefuncţionale pentru organismul individual, ele trebuie să fi
influenţat semnificativ evoluţia
SLIDE 51. Rearanjamente funcţionale la nivelul ADN cromozomial
În contrast cu transpoziţia elementelor mobile în ADN genomic, care par să nu servească
direct, funţionării imediate a organismului, există diferite tipuri de rearanjamente ale regiunilor
ADN care sunt benefice pentru organism. Aceste rearanjamente funcţionale, care au fost
identificate atât la eucariote cât şi la procariote, apar prin inversii şi deleţii ale segmentelor de
ADN şi prin amplificarea ADN. Aceste aranjamente funcţionale joacă şi un rol important în
reglarea unor gene, cel mai frecvent mecanism de control implicând reglarea transcripţiei.
SLIDE 52. Genele pentru anticorpi sunt asamblate prin re-aranjarea liniilor ADN germinale Unul
dintre cele mai remarcabile aspecte ale răspunsului imun este vasta diversitate a anticorpilorcare
pot fi orientaţi către multe antigene posibile şi particule individuale. Se estimează că un individ
poate produce potenţial mai multe milioane de tipuri de anticorpi cu specificităţi pentru tot atâtea
tipuri de antigene diferite. Un milion de molecule de anticorpi diferiţi nu pot fi codificaţi direct
de genomul uman, când genomul conţine numai aproximativ 25 000 de gene. Mecanismul
molecular de generare a unei astfel remarcabile diversităţi pornind de la o cantitate limitată de
ADN este acum înţeles. Inversiile şi deşaţiile regulate au un rol important în proces. Pentru a
înţelege cum se realizează acest lucru trebuie mai întâi să ne amintim structura anticorpilor.
Structura pe domenii a anticorpilor
Anticorpii aparţin unei clase de proteine numite imunoglobuline, care constituie
aproximativ 20% din proteinele din sânge. Cel mai abundent tip de anticorpi, imunoglobulinele G
(IgG) sunt molecule simetrice compuse din patru lanţuri polipeptidice: două identice grele H
(heavy) de 55 kDa şi două identice uşoare L (light) de 23 kDa. Lanţurile uşoare sunt compuse din
două domenii, un domeniu terminal numit VL, deoarece este uşor diferit sau “variabil” ca secvenţă
şi ca structura diferitelor molecule de anticorpi, şi un domeniu C terminal numit CL, care are o
structură identică sau “constantă” în toate moleculele IgG. Similar, lanţurile grele sunt compuse
din patru domenii, un domeniu N-terminal variabil VH şi trei domenii constante denumite CH1,
CH2, CH3.
Moleculele de anticorp leagă o moleculă de antigen prin intermediul suprafeţelor create la
intefaţa domeniilor VL şi VH ale antenelor în Y ale moleculei. În consecinţă, specificitatea de
legare a unui anticorp este determinată de secvenţa dfomeniilor VL şi VH.
SLIDE 53. Organizarea lanţurilor uşoare Organizarea lanţurilor
uşoare ADN
Anticorpii sunt produşi de limfocitele B. Genele care codifică anticorpi cu diferite
specificităţi de legare nu sunt moştenite direct din oul fertilizat. Mai degrabă acestea sunt
asamblate dintr-un număr de fragmente separate prezente în ADN-ul liniei germinative; acest
proces apare în timpul dezvoltării celulelor B din celulele
109
stem ale măduvei spinării. De exemplu, un aranjament funcţional al genelor care codifică pentru
lanţul uşor k (tipul major de la şoarece şi la om) conţine trei segmente. La capătul 5’ este segmentul
Lk; acesta codifică pentru o peptidă semnal sau ledader care direcţionează proteinele nou traduse
în reticolul endoplasmatic pentru prepararea secreţiei extracelulare a acestora. În timpul procesului
post-translaţional peptida semnal este înlăturată din structura lanţului uşor şi nu este prezentă în
molecula de anticorp matură. Cel de al doilea segment codifică pentru domeniul VL al lanţului
uşor şi al treilea segment de la capătul 3’ codifică pentru domeniul CL.
Aşa cum vedem în figură, ADN celulelor germinative şi a altor celule cu excepţia
limfocitelor B mature (de ex. spermă, ou) conţin un locus k care posedă o regiune variabilă la
capătul său 5’. Această regiune constă într-o bancă segmente leader Lk şi variabil Vk conţinând
aproximativ 100Lk +Vk unităţi la om; aceste unităţi sunt distribuite în tandem de-a lun gul unui
fragment de ADN ( Segmentul Lk corespunde exonului leader din gena finală; segmentul Vk
prinde majoritatea dar nu întreg exonul final VL care codifică regiunea variabilă a lanţului uşor).
Fiecare dintre unităţile Lk +Vk sunt lungi de aproximativ 400 nucleotide şi sunt separate de
aproximativ 7 kb; astfel 100 de unităţi Lk+Vk acoperă aproximativ 740 kb. Regiunea variabilă a
locusului k este urmată de cinci segmemente de îmbinare (joining-Jk) şi un segment constant Ck,
în ADN germinativ uman. Cele 5 segmente Jk sunt dispuse în tandem şi sunt separate de
aproximativ 20 kb de capătul 3’ al regiunii variabile. Fiecare dintre segmentele Jk este de
aproximativ 30 nucleotide şi sunt împrăştiate pe o distanţă de aprox 1,4 kb. Între segmentul 3’ Jk
şi segmentul circular Ck există un fragment de 2,4 kb. Numărul segmentelor Vk şi Jk variază cu
speciile de mamifere, totuşi există întotdeauna mult mai multe segmente Vk decât Jk.
SLIDE 54. Rearanjarea ADN care codifică lanţurile uşoare, Rearanjarea lanţurilor uşoare ADN
Când ADN se reorganizează pentru a face funcţională o genă k, un segment Vk este reunit cu un
segment Jk. Această reunire este realizată de o recombinază situs-specifică care recunoaşte
secvenţele de la capătul 3’ al fiecărui segment Vk şi capetele 5’ ale segmentului Jk.
Recombinarea între aceste secvenţe are ca rezultat o deleţie şi o inversiune la nivelul secvenţei
participante, depinzând dacă unitatea Lk + Vk posedă aceeaşi orientare transcripţională sau
orientare opusă faţă de segmentul Jk. Această recombinare formează regiunea variabilă
completă. Mai mult, se cunoaşte că orice Vk se poate reuni cu cu oricare Jk alegerea fiind
aleatoare. O dată ce segmentele Vk şi Jk sunt reunite, regiunile variabile şi constante sunt
transcrise împreună într-un transcript ARN primar. Secvenţele care intervin între Lk şi Vk şi
între Jk şi Ck (icluzând oricare dintre regiunile Jk rămase) sunt apoi înlăturate prin splicigul
ARN pentru a obţine proteina lanţului uşor k.
Atâta timp cât fiecare segment Vk şi Jk are o secvenţă nucleotidică unică, reunirea Vk-Jk
alre celor 100 segmente Vk şi 5 segmente Jk în liniile germinative umane poate produce 500
posibile lanţuri diferite. Dar reunirea Vk-Jk generează o şi mai mare variabilitate decât pot sugera
aceste calcule deoarece un număr mic, variabil de nucleotide sunt pierdute din segmentele Vk şi
Jk atunci când ele sunt reunite. Imprecizia procesului de reunire creşte mult diversitatea secvenţei
posibile de aminoacizi a VL codificată de către regiunile Vk-Jk reunite. Semnificativ această
regiune codifică mulţi dintre aminoacizii din situsul de legare a antigenului la capătul domeniului
VL.
110
 Pierderea aleatoare a nucleotidelor la situsul de reunire generează o diversitate
semnificativă în acest punct, dar sistemul plăteşte pentru această diversitate. Costul este evident
dacă ne amintim constrîngerile unei structuri codante. Trebuie să ţinem seamă că o secvenţă
codantă trebuie citită sub formă de triplete, şi că AUG (metionină) este codonul care defineşte o
fază de lectură care grupează restul regiunii codante in triplete. Astfel reunirea a două piese de
fragmente de ADN cum sunt Vk şi Jk pot produce o nouă fază de lectură corectă sau incorectă care
produce proteină non- sens. Deoarece reunirea segmentelor se face aleator, două din trei reuniuni
determină formarea unei proteinre non-sens.
În concluzie, au fost descrise trei surse de diversitate: - variabilitatea secvenţei multor
segmente Vk la nivelul locusului k; - variabilitatea variabilitatea secvenţelor unui mic
număr de segmente Jk; - variabilitatea numărului de nucleotiode deletate la reunirea Vk-
Jk. Există şi alte procese care generează o mult mai mare variabilitate prin modificarea
secvenţei ADN la nivelul reunii segmentelor.
SLIDE 55. Organizarea şi rearanjarea secvenţelor ADN ale lanţurilor grele Organizare şi
rearanjamentul lanţurilor grele ADN Genele funcţionale care codifică lanţurile grele ale
anticorpilor sunt formate prin procese similare celor deja descrise anterior pentru lanţurile
uşoare. Analiza situsurilor de legare ale a antigenelor la numeroşi anticorpi sugerează că
contribuţia lanţurilor grele la contactul cu antigenele este chiar mai mare decât contribuţia
lanţurilor uşoare. În concordanţă cu necesitatea de diversitate la nivelul lanţurilor grele, trei bănci
de segmente genetice contribuie la variabilitatea regiunii funcţionale a lanţurilor grele. Primele
două sunt formate din băncile fragmentelor VH şi JH ale lanţurilor grele iar cea de a treia este
formată din diversitatea segmentelor D (diversity) care sunt localizate între celelalte două bănci.
Diversitatea este asigurată de două procese de reunire, VH cu D şi D cu JH. Cu siguranţă
că reunirea a trei fragmente oferă o diversitate mult mai mare de combinare. ADN din liniile
germinale umane conţine aproximativ 100 segmente Vh, 30 segmente D şi 6 segmente funcţionale
JH. Pe lângă diversitatea furnizată de reunirile aleatoare ale segmentelor VH cu D şi a D cu JH o
anumită diversitate este furnizată de pierderea nucleotidelor la realizarea joncţiunilor care apar la
combinarea segmentelor. ADN pentru lanţurile grele din liniile germinale conţin şi multiple
segmente C care codifică pentru domeniile constante ale regiunii claselor de IgG variabile. O
combinare între procesările alternative ale ARN şi aranjamentele adiţionale (switching-ul clasei)
determină ce clasă de IgG este exprimată în anumite tipuri de celule B.
SLIDE 56. Amplificarea generalizată produce cromozomi
politeni Toate rearanjamentele ADN discutate anterior atât
funcţionale cât şi nefuncţionale implică modificări ale poziţiilor secvenţelor în cadrul genomului.
Alt tip de rearanjament implică amplificarea generalizată a secvenţelor ADN sau politenizarea.
Este exemplul glandelor salivare de la Drosophila care conţin cromozomi mari în interfază.
Când fixăm şi colorăm aceşti cromozomi, ei se caracterizează printr-un mare număr de benzi
demarcate, care pot fi utilizate pentru a stabili poziţia
111
şi ordinea genelor la Drosophila. Mărirea cromozomilor din glanda salivară şi din alte celule de la
Drosophila, apare atunci când ADN se replică repetitiv şi cromozomii obţinuţi nu sunt separaţi.
Rezultatul este formarea cromozomilor politeni compuşi din multe copii paralele . Amplificarea
ADN cromozomal creşte mult numărul de copii de gene, probabil pentru a suplini necesitatea de
ARNm pentru sinteza proteică care are loc celulele aceastei glande salivare masive. Totuşi, la
majoritatea cromozomilor care participă la politenizare, anumite secvenţe cum sunt secvenţele
simple ADN de la nivelul centromerilor şi telomerilor nu sunt amplificate. Mai mult genele
ribozomale tind să fie amplificate mai puţin decât alte sevenţe.
Mecanismul molecular al acestor procese este necunoscut, dar se pare că secvenţele simple
de ADN contribuie probabil la alinierea ADN amplificat de-a lungul lungimii cromozomilor
politeni.
SLIDE 57. Concluzii Diversitatea remarcabilă a moleculelor de anticorpi
este realizată prin asamblarea genelor funcţionale, care codifică lanţurile grele şi uşoare ale
anticorpilor, de la mai multe segmente cu secvenţă unică prezente în ADN din liniile germinale.
Segmentele care codifică pentru domeniile variabile ale lanţurilor uşoare şi grele din bănci
alternative de regiuni codante scurte;
Numărul mare de combinaţii posibile în care segmentele de gene ale lanţurilor grele şi
uşoare pot fi combinate reprezintă un mecanism de generare a variaţiilor secvenţei de aminoacizi
şi de creştere a specificităţii de legare a anticorpilor produşi de limfocite individuale. Diversitatea
creşte si datorită pierderilor sau adăugirilor aleatoare care se produc la reunirea capetelor
segmentelor genelor care codifică pentru lanţurile grele şi uşoare;
În unele organisme, celulele specializate îşi sporesc numărul şi mărimea ADN cromozomal
prin amplificare, producând cromozomi politeni cum sunt cei din glandele larvare de la
Drosophila. Cromozomii acestor celule gigante rezultă din aproximativ 10 replicări fără diviziune
celulară şi fără replicarea secvenţelor simple de ADN asociate centromerilor şi telomerilor
112
 NOTE DE CURS BM3 Reglarea Iniţierii Transcripţiei
SLIDE 2. Controlul genetic la bacterii: modelul Jacob-Monod Figura: Când represorul lac se
leagă la secvenţa numită operator (O), care se leagă chiar în amonte de gena lacZ, transcripţia
operonului de către ARN polimeraza este blocată. Legarea lactozei la represor determină o
modificare conformaţională a represorului astfel încât acesta nu se mai leagă la operator. ARN
polimeraza este apoi liberă să se lege la promotor (P) şi iniţiază transcripţia genelor lac; ARNm
policistronic rezultat este tradus în proteinele codificate.
O combinaţie între experimentele genetice şi biochimice la bacterii determină
recunoaşterea iniţială a
i) legarea proteinelor la secvenţele reglatoare asociate cu genele; , ii) proteinele a căror legare la
secvenţe reglatoare fie activează fie represează transcripţia.
Aceste componente cheie susţin (fundamentează) capacitatea atât a celulelor procariote cât
şi a celor eucariote de a activa sau inhiba (deschide sau închide) (Turn on or turn off) cu toate că
au fost descoperite diferite variante ale procesului de bază.
Ce urmărim: un rapel al modelelor experimentale timpurii privind controlul transcripţiei
bacteriene; un rapel al modului în care ARN polimerazele bacteriene iniţiază transcrierea şi
mecanismele prin care acestea au capacitatea de a realiza acest lucru.
La bacterii, controlul genetic serveşte în primul rând pentru a permite celulelor individuale
să se adpteze la schimbările mediului nutriţional astfel încât creşterea şi diviziunea să fie
optimizate.
Astfel, primele orientări ale cercetărilor s-au îndreptat către genele care codifică proteine a
căror producere variază în funcţie de statusul nutriţional al celulelor.
Deşi controlul genetic al organismelor multicelulare implică adesea răspuns la modificările
de mediu, este foarte caracteristic şi adesea scopul biologic esenţial îl reprezintă reglarea unui
proces genetic care susţine dezvoltarea embrionară şi diferenţierea tisulară. Mai mult, majoritatea
principiilor controlului transcripţional au fost mai întîi descoperite la bacterii şi apoi
aplicate/adaptate celulelor eucariote
SLIDE 3. Model experimental pentru evidenţierea secvenţelor care acţionează în cis Figura:
Demonstraţie experimentală că mutaţiile Oc acţionează în cis Celulele E. coli care conţin două
copii ale operonului lac sunt prezentate în diagramă. Liniile diagonale indică genele şi regiunile
de control purtătoare de mutaţii. În aceste celule, operonul lac al cromozomului bacterian şi
prezintă o mutaţie Oc la nivelul operatorului şi o mutaţie în gena lacZ (gena lacZ-) care
inactivează enzima beta-galactozidaza. Operonul lac din plasmida F este de tip sălbatic. (Top)
În absenţa inductorului IPTG, aceste celule exprimă constitutiv o permează funcţională dar nu şi
o beta-galactozidază. Aceste rezultate indică că mutaţia Oc afectează numai genele ale aceluiaşi
ADN. Dacă mutaţiile Oc ar fi acţionat în trans, transcripţia genei lacZ+ din plasmida F ar fi
condus la o activitatea beta-galactozidazică observabilă (în partea de jos). În prezenţa IPTG
 (Isopropyl β-D- 1-thiogalactopyranoside), sunt observate atât activitate galactozidazică cât şi
113
permeazică. Aşa cum se poate constata din diagramă, transcripţia genei lacZ normale
(salbatice) din plasmida F conduce la o beta-galactozidază funcţională.
SLIDE 4. Model experimental pentru evidenţierea secvenţelor care acţionează în trans Figura:
demonstraţie experimentală că gena lacI+ acţionează în trans. Celulele care posedă o singură
genă lacI- produc un represor inactiv, şi au ca rezultat expresia constitutivă a beta-
galactozidazei şi permeazei. Dacă o genă sălbatică lacI+ prezentă în plasmidele factor F este
introdusă în celule lacI-, celulele transformate produc un represor funcţional, care se poate lega
la operatorii lac. Ca rezultat aceste celule nu exprimă beta-galactozidază sau permează (lacto-
permează) în absenţa inductorului.
SLIDE 5. Inducerea operonului lac conduce la creşterea sintezei ARNm lac Figura:
demonstraţie biochimică că inductorul determină creşterea transcripţiei operonului lac.
Eşantioane de celule de E. coli crescute pe mediu de glucoză, au fost prelevate înainte şi la
scurte intervale după adăugarea IPTG. Uridină marcată cu tritiu a fost adăugată fiecărei probe
imediat după prelevare. După 20 de secunde celulele au fost lizate şi a fost izolat ARN. Fiecare
probă marcată a fost hibridizată cu un exces de ADN clonat fixat pe membrană. Radioactivitatea
rămasă pe menbrană este o măsură a vitezei de sinteză a ARNm în timpul perioadei scurte de
marcare. Procentajul total de ARN marcat cu tritiu care hibridizează cu ADN lac în raport cu
timpul după adăugarea IPTG indică că proporţia sintezei de ARNm creşte rapid după
adăugarea IPTG, ajungând la o rată maximală după două minute.
SLIDE 6: Concluzii Multe proteine bacteriene sunt inductibile, sinteza
lor fiind dependentă de statusul nutriţional al celulelor. Expresia diferenţială a genelor care
codifică astfel de proteine apare cel mai adesea la nivelul iniţierii transcripţiei;
În concordanţă cu modelul Jacob şi Monod privind controlul transcripţiei, transcripţia
operonului lac, care codifică trei proteine inductibile este represată de legarea proteinei represoare
lac la secvenţa operator. În absenţa lactozei sau a altor inductori represia este înlăturată şi operonul
lac este transcris;
Mutaţiile la nivelul promotorului, la care se leagă ARN polimeraza, sau la nivelul
operatorului acţionează în cis; aceasta înseamnă că ele afectează numai expresia genelor de pe
aceeaşi moleculă de ADN în care apare mutaţia;
Mutaţiile în secvenţa unui operator care scad legarea unui represor au drept rezultat o
transcripţie constitutivă. Mutaţiile în secvenţa promotorului, care afectează afinitatea de legarea a
ARN polimerazei, pot fie să scadă (mutaţie “down”) fie să crească (mutaţie “up”) transcripţia;
Represorii şi activatorii acţionează în trans; ei afectează expresia genelor reglate de ei
indifent de poziţionarea moleculei de ADN în celulă.
SLIDE 7. Inţierea transcripţiei la bacterii ➢ ARN polimeraza iniţiază transcripţia majorităţii
genelor la nivelul unei poziţii
unice situată în amonte de secvenţa codantă;
114
➢ Perechea de baze la nivelul căreia se iniţiază transcripţia este denumită “situs
de iniţiere a transcripţiei” sau Punct START; ➢ Prin convenţie, situl de iniţiere a transcripţiei
de pe secvenţa ADN este desemnată cu poziţia +1, bazele situate în sensul transcripţiei
(downstream) sunt desemnate cu numere pozitive iar cele poziţionate în sens opus (upstream)
sunt asimilate cu numere negative; ➢ Diferitele proteine (ARN polimeraze, activatori, represori)
interacţionedază cu ADN la nivelul promotorului sau în vecinătatea acestuia pentru a regla
iniţierea transcripţiei
SLIDE 8. Interacţiunile proteine-ADN identificate prin tehnica “footprinting Figura: Technica
Footprinting cu DN-aza I comună pentru identificarea situsurilor de legare a proteinelor la
ADN.
Un fragment de ADN care este marcat la unul din capete cu 32P (bilele roşii) ca şi în
metoda de secvenţiere Maxam şi Gilbert. Porţiuni din probă sunt apoi digerate cu DN-aza I în
prezenţa şi în absenţa unei proteine care se leagă la o secvenţă specifică din fragment. DN-aza I
hidrolizează aleator legăturile fosfodiester. La concentraţii scăzute DN-aza I este utilizată astfel
încât fiecare moleculă de ADN este clivată numai o dată. În absenţa proteinelor care se leagă la
ADN, proba este clivată la toate poziţiile posibile între capătul marcat şi nemarcat al moleculei.
Cele două probe de ADN sunt apoi separate de proteine, denaturate pentru desfacerea catenelor şi
supuse electroforezei. Gelul rezultat este supus electroforezei şi supus autoradiografiei pentru a
detecta numai catenele marcate şi pentru a identifica fragmentele care se întind de la capătul marcat
până la locul de acţiune al DN-azei I.
În dreapta se poate observa o autoradiogramă unde sunt analizate două fragmente de ADN
în absenţa şi în prezenţa unor proteine de legare la ADN după digestia cu DN-aza I. Pentru proba
digerată în prezenţa proteinelor de legare la ADN se observă lipsa a două benzi; acestea corespund
regiunii protejate de digestie prin legarea proteinelor (spunem ca am realizat un footprinting
privind legarea acestei proteine). Această regiune de protecţie poate fi foarte uşor aliniată cu
secvenţa ADN dacă se realizează o reacţie de secvenţiere a produşilor iniţiali şi a celor care s-au
obţinut în urma protecţiei furnizate de legarea proteinelor. Reacţiile de secvenţiere şi fragmentele
rezultazte în urma acţiunii DN-azei sunt trecute pe acelaşi gel.
SLIDE 9. Identificarea interacţiilor proteine-ADN prin tehnica “gel- shift assays” Figura:
Rezultatele unei determinări ale mobilităţii eledctroforetice prin tehnica de “întârziere în gel”
pentru proteinele care se leagă la ADN (EMSA-Electrophoretic Mobility Shift Assay).
În acest exemplu, fracţii ale unei coloane cromatografice de schimb ionic au fost analizate
pentru proteinele care se leagă la regiunea promotoare a unei gene pentru ARNt de la EK. Un
eşantion al fracţiei proteice este încărcată pe o coloană (ON) iar fracţiile eluate de pe coloană la
concentraţii saline crescute (numerele fracţiilor) au fost incubate cu o sondă (fragment de restricţie)
radiomarcată care include regiunea promotoare; fiecare probă a fost apoi supusă electroforezei
într-un gel de poliacrilamidă. Sondele libere care nu se leagă la proteine migrează în faţă. O
115
proteină prezentă în fracţiile 7 şi 8 eluate de pe coloană se leagă la sondă, formând un complex
ADN-proteină care migrează mult mai lent decât sonda liberă
SLIDE 10. Evidenţierea poziţionării ARN polimerazei la nivelul regiunii control
a represorului lac prin tehnica “footprint” Figura: Imagine “footprint” a legării
ARN polimerazei şi a represorului lac la regiunea control al ADN lac
Deoarece DN-aza I clivează unele legături fosfodiester mai frecvent decât altele, densitatea
benzilor în absenţa proteinelor (linia 3) nu sunt la fel de uniforme ca şi din figura din slide-ul 8.
Parantezele din dreapta indică regiunile ADN protejate de către digestia cu DN-aza I prin legarea
ARN polimerazei (linia 4) sau a represorului lac (linia 5). Liniile 1 şi 2 arată produşii celor două
reacţii de secvenţiere Maxam şi Gilbert: de pe aceste linii, benzile din gel pot fi corelate cu secvenţa
nucleotidică a regiunii de control lac. Poziţiile în secvenţă sunt notate pe partea stângă; capetele
săgeţilor indică direcţia transcripţiei. Experimrentul “footprinting” a fost realizat ci marcate la
capătul 5’ al capătului din dreapta al catenei superioare ca şi în slide-ul 6.
SLIDE 11. Regiunea control a operonului lac conţine 3 situri critice “cis-acting”
Figura: Diagrama regiunii de control a transcripţiei a operonului lac.
Regiunea codantă a beta-galactozidazei N terminale este către dreapta, şi regiunea codantă
C-terminală a represorului lac este în stânga. Regiunile protejate de digestia cu DN-aza I
(footprints) de către cAMP-CAP, ARN polimeraza şi represorul lac sunt indicate prin barele
colorate de deasupra. Analizele mutaţionale identifică trei regiuni critice cu acţiune în cis: două în
promor (regiunea galbenă de la –35 la -10) şi una între +1 la +20 situată la nivelul operatorului (în
maron).
Regiunea “footprint” represoare se suprapune capătului din amonte a regiunii “footprint”
a ARN polimerazei dar nu este prea mare. Experimente similare de “footprint” au demonstrat că o
a treia proteină, numită CAP care se complexează cu cAMP ( cAMP-CAP) se leagă de asemenea
la regiunea de control lac. Complexul cAMP-CAP acţivează transcripţia de la nivelul promotorului
lac.
SLIDE 12. ARN polimeraza se fixează specific la nivelul secvenţelor
promotorului pentru a iniţia transcripţia Figura: reprezentarea schematică
modului de legare la ADN a formei majore a ARN polimerazei de la E. Coli.
Prin convenţie, situsul de iniţiere a transcripţiei este numerotat, în general, cu +1. Perechile
de baze care se extind în direcţia transcripţiei sunt numite “downstream”, în aval, faţă de situsul
de iniţiere a transcripţiei; cele care sunt extinse în regiunea inversă sunt considerate “unstream”
sau în amonte. Subunitatea sigma70 se leagă la secvenţe specifice situate lângă poziţiile –10 la –
35 ale promotorului. Subunităţile alfa se leagă strâns la ADN din amonte, iar beta şi beta’ sunt
asociate punctului de start.
SLIDE 13. Diferenţele de la nivelul secvenţelor promotorului E. coli afectează
 frecvenţa iniţierii transcripţiei Figura: Promotorii recunoscuţi de către ARN
polimeraza (conţinând secvenţa sigma70) de la E. coli.
116
 a) Secvenţele unor promotori “puternici” cu spaţii (puncte) introduse pentru a maximiza
omologia la nivelul regiunii –10 la –35. Aceste secvenţe corespund catenei sens (de sus) a
promotorului în condiţiile în care procesul de transcripţie se realizează de la stînga la dreapta.
Bazele care corespund secvenţei consens din regiunea –35 la – 1o sunt colorate în galben. Şase
dintre secvenţe corespund secvenţelor control ale genelor care codifică pentru ARN. Secvenţele
din structura regiunilor promotoare ale Lambda, T7 şi fd, care sunt prezente în genoame virale
care sunt direct transcrise de către ARN polimeraza celulei gazdă.
b) Secvenţele consens ale regiunilor –35 la –10, care sunt separate de 15-17 pb. Sunt descrise
mutaţiile cunoscute ca descrescând semnificativ frecvenţa transcripţiei unui anumit număr de
promotori. În secvenţele consens, frecvenţa cu care bazele indicate apar la fiecare poziţie la
diferiţi promotori sigma70 este indicată după cum urmează: litere în roşu: > 70%; litere boldite
negre: 50-70%; litere negre: 40-50%.
c) secventele regiunilor /35 la /10 ale promotorului lac care sunt diferite de secvenţa
consens în patru poziţii (în albastru) Mutaţiile “down” determină scăderea expresiei operonului
lac. Cele două mutaţii “up” care cresc gradul de asemănare a regiunii –10 cu secvenţa consens,
cresc expresia.
SLIDE 14. Majoritatea secvenţelor operator sunt scurte repetiţii inversate Figura: Secvenţa
operatorului lac reprezintă o secvenţă repetitivă inversată aproape perfectă centrată în jurul
unei secvenţe GC situată în poziţia 11.
Secvenţa de 17 pb de pe catena sens care începe la –7 este identică cu secvenţa de 17 pb
situată pe catena antisens şi începe la +28, cu excepţia nucleotidelor indicate în italic. Fiecare din
aceste secvenţe repetitive este denumită “jumătate de situs operator”.
SLIDE 15. Majoritatea represorilor bacterieni sunt structuri dimere care conţin
elice α care se inserează în fosele majore adiacente ale ADN Figura: Modele
privind represorul bacteriofagului 434 şi interacţiunea sa cu ADN
Acesta şi mulţi alţi represori bacterieni sunt homodimeri care inserează un helix alfa (helixul
de recunoaştere) al fiecărui monomer într-o fosă majoră a operatorului ADN. Represorii
bacteriofagilor se leagă la secvenţele operator din genomul viral prevenind astfel transcripţia de
către ARN polimeraza celulei ţintă.
a) Modelul cu bile (space-filling model) al represorului dimer 434 legat la operatorul său
ADN specific
b) Modelul paglică al monomerului superior (de sus) al represorului dimer 434 arătând
interacţia sa cu ADN. Trei resturi de glutamine (Q), o serină (S) şi o treonină (T) în helixul de
recunoaştere formează legături de hidrogen cu bazele din fosa majoră a ADN operator;
c) Diagrama “in fire” demonstrând interacţiile dintre ADN şi monomerul inferior şi interfaţa
dimerului în represorul 434. Punctele roşii indică legăturile de hidrogen şi ionice dintre represor şi
ADN. Cercurile mici reprezintă molecule de apă legate.
117
 SLIDE 16. Modificările conformaţionale induse de liganzi modifică afinitatea
multor represori pentru ADN Figura: Modificări conformaţionale în structura
apo-represorului cauzate de legarea triptofanului.
Elicele alfa din proteina dimeră, reprezentate ca cilindri, sunt identificate prin literele
majuscule într-un monomer şi literele minuscule în celălalt. Elicele de recunoaştere (E şi e) sunt
prea apropiate apropiate pentru a intra în fosele majore adiacente ale operatorului ADN. Când
aporepresorul leagă triptofanul, capetele N terminale ale elecelor E şi e se deplasează cu 8 A. Drept
rezultat elecele E şi e din represor împreună cu triptofanul legat (in portocaliu) se orientează (se
dispun) în operatorul ADN.
SLIDE 17. Controlul pozitiv al operonului lac este exercitat de către cAMP-CAP Figura:
Control transcripţional pozitiv şi negativ al operonului lac de către represorul lac şi respectiv
cAMP-CAP
a) În absenţa lactozei, nu se formează ARNm lac deoarece represorul se leagă la operatorul
lac şi împiedică trancripţia;
b) În prezenţa glucozei şi lactozei, represorul lac se leagă la lactoză şi suferă modificări
conformaţionale şi astfel nu se mai poate lega la operatorul lac. Totuşi, cAMP este scăzut, deoarece
glucoza este prezentă şi atunci complexul cAMP-CAP nu se leagă sitului CAP de pe operator. Ca
rezultat, ARN polimeraza nu se leagă eficient la promotorul lac şi este sintetizat numai puţin
ARNm lac;
c) În prezenţa lactozei şi în absenţa glucozei, apare transcripţie maximă la nivelul operonului
lac. În această situaţie, represorul lac nu se leagă la operatorul lac, concentraţia cAMP creşte şi
coplexul cAMP-CAP format se leagă la situsul CAP, stimulând legarea şi iniţierea de către ARN
polimerază.
SLIDE 18. Legarea cooperativă a cAMP-CAP şi a ARN polimerazei la regiunea
de control a lac activează transcripţia Figura: Legarea cooperativă a ARN
polimerazei de la E. Coli şi a complexului cAMP-CAP la promotorul lac.
Prin propria structura, ARN polimeraza şi cAMP-CAP posedă afinităţi relativ reduse
pentru situsurile lor de legare la promotorul lac. Totuşi, interacţia dintre regiunile CAP şi
subunitatea alfa a ARN polimerazei formează un complex proteină- proteină care se leagă mult
mai stabil la promotorul ADN decât fiecare dintre cele două proteine singură.
SLIDE 19. Model de legare a cAMP-CAP la secvenţa promotoare lac promoter Figura: Modelul
cu bile de legare a complexului cAMP-CAP la promotorul lac
CAP leagă ADN dublu helix în jurul suprafeţei sale. Când există resturi de aminoacizi
mutante complexul cAMP-CAP nu mai activează transcripţia de la nivelul promotorului lac.
Secvenţa ADN situată la extremitatea complexului reprezintă regiunea din apropierea poziţiei –50
unde capătul C terminal al unei subunităţi alfa se consideră că interacţionează resturile mai închise
la culoare din structura CAP.
118
 SLIDE 20. Transcripţia de la nivelul unor promotori este iniţiată de factorii sigma (σ) alternativi
Tabel: Transcripţia majorităţii promotorilor de la E. Coli este demarată prin interacţia
promotorilor cu ARN polimeraza care conţine factorul sigma70. Transcripţia anumitor grupe de
gene, totuşi, este realizată de către ARN polimeraze care conţin una sau mai multe alternative de
factori sigma: sigma28, sigma32, sigma38 şi sigma54-care recunosc secvenţe promotor consens
diferite de sigma70. Atât sigma28 şi sigma32 prezintă regiuni de omologie cu sigma70 şi
recunosc secvenţe situate tot în intervalul –35 la –10.
SLIDE 21. Activarea subunităţii σ54 a ARN polimerazei la nivelul promotorului glnA de către
NtrC Figura: Activarea subunităţii sigma54 a ARN polimerazei la promotorul glnA de către
NtrC (Nitrogen regulatory Protein) glnA este o genă care codifică pentru enzima glutamin
sintetaza care sintetizează glutamina pornind de la acidul glutamic şi amoniac.
Polimeraza se leagă la promotorul glnA, formând un complex unit (strâns), înainte de
activare. Ca răspuns la concentraţiile mici de aztot organic, o protein kinază numită NtrB
fosforilează proteina dimeră NtrC (purpurie) care apoi se leagă la doi “enhancers” (portocaliu)
poziţionaţi la –108 şi –140 faţă de situsul de START al transcripţiei. Dimerii NtrC fosforilaţi legaţi
interacţionează cu subunitatea sigma54 legată determinând formarea unei bucle la nivelul ADN
implicat. Activitatea ATP- azică A NtrC stimulează apoi polimerază să desfacă catenele la situsul
de start, formând un complex deschis. Transcripţia genei glnA poate să înceapă.
SLIDE 22. Vizualizarea buclei ADN şi a interacţiilor legării NtrC şi subunităţii
σ54 a polimerazei Figura: Vizualizarea buclei ADN şi interacţiilor Ntrc şi a
subunităţii sigma54 a polimerazei
a) Micrografie electronică a fragmentului de restricţie ADN cu cei doi dimeri NtrC fosforilaţi
legaţi la regiunea enhancer lângă unul din capetele subunităţii sigma54 a polimerazei legată la
promotorul glnA lângă celălat capăt.
b) Micrografie electronică a aceluiaşi fragment demonstrând legarea dimerilor NtrC şi a
subunităţii sigma54 a polimerazei unul cu altul cu formarea buclei de ADN între aceştia.
SLIDE 23. Multre răspunsuri bacteriene sunt controlate de sisteme reglatoare
bi-componente Figura: Sistemul bicomponent reglator PhoR/PhoB de la E. Coli
Ca răspuns la concentraţiile scăzute de fosfaţi din mediu şi spaţiul periplasmic, un ion fosfat
disociază din domeniul periplasmic a proteinei senzor PhoR (portocaliu). Aceasta determină o
modificare conformaţională care activează un domeniu transmiţător al unei protein kinaze din
regiunea citosolică a PhoR. Domeniul transmiţător activat transferă un un gama-fosfat din structura
ATP unui rest de histidină conservat din structura domeniului transmiţător. Acest fosfat este apoi
transferat unui acid aspartic din domeniul receptor al regulatorului răspunsului ProB (purpuriu).
Mai multe proteine ProB pot fi fosforilate de către una activată ProR. Proteinele fosforilate ProB
activează apoi transcripţia de la gbenele care codifică
119
proteine care ajută celula să răspundă la cantitatea mică de fosfat, incluzând phoA, phoS, phoE şi
ugpB.
SLIDE 24. Concluzii (I)
ARN polimerazele sunt proteine mari compuse din subunităţi beta, beta’ şi două subunităţi
alfa care formează “core” polimeraza şi o subunitate sigma, din câteva alternative, care
funcţionează ca factor de iniţiere;
Iniţierea începe când subunitatea sigma a moleculei de polimerază se leagă la secvenţa
promotor, formând un complex unit. Polimeraza separă apoi catenele pe o distanţă de 12-13 pb la
nivelul situsului de start a transcripţiei, formând un complex deschis. După ce aproximativ 10
ribonucleotide au fost polimerizate, subunitatea sigma este eliberată şi “core” polimeraza continuă
transcripţia matriţei;
“Puterea” unui promotor se referă la cât de frecvent ARN polimeraza iniţiază transcripţia
pornind de la acesta. Subunitatea sigma70, factorul major în iniţiere la E. coli, interacţionează cu
secvenţele promotor situate în regiunea –10 la –35 faţă de situsul de start;
Represorii se leagă la secvenţele de ADN numite operatori, care se suprapun parţial cu
regiunea promotoare la nivelul căreia se leagă ARN polimeraza. Legarea represorului interferă cu
legarea ARN polimerazei şi cu iniţierea transcripţiei;
Activatorii subunităţii sigma70 a ARN polimerazei se leagă, în general, la ADN pe partea
opusă a helixului faţă de polimerază, în regiunea –20 la –50, sau chiar în amonte de polimerază,
în apropierea –60;
SLIDE 25 Concluzii (II) Activatorul cAMP-CAP stimulează transcripţia
prin formarea unui complex cu ARN polimeraza care prezintă o mai mare afinitate pentru
situsuri ADN specifice decât proteinele individuale. În plus faţă de stimularea legării
polimerazei, activatorii pot stimula şi formarea complexului deschis şi începerea transcripţiei;
Mulţi represori bacterieni sunt dimeri. Fiecare monomer conţine un alfa-helix care se
inserează în fosa majoră a operatorului ADN, astfel încât dimerul se leagă la fose majore succesive.
Afinitatea mare de legare este rezultatul formării multor legături de hidrogen, ionice şi van der
Waals dintre proteine şi secvenţe ADN specifice;
Secvenţele de ADN care leagă proteinele reglatoare dimere sunt secvenţe repetitive
inverse, care reprezintă fiecăre jumătaţi de situsuri care leagă un monomer;
Operonii transcrişi de către subunitatea sigma54 sunt reglate prin activatori care se leagă
la secvenţe “enhancer” de aproximativ 100 pb în amonte de situsul de iniţiere. Secvenţele
“enhancer” care leagă activatori inetracţionează tranzitoriu cu polimeraza echilibrată legată la
nivelul promotorului, stimulând formarea unui complex deschis şi inţierea transcripţiei;
În sistemele bi-componente reglatoare, o proteină acţionează ca un senzor, monitorizând
nivelul de nutrienţi din mediu. În condiţii adecvate, proteina senzor activează o a doua proteină,
reglatorul răspunsului, care se leagă apoi la secvenţele reglatoare, stimulând sau represând astfel
transcripţia genelor specifice.
120
SLIDE 26. Controlul genelor eucariote: scop şi principii generale ➢ Spre deosebire de celulele
bacteriene şi eucariotele unicelulare, celulele organismelor pluricelulare au relativ puţine gene
reglate reversibil de condiţiile de mediu;
➢ Controlul genetic al organismelor pluricelulare este important pentru dezvoltare şi
diferenţiere şi,
➢ În general, nu este reversibil
În interiorul unei celule bacteriene singulare, genele sunt reversibil induse şi represate prin
control transcripţional pentru a ajusta maşinăria enzimatică celulară mediului înconjurător
nutriţional şi fizic. Eucariotele monocelulare, cum sunt drojdiile, posedă şi ele multe gene care
controlează răspunsul la variaţia mediului (cum ar fi statusul nutriţional, tensiunea de oxigen şi
temperatura). Chiar în organele organismelor superioare, de exemplu, ficatul mamiferelor unele
gene pot răspunde reversibil la stimulii externi cum sunt noxele chimice. Totuşi, în general
celulele eucariotelor pluricelulare sunt protejate de influenţele externe imediate; adică
majoritatea celulelor îşi desfăşoară activitatea într-un mediu constant. Probabil, din acest motiv
genele care răspund schimbărilor de mediu contrituie o fracţie mult mai mică din numărul
celulelor unui organism multicelular decât în organismul unicelular. Cea mai importanta
caracteristică a controlului genetic la organismele multicelulare este exactitatea execuţiei deciziei
precise de dezvoltare astfel încât gena necesară să fie activată într-o anumită celulă la un anumit
moment din dezvoltarea organismului care conţine un număr mare de tipuri celulare. În
majoritatea cazurilor o dată ce etapa de dezvoltare a fost depăşită de o celulă, ea nu este
reversibilă. Astfel, aceste decizii sunt fundamental diferite de inducţia sau represia bacteriană. În
executarea programului lor genetic, multe tipuri celulare diferite (ex. celulele din piele, celulele
rosii din sânge, celule producătoare de anticorpi, etc) marchează o cale către moartea celulară
finală. Profilele determinate ale controlului genetic care conduc la diferenţiere servesc
necesităţile întregului organism şi nu supravieţuirii individuale a celulei.
SLIDE 27 La eucariotele superioare reglarea multor gene se
realizează prin controlul transcripţiei Figura: Determinarea ratei de
transcripţie a lanţurilor în formare ale unei gene prin tehnica “run-on” Nucleii izolaţi au fost
incubaşi cu 32P-ribonucleotid trifosfaţi pentru o perioadă scurtă. În timpul acestei perioade
moleculele de ARN polimeraze care transcriu o genă când nucleii sunt izolaţi adaugă 300-500
nucleotide lanţurilor de ARN în formare. Apar foarte puţine reacţii de iniţiere. Prin hibridizarea
ARN marcat cu ADNc pentru o genă specifică (A în acest caz), poate fi măsurată fracţia de ARN
total produsă de pe această genă (deci transcripţia sa relativă).
Măsurătorile directe ale ratelor de transcripţie ale mai multor gene în diferite tipuri celulare
au arătat că reglarea iniţierii transcripţiei este forma universală a controlului genetic la eucariote
ca şi la bacterii. Cea mai simplă şi mai directă metodă de a măsura ratele de transcripţie este aceea
de a expune celulele pentru un timp foarte scurt (de exemplu 5 minute sau mai puţin) unui
precursor ARN marcat (ribonucleotid) şi apoi să se determine cantitatea de ARN nuclear marcat
format prin hibridizarea sa cu un ADN clonat. Această metodă poate fi folosită pentru a determina
ratele de transcripţie în culturile de celule dar nu şi în întregul organism deoarece cantitatea de
ARN marcat obţinut este insuficientă pentru măsurători de acurateţe. Chiar şi în
121
celulele cultivate, o a doua metodă numită “ analiza produsului în formare”(nascent- chain
analysis) sau (“run-on” analysis) este adesea preferată. În această metodă, nucleii sunt izolaţi din
celule şi permit incorporarea 32P din ribonucleotid trifosfat în catenele de ARN în formare.
Vitezele relative de transcripţie determinate fie prin marcarea culturilor de celule sau a nucleilor
izolaţi sunt aproximativ aceleaşi, inbdicând că moleculele de polimeraze care sunt active la nivelul
nucleilor chiar dacă sunt scoase din mediul celular.
SLIDE 28. Sinteza diferenţiată a 12 molecule ARNm codificate
specific de gene hepatice Figura: Demonstracţie experimentală a
sintezei diferenţiale a 12 moleculele de ARNm care codifică proteine hepatice specifice
Nucleii din ficat, rinichi, celule din creier de şoarece au fost expuse la 32P- UTP, şi ARN
marcat rezultat a fost hibridizat cu diferite molecule de ADNc fixate pe nitroceluloză. După
îndepărtarea ARN nehibridizat, hibrizii au fost evidenţiaţi prin autoradiografie. Moleculele de
ADNc marcate codifică pentru 1-12 proteine sintetizate activ în ficat (de exemplu 4 = albumină,
3 = alfa1-antitripsină, 6 = transferină) dar nu în majoritatea celorlalte ţesuturi. Celelalte
molecule de ADNc testate au fost actina (A), alfa- şi beta-tubulina (αT şi βT), care sunt proteine
ce se detectează în majoritatea tipurilor celulare. ARNt pentru metionină şi ADN plasmidial (pB)
în care ADNc au fost clonate au fost folosite drept control. Intensitatea spoturilor generată prin
hibridizarea ARN sintetizat în timpul transcripţiei “run-on” in vitro izolaţi dincele trei ţesuturi
indică că genele care se exprimă specific în hepatocite sunt transcrise în ficat dar nu sunt
transcrise în celulele altor ţesuturi.
Rezultatele analizelor “run-on” sunt ilustrate în figură şi demonstrează că transcripţia
multor gene care care codifică proteine exprimate specific în hepatocite (celulele majore ale
ficatului mamiferelor) este întradevăr detectată şi în nucleii preparaţi din ficat, dar nu şi în nucleii
izolaţi din creier şi rinichi. Analizând măsurătorile sintezelor de ARN din timpul dozărilor “run-
on” , aceste rezultate indică că sintezele diferenţiale ale proteinelor specifice ficatului sunt reglate
de factori de control a transcripţiei genelor corespunzătoare în diferite ţesuturi. Rezultate similare
au fost obţinute în experimentele “run-on” realizate pe alte tipuri celulare şi pe o largă varietate de
proteine ţesut-specifice, indicând că controlul transcripţional este comun în organismele complexe.
SLIDE 29. Analiza ADN „Microarray” Analizele ADN microarray oferă o
vedere globală asupra modificărilor în procesul de transcripţie, de exemplu, ca urmare a
adăugării de SFV (ser fetal) la celulele umane în cultură.
Serul conţine factori de creştere care stimulează celulele în faza staţionară către creştere şi
diviziune. Prin analiza ADN microarray se pot detecta factorii de trasncripţie relativi ai genelor în
două populaţii celulare în cultură. Această analiză constă în spot-uri foarte fine de ADN ataşate pe
o lamă de microscop sau pe alt suport. Fiecare spot constă în mai multe copii de secvenţe ADN
dintr-o singură genă umană. Se realizează două preparate ARN:
i) un preparat de ARN, care conţine toate tipurile de ARN provenind de la celulele
staţionare care au fost cultivate în mediu fără ser care este marcat cu molecule fluorescente verzi;
122
 ii) un preparat de ARN care conţine toate tipurile de ARN de la celulele în creştere şi
diviziune cultivate pe mediu cu SFV şi marcate fluorescent în rosu.
Cele doua preparate sunt amestecate şi hibridizate pe lamă, unde acestea se vor împerechea
cu secvenţele genelor lor corespunzatoare. Spoturile verzi (ex. spot 3) indică genele care sunt
transcrise în celulele nedivizate crescute în lipsă de ser. Spoturile rosii (ex. spot 4) indică genele
care sunt transcrise în celulele în diviziune, iar spoturile galbene (ex. spot 1 şi 2) indică genele care
sunt transcrise în cele două tipuri celulare (staţionare şi în diviziune) [From V. R. Iyer et al., 1999,
Science 283:83).
SLIDE 30. Elementele reglatoare la eucariote ➢ Reprezintă adesea mii de kilobaze
în amonte sau în aval de START; ➢ Principiile de bază care controlează transcripţia la bacterii
există şi la eucariote: transcripţia este iniţiată la nivelul unei regiuni specifice şi este controlată
de legarea proteinelor “trans-activatoare” (factori de transcripţie) la secvenţele “cis-
activatoare” din structura ADN;
➢ Elementele “cis-activatoare” sunt adesea mult mai departe de promotorul pe care îl
reglează, transcripţia la nivelul unui singur promotor poate fi reglată prin legarea mai multor
factori de transcripţie la elementele de control alternative;
➢ Secvenţele care controlează transcripţia pot fi identificate prin analize de deleţie în serie
la capătul 5’.
Genele procariote şi eucariote sunt structurate după aceeaşi logică de bază, dar cu diferenţe
importante în detaliile moleculare. O definiţie sintetică a unei gene eucariote poate fi utilă pentru
a rezuma esenţa acestor diferenţe. Este general admis că o singură definiţie dată genei eucariote
nu poate satisface pe toată lumea sau să corespundă la toate exemplele. Cea pe care am adoptat-o
este rezultatul structurii moleculare a genelor care asigură o gamă largă de funcţiuni în diverse
organisme eucariote. Definiţia ţine cont de diferenţele de localizare şi de tipurile de secvenţe care
influenţează expresia genelor. Aceasta presupune implicit că mutaţiile fenotipice observabile sunt
rezultatul modificărilor la nivelul semnalelor de reglare dar şi în secvenţele codante.
Definim gena ca fiind o combinaţie de segmente de ADN care, împreună, constituie o
unitate de expresie, o unitate care determină formarea unui produs specific şi funcţional al genei
şi care poate să fie o moleculă de ARN sau un polipeptid. Segmentele de ADN care definesc gena
includ:
1. Unitatea de transcripţie care este constituită dintr-un segment ADN continuu care
codifică pentru secvenţa transcriptului primar; acesta include:
a) secvenţa codantă a ARN matur sau a proteinei produse, b) intronii şi c) secvenţele leader 5’ şi
coadă 3’ prezente la nivelul ARNm matur ca şi secvenţele de separare care sunt eliminate în
timpul maturării trannscripţilor primari care codifică pentru ARN.
2. Secvenţele minimale necesare pentru iniţierea corecte a transcripţiei (promotorul) şi
pentru a da naştere extremităţii 3’ particulare din structura ARN matur.
 3. Elementele secvenţei care determină frecvenţa de iniţiere a transcripţiei; acestea cuprind
secvenţele responsabile de inducerea şi represia transcriăţiei şi de specificitatea celulară, tisulară
şi temporală a transcripţiei. Aceste regiuni sunt foarte variate structural, ca poziţie şi ca funcţie
pentru a putea purta un singur nume. Dintre acestea enumerăm elementele activatoare (enhancers)
şi elementele moderatoare
123
(silencers), care sunt secvenţe ce influenţează iniţierea transcripţiei la distanţă, independent de
localizarea lor în raport cu situsul de iniţiere.
În această definiţie a genei nu sunt incluse secvenţele ADN care influenţează configuraţia
unei gene în cromatină şi nici cele care codifică proteine sau ARN care modulează expresia unei
anumite unităţi de transcripţie.
Într-o reprezentare grafica, începutul genei este în stânga şi capătul în dreapta, în acord cu
convenţia generală admisă de reprezentare a transcripţiei. Aceasta semnifică că braţul de ADN
care are aceeaşi structură cu ARN transcris, este braţul sens 5’-3’ orientat de la stânga la dreapta
şi este în general reprezentat ca braţul superior. Matricea de transcripţie, catena antisens este
orientată 3’-5’ de la stânga la dreapta (braţul inferior). Pentru a uşura schemele, catena sens este
adesea singura reprezentată. Poziţia primei nucleotide în molecula transcript este notată +1, iar
nucleotidele situate în aval în unitatea de transcripţie sunt numerotate pozitiv (ex. +16).
Nucleotidele care sunt în amont de +1 (secvenţă netranscrisă) sunt desemnate cu numere negative
(ex. -25).
O modalitate uşoară de a examina relaţia care există între noile caracteristici structurale ale
genelor eucariote şi expresia şi reglarea lor constă în a pleca de la exemple de gene reprezentative
în contextul ARN polimerazei care iniţiază expresia acestora. Astfel, vor fi discutate pe rând
caracteristicile structurale ale genelor de clasă I, clasă II şi clasă III; caracteristicilor ARN
polimerazelor respective; mecanismele de reglare a transcripţiei. Maturarea transcripţilor primari
ARN, în particular mecanismul procesului de excizie-episaj care determină producerea ARNm,
ARNr şi ARNt. Într-o altă secţiune vor fi examinate motivele structurale care permit factorilor de
transcripţie proteici să interacţioneze cu secvenţe specifice din structura ADN şi între ei. Capitolul
se va termina cu examinarea mecanismelor cele mai generale de reglare, şi anime cele care
influenţează reînnoirea ARNm, şi a modului în care blocuri mari de gene sunt reglate prin
modificarea ADN sau a cromatinei în care genele sunt împachetate.
SLIDE 31. Secvenţele promotoare ale mai multor gene structurale
eucariote Figura: Secvenţele promotoare ale unor gene
eucariote. Segmentul omolog, TATA box, este colorat în roşu şi prezintă proporţiile diferitelor
baze precunm şi secvenţa consens cea mai probabilă. Informatii suplimentare
Fenotipul unui organism sau a unei celule diferenţiate este, în mare măsură, determinat de
cantitatea şi de varietatea proteinelor pe care acesta (aceasta) le conţine. Acest lucru reflectă, în
general, concentraţia şi natura ARNm sintetizate. Principalul mecanism responsabil de diferitele
fenotipuri este deci expresia diferenţiată a genelor din clasa II. Această relaţie fundamentală între
expresia genelor şi fenotip a fost stabilită prin măsurători comparative ale cantităţii proteinelor şi
ale cantităţii ARNm în diferite stadii ale dezvoltării unui organism în diverse ţesuturi diferenţiate
ale aceluiaşi organism şi chiar în celule identice aflate în stadii fiziologice diferite.
În principiu, dar şi în realitate, reglarea expresiei unei gene poate să intervină în orice etapă
a biogenezei ARNm sau la traducerea acestuia în proteină. O serie de experimente indică că
determinantul esenţial al nivelului ARNm este iniţierea transcripţiei. Acest proces este reglat în
principal prin interacţia elementelor secvenţei (elementele cis) prezente la nivelul situsului de
iniţiere sau la distanţe variabile de acesta, cu o colecţie de proteine specifice (factori de transcripţie
care acţionează în trans) dintre care cea mai mare parte recunosc secvenţe particulare de ADN.
Astfel,
124
atât reglarea temporală a transcripţiei cât şi reglarea sa specifică în funcţie de ţesut sunt determinate
de prezenţa şi cantitatea diferiţilor factori care acţionează în trans. Viteza şi natura procesului de
excizie-episaj a pre-ARNm reprezintă cel de al doilea mecanism important care contribuie la
reglarea nivelului ARNm. Degradarea diferenţială a moleculelor ARNm influenţează şi ea
expresia anumitor gene. Transportul moleculelor de ARNm din nucleu către citoplasmă poate să
participe şi el la controlul expresiei genelor ce codifică pentru proteine, cu toate până în prezent
există destul de puţine date care să susţină această ipoteză. În plus, chiar traducerea ARNm poate
fi reglată în acest sens existând multe date probatorii. Degradarea selectivă a proteinelor contribuie
şi ea la reglarea nivelului lor, dar importanţa acestui proces nu este încă clarificată. Dacă proporţia
de re-înnoire a unei proteine influenţează echilibrul concentraţiei unui component critic al
maşinăriei de traducere, de exemplu un factor care acţionează în trans, influenţa sa poate fi mare
asupra sintezei moleculelor de ARNm.
SLIDE 32. Construcţia şi analiza deleţiilor seriate în 5’ Figura: Construcţia şi analiza
deleţiilor 5’ seriate pentru a localiza secvenţele de control a transcripţiei situate în amonte de
genele eucariote
Un fragment de ADN (galben) care conţine o regiune start a transcripţiei este clonată într-
un vector plasmidial (upper-left). Plasmida este linearizată prin digestia cu o enzimă de restricţie
(A) care scindează la capătul din amonte a fragmentului linearizat. ADN linearizat este apoi digerat
cu o exonuclează pentru diferite perioade de timp, astfel încât lungimi diferite de ADN sunt
înlăturate de la fiecare capăt. După adăugarea unui linker oligonucleotidic şi digestia cu cu
enzimele de restricţie B şi C, fragmentele înlăturate sunt clonate într-un vector plasmidial care
conţine o genă raportor slabă (albastru deschis). Plasmidele prezentând fragmente de lungimi
diferite ale regiunii din amonte (regiunea din 5’ ale situsul de demarare a transcripţiei) sunt apoi
transfectate în culturi de celule (sau folosite la realizarea de animale transgenice) şi este
determinată expresia genei raportor. Rezultatele acestui exemplu ipotetic indică că fragmentele
testate conţin două elemente de control. Capătul 5’ al uneia este cuprins între deleţiile 2 şi 3;
capătul 5’ al celeilalte este corelat cu deleţiile 4 şi 5.
SLIDE 33. Sinteza moleculelor de ARN este catalizată de 3 polimeraze Figura: Separararea şi
identificarea celor trei ARN polimeraze de la eucariote prin cromatografie pe coloană.
Un extract proteic din nuclei celulelor de broască a fost trecut pe o coloană de DEAE
Sephadex pe care proteinele încărcate se absorb diferit. Proteinele absorbite sunt eluate (curba
albastră) cu o soluţie cu concentraţie de NaCl crescândă. Fracţiile care conţin proteinele eluate
sunt testate pentru capacitatea lor de a realiza transcripţia ADN (Curba roşie) în prezenţa a patru
ribonucleotid-trifosfaţi. A fost măsurată şi sinteza ARN de către fiecare fracţie în prezenţa a
1microgram/ml de alfa-amanitină (curba bleu). La această concentraţie alfa-amanitina inhibă
activitatea polimerazei Iidar nu afectează pe cea a polimerazelor I şi III (Polimeraza III este
sensibilă la 10 micrograme/ml de alfa-amanitină în timp ce polimeraza I este neafectată chiar şi
la concentraţii mai mari) . Informaţii suplimentare
Transcripţia genelor din clasa I este realizată de ARN polimeraza I şi reprezintă jumătate
din activitatea de transcripţie pentru majoritatea celulelor eucariote. Singurul produs al acestei
transcripţii este un precursor de ARN ribozomic
125
(pre-ARNr), care este transformat prin clivare secvenţială pentru a forma speciile de ARNr 5,8S,
18S şi 28S (cel de al patrule tip de ARNr 5S este codificat de către o genă din clasa III). Numărul
de gene care codifică pentru ARNr variază de la o sută la mai multe mii, în funcţie de specie.
Acestea sunt localizate pe unul sau pe mai mulţi cromozomi specifici, în regiuni morfologice
distincte numite organizatori nucleolari. În timpul interfazei, aceste regiuni sunt încorporate în
nucleol, structură în care moleculele de ARNr sunt transcrise activ, se transformă pre-ARNr şi se
asamblează ribozomii.
ARN polimerazele au fost purificate dintr-o mare varietate de celule utilizând metode
clasice de separare a proteinelor. Contrar ARN polimerazelor II şi III localizate în nucleoplasmă,
ARN polimeraza I este asociată nucleolului şi poate fi izolată de nucleosol. Numai ARN
polimeraza I catalizează transcripţia grupului de gene ARNr. Specificitatea ARN polimerazei I
pentru genele ARNr este sugerată de insensibilitatea sintezei ARNr şi de rezistenţa polimerazei I
la α-amanitină. Caracteristicile moleculelor ARN de clasă II
Gene din clasa II codifică pentru toate moleculele de ARNm citoplasmatic moleculele
ARN U din snRNP (small nuclear ribonucleoproteine), cu excepţia U6. Moleculele transcript ale
genelor din clasa II posedă modificări caracteristice la extremitatea 5’ (coif): 7-metil guanozină
pentru ARNm şi 2, 2, 7- trimetil guanozină pentru ARN U. În ambele cazuri, guanozina metilată
a coifului este legată de primul nucleotid transcris printr-o legătură trifosfat cu nucleotidele din
poziţiile lor 5’. Aproape toate moleculele de ARNm posedă şi o coadă poliadenilată (poli A)
caracteristică care debutează la distanţe diferite dincolo de sfârşitul regiunii codante; coada poli A
nu este codificată de gena care a determinat obţinerea transcriptului ci este adăugată în urma unei
reacţii post-transcripţionale. La drojdii şi alte eucariote inferioare lungimea cozii poli A este de
ordinul a 75 la 185 resturi. Moleculele de ARNm nuclear de la majoritatea vertebratelor au o coadă
poli A de 200 la 300 nucleotide, dar extensia poli A a moleculelor ARNm citoplasmatice este mai
scurtă şi caracteristică fiecărui tip de ARNm în parte. Din contră, multe molecule de ARNm care
codifică histone sau ARN U sunt lipsite de această coadă. Anumite molecule ARNm conţin adenin
N6-metilate şi toate moleculele ARN U au caracteristic un număr mare de resturi uracil modificate.
Aceste modificări sunt probabil realizate în timpul sau după transcripţie, funcţiile lor fiziologice
fiind necunoscute.
Cu excepţia unor cazuri foarte rare, moleculele ARNm şi ARN U derivă din transcripţi
primari ale căror secvenţe sunt colineare pe întreaga lungime cu ADN de pe care au fost transcrise.
În afară de coif şi clivarea extremităţii 3’ înainte de poliadenilare, principala etapă de maturare
necesară formării unei noi molecule de ARNm funcţională este excizia-episajul (splicing). Cu toate
că absenţa intronilor în pre-ARN U face această operaţie inutilă, moleculele transcript primar
necesită clivarea endo şi exonucleotidică pentru formare extremităţilor 3’ mature.
Moleculele de ARN transcrise de pe structura genelor din clasa III nu codifică proteine. De
fapt, produşii acestora sunt molecule mici de ARN implicate în sinteza proteinelor (ARNt şi ARNr
5S), în transportul intercelular al proteinelor (ARN 7 SL) şi în maturarea post-transcripţională
(ARN U6). Genele din clasa III codifică şi multe alte molecule de ARN al căror rol fiziologic este
necunoscut (ARN 7SK, ARN Alu). Genoamele adenovirusurilor posedă două gene de clasă III,
VA1 şi VA2, ai căror produşi de transcripţie (de 157 şi 140 nucleotide) deturnează maşinăria de
transcripţie a celulei infectate făcând-o mai eficace pentru sinteza proteinelor necesare structurii
virale. Două molecule mici de ARN, EBER I şi EBER II (166 şi 172 nucleotide) sunt şi ele produse
de gene din clasa III ale genomului virusului Epstein-Barr.
126
 Genele din clasa III sunt repartizate în două grupe. În prima, care codifică pentru ARN 5S
şi ARN 7SL, 7SK, U6 şi VA, transcripţii primari au aceeaşi lungime cu moleculele ARN
funcţionale; nu există deci maturare a acestor transcripţi. Trifosfatul din poziţia 5’ rezultat în urma
iniţieri transcripţiei reprezintă extremitatea 5’ şi ultimul rest care este transcris corespunde
extremităţii 3’ a ARN matur. Genele clasei III din a doua grupă codifică pentru moleculele ARNt
ale căror forme mature sunt produse prin eliminarea extremităţilor 5’ şi 3’ ale transcripţilor primari
de către endonucleaze specifice. Secvenţa -CCA 3’ terminală, necesară funcţionării tuturor ARNt
nu este codificată de către genă şi este adăugată de o enzimă particulară. Deoarece anumite gene
care codifică ARNt conţin introni este necesar procesul de maturare (excizie/episaj) pentru
producerea moleculelor ARNt mature.
SLIDE 34. Structura ARN polimerazelor eucariote determinată
prin cristalografie electronică Figura: Structurile ARN polimerazelor
eucariote determinate prin cristalografie electronică.
a) ARN polimeraza II de la drojdii la o rezoluţie de aproximativ 16 A. Proteina are aprox
140x136x110 A.
b) Este ARN polimeraza I de la drojdii la o rezoluţie de aprox 30 A. Proteina are
aproximativ 150x110x110 A.
SLIDE 35. Comparaţie: subunităţile structurale ale ARN
polimerazei de la drojdii şi E. coli RNA Figura: Reprezentare schematică a
subunităţilor structurale ale ARN polimerazelor de la drojdii în comparaţie cu ARN polimeraza
de la E. coli.
Toate trei polimerazele de la drojdii prezintă patru subunităţi centrale (core) care exprimă
aceeaşi omologie cu subunităţile beta, beta’ şi subunităţile alfa de la E. coli. Cea mai mare
subunitate (L’) de la ARN polimeraza II conţine şi domeniul C terminal (CTD). ARN polimeraza
I şi III conţine aceleaşi două subunităţi like-alfa neidentice, în timp ce ARN polimeraza II are
două copii a unei subunităţi diferite like- alfa. Toate trei polimerazele prezintă alte cinci
subunităţi comune (două copii ale celei mai mari dintre acestea). În plus, fiecare polimerază din
drojdie conţine de la 4 la 7 subunităţi mici unice. Informaţii suplimentare ARN polimeraza II
Genele din clasa II sunt transcrise în nucleu de către ARN polimeraza II. Enzima a fost
izolată de la numeroase organisme printre care drojdiile, Physarum, Aspergilius, Acathamoeba,
vegetale superioare insecte, Xenopus şi mamifere. Compoziţia în subunităţi a enzimelor din
diferite organisme este foarte asemănătoare şi adesea de ne-departajat pe baza unor criterii fizice.
Un număr de nouă sau zece subunităţi pare să fie o regulă. Toate enzimele analizate conţin două
subunităţi mari. Una, de aproximativ 220 kD, este cea mai mare polipeptidă pe care o regăsim în
structura celor trei tipuri de ARN polimeraze; alta de aproximativ 140 kD. Trei subunităţi mici ale
ARN polimeraza II sunt comune cu ARN polimeraza I şi II; celelalte patru sau cinci subunităţi
sunt specifice enzimei. Existenţa unei similitudini structurale şi chimice între cele două subunităţi
mari la cele trei ARN polimeraze eucariote a fost iniţial suspectată datorită reacţiilor imunologice
încrucişate pe care acestea le dădeau şi datorită existenţei unor peptide comune: această asemănare
este acum confirmată prin compararea secvenţelor genelor clonate. În plus, cele două
127
subunităţi mari ale fiecăreia dintre cele trei polimeraze eucariote posedă secvenţe în aminoacizi cu
un înalt grad de asemănare cu secvenţele subunităţilor mari ale ARN polimerazei de la E. coli.
Dintre cele trei ARN polimeraze, ARN polimeraza II este cea mai sensibilă la α-amanitină.
Toxina permite iniţierea lanţului de ARN dar blochează elongarea acestuia. Situsul de acţiune al
α-amanitinei pare să fie situat la nivelul subunităţii celei mai mari. La Drosophila şi la S. cerevisiae
mutaţiile care conferă rezistenţa la amanitină sunt localizate în gena care codifică pentru
subunitatea de 220 kD. Această subunitate mare este şi subiectul reacţiilor de fosforilare şi
defosforilare la nivelul mai multor situsuri. Forma înalt fosforilată, găsită in vivo, atunci când
activitatea de transcripţie este importantă, este considerabil mai activă decât enzima defosforilată
din vitro, cel puţin în prezenţa promotorului regiunii tardive din adenovirus.
Domeniul carboxi-terminal al subunităţii celei mai mari a ARN polimerazei II de la drojdii,
de la Drosophila şi de la mamifere conţine multiple repetiţii în tandem ale hexapeptidului Tyr-Ser-
Pro-Thr-Ser-Pro-Ser. Numărul acestor copii este 26 la drojdie la 52 la şoarece. Această secvenţă
repetitivă este unică şi esenţială pentru activitatea enzimei. Modificarea acestei regiuni în gena de
drojdie demonstrează că subunităţile care conţine mai puţin de 13 la 13 copii nu sunt funcţionale
in vivo. Serinele şi treoninele, abundente în această regiune, pot fi situsurile de fosforilare
menţionate mai sus, dar rolul precis al acestui heptamer nu este deplin elucidat.
SLIDE 36. Cea mai mare subunitate a ARN polimerazei II conţine o repetiţie
esenţială carboxi-terminală care este fosforilată în timpul transcripţiei Figura:
Demonstraţia experimentală că domeniul carboxi-terminal (CTD) al ARN
polimerazei II este fosforilat în timpul transcripţiei în vivo.
Cromozomii politeni de la nivelul glandelor salivare au fost preparati din larvele de
Drosophila chiar înainte de năpârlire. Preparatul a fost tratat cu un anticorp de şoarece pentru
regiunea CTD fosforilată şi cu un anticorp de capră pentru regiunea CTD nefosforilată. Preparatul
a fost apoi colorat cu un anticorp anti-capră marcat fluorescent cu fluoresceină (verde) şi cu un
anticorp anti-şoarece marcat fluorescent cu rodamină (roşu). Moleculele de polimeraze care
prezintă regiuni CTD nefosforilate vor fi colorate în verde iar cele care prezintă regiuni CTD
fosforilate în roşu. Hormonul de năpârlire ecdizona induce rate înalte ale transcripţiei în regiunile
bufante74EF şi 75B; de reţinut că în aceaste regiuni sunt prezente numai CTD fosforilate.
Regiunile bufante mici transcrise la rate mari sunt vizibile. Situsurile ne- bufante care sunt colorate
în roşu (săgeata în sus) sau verde (sageata orizontală), ca şi siturile colorate atât în roşu şi verde,
care produc o culoare galbenă (săgeata în jos).
Informaţii suplimentare Factorii de transcripţie
ARN polimeraza II, ca şi celelalte ARN polimeraze necesită o serie de proteine adiţionale
pentru a forma un complex de transcripţie funcţional. Multe sunt proteine care se fixează pe ADN
şi recunosc una sau mai multe secvenţe care, par să constituie promotorul genei. Anumiţi factori
de transcripţie reacţionează prin intermediul interacţiilor proteină-proteină sau cu alţi factori şi să
modifice astfel specificitatea şi afinitatea acestora. Prin interacţii mutuale sau cu diferite secvenţe
de ADN, diferiţii factori de transcripţie formează ansamble proteice complexe care reglează
capacitatea ARN polimerazei II de a iniţia transcripţia. Cea mai mare parte a complexelor
reacţionează pozitiv crescând frecvenţa iniţierilor, dar sunt cunoscute şi
128
altele care acţionează negativ fiind deci represori. Există chiar şi factori care stimulează transcripţia
unei gene dar inhibă pe cea a alteia. Mulţi dintre aceşti factori sunt specifici unui ţesut sau unor
celule şi nu reacţionează decât în anumite stadii de dezvoltare; acest lucru permite genelor să fie
transcrise diferit în funcţie de ţesut sau de moment (timp). Într-un anumit sens, ARN polimeraza
reprezintă maşinăria de transcripţie, iar interacţiile factorilor cu semnalele de reglare de pe ADN
sau între ei, determină unde, când şi cu ce viteză va funcţiona această maşinărie.
Numărul de factori proteici care acţionând în trans sunt implicaţi în sistemele de
transcripţie utilizare de ARN polimeraza II este mereu în creştere cu toate că nu toţi au fost foarte
bine caracterizaţi. Rolul unui factor este în funcţie de tipurile de aranjamente ale secvenţelor de
ADN, elementele cis care constituie regiunea de reglare a unei gene. Complexitatea lor este atât
de mare încât anumiţi factori se leagă la mai mult de o secvenţă de ADN şi anumite secvenţe de
ADN reprezintă situsuri de fixare pentru mai multe tipuri de factori. În plus, anumite motive
organizate în tandem se suprapun (se încalecă) creând adesea situsuri de legătură suplimentare
absente în motivele individuale unde favorizează fixarea unui factor sau a altuia. Complexitatea
acestor interacţiuni, cât şi numărul mare de detalii ne-explicate, fac, în momentul de faţă,
imposibilă o descriere de ansamblu a acestui domeniu important. În plus, există încă nomenclaturi
diferite şi adesea fără raport care au fost folosite pentru a desemna factorii de transcripţie. Acestea
sunt, în general, bazate pe originea , tisulară sau celulară, pe o caracteristică a situsului de legare
sau rezultă pur şi simplu dintr-o alegere a aleatoare a autorului.
SLIDE 37. Analiza transcripţilor marcaţi în formare permite cartarea situsului de iniţiere a
transcripţiei Figura: Cartarea aproximativă a situsului de iniţiere a transcripţiei prin analiza
transcripţilor în formare sintetizaţi in vivo.
O secţiune de ADN care este în curs de transcriere este evidenţiată în imagine. După ce
celulele sunt marcate pentru timp scurt, producând molecule de ARN în formare, celulele sunt
rupte şi moleculele de ARN izolate sunt separate pe baza mărimii lanţurilor estimată prin
centrifugare în gradient de densitate. Fracţiile de diferite mărimi sunt apoi hibridizate cu
fragmentele de restricţie prezentate în diagrama de sus (de la A la E). Cei mai scurţi ARN marcaţi
vor hibridiza ci fragmentul de restricţie B care conţine situsul de iniţiere; nucleotidul exact la care
începe transcripţia nu poate fi determinat. Succesiv moleculele de ARN mai lungi vor hibridiza cu
fragmente din aval faţă de situsul de iniţiere. Cel mai lung ARN hibridizează cu fragmentul D care
conţine şi situsul de terminare.
SLIDE 38. ARN polimeraza II iniţiază transcripţia secvenţelor ADN corespuntătoare capătului
5′ al ARNm Figura: Cartarea precisă a situsului de iniţiere a unităţii de transcripţie târzii a
adenovirusului prin transcripţie in vitro
Stânga: Liniile du sus arată situsurile de restricţie ale HindIII (cu negru), XmaIII
(albastru) şi SmaI (roşu) din regiunea genomului adenovirusului unde a fost localizat situsul de
iniţiere a transcripţiei prin analiza transcripţilor în formare (aproximativ 16 unităţi cartate).
Fragmentele de restricţie HindIII, XmaIII şi SmaI care comţin situsurile de iniţiere au fost
incubate individual cu un extract nuclear preparat din celule HeLa şi ribonucleotid trifosfaţi
marcaţi cu alfa-32P. Transcripţia fiecărui fragment începe la situsul de start: când o moleculă de
ARN polimeraza II
129
care transcrie un fragment ajunge la capătul tăiat, şi părăseşte matriţa (“run-off remplate”).
Dreapta: Transcriptul rezultat este apoi supus electroforezei în gel şi autoradiografiei.
Dacă sunt cunoscute poziţiile situsurilor de restricţie de pe ADN matriţă, lungimea transcripţilor
“run-off” (în nucleotide, nt) a fragmentelor produse de SmaI (linia 1). XmaIII (linia 2) şi HinIII
(linia 3) cartează precis situsul de start la 16,4 unităţi de cartare pe genomul adenovirusului.
Secvenţele acestei regiuni a adenovirusului ADN şi a capătului 5’ al ARNm corespunzător şi a
transcripţilor ARN produşi in vitro sunt prezentaţi în partea stângă jos. Astfel punctul de start
pentru transcripţia in vitro realizată de către ARN polimeraza II corespunde situsului “cap” al
ARNm. Proba din linia 1a este aceeaşi cu cea din linia 1, cu excepţia prezenţei alfa-amanitinei,
ca inhibitor al polimerazei II, care a fost inclus în amestecul de transcripţie. Benzile din partea
superioară şi inferioară agelului reprezintă moleculele cu mase moleculare ale transcripţilor mari
şi mici care se formează în condiţile acestui experiment.
SLIDE 39. Concluzii Principalul scop al controlului genetic în
organismele multicelulare este realizarea deciziilor precise de dezvoltare astfel încât gene
particulare sunt exprimate în celule particulare în timpul dezvoltării şi diferenţierii celulare;
Controlul transcripţional este principalul sens al reglării expresiei genice atât la eucariote
cât şi la procariote;
În genoamele eucariote, elementele de control care acţionează în cis şi care reglează
expresia de la nivelul promotorului sunt adesea localizate la multe kb depărtare de situsul de start.
În contrast, elementele de control bacterian sunt dispuse, în general, pe o distanţă de 60 pb faţă de
promotorul pe care aceştia îl reglează;
Eucariotele conţin trei tipuri de ARN polimeraze nucleare. Toate trei conţin două subunităţi
mari şi două subunităţi mici care constituie structura centrală omologă cu subunităţile β, β’ şi α ale
ARN polimerazei de la E. Coli, cât şi numeroase subunităţi mai mici adiţionale. Unele dintre aceste
subunităţi mici sunt comune iar altele sunt unice pentru fiecare polimerază;
ARN polimeraza I sintetizează numai pre-ARNr, ARN polimeraza II sintetizează ARNm
şi unele molecule mici de ARN nuclear care participă la splicingul ARNm iar ARN polimeraza III
sintetizează ARNt, ARNr 5S şi multe alte molecule relativ scurte şi stabile de ARN.
O secvenţă heptapeptidică, domeniul carboxi-terminal (CTD), din subunitatea cea mai
mare a ARN polimerazei II este fosforilată în timpul iniţierii şi rămâne fosforilată cât timp enzima
transcrie matriţa;
Similară cu ARN polimerazele bacteriene, ARN polimeraza II iniţiază, de obicei,
transcripţia genelor la nivelul unor perechi de baze specifice sau baze vecine alternative din ADN
matriţă. Nucleotidul din 5’ căruia i se adaugă capişonul la nivelul ARNm corespunde nucleotidului
de pe catena matriţă la care transcripţia este iniţiată.
SLIDE 40. TATA box este cel mai bine conservat promotor la eucariote Figura: Comparaţii ale
secvenţelor nucleotidice situate în amonte de situsul de start la 60 de gene care codifică pentru
proteine diferite de la vertebrate
 Fiecare secvenţă a fost aliniată pentru a maximiza omologia regiunii –35 la – 20. Numerele
introduse în tabel reprezintă frecvenţa fiecărei baze la fiecare poziţie. Omologie maximă apare
pentru o regiune de 6 baze, care se referă la TATA box şi a
130
cărei secvenţă este prezentată în partea de jos. Baza iniţială cea mai frecventă din ARNm
codificat de genele care conţin o TATA box este A.
SLIDE 41. Construcţia şi analiza deleţiilor seriate în 5’ Figura: Construcţia şi analiza
deleţiilor 5’ seriate pentru a localiza secvenţele de control a transcripţiei situate în amonte de
genele eucariote
Un fragment de ADN (galben) care conţine o regiune start a transcripţiei este clonată într-
un vector plasmidial (upper-left). Plasmida este liniarizată prin digestia cu o enzimă de restricţie
(A) care scindează la capătul din amonte a fragmentului liniarizat. ADN liniarizat este apoi digerat
cu o exonuclează pentru diferite perioade de timp, astfel încât lungimi diferite de ADN sunt
înlăturate de la fiecare capăt. După adăugarea unui linker oligonucleotidic şi digestia cu cu
enzimele de restricţie B şi C, fragmentele înlăturate sunt clonate într-un vector plasmidial care
conţine o genă raportor slabă (albastru deschis). Plasmidele prezentând fragmente de lungimi
diferite ale regiunii din amonte (regiunea din 5’ ale situsul de demarare a transcripţiei) sunt apoi
transfectate în culturi de celule (sau folosite la realizarea de animale transgenice) şi este
determinată expresia genei raportor. Rezultatele acestui exemplu ipotetic indică că fragmentele
testate conţin două elemente de control. Capătul 5’ al uneia este cuprins între deleţiile 2 şi 3;
capătul 5’ al celeilalte este corelat cu deleţiile 4 şi 5.
SLIDE 42. Identificarea elementelor de control transcripţional cu “linker mutants” Figura:
Analize de scanare mutaţională care identifică elementele de control- transcripţional.
O regiune de ADN eucariot (galben) care susţine nivele de expresie crescute ale unei gene
raportor (albastru deschis) este clonată într-un vector plasmidial obţinându-se un număr de clone.
Mutaţii poziţionate la nivelul regiunii de control în diferite regiuni sunt introduse de la un capăt
la altul al fragmentului. Aceste mutaţii sunt rezultatul înlăturării aleatroare a unei scurte secvenţe
din ADN. Plasmidele mutante sunt transfectate separat în celule ăn cultură şi este determinată
activitatea genei raportoare. În exemplul ipotetic muatţiile LS (linker scaning) 1,4,6, 7 şi 9 nu au
efect sau au efect slab asupra expresiei genei raportor, indicând că regiunile afectate în aceşti
mutanţi nu conţin elemente de control. Exprfesia genei raportor este semnificativ afectată pentru
mutanţii 2, 3, 5, şi 8 indicând că elementele control (in maron) sdunt situate în poziţiile indicate
în partea inferioară a figurii.
SLIDE 43. Elementele din proximitatea promotorului pot interveni în reglarea genelor eucariote
Figura: Identificarea elementelor din proximitatea promotorului care controlează gena timidin-
kinazei (tk) sin virusul herpex simplex (HSV) prin analiza LS (linker scaning) a mutaţiilor.
a) O serie de contrucţii ADN a fost preparată, în fiecare construcţie o regiune de
aproximativ 10 pb situată în amonte de situsul start al genei tk este mutantă prin înlocuirea cu un
linker sintetic care conţine un situs de restricţie. Fiecare construcţie a fost co-injectată cu o genă
tk pseudo-sălbatică în ovocitele de Xenopus Laevis în care gena tk a HSV este transcrisă cu o
frecvenţă ridicată. După 24 de ore, a fost izolat ARN şi dozat prin metoda de extincţie a primerului
folosind un primer ARN marcat (roşu deschis) complementar cu o scurtă secţiune a ARNm pentru
tk. Gena
131
pseodo-sălbatecă, care posedă o deleţie de 10 pb, serveşte drept control intern a activităţii
transcripţionale a ovocitelor injectate şi a recuperării ARN.
b) Produşii de extindere a primerilor au fost analizaţi prin gel electroforeză şi
autoradiografie. Dozarea ARN produsă de mutaţşii LS (linker scaning) conduce la două tipuri
principale de produşi: unul conţine 90 de nucleotide corespuntătoare extensiei tuturor începând
de la capătul 5’ al ARN; cel de al doilea este mult mai mic datorită incompletei extensii.
Determinarea ARN transcris de la nivelul genei pseudo- salbatice conduce şi ea la doi produşi:
unul lung de 80 de nucleotide şi altul mult mai scurt. Benzile marcate ale fiecărui mutant “linker
scaning” sunt comparate cu cele ale genei pseudo-salbatice injectate în acelaşi ovocit (benzile
subţiri de fond sunt ignorate). Mutanţii LS sunt numiţi prin intervalul din amonte la nivelul căruia
secvenţa sălbatecă din amonte a tk este mutată. De reţinut că densitatea descrescătoare a benzilor
indică descreşterea transcripţiei tk, pentru moleculele de ADN LS mutante marcate în roşu.
c) Pe baza rezultatelor au fost cartate elementele din regiunea proximală promotorului
(in maron) genei tk.
SLIDE 44. Transcripţia catalizată de ARN polimeraza II este adesea stimulată
de secvenţe “enhancer” depărtate Figura: Identificarea regiunii “enhancer” a
SV40.
Au fost construite plasmide conţinând gena beta-globinei cu sau fără prezenţa unui
fragment de 366 pb provenind de la SV40. Fiecare plasmidă a fost transfectată separat în
fibroblaste în cultură, care în mod normal nu exprimă beta-globină (etapa 1). Cantitatea de ARNm
pentru beta-globină sintetizată de celulele transfectate a fost determinată prin metoda de protecţie
cu nuclează S1. Sonda folosită în această determinare a fost un fragment de restricţie, generat din
ADNc pentru beta-globină, complementar cu capătul 5’ al ARNm pentru beta-globină (etapa 2).
Capătul 5’ al sondei a fost marcat cu 32P (punctele roşii). Când ARNm pentru beta-globină a fost
hibridizat cu sonda, un fragment de aproximativ 340 nucleotide din sondă a fost protejat de
digestia cu nuclează S1 (etapa 3). Autoradiografia fragmentelor protejate de S1 (etapa 4)
evidenţiază că celulele transfectate cu plasmida 1 (linia 1) produc mai mult ARNm pentru beta-
globină decât cele transfectate cu plasmida 2 (linia 2). Linia C reprezintă controlul ARNm pentru
beta-globină izolat din reticulocite care sintetizează activ beta-globină. Aceste rezultate
demonstrează că fragmentul de ADN pentru SV40 conţine un element, numit “enhancer”
(activator) care stimulează mult sinteza ARNm al beta-globinei.
SLIDE 45. Majoritatea genelor eucariote sunt reglate prin mai multe mecanisme de control
Figura: Comportamentul general al elementelor de control care acţionează în cis pentru
reglarea expresiei genelor la drojdii şi la orgamismele multicelulare (nevertebrate, vertebrate şi
plante).
a) Genele organismelor multicelulare conţin atât elementele proximale promotorului şi
“enhancerii” (activatorii) cât şi TATA box sau alte elemente promotoare. Ultimile poziţionează
ARN polimeraza II pentru a iniţia transcripţia la situsul de start şi influenţează rata transcripţiei.
Activatorii pot fi poziţionaţi fie în amonte fie în aval şi la o distanţă de aproximativ 50 kb faţă de
situsul de start al transcripţiei. În unele cazuri, elementele din proximitatea promotorului apar la
fel de bine şi în aval de situsul de start al transcripţiei.
132
 b) majoritatea genelor de drojdii conţin numai o regiune reglatoare, numită “secvenţa
activatoare în amonte” (Upstream Activating Sequence-UAS) şi o TATA box, care este de
aproximativ 90 pb în amonte de situsul de start.
SLIDE 46. Concluzii Expresia genelor eucariote care codifică pentru
proteine este reglată prin intervenţia unor elemente multiple care acţionează sub forma unor
regiuni de control în cis. Unele elemente de control sunt localizate în apropierea situsului de start
(elemente din proximitatea promotorului), în timp ce altele sunt localizate la distanţă (activatori
sau “enhanceri”);
Promotorii determină situsul de iniţiere a transcripţiei şi legarea directă a ARN polimerazei
II. Au fost identificate trei tipuri de secvenţe promotor pentru ADN de la eucariote. TATA box,
tipul cel mai comun este dominant pentru genele transcrise rapid. Promotorii de tip iniţiator sunt
reprezentaţi cu o frecvenţă scăzută în anumite gene în timp ce insulele CpG sunt caracteristice
genelor transcrise;
Elementele din proximitatea promotorului sunt localizate într-un interval de 200 pb faţă de
situsul de start. Multe astfel de elemente, conţinând mai puţin de 20 pb, pot fi utile în reglarea unei
gene particulare;
Activatorii, care au de obicei o lungime de aproximativ 100-200 pb, conţin mai multe
elemente control de 8 la 20 pb. Acestea pot fi localizate de la 200 pb la 10 kb în amonte sau în aval
de promoter, în interiorul unui intron, sau în aval de exonul final al genei;
Elementele din proximitatea promotorului şi activatorii sunt adesea specifici unui tip
celular, funcţionând numai tipuri celulare diferenţiate specific.
SLIDE 47. Factoriii implicaţi în transcripţie sunt identificaţi prin tehnici
biochimice Figura: Purificarea factorilor de transcripţie
a) Mai multe etape cromatografice sunt folosite pentru purificarea unui factor de transcripţie
(proteină inrudită, asemănătoare, similară) care se leagă specific la un element reglator din
structura ADN. Purificarea finală este obţinută prin cromatografie de afinitate pe o coloană care
este cuplată cu cu catene lungi de ADN care conţin mai multe copii al situsului de legare a
factorului proteic. Un preparat proteic partial-purificat care conţine factorul de transcripţie este
aplicat pe o coloană cu o tărie ionică scăzută (100 mM KCl). Proteinele care nu se leagă deloc la
situsurile specifice vor fi eluate cu tampoane cu salinitate scăzută. Proteinele cu afinitate scăzută
pentru situsul de legare sunt spălate de pe coloană cu toampoane de salinitate intermediară (300
mM KCl). In final, factorii proteici inalt purificaţi sunt eluaţi cu soluţii saline concentrate (1 M
KCl);
b) Proteinele separate prin cromatografie pe coloană sunt testate pentru capacitatea lor de
legare la un element reglator identificat. În acest exemplu, testările ADN “footprinting”pentru
proteinele separate prin cromatografie de schimb ionic indică că fracţiile de interes sunt 9-12.
Aceste proteine pot fi testate si prin tehnica de intarziere in gel. Informaţii suplimentare
 Ca şi la E. coli, diferitele elemente transcripţionale de control prezente la eucariote sunt
situsuri de legare a proteinelor reglatoare care acţionează în trans. Mai departe o sa discutăm despre
identificarea, purificarea şi structura acestor factori de transcripţie care sunt activatori şi represori
ai genelor proteice care codifică pentru proteine.
133
 După identificarea elementelor reglatoare cu ajutorul analizelor mutaţionale descrise
anterior, pasul următor îl reprezintă identificarea proteinelor care recunosc aceste structuri si se
leagă specific la ele.
Figura evidenţiază modul în care un extract proteic nuclear este supus mai multor etape
cromatografice şi apoi unor analize de “footprinting” cu DN-aza I sau de “intarziere în gel” folosint
fragmente de ADN care conţin elementele reglatoare în cis deja identificate. Fracţiile care conţin
proteine care se leagă la elementele reglatoare este foarte probabil să conţină un posibil “putativ”
factor de transcripţie. O tehnică bună pentru etapa de purificare finală a factorilor de transcrpţie o
constituie un tip particular de cromatografie de afinitate specifică unei secvenţe de ADN. Ca un
test final, capacitatea proteinelor izolate de a stimula transcripţia unei matrici care conţine un situs
corespunzător de legare a proteinei, se realizează o reacţie de transcripţie in vitro.
O dată ce factorul de transcripţie a fost izolat, secvenţa sa parţială în aminoacizi poate fi
determinată şi folosită pentru pentru clonarea genei sau a ADNc codificat de aceasta. Gena izolată
poate fi folosită apoi pentru a testa capacitatea proteinei codificate de a stimula transcripţia într-o
reacţie de transcripţie in vitro.
SLIDE 48. Determinarea “in vitro” a activităţii factorilor
de transcripţie Figura: testarea in vitro a activităţii de
transcripţie
Sistemul experimental folosit necesită prezenta a două plasmide. O plasmidă conţine gena
care codifică pentru un factor posibil (putativ) de transcripţie-proteina X. Cea de a doua
plasmismidă conţine o genă raportor si unul sau mai multe situsuri de legare a proteinei X. Ambele
plasmide sunt simultan introduse în celule gazdă cărora le lipsesc gena care codifică pentru
proteina X şi gena raportor. Este măsurată transcripţia ARN produsă de gena raportor; alternativ,
activitatea proteinelor codificate poate fi determinată. Dacă transcripţia genei raportor este mai
mare in prezenţa plasmidei care codifică proteina X, înseamnă că proteina este un activator; dacă
transcripţia este mai scăzută, atunci este un represor. Prin folosirea unor plasmide care codifică au
factor de transcripţie mutant sau care conţine o rearanjare, pot fi identificate domeniile importante
ale proteinei.
SLIDE 49. Identificarea genetică a genelor care codifică pentru factori de transcripţie Ex: serii
de mutanţi Gal4 purtători de deleţii-demonstrează că factorii de transcripţie sunt compuşi din
domenii separate de legare şi de activare
La drojdii, genele care codifică pentru factori de transcripţie au fost mai întâi identificate
prin analize genetice clasice. De ex, una dintre genele de la drojdii necesare cresterii este numită
Gal4. Incubarea unor celule sălbatice într-un mediu care conţine galactoză are drept rezultat
creşterea de aproximativ o mie de ori a cantităţii de ARNm pentru enzimele implicate în
metabolismul galactozei. Această activare nu se poate observa în cazul mutanţilor gal4. Studii de
mutageneză dirijată asemănătoare celor prezentate anterior pentru determinarea regiunilor UAS
pentru genele inductibile. S-a determinat că fiecare regiune UAS conţine mai mult de o copie a
secvenţei de 17 pb înrudite numită UASGAL. Când o copie a UASGAL a fost clonată în amonte
de o secvenţa TATA box urmată de o genă raportor lacZ, expresia lacZ a fost activată in celulele
sălbatice cultivate pe mediu cu galactoză, dar nu şi în cazul
134
mutantelor gal4. Aceasta indică că UASGala este un element de control al transcripţiei activat de
către proteina Gal4 pe mediile cu galactoză.
Gena Gal4 a fost izolată prin complementare mutantului gal4 cu o bancă de ADN de drojdii
sălbatec. Prin folosirea tehnicilor de recombinare a ADN, proteina Gal4 a fost exprimată în E. coli
şi s-a determinat legarea acesteia la UASGAL. Când proteina Gal4 se leagă la secvenţele
UASGAL şi activează transcripţia din apropierea promotorului când celulele sunt plasate pe mediu
cu galactoză.
Studii genetice clasice au fost realizate si pe multe alte organisme cum sunt Drosophila,
C. elegans si plantele superioare au dus la descoperirea mai multor gene care codifică pentru
factori de transcripţie. Activatorii transcripţionali sunt proteine modulare compuse din domenii
funcţionale distincte
Un remarcabil set de experimente realizate cu proteina Gal4 de la drojdii au demonstrat că
acest factor de transcripţie este compus din domenii funcţionale separabile: un domeniu de legarea
a ADN care interacţionează cu secvenţe specifice de ADN şi un domeniu de activare, care
interacţionează cu alte proteine pentru a stimula transcripţia de la nivelul secvenţelor din
apropierea promotorului. În aceste experimente o serie de mutanţi de deleţie gal4 au fost testaţi
pentru capacitatea lor de a activa transcripţia unei gene raportor (lacZ) legată la UASGAL.
Măsurarea activării transcripţiei a fost măsurată în celulele care gena GAL4 şi deci şi proteina gal4
nu vor interfera cu analiza. Legarea proteinei mutante Gal4 la secvenţa UASGAL poate fi şi
aceasta testată. Rezultatele acestor experimente, evidenţiate în figură demonstrează că Gal4
conţine un un domeniu N-terminal de legare la ADN de 74 aminoacizi şi un domeniu activator C-
terminal. Când domeniul N-terminal de legare la ADN a fost fuzionat cu difrerite fragmente C-
terminale, proteinele trunchiate rezultate păstrează capacitatea de a stimula expresia genei raportor.
Deci regiunea internă a proteinei nu este necesară pentru funcţionarea Gal4 ca factor de
transcripţie.
Experimente similare au fost realizate şi pentru factorul de transcripţie de la drojdii Gcn4,
care reglează genele necesare pentru sinteza multor aminoacizi, indică existenţa unui domeniu de
legare de aproximativ 60 aa şi un domeniu de activare C- terminal de aproximativ 20 aa pozitionat
în apropierea mijlocului secvenţei.
Studii de acest fel au fost realizate pentru mulţi factori de transcripţie de la drojdii.
Domeniile de activare ale factorilor de transcripţie de la mamifere au fost adesea determinate
frecvent prin fuzionarea lor cu domeniul de legarea al Gal4 când celuzlele de mamifere nu conţin
un factor endogen capabil să se lege la secvenţa UASGAL. Modelul structural a activatorilor de la
eucariote care a fost emanat din aceste studii este unul modular în care unul sau mai multe domenii
activatoare sunt conectate unui domeniu de legare capab il să recunoască secvenţe specifice de
legare la ADN. În unele cazuri, aminoacizii incluşi in domeniul de legare contribuie şi el la
activarea transcripţională. Aşa cum s-a discutat anterior, domeniile de activare se crede că
funcţionează prin intermediul interacţiilor proteină-proteină cu factorii de transcripţie legaţi la
promotor. Domeniile proteice ale activatorilor, care conectează domeniile de legare la ADN cu
domeniile de activare pot explica de ce modificările în spaţiul dintre elementele de control sunt
atât de bine tolerate la nivelul regiunilor de control de la eucariote. Când domeniile de legare din
apropierea factorilor de transcripţie sunt deplasate de pe poziţiile lor relative de pe ADN, domeniile
lor de activare pot incă să interacţioneze deoarece ataşarea lor la domeniile de legare este flexibilă.
135
 SLIDE 50. Activatorii transcripţionali sunt proteine modulare compuse din domenii funcţionale
distincte Figura: Diagrame schematice care ilustrează structura modulară a activatorilor de
transcripţie de la eucariote
Aceşti factori de transcripţie pot conţine mai mult de un domeniu de activare dar arareori
conţin mai mult de un domeniu de legare la ADN. Receptorul glucocorticoid (GR), care conţine
şi un domeniu de legare a hormonului activează transcripţia genelor ţintă în prezenţa anumitor
hormoni. Sp1 se leagă la regiunea promotoare bogată în elemente GC într-un număr mare de
gene de mamifere. Domeniile proteice cu flexibilitate mare din structura activatorilor sunt
extrem de sensibile la digestia cu proteaze. Informaţii suplimentare Factorii de transcripţie se
leagă la ADN şi activează transcripţia prin intermediul domeniilor independente
Factorii de transcripţie şi alte proteine reglatoare sunt necesari pentru două tipuri de
activităţi:
- Ei trebuie să recunoască secvenţele ţintă specifice localizate în activatori, promotori, sau
alte elemente reglatoare care afectează o anumită genă. (Pentru o proteină represor, legarea la ADN
poate fi suficientă pentru a-şi exercita funcţia: prezenţa proteinei serveşte pentru a împiedica
expresia genei).
- Pentru un factor se transcripţie sau o proteină reglatoare este necesar mai mult; odată
legată la ADN, proteina îşi exercită funcţia prin legarea altor componente care fac parte din
aparatul de transcripţie.
Putem caracteriza domeniile factorilor de transcripţie care sunt responsabili pentru aceste
activităţi? Adesea domeniile care leagă ADN şi activează transcripţia sunt separate, şi fiecare
funcţionează independent. De fapt, putem vedea (considera) funcţia domeniului de legare a ADN
ca fiind completă odată ce domeniul de activare a fost adus în vecinătatea punctului de start. În
principiu, este necesar ca conexiunea dintre domeniile de legarea a ADN şi cel de activare să fie
destul de flexibilă pentru a permite domeniului de activare să găsească ţintele sale proteice fără a
ţine seama de situsul exact conţinut de domeniul de legare a ADN la nivelul promotorului. Proteina
ţintă este cel mai probabil un factor de transcripţie bazal. Experimentele cu diferite sisteme
sugerează că principiul domeniilor independente este comun pentru activatorii transcripţiei.
Natura modulară a activatorilor transcripţiei a fost bine caracterizată pentru activatorul
GAL4 de la drojdie, care controlează transcripţia genelor ai căror produşi sunt responsabili de
metabolizarea galactozei. Reglarea se realizează la UASG (o secvenţă de activare din amonte care
la drojdii este echivalentul unui activator). Proteina GAL4 are 4 situsuri de legare în UASG.
Fiecare situs este o copie a palindromului care are o secvenţă consens de 17 pb. Totuşi, o singură
copie a secvenţei consens este adecvată pentru a conferi susceptibilitate (sensibilitate) la reglarea
GAL4.
Proteina GAL4 are trei funcţii: ea se leagă la ADN; ea activează transcripţia; şi ea leagă o
altă proteină reglatoare, numită GAL80. Aceste funcţii pot fi separate.
Domeniul de legare a GAL4 constă în 65 de aminoacizi terminali. Fragmentul N-terminal
poate lega secvenţa consens obişnuită, dar nu activează transcripţia.
Capacitatea de a activa transcripţia poate fi conferită de către două alte regiuni ale
proteinelor: fie secvenţa 148-196 fie 768-881, dacă ataşarea la domeniul de legare a ADN poate
activa transcripţia.
136
 Regiunea 65-94 permite proteinei să formeze dimeri (dimerizeze). Este destul de normal
pentru factorii de transcripţie să posede domenii adiacente pentru legarea ADN şi dimerizare.
Regiunea 851-881, localizată în interiorul unuia dintre domeniile dezactivare, leagă GAL80. DE
fapt, aceasta este modalitatea prin care GAL4 răspunde la galactoză. Expresia genelor GAL este
indusă de către galactoză, care se leagă la proteina GAL80. În absenţa galactozei, proteina
GAL80 leagă GAL4 şi o împiedică să realizeze activarea transcripţiei. Galactoza induce
transcripţia prin eliberarea GAL80, permiţând astfel GAL4 să funcţioneze efectiv. Aceasta este
una dintre variantele unei teme comune: o proteină (sau oricare alt ligand) se leagă la un factor
de transcripţie pentru a regla (direct sau indirect) domeniul său activare a transcripţiei. Este
natural că legarea la ADN este prealabilă activării transcripţiei. Depinde activarea de un anumit
domeniu de legare la ADN (DNA-binding domaine).
Represorul bacterian LexA are un capăt N-terminal al domeniului de legare la ADN care
recunoaşte un operator specific; legarea LexA la acest operator reprimă promotorul adiacent. Într-
un experiment ‘de schimbare’, această secvenţă poate fi înlocuită cu domeniul de legare al GAL4.
Gena hibrid poate fi introdusă în drojdii împreună cu gena ţintă care conţine fie operatorul US fie
LexA.
O proteină GAL4 autentică poate activa o genă ţintă numai dacă are un operator UAS.
Represorul LexA singur nu are capacitatea de a activa nici un fel de ţintă. Hibridul LexA-GAL4
nu mai poate nici el să activeze o genă cu un UAS, dar acum poate activa o genă care are un
operator LexA.
Acest rezultat corespunde punctului de vedere modular asupra activatorilor transcripţiei.
Domeniul de legare a ADN serveşte în aducerea proteinei într-o localizare corectă. Cum şi unde
acesta se leagă la ADN nu este relevant, dar, odată legate, domeniile de activare a transcripţiei pot
determina iniţierea transcripţiei. În acord cu acest punct de vedere, nu mai are importanţă atât de
mare dacă domeniile de activare a transcripţiei sunt aduse în vecinătatea promotorului prin
recunoaşterea UAS via domeniului de legare a GAL4 sau prin recunoaşterea operatorului LexA
via specificităţii modului LexA. Capacitatea celor două tipuri de module de a funcţiona în proteine
hibride sugerează că fiecare domeniu al proteinei se pliază independent într-o structură activă şi
nu este influenţată de restul proteinei.
Ideea că factorii de transcripţie au domenii independente care leagă ADN şi care activează
transcripţia este întărită de capacitatea proteinei tat a virusului HIV de a stimula iniţierea fără a se
lega deloc la ADN. Proteina tat se leagă la o regiune a structurii secundare a produsului ARN;
partea ARN necesară pentru acţiunea tat este numită secvenţa tar.
Secvenţa tar este localizată chiar în aval de punctul de start, astfel încât când tat se leagă la
tar, este adusă în vecinătatea complexului de iniţiere. Acest lucru este suficient pentru a asigura ca
domeniul său de activare să fie destul de aproape de complexul de iniţiere. Domeniul de activare
interacţionează cu unul sau mai mulţi factori de transcripţie legaţi la complex în acelaşi fel ca şi
un factor de transcripţie situat în amont (De reţinut că cel puţin primul transcript trebuie să fie
început în absenţa tat pentru a furniza astfel situsul de legare).
 O demonstraţie extremă privind independenţa localizării şi activării domeniilor a fost dată
de câteva construcţii în care tat integrat astfel încât domeniul de activare a fost conectat la domeniul
de legare a ADN în locul secvenţei obişnuite de legare tar: când un situs ţintă adecvat este plasat
în promotor, domeniul de activare tat poate activa transcripţia. Aceasta sugerează că putem
considera domeniul de legare al ADN (sau în acest caz domeniul de legare al ARN) ca furnizând
o funcţie ‘de fixare’
137
(de priponire), al cărei scop principal este să se asigure că domeniul de activare se află în
vecinătatea complexului de iniţiere.
Noţiunea de priponire este un exemplu mult mai specific pentru ideea generală că iniţierea
necesită o concentraţie mare de factori de transcripţie în vecinătatea promotorului. Acest deziderat
poate fi atins când factorii se leagă de activator care se află la o anumită distanţă pe ADN linear,
când factorii se leagă în amont de componentele promotorului, sau în caz extrem prin priponirea
(fixarea) unui produs ARN. Cerinţa comună a tuturor acestor situaţii este flexibilitatea exact cele
în trei dimensiuni a aranjamentului format din ADN şi proteine.
Există diferite modalităţi prin care factorii de transcripţie situaţi în amont activează
transcripţia, dar cea mai obişnuită modalitate este probabil interacţia proteină-proteină cu un factor
de transcripţie bazal. Cele mai comune ţinte pentru activare par să fie TFIIID şi TFIIIB.
Domeniile de activare ale factorilor de transcripţie GAL4 şi GCN4 de la drojdie au multe
sarcini negative, de unde descrierea lor drept ‘activatori acizi’. Un alt activator efectiv particular
de acest tip este proteina VP16 a virusului Hepex Simplex (VP16 nu are un domeniu de legare la
ADN, dar interacţionează cu aparatul de transcripţie via o proteină intermediară. Experimentele
realizate pentru a putea caracteriza funcţionarea activatorului acid au fost realizate adesea folosind
regiunea de activare a VP16 legată la câteva motive de legare a ADN.
Nu este clar dacă sarcinile negative sunt necesare pentru funcţionarea ‘activatorilor acizi’.
Pe de o parte, secvenţele care au capacitate activatoare când se leagă la domeniul de legare a ADN
al GAL4 pot exista sub forma unei serii de secvenţe polipeptidice scurte care au în comun numai
faptul că posedă sarcini negative. Aceasta sugerează că regiunea de activare este reprezentată de
‘un lob acid’ (regiune acidă) care interacţionează într-o manieră relativ nespecifică cu alte proteine
implicate în transcripţie. Se consideră că mutaţiile care determină îndepărtarea (pierderea)
aminoacizilor acizi reduc abilitatea de activare, în timp ce mutaţiile care îndepărtează aminoacizii
bazici generează activatori mult mai eficienţi. Totuşi, mutarea sistematică pentru a îndepărta
grupările încărcate din GAL4 nu afectează asupra capacităţii de activare. Probabil este importantă
lipsa sarcinilor pozitive. Domeniile de activare ale GAL4 şi GCN4 formează foi β (β-sheets, pliere
β) care furnizează probabil o interfaţă pentru contactarea altor proteine.
Activatorii acizi funcţionează prin schimbarea capacităţii TFIIB să lege complexul bazal
de iniţiere. Experimentele in vitro arată că legarea TFIIB la complexul de iniţiere pentru un
promotor al adenovirusului este stimulată de prezenţa activatorilor acizi GAL4 sau VP16; VP16
se poate lega direct la TFIIB. Asamblarea TFIIB în complex pentru acest promotor (al
adenovirusului) reprezintă o etapă limitantă de viteză care este stimulată de prezenţa unui activator
acid.
Alte tipuri de motive de activare sunt mult mai puţin bine caracterizate, dar includ o regiune
bogată în glutamină pentru Sp1 şi o regiune bogată în prolină în CTF. Sp1 pare să necesite
proteinele TAF (TAFs= TBP asociated factors) care sunt asociate cu TBP (TATA binding protein)
pentru această acţiune, astfel încât ţinta sa de activare să fie complexul TFIID. Există date care
indică că activatorii pot acţiona cu TFIID.
 Elasticitatea promotorului ARN polimerazei II faţă de rearanjarea elementelor, şi chiar
prezenţă unor elemente particulare, sugerează că evenimentele (etapele, procesele) prin care acesta
este activat sunt într-o oarecare măsură independente context şi relativ generale (destul de
generale). De fapt, orice factor situat în amont şi a cărui regiune de activare este adusă în aceeaşi
orientare (la acelaşi nivel) cu
138
complexul bazal de iniţiere poate fi capabil să stimuleze formarea acestuia. Câteva din dovezile
izbitoare ale acestei vesatilităţi (multiplicităţii/elesticităţii) au fost furnizate prin construirea unor
promotori care constau în noi combinaţii de elemente. De exemplu, când elementul UASG de la
drojdie este inserat lângă promotorul unei gene de la un eucariot mai evoluat, această genă poate
fi activată de GAL4 în culturi celulare de mamifere.
Deoarece GAL4 activează promotorul se pare că această proteină este bine conservată
evolutiv începând de la drojdii şi până la eucariotele superioare. Proteina GAL4 trebuie să
recunoască anumite trăsături ale aparatului de transcripţie de la mamifere care se aseamănă cu
punctele sale normale de contact de la drojdie. O interpretare este aceea că de fapt există
componente comune, fie ale ARN polimerazei fie ale altor factori de transcripţie, care pot fi
recunoscuţi de către unul sau mai mulţi factori pentru a activa transcripţia. Componentul comun
poate fi mai degrabă un motiv dintr-o proteină decât o proteină întreagă.
SLIDE 51. Domeniile de legare la ADN pot fi clasificate în mai multe tipuri structurale ➢
Proteine care conţin homeodomenii ➢ Proteine “Zinc-finger” ➢ Proteine “Winged-helix
(forkhead)” ➢ Proteined “Leucine-zipper” ➢ Proteine “Helix-loop-helix” Factorii de transcripţie
de la eucariote conţin o varietate de motive structurale care interacţionează cu secvenţe de ADN
specifice. Ca şi la majoritatea activatorilor şi represorilor bacterieni, elicele alfa ale factorilor de
transcripţie de la eucariote sunt orientate astfel încât să facă posibilă legarea la fosa majoră a
ADN unde atomii din structura proteinelor participă la formarea legăturilor de hodrogen şi a
legăturilor Van der Waals cu atomi din structura ADN. Interacţiile cu atomii scheletului fosfat, şi
în unele cazuri cu atomii din structura ADN de la nivelul fosei minore contribuie şi acestea la
legare.
Analizele cristalografice cu raze X ale complexelor dintre situsuri de legare specifice din
structura ADN şi factori de transcripţie izolaţi au evidenţiat un număr de motive structurale care
pot prezenta un alfa-helix in fosa majoră. Informaţii suplimentare Există multe tipuri de domenii
de legare a ADN (ADN binding domains)
Comparaţiile între secvenţele mai multor factori transcripţionali (implicaţi în transcripţie)
sugerează că pot fi regăsite tipuri comune de motive care sunt responsabile pentru legarea ADN
(pentru legarea la ADN). Motivele sunt întotdeauna destul de scurte şi cuprind numai o mică parte
a structurii proteinei. Motivele au fost de asemenea identificate ca fiind responsabile de activarea
transcripţiei via interacţiilor dintre proteinele aparatului de transcripţie. Există informaţii detaliate
despre numeroase grupuri de proteine care reglează transcripţia folosind motive particulare
(anumite tipuri de motive) pentru a lega ADN:
- Receptorii steroizi sunt definiţi ca grup printr-o relaţie funcţională: fiecare receptor este
activat prin legarea unui anumit steroid (un steroid particular). Receptorul pentru glucocorticoid
este cel mai studiat. Împreună cu alţi receptori, cum sunt receptorul pentru hormonul tiroidian sau
receptorul pentru acid retinoic, receptorii steroizi sunt membrii unei superfamilii de factori de
transcripţie cu acelaşi mod general de operare (modus operandi).
139
 - Motivele degete cu zinc (zinc finger) cuprind un domeniu de legare a ADN (care leagă
ADN). Au fost original recunoscute în factorul TFIIA, care este necesar ARN polimerazei III
pentru a transcrie genele care codifică ARNr 5S. De atunci au fost identificate în numeroşi alţi
factori de transcripţie (şi presupuşi factori de transcripţie). O formă distinctă a motivului a fost
găsită şi în receptorii steroizi.
Motivul “Winged-helix” (înaripat) sau “Forkhead” (ramificat) este caracteristic domeniilor
de legare la ADN ale histonei 5 şi a altor factori de transcripţie care au fost evidenţiaţi ca fiind
implicaţi în funcţionarea timpurie la Drosophila şi mamifere. Asemeni proteinelor “zinc-finger”
C2H2, proteinele “winged-helix” se leagă în genmeral la ADN ca monomeri.
Motivul helix-turn-helix (helix-cotitură-helix) a fost original identificat ca un domeniu de
legare a ADN al fagilor represori. Un α-helix se leagă în fosa mare a ADN; celălalt helix se leagă
transversal (de-a curmezişul) peste ADN. O formă înrudită a motivului este prezentă în domeniul
homeo (homeo domain), secvenţă care a fost pentru prima dată caracterizată la numeroase proteine
codificate de gene implicate în reglarea dezvoltării la Drosophila. Aceste domenii au fost
identificate acum în gene care codifică pentru factorii de transcripţie de la mamifere.
- Motivul amfipatic helix-loop-helix (helix-buclă-helix) (HLH) a fost identificat în cazul
câtorva regulatori de dezvoltare şi în genele care codifică pentru proteine care leagă ADN. Fiecare
helix amfipatic prezintă o fază formată din resturi hidrofobe şi cealaltă formată din resturi încărcate
(sarcini). Lungimea buclei (loop) de conectare variază de la 12 la 28 de aminoacizi. Motivul
permite moleculelor să dimerizeze, şi o regiune bazică (încărcată pozitiv) situată lângă acest motiv
intră în contact cu ADN.
- Motivul fermoar de leucine sau agrafe cu leucină (leucine zippers) constă într-o regiune
(întindere) formată din aminoacizi în care fiecare al şaptelea aminoacid este o leucină. O secvenţă
leucine zipper (fermoar leucină) de pe o polipeptidă interacţionează cu o altă secvenţă de acelaşi
tip de pe o altă polipeptidă pentru a forma un dimer. Adiacent (în apropierea) fiecărui fermoar
(zipper) există o porţiune (întindere) de resturi încărcate pozitiv care este implicată în legarea
ADN.
Activitatea unui factor de transcripţie inductibil poate fi reglată în mai multe moduri:
a) un factor este specific de ţesut (ţesut specific) deoarece el este sintetizat numai într-un
anumit tip de celulă. Mai mulţi factori de acest tip sunt cunoscuţi, mulţi dintre ei incluzând domenii
homeobox.
b) activitatea unui factor poate fi direct controlată prin modificarea acestuia. HSTF este
transformat în forma activă prin fosforilare. AP1 (un heterodimer constituit din subunităţile Jun şi
Fos) este transformat în forma activă prin defosforilarea subunităţii Jun.
c) un factor este activat sau inactivat prin cuplarea unui ligand. Receptorii steroidieni sunt
primele exemple. Cuplarea (ataşarea) ligandului poate influenţa atât localizarea proteinei (afectând
transportul din citoplasmă în nucleu) cât şi direct abilitatea (capacitatea) sa de a se lega la ADN.
d) disponibilitatea unui factor poate varia; de exemplu, factorul NFkB (care activează
genele k ale imunoglobulinelor în limfocitele B) este prezent în multe tipuri de celule. Acesta poate
fi însă reţinut în citoplasmă de către inhibitorul proteic I-kB. În limfocitele B, NFkB este eliberat
de I-kB şi se deplasează în nucleu, unde activează transcripţia.
e) un factor cu structură dimeră poate avea comportamente diferite. Există posibilitatea ca
un partener să îl inactiveze; sinteza partenerului activ poate deplasa
140
partenerul inactiv. Vom putea vedea mai departe că astfel de situaţii pot fi amplificate în reţelele
în interiorul cărora diferiţi parteneri se împerechează alternativ unul cu altul. Situaţie este
valabilă mai ales în cazul proteinelor HLH (helix-loop-helix) Totuşi, trebuie să reţinem că
mutaţii la nivelul factorilor de transcripţie din unele din aceste clase (categorii) dă naştere unor
activaţi ne-adecvat (incorect) sau inhibă activarea transcripţiei; ei pot avea lor în generarea
tumorilor. .
În continuare vor fi discutate mai detaliat reacţiile de legare a ADN şi de activare, realizate
de unele dintre aceste clase de proteine. În multe cazuri, legarea ADN este realizată de o scurtă
regiune de α-helix care face contact fie cu bazele fie cu scheletul fosfat de la nivelul fosei majore.
SLIDE 52. Homeodomeniile proteinei “engrailed” care interacţionează cu
domeniile specifice din structura ADN Figura: Homeodomeniul proteinei
“engrailed” care interacţionează specific cu situsul său specific ADN
Factorul de transcripţie “engrailed” este exprimat în timpul embriogenezei de la
Drosophila. Perechile de baze ale situsului de recunoaştere care intră în contact direct cu proteina
sunt evidenţiate în alb. Regiunile mai deschise din proteină conţin resturile care intră în contact
cu fosa mare. Informaţii suplimentare Domeniile Homeo se pot lega la secvenţe ţintă înrudite de
pe ADN
‘Homeobox’ este o secvenţă care codifică pentru un domeniu de 60 aminoacizi prezentă în
proteinele multor sau chiar a tuturor eucariotelor. Numele său derivă de la identificarea iniţială la
Drosophila a ‘locilor homeotici’ (acele gene care determină identitatea structurilor corpului).
‘Homeobox’ este prezentă în multe gene care reglează dezvoltarea timpurie la Drosophila, un
motiv înrudit fiind determinat în genele unui mare număr de eucariote superioare. Este foarte
atractivă ipoteza că ‘domeniile homeo’ identifică (sau măcar sunt comune acestora) genele
implicate în reglarea dezvoltării. Secvenţe înrudite cu ‘domeniul homeo’ au fost găsite în multe
tipuri de factori de transcripţie de la animale. Extinderea de la ‘domeniile homeo’ originale de la
Drosophila la mamifere, corelaţiile (relaţiile) dintre regiunile conservate scad semnificativ.
La Drosophila genele homeo, adesea ‘domeniul homeo’ (dar nu întotdeauna) sunt
localizate în apropierea capătului C-terminal. Adesea genele posedă o secvenţă mică conservată
situată în afara ‘homeobox’. Conservarea secvenţelor ‘homeobox’ variază. Un grup major de
‘homeobox’ care conţine şi genele de la Drosophila are o secvenţă bine conservată, cu 80-90%
omologie (asemănare) între perechile de secvenţe comparate. Adesea, în factorii de transcripţie
animali ‘domeniul homeo’ este combinat cu alte motive. Un exemplu este prezentat de către
proteinele Oct (octamer- binding), care reprezintă un grup în care regiunea de 75 aminoacizi
conservată este denumită regiunea Pou şi este localizată în imediata vecinătate a unei regiuni care
se aseamănă cu ‘domeniul homeo’. Secvenţele corespunzătoare prezente în ‘domeniile homeo’ ale
proteinelor din grupul Pou sunt cele mai îndepărtate rude ale grupului original, constituind astfel
cea mai cea mai îndepărtată ramură a familiei (cea mai îndepărtată extensie a familiei).
‘Domeniul homeo’ este responsabil pentru legarea la ADN, experimentele de schimbare a
‘domeniilor homeo’ între proteine sugerează că specificitatea recunoaşterii ADN este ‘înscrisă’ în
interiorul ‘homeo domeniului’. Dar (ca şi în cazul fagilor represori) nu poate fi dedus un cod
simplu care leagă proteina şi secvenţele de ADN. Regiunea C-terminală a ‘domeniului homeo’
arată o omologie cu motivul
141
‘helix-turn-helix’ al represorilor de la procariote. Aşa cum ne amintim represorul lambda posedă
un ‘helix de recunoaştere’ (α-helix-3) care intră în contact cu fosa majoră a ADN, în timp ce celălalt
helix (α-helix-2) se leagă într-un anumit unghi transversal (de-a curmezişul) de-a lungul ADN.
‘Domeniul homeo’ poate fi organizat în trei regiuni sub formă de helix potenţiale; Partea cea mai
bine conservată a secvenţei se leagă de cel de al treilea helix. Diferenţele dintre aceste structuri şi
structurile represorului de la procariote sunt legate de lungimea helixului care recunoaşte ADN,
helixul 3, care este cu 17 aminoacizi mai lung în ‘domeniul homeo’, faţă de o lungime de 9 resturi
în cazul represorului lambda.
Structura cristalină a ‘domeniului homeo’ al produsului genei D. melanogaster engrailed
(pictată) este prezentată schematic în figura. Helixul 3 se leagă la nivelul fosei mari a ADN şi
realizează majoritatea contactelor dintre proteină şi acidul nucleic. Majoritatea contactelor care
orientează helixul în fosa majoră sunt realizate cu coloana fosfat, deci ele nu sunt specifice pentru
secvenţa ADN. Aceasta se leagă larg pe faţa dublului helix, şi flanchează bazele cu care au fost
realizate contacte specifice. Celelalte puncte de contact rămase sunt realizate de braţul N-terminal
al ‘domeniului homeo’, secvenţa care precede exact primul helix. Ea este proiectată
(orientată/azvârlită) în fosa minoră. Astfel, regiunile N- şi C-terminale ale ‘domeniului homeo’
sunt primele răspunzătoare de contactul cu ADN (de intrarea în contact cu ADN).
O interesantă demonstraţie a caracterului general al acestui model derivă din compararea
structurii cristaline a ‘domeniului homeo’ de la D. melanogaster engrailed cu proteina α2 de
‘mating’ de la drojdie. Domeniul de legare al acestei proteine se aseamănă cu ‘domeniul homeo’,
şi poate forma trei helixuri similare: structura sa în fosa ADN poate fi suprapusă aproape exact cu
cea a ‘domeniului homeo’ de la ‘engrailed’. Aceste asemănări sugerează că toate domeniile homeo
se leagă la ADN (leagă ADN) în acelaşi mod. Aceasta înseamnă că un număr relativ mic de resturi
din helixul 3 şi din braţul N-terminal sunt responsabile de specificitatea contactelor.
SLIDE 53. Interacţia ADN-Proteine Modelul ”helix-turn-helix” (HTH) Figura: Modelul “helix-
turn-helix” (HTH) este o structură comună de recunoaştere a ADN şi la procariote. În figură avem
o imagine obţinută prin difracţie cu raze X pentru dimerul cAMP-CAP care formează un complex
cu aproximativ 30 pb de duplex ADN.
a) Complexul văzut cu cele două plieri faţă de axa orizontală în planul hărtiei. Proteina este
reprezentată prin structurile sale alfa cu domeniul N-terminal de legare a cAMP, colorat în albastru
şi cel C-terminal de legare la ADN în mov/roşu;
b) Legarea dimerului CAP prin intermediul motivelor HTH în fosele mojore succesive ale
ADN. Capătul N-terminal al motivului HTH este albastru în timp ce helixul de recunoaştere este
roşu.
SLIDE 54. Interacţia ADN-ProteineModelul HTH (represorul 434 al bacteriofagullui P22)
Figura: Structura obţinută cu raze X a represorului 434 al fagului P22 (este evidenţiat numai
domeniul capătului de 69 de resturi amino-terminal) în complex cu un fragment ţintă de 20 pb cu
structura d(TATACAAGAAAGTTTGTACT)
 a) Modelul sub formă de schelet cu ADN în stânga si cu cele două subunităţi identice ale
proteinei (două elice alfa) în stânga.
142
 b) Reprezentare schematică a motivului “helix-turn-helix”, care evidenţiază interacţia elicelor
alfa2 şi alfa3 cu ADN ţintă. Barele scurte din structură sunt grupările peptidice NH, legăturile de
hidrogen sunt reprezentate de linii punctate, grupările fosfat ale ADN prin numere încercuite.
Cercurile mici sunt molecule de apă. c) Modelul cu bile corespunzător repşrezentării din figura a.
Proteina este reprezentată în galben.
SLIDE 55. Interacţia ADN-Proteine Modelul HTH (represorul TRp de la E. Coli) Figura:
Structura cu raze X a complexului represor-operator pentru operonul trp de la E. Coli.
Cele două subunităţi identice ale proteinei sunt reprezentate sub formă de panglici una
verde şi cealaltă mov. Ambele formează motivul HTH (elicele D şi E). Represorul trp se leagă la
operator numai cînd L-triptofanul (în roşu) este legat simultan
SLIDE 56. Interacţiile domeniilor C2H2 şi C4 “zinc-finger” cu ADN Figura:
a) O proteină C2H2 cu cinci degete numită GL1. Această proteină monomeră este codificată
de o genă care este amplificată într-un număr de tumori umane. Regiunile helicale sunt
reprezentate prin cilindri iar catenele beta prin panglici. Degetul 1 nu interacţionează cu ADN, în
timp ce celelalte patru degete da. Cercurule negre indică ionii de Zn2+;
b) regiunile sub formă de helix sunt reprezentate ca spirale iar catenele beta sub formă de
săgeţi. Două elice alfa, una din fiecare monomer, interacţionează cu ADN. Ca toţi homodimerii
“Zinc-finger” C4, acest factor de transcripţie posedă o simetrie de pliere rotaţională; centrul de
simetrie este avidenţiat prin elipsa galbenă. Cercurile negre indică ionii de Zn2+. Informaţii
suplimentare Motivul zinc finger poate furniza un domeniu de legarea a ADN (poate constitui un
domeniu de legare a ADN)
Zinc fingers (degete cu zinc) şi-au luat numele după structura pe care o posedă. În aceasta,
un mic grup de aminoacizi conservaţi leagă ionul de zinc, şi formează un domeniu relativ
independent în proteină. Două tipuri de proteine care se leagă la ADN (DNA-binding proteins) au
structuri de acest tip: proteinele clasice ‘zinc finger’ şi receptorii steroidieni.
O proteină ‘finger’ tipică are o serie de degete cu zinc, aşa cum este prezentat în figură.
Secvenţa consens a unui singur deget este:
Cys-X2-4-Cys-X3-Phe-X5-Leu-X2-His-X3-His Motivul îşi trage numele (şi-a luat numele) de la
bucla (loop) de aminoacizi care depăşeşte ca o protuberanţă situsul de legare al zincului, care
este descris ca un deget Cys2/His2. Zincul este prins într-o structură tetraedrică formată prin
conservarea resturilor de Cys şi His. Degetul în sine conţine aproximativ 23 aminoacizi, iar
legătura dintre degete este, în mod normal, de 7-8 aminoacizi.
Factorul de transcripţie TFIIIA (necesar ARN polimerazei III să transcrie genele care
codifică ARN 5S) conţine o serie de 9 degete organizate în repetiţii în tandem (tandem repeats=
secvenţe repetitive în tandem). Trei repetiţii ale secvenţei deget sunt prezente şi în factorul de
transcripţie SP1 care este implicat în iniţierea transcripţiei la mai mulţi promotori folosiţi de ARN
polimeraza II. Degetele sunt necesare pentru legarea ADN (sau legarea la ADN).
143
 Este necesar să se manifeste precauţie la interpretarea prezenţei (sau putativelor/posibilelor
degete) degetelor cu zinc, mai ales când proteina conţine numai un singur motiv deget. Degetele
mai pot fi implicate şi în legarea la ARN (legarea ARN) sau chiar fără a fi corelate cu activitatea
de reglare la vreun tip de acid nucleic.
Prototipul proteinei cu degete (finger protein) este TFIIIA care se leagă atât la gena ADNr
5S cât şi la produsul acesteia ARNr 5S. Un factor de iniţiere a translaţiei eIF2β are un deget cu
zinc; mutaţiile la nivelul motivului deget influenţează recunoaşterea codonului de iniţiere.
Proteinele capsidei retrovirale au un motiv înrudit cu motivul deget care poate fi implicat în legarea
ARN viral.
Degetele zinc au un motiv comun în proteinele care leagă ADN (care se leagă la ADN).
De obicei, degetele sunt organizate ca o singură serie de unităţi repetitive în tandem; ocazional
există mai mult decât un singur grup de degete. Regiunea degetelor variază ca întindere de la o
lungime de 9 repetiţii, care ocupă aproape întreaga proteină (este cazul TFIIIA), la numai un mic
domeniu care constă în două degete (ca în cazul proteinei reglatoare ADT1 de la Drosophila)
Factorul general de transcripţie Sp1 posedă un domeniu de legare a ADN format din trei degete cu
zinc.
Partea C-terminală a fiecărui deget formează un α-helix care leagă ADN; partea N-
terminală formează o structură β-pliată. (Pentru simplificare conformaţia β- pliată şi localizarea
ionului de zinc nu au mai fort configurate în partea de jos a figurii). Cele trei regiuni α-helix se
potrivesc (se fixează) într-o răsucitură (întoarcere/cotitură a fosei majore); fiecare α (şi astfel
fiecare deget realizează două contacte specifice de secvenţă (secvenţă specifice) cu ADN (indicate
prin săgeţi).
Dacă acest tip de structură este tipică degetelor cu zinc, ne putem aştepta ca aminoacizii
ne-conservaţi de la capătul C-terminal să fie responsabili de recunoaşterea specifică a situsurilor
ţintă. (De reţinut că ipoteze similare despre motivul helix-turn-helix prezent la represorii de la
procariote au fost dificil de susţinut, acum ezitând dubii (semne de întrebare) dacă putem dovedi
existenţa unui cod care corelează secvenţele în aminoacizi ale elicei cu perechile de baze ale
secvenţei ADN ţintă.
Cunoscând că degetele cu zinc se găsesc în factori de transcripţie autentici care însoţesc
(asistă) atât ARN polimeraza II cât şi III, putem privi proteinele cu motive deget dintr-o perspectivă
inversă. Când se determină că o proteină conţine mai multe degete cu zinc, aceasta constituie cel
puţin prima premisă (prima facie) în sensul investigării proteinei ca având un posibil rol ca factor
de transcripţie. Astfel s-a identificat că diferiţi loci implicaţi în dezvoltarea embrionară la D.
melanogaster sunt reglatori ai transcripţiei.
Receptorii hormonilor steroizi (şi alte proteine) au un alt tip de motiv deget. Structura se
bazează pe o secvenţă cu (un posibil/putativ) un situs consens de legare a zincului:
Cys-X2-Cys-X1-3-Cys-X2-Cys Acestea sunt denumite degete Cys2/Cys2. Proteinele cu degete
de acest tip au adesea degete ne-repetitive, în contrast cu repetiţia în tandem a tipului Cy2/His2.
 Secvenţele de legare de pe ADN sunt scurte şi palindromice. Analiza mutaţiilor a arătat că
regiunile proteinelor reglatoare care se leagă la ADN includ motive finger.
Degetele Cys2/Cys2 sunt distincte de degetele Cys2/His2. Studiile pe receptori steroidieni
au arătat că mutaţiile care transformă cea de a doua Cys în His, schimbând astfel tipul de deget,
determină pierderea capacităţii de activare a genelor ţintă. Deci cele două tipuri de structuri sub
formă de deget nu sunt interschimbabile.
Receptorii pentru glucocorticoid şi estrogen au fiecare câte două degete, fiecare cu un
atom de zinc în centrul tetraedrului format de cisteine. Cele două
144
structuri deget formează α-helixuri care se pliază împreună pentru a da naştere unui domeniu
globular mare. Părţile aromatice ale α-helixurilor formează împreună un centru hidrofob unde o
structură β-pliată conectează cele două helixuri. O parte a helixului N-terminal vine în contact cu
fosa majoră a ADN. Doi receptori glucocorticoizi dimerizează pentru a se lega la ADN, şi fiecare
angajează o scobitură (răsucire/turnură) succesivă a fosei majore. Acest aspect este în concordanţă
cu natura palindromică a ‘elementului răspuns’.
Fiecare deget controlează o proprietate importantă a receptorului. Dintre aminoacizii
relevanţi (cu relevanţă), cei de pe partea dreaptă a primului deget controlează legarea la ADN iar
cei de pe partea stângă a celui de al doilea deget controlează capacitatea de a forma dimeri.
Dovezi directe privind legarea ADN la degete au fost obţinute printr-un experiment de
‘modificare a specificităţii’ (specificity swap). Motivul deget al receptorului pentru estrogen a
fost înlăturat şi înlocuit cu cel al unui receptor glucocorticoid. Noua proteină recunoaşte secvenţa
GRE (secvenţa obişnuită pentru un receptor glucocorticoid) în locul secvenţei ERE (secvenţa
obişnuită pentru un receptor estrogen). Această recunoaştere stabileşte specificitatea cu care este
recunoscut ADN. Secvenţele GRE şi ERE sunt destul de asemănătoare (similare), şi alte
experienţe de ‘modificare a specificităţii’ au arătat că diferenţierea dintre ele constă în doi
aminoacizi care sunt diferiţi la primul motiv deget. Diferenţele dintre secvenţele receptorului
glucocorticoid şi a celui estrogen sunt determinate în principal pe baza motivului deget.
Substituirea a două dintre poziţiile importante face ca receptorul glucocorticoid să se lege la o
secvenţă ERE în loc de una GRE.
SLIDE 57. Interacţia dintre proteina C6 “zinc-finger”(Gal4) şi ADN Figura: Diagrama
interacţiei dintre gal4, o proteină “zinc-finger” C6, şi ADN
Această proteină se leagă la ADN ca un homodimer care interacţionează pentru a forma o
structură suprarăsucită care se leagă perpenticular pe helixul ADN. Legarea resturilor de cisteină
la doi ioni Zn2+ (în galben) pe fiecare monomer care formează câte un domeniu globular de legare
la ADN.
SLIDE 58. Interacţia proteinei homodimere “leucine-zipper” şi ADN Figura: Două imagini
ale interacţiunii factorului Gcn4 de la drojdii, o proteină homodimeră “leucine-zipper”, cu ADN
Regiunile alfa-helix extinse ale monomerului prind ADN la nivelul foselor majore
adiacente. Domeniul suprarăsucit de dimerizare al Gcn4 conţine resturi de leucine precis
poziţionate. Unele proteine de legare la ADN care conţin acelaşi model general conţin alţi
aminoacizi hidrofobi în aceste poziţii; din această cauză modelul prezentat aici se numeşte modelul
”fermoar de leucină” de bază.
Informaţii suplimentare Motivele ‘leucine zipper’ pot fi implicate în formarea dimerilor
Interacţiile dintre proteine constituie o temă comună în constituirea complexului
transcripţional. Un motiv găsit (caracteristic) mai multor factori de transcripţie (şi altor proteine)
este implicat atât în interacţiile homo- cât şi heterodimerice. Motivul ‘leucine zipper’ este o
secvenţă (regiune/lungime) de aminoacizi bogată în resturi de leucină care furnizează un motiv
dimer. Însăşi formarea dimerilor a apărut ca un principiu comun în acţiunea proteinelor care
recunosc secvenţe specifice de ADN. În cazul ‘leucine zipper’ relaţiile acestui motiv
145
cu legarea ADN sunt clare, deoarece dimerizarea juxtapune regiunile de legare a ADN de pe
fiecare subunitate.
Un α-helix amfipatic prezintă o structură în care grupările hidrofobe (inclusiv leucină) se
orientează către una dintre părţi, în timp ce grupările încărcate se orientează către cealaltă parte.
Motivul ‘leucine zipper’ formează un helix amfipatic în care leucinele fermoarului unei proteine
se pot intercala printre leucinele altui α- helix care aparţine altei proteine paralele care poartă
acelaşi motiv (protuberanţele leucinelor unei părţi a fermoarului unei proteine se intercalează cu
leucinele celeilalte părţi a fermoarului celeilalte proteine dispusă paralel). Cele două elice de ‘mână
stângă’ (răsucite către stânga) se rotesc una în jurul celeilalte, cu 3,5 resturi pe tură, astfel încât
motivul se repetă integral după 7 resturi.
Cum se leagă această structură la ADN? Regiunea adiacentă resturilor repetitive de leucină
este foarte bazică în fiecare proteină fermoar, şi poate cuprinde situsul de legare a ADN. Cele două
fermoare leucină formează de fapt o structură în formă de Y, în care fermoarele constituie stemul
(tulpina), iar cele două regiuni bazice se bifurcă simetric pentru a forma braţele care leagă ADN.
Această structură este cunoscută drept motivul structural bZIP. Aceasta explică de ce secvenţele
ţintă ale unei astfel de proteine sunt repetiţii inverse ne-separate între ele (secvenţe repetitive
inverse care nu sunt distanţate între ele).
Fermoarele pot fi utilizate pentru a sponsoriza (asigură formarea homodimerilor şi
heterodimerilor. Ele sunt motive lungi. Leucina ocupă fiecare al şaptelea rest în potenţialul motiv
fermoar. În proteina C/EBP (factor care se leagă sub formă de dimer atât la ‘CAAT box’ cât şi la
miezul/core activatorului SV40) există 4 repetiţii, iar în factorii Jun şi Fos (care formează factorul
heterodimer de transcripţie, AP1). AP1 a fost original identificat ca o secvenţă care leagă ADN
prezentă în activatorul (în regiunea activatoare) SV40.
Preparatul activ al AP1 include mai multe polipeptide. Un component major este Jun,
produsul genei c-jun care a fost identificată prin relaţia sa cu oncogena v-jun purtată de virusul
sarcomului aviar. Genomul de şoarece conţine o familie de gene înrudite, c-jun (izolată original)
şi junB şi junD (identificate datorită omologiei de secvenţă cu jun). Aceste trei proteine au o
considerabilă omologie de secvenţă; ele posedă motive ‘leucine zipper’ care pot interacţiona
pentru a forma homodimeri şi heterodimeri.
Un alt component major al AP1 este produsul unei alte gene cu o copie oncogenă. Gena c-
fos este un omolog celular al oncogenei v-fos purtată de virusul sarcomului murin (virusul
sarcomului de şoarece). Expresia c-fos activează genele ai căror promotori posedă un situs ţintă
pentru AP1. Produsul c-fos este o fosfoproteină nucleară care face parte din acest grup de proteine.
Celelalte au fost descrise ca fiind antigeni înrudiţi cu Fos (Fos-related antigenes = FRA); ele
constituie familia proteinelor Fos (Fos-like proteins).
Fos are şi ea un motiv ‘leucine zipper’, nu poate forma homodimeri dar formează un
heterodimer cu Jun. Pentru reacţie este necesar un motiv ‘leucine zipper’ pentru fiecare proteină.
Capacitatea de a forma dimeri este partea crucială (cea mai importantă) a interacţiei acestor factori
cu ADN. Fos singură nu poate lega ADN, probabil datorită incapacităţii sale de a forma dimeri.
Heterodimerul Jun-Fos se poate lega la ADN cu aceeaşi specificitate pentru secvenţa ţintă ca şi
dimerul Jun-Jun; acest heterodimer se leagă la situsul AP1 cu o afinitate de aproximativ 10 ori mai
mare decât homodimerul Jun.
Unul dintre modelele imaginate presupune că atât în cazul homodimerului Jun-Jun cât şi
al heterodimerului Jun-Fos, ambele subunităţi intră în contact cu ADN.
146
Afinitatea crescută a heterodimerului pentru ADN poate reflecta capacitatea situsurilor de legare
ale subunităţilor Jun şi Fos de a intra mai puternic în contact cu ADN faţă de situsurile celor două
subunităţi Jun.
SLIDE 59. Interacţia proteinei homodimere “helix-loop-helix” şi ADN Figura: Interacţia
domeniului HLH (“helix-loop-helix”) din proteina homodimeră Max cu ADN
Motivul HLH se extinde şi dincolo de elicele de legare la ADN, în stânga (capetele N-
terminale ale monomerilor) până în apropierea regiunii de răsucire a catenelor; această regiune
este urmată imediat de o regiune de răsucire de tip “leucine Zipper” în proteina dimeră.
Informaţii suplimentare Proteinele ‘helix-loop-helix’ interacţionează prin asociere combinată
Cele două trăsături comune ale proteinelor care se leagă la ADN sunt prezenţă regiunilor
sub formă de helix care leagă ADN, şi capacitatea proteinei de a dimeriza. Ambele trăsături sunt
caracteristice şi grupului de proteine ‘helix-loop-helix’ care conţin un tip comun de motiv de
secvenţă: o regiune (întindere) de 40-50 de aminoacizi conţin două α-helixuri amfipatice separate
de o regiune de legare (linker region=the loop), bucla, care are o lungime variabilă. Proteinele din
acest grup formează atât homodimeri cât şi heterodimeri prin intermediul interacţiunilor care se
stabilesc între resturile hidrofobe situate pe feţele (părţile) corespunzătoare celor două helixuri.
Regiunile sub formă de helix au o lungime de 15-16 aminoacizi, fiecare conţinând mai multe
resturi conservate. Capacitatea de a forma dimeri rezidă (se află) în aceste helixuri amfipatice, şi
este comună tuturor proteinelor HLH (helix-loop- helix). Bucla este probabil importantă numai
pentru a oferi libertate celor două regiuni să interacţioneze independent una de cealaltă.
Majoritatea proteinelor HLH conţin o regiune adiacentă motivului HLH care este foarte
bazică, şi care este necesară pentru legarea ADN. Pe o lungime de 15 aminoacizi aproximativ 6
resturi sunt conservate. Membrii grupului care conţin o astfel de regiune sunt numiţi proteine
bHLH. Se pot lega la ADN atât un homodimer cât şi un heterodimer în care ambele subunităţi
conţin o regiune bazică. Se pare că domeniile HLH au rolul de a orienta corect cele două regiuni
bazice conţinute de subunităţile individuale. Nu se cunoaşte încă mult despre modalitatea în care
proteinele HLH activează transcripţia.
Membrii grupului bHLH includ: două proteine E12 şi E47 care se leagă la un element
prezent într-un activator al genei imunoglobulinelor, myoD, miogenina, factorul de transcripţie
myf-5 care este implicat în miogeneză (formarea muşchiului), genele myc (care sunt copii/dubluri
ale oncogenelor implicate în reglarea creşterii), şi un grup de gene care specifică (sunt
responsabile) dezvoltarea sistemului nervos la D. melanogaster.
Proteinele bHLH se împart în două subgrupe (categorii) generale: - clasa A constă în
proteinele care sunt exprimate ubicuitar, incluzând proteinele E12/E47 de la mamifere şi musca
da (musca domestică); - clasa B constă în proteine care sunt exprimate specific în funcţie de
ţesut, care includ Myo D de la mamifere şi AC-S de la musca domestică. Proteinele clasei bHLH
ţesut specifice pot fi factori de reglare transcripţionali (reglatori transcripţionali) care
funcţionează mult mai eficient prin formare de heterodimeri cu un partener cu distribuţie
ubicuitară. Nu se cunoaşte dacă acesta este singurul tip de activitate, sau dacă homodimerii
formaţi de proteinele bHLH ubicuitare sunt uneori folosite pentru a
147
regla transcripţia. Proteinele myc formează o categorie (clasă) separată de proteine bHLH ai
căror parteneri şi secvenţe ţintă sunt diferite.
Dimerii formaţi de proteinele bHLH diferă prin capacitatea lor de a se lega la ADN. De
exemplu, homodimerii E47, heterodimerii E12-E47, şi MyoD-E47 se formează eficient şi se leagă
puternic la ADN. E12 homodimerizează bine, dar se leagă slab la ADN, în timp ce homodimerii
MyoD homodimerizează destul de slab. Astfel, atât formarea dimerilor cât şi legarea ADN pot
reprezenta punte reglatoare importante. În această conjunctură, este posibilă definirea unor grupuri
de proteine HLH ai căror membri formează diferite tipuri de combinaţii (tipuri de
împerecheri/cuplaje), dar nu pentru prezice secvenţele cele mai puternic implicate în formarea
dimerilor sau legarea ADN. Toţi dimerii acestui grup care leagă ADN recunosc aceeaşi secvenţă
consens. Nu se ştie încă dacă diferiţii homo- sau heterodimeri manifestă preferinţe pentru situsurile
ţintă uşor diferite care sunt corelate cu funcţiile lor.
Diferenţele de legare a ADN sunt determinate de proprietăţile regiunii situate în sau din
apropierea motivului HLH; de exemplu, E12 diferă de E47 prin faptul că posedă o regiune
inhibitoare chiar după regiunea bazică şi/sau conţine resturi de prolină care par să-i deranjeze
funcţia. Proteinele de acest tip au aceeaşi capacitate de dimerizare ca şi proteinele bHLH, dar un
dimer care conţine o subunitate de acest tip nu se mai poate lega specific la ADN. Aceasta
reprezintă o demonstraţie eficace (puternică) a importanţei dublării motivelor de legare a ADN în
proteinele care se leagă la ADN (sau care leagă ADN).
Importanţa distincţiei dintre proteinele ne-bazice HLH şi bHLH este sugerată de
proprietăţile a două grupe de proteine HLH: grupul da-AC-S/emc şi tipul Myo/Id. La D.
melanogaster, gena emc (extramacrochaetae) este necesară pentru stabilirea orientării normale a
organelor senzoriale adulte. Ea funcţionează prin suprimarea funcţiilor mai multor gene inclusiv
da (daughterless) (care împiedică formarea de progenituri) şi a complexului AC-S (achaete-scute),
care în caz contrar (altfel) determină celulele adiţionale (complementare/suplimentare) să nu
urmeze acest destin. AC-S şi da sunt gene care aparţin tipului bHLH. Supresorul emc codifică
pentru o proteină HLH căreia îi lipseşte regiunea bazică. Se presupune că, în absenţa funcţiei emc,
proteinele da şi AC-S formează dimeri care activează transcripţia unor gene ţintă adecvate, dar
producerea proteinei emc determină formarea heterodimerilor care nu pot lega ADN. Astfel,
producerea proteinei emc în celule adecvate (în anumite celule) este necesară pentru a suprima
funcţia AC-S/da.
Formarea celulei musculare este dirijată (orientată/direcţionată) de o modificare în
programul transcripţional care necesită numeroase proteine bHLH, inclusiv MyoD. MyoD este
produsă specific în celulele cu funcţie miogenică; s-a constata că super-exprimarea MyoD în orice
altă celulă poate induce începerea unui program miogenic. Semnalul (declanşatorul ,mecanismul
responsabil de declanşare) diferenţierii celulare este mai probabil un heterodimer care constă în
MyoD-E12 sau MyoD-E47 decât un homodimer MyoD/MyoD. Înainte de începerea miogenezei,
un membru al tipului de proteine HLH ne-bazice, proteina Id, se poate lega la MyoD şi/sau E12 şi
E47 pentru a forma heterodimeri care nu pot lega ADN. Acestea se leagă la E-12/E47 mai bine
decât la MyoD, şi poate funcţiona prin sechestrarea partenerului bHLH ubicuitar. Supraexpresia
Id poate împiedica miogeneza. Astfel, îndepărtarea Id poate fi semnalul care eliberează MyoD
pentru a iniţia miogeneza.
Comportamentul proteinelor HLH este ilustrat în două principii generale ale reglării
transcripţiei. Un mic număr de proteine formează asocieri combinate; este posibil ca aceste
combinaţii particulare să aibă diferite funcţii în ceea ce priveşte
148
legarea ADN şi reglarea transcripţiei, dar pentru moment nu sunt înţelese în întregime funcţiile
relative ale proteinelor bHLH specifice unui anumit ţesut şi ubicuitare. Membrii aceleiaşi clase de
proteine pot funcţiona ca supresori prin participarea la alte combinaţii asociative. Diferenţierea
poate depinde fie de prezenţa fie de îndepărtarea unor proteine supresor particulare (anumitor
proteine supresor) aparţinând clasei HLH de proteine ne-bazice.
SLIDE 60. Factorii transcripţionali heterodimeri cresc opţiunile controlului genetic Figura:
Posibilităţi de combinare datorate formării factorilor de transcripţie heterodimeri
a) În modelul ipotetic prezentat, factorii de transcripţie A, B şi C fiecare interacţionează unul
cu celălalt, permitând celor trei factori să se lege la 6 secvenţe diferite de ADN (situsurile 1-6) şi
crează 6 combinaţii ale domeniilor de activare (de reţinut că fiecare situs de legare este împărţit în
două jumătăţi de situsuri şi că un singur factor heterodimer conţine domeniile de activare al
fiecăruia dintre monomerii constituenţi). Patru factori monomeri diferiţi se pot combina pentru a
forma 10 factori homo şi heterodimeri; cinci monomeri vor duce la formarea a 15 factori dimeri şi
aşa mai departe;
b) Când un factor inhibitor (în verde) se consideră că interacţionează numai cu factorul A,
situsurile de legare 1, 4 şi 5 sunt inhibate dar situsurile 2, 3 şi 6 nu sunt afectate Informaţii
suplimentare
Trei tipuri de proteine de legare la ADN discutate anterior pot forma heterodimeri:
proteinele “Zn finger” C4, proteinele bazice “zipper” şi proteinele “helix-loop-helix”. Alte clase
de factori de transcripţie ale căror structuri nu sunt considerate specific formează şi ele proteine
heterodimere. În unii factori de transcripţie heterodimeri, fiecare monomer posedă un domeniu de
legare a ADN cu specificitate de secvenţă echivalentă, dar rareori permite domeniilor de activare
asociate cu fiecare monomer să fie adunate împreună într-un singur factor de transcripţie. Totuşi,
dacă monomerii posedă diferite specificităţi de legare la ADN, formarea heterodimerilor creşte
numărul de secvenţe potenţiale de ADN pe care factorii le pot lega.
În plus, există exemple proteine inhibitoare bazice “zipper” sau de “helix- loop-helix” care
blochează legarea ADN când dimerizează cu un partener polipeptidic normal capabil să lege ADN.
Când aceşti factori inhibitori sunt exprimaţi, ei represează activarea transcripţională prin
intermediul factorilor cu care ei interacţionează.
Regulile care guvernează interacţiile membrilor unei clase de factori de transcripţie sunt
complexe. Această complexitate combinaţională poate fi extinsă şi numărului de situsuri ADN la
nivelul cărora aceşti factori pot activa transcripţia dar şi modalităţilor prin care aceasta poate fi
reglată. Acest lucru nu este posibil pentru factorii de transcripţie care se leagă sub formă de
monomeri sau homodimeri.
SLIDE 61. Domeniile de activare manifestă o considerabilă diversitate structurală Figura 1:
Structura domeniului fosforilat de activare acid CREB complexat cu domeniul său de
interacţiune şi co-activatorul său CBP
149
 Structura polipeptidică a domeniului activator fosyforilat acid al CREB este reprezentat
sub forma unei spirale roz. Resturile de aa din CREB care interacţionează cu suprafaţa CBP sunt
indicate prin abrevieri cu o singură literă. Suprafaţa domeniuli de interacţie cu CBP accesibilă
apei este reprezentată în spatele figurii cu regiuni de potenţial pozitiv şi negativ prezentate în
albastru şi roşu. Figura 2: Efectul legării ligandului asupra conformaţiei domeniilor de legare a
liganzilor în cazul a doi receptori nucleari înrudiţi de la om. Structura determinate prin
cristalografie cu raze X. a) În absenţa legării ligandului (acid 9-cis retinoic), domeniul de legare
a domeniului în receptorul RXRalfa prezintă o conformaţie deschisă. În această formă, el
funcţionează ca un domeniu represor; b) Când se leagă la all-trans acid retinoic, domeniul de
legare a ligandului din receptorul uman RARgama are o conformaţie compactă. În această formă
acesta poate stimula transcripţia.
Cilindrii reprezintă alfa-helixurile. Regiunile domeniului de legare a ligandului care nu îşi
schimbă semnificativ conformaţia datorită legării ligandului sunt reprezentate în verde iar regiunile
care o fac în galben.
Informaţii suplimentare
Un domeniu de activare este o secvenţă polipeptidică care activează transcripţia când
fuzionează cu un domeniu de legare la ADN. De exemplu, un număr mare de secvenţe
polipeptidice pot activa transcripţia în celule eucariote de la un promotor care posedă în amonte
situsuri UASGAL care leagă domeniul de legare la ADN al Gal4. S-a constatat că aprox 1% din
proteinele de fuziune compuse din domeniul Gal4 de legare la ADN şi segmente aleatoare ale
proteinelor activatoare de la E. coli, activează transcripţia la nivelul unui promotor de la drojdii şi
mamifere care posedă în amonte o secvenţă UASGAL.
Aceste rezultate demonstrează că un grup divers de secvenţe peptidice pot funcţiona ca
domenii de activare, chiar dacă aceste au alte funcţii în mod obişnuit. Cu toate aceste multe
domenii de activare posedă un procentaj crescut de aminoacizi particulari. De exeplu Gal4 şi Gcn4
ca şi majoritatea factorilor de transcripţie de la drojdii sunt foarte bogaţi în acid aspartic şi acid
glutamic. Acestea sunt numite şi domenii acide de activare şi sunt capabile să activeze transcripţia
aproape pentru toate tipurile de celule animale, fungi, plante.
Studii biofizice recente pe modele de activatori acizi evidenţiază că există ca structuri
polipeptidiced nestructurate, pliate la întâmplare până în momentul în care aceştia interacţionează
cu o proteină co-activator. Această interacţiune induce plierea domeniului de activare într-o
structura alfa-helix amfipatică care intră în contact cu o suprafaţă complementară a proteinei co-
activatoare.
SLIDE 62. Complexele multiproteice acţionează la nivelul “enhancer”- ilor Figura: Model de
“enhanceozome” (complex activator) care se formează la nivelului “activatorului” pentru beta-
interferon.
Heterodimerii cJun/AFT2 (Activation Transcription Factor 2), IRF-3, IRF-7 (iron
responsive elements/iron binding protein or iron responsive factors) şi NF-kB (un heterodimer
format din p50 şi p65) se leagă la cele 4 elemente de control ale “activatorului” de aproximativ 70
pb. Legarea cooperativă a acestor factori de transcripţie este facilitată de HMGI care se leagă la
fosa minoră a ADN. Proteinele c- jun, AFT-2, p50 şi p65 toate par să interacţioneze direct cu o
HMGI poziţionată în
150
apropierea lor. Plierea secvenţei activatoare determinată de legarea HMGI este critică pentru
formarea “enhanceozomului” (complexului activator). Alte proteine care se leagă la ADN şi
determină plierea acţionează similar la nivelul altor activatori.
Protooncogenele C-jun şi c-fos codifică proteine care uneori se asociază pentru a forma
un factor de transcripţie heterodimer, numit AP1 care se leagă la secvrenţe din regiunea
promotoare şi activatoare a diferitelor gene. Atât Fos cât şi Jun pot acţiona independent ca factori
de transcripţie.
NF-kB (factorul nuclear pentru transcripţia lanţurilor k în celulele B) este un factor de
transcripţie heterodimer care a fost descoperit în urma unor experimente biochimice pornind de
la necesitatea acestui factor de către celulele B pentru transcripţia lanturilor k ale
imunoglobulinelor. NF+kB este un heterodimer format din două proteine înrudite p50 şi p65.
Aceste proteine manifestă o regiune de omologie la capetele lor N-terminale care este necesară
pentru legarea ADN şi dimerizare. Complexele multiproteice se formează la nivelul
“enhancerilor”
“Enhancerii” sau activatorii sunt în general secvenţe cu o lungime cuprinsă între 50 şi
200 pb şi conţin numeroase situsuri de legare a factorilor transcripţionali.
Factorii transcripţionali multipli care se leagă la un singur activator se consideră că
interacţionează. Analizele activatorului care reglează expresia beta- interferonului, o proteină
importantă implicată în apărarea organismului uman faţă de infecţiile virale, furnizează un bun
exemplu privind modul de interacţiune al acestor factori. La nivelul acestui activator de
aproximativ 70 pb au fost identificate patru elemente de control prin analiză mutaţională. Studii
mai detaliate au evidenţiat că factorii care recunosc activatorul se leagă simultan. În prezenţa unei
proteine mici abundente asociată cu cromatina, numită HMGI (high-mobility-group), legarea
factorilor de transcripţie este înalt cooperativă, similară cu legarea proteinei CAP de la E. coli şi a
ARN polimerazei în regiunea promotorului operatorului lac. Această legare cooperativă duce la
formarea unui complex multi-proteic la nivelul activatorului ADN. Termenul de “enhaceozom” a
fost desemnat pentru a denumi astfel de complexe nucleoproteice asamblate din factori
transcripţionali în momentul în care aceştia se leagă cooperativ la situsurile multiple de legare din
structura activatorilor.
HMGI se leagă la fosa minoră a ADN indiferent de secvenţă şi are drept rezultat îndoirea
rapidă a moleculei de ADN. Această pliere a “activatorului” ADEN permite factorilor de
transcripţie să interacţioneze adecvat (curat). Interacţiile relativ slabe dintre proteinele legate sunt
activate datorită legării factorilor de transcripţie în zonele vecine, menţinând proteinele la o
concentraţie relativă foarte ridicată.
Studiile realizate cu activatorii genei receptorului alfa din celulele T, de asemenea
important în răspunsul imun, asamblarea “enhaceozomului” s-a determinat a fi dependentă de o
altă proteină (diferită de HGMI) care interacţionează cu fosa minoră a ADN şi induce o curbură.
Astfel de proteine implicate în îndoirea ADN au fost denumite “proteine arhitecturale”, dearece
sunt necesare pentru construcţia acestor complexe nucleoproteice.
 SLIDE 63. Mulţi represori interacţionează cu activatorii ➢ Transcripţia de la eucariote
este reglată de represori cât şi de activatori ; ➢ Situsurile de legare a represorilor pot fi
identificate şi represorii purificaţi
prin aceleaşi tehnici folosite pentru activatori; ➢ Mulţi represori din sistemele eucariote
posedă două domenii: un domedniu
de legare a ADN şi un domeniu represor
151
 Studii genetice şi biochimice au demonstrat că transcripţia la eucariote este reglată atât prin
proteine represoare cât şi activatoare. De exemplu, geneticienii au identificat mutaţii la drojdii care
au implicaţii în exprimarea constitutivă a anumitor gene, indicând că aceste gene sunt în mod
normal reglate de către un represor. În alte studii, au fost identificate situsuri de legare arepresorilor
prin analize mutaţionale sistematice ale regiunilor implicate în procesul de transcripţie de la
eucariote, similare cu cele realizate pentru procariote. În timp ce o mutaţie la nivelul unui situs de
legare a activatorilor conduce la descresterea expresiei genei raportor corelate, mutaţia la nivelul
situsului de legare a represorului conduce la creşterea expresiei genei raportor. Proteinele
represoare care se leagă la astfel de situsuri au fost purificate şi caracterizate folosind
cromatografie de afinitate şi secvenţe specifice, ca şi în cazul proteinelor activatoare.
Absenţa unei activităţi represoare adecvate poate avea consecinţe devastatoare. De
exemplu, proteina codificată de către gena WT1 (tumoarea Wilm) este un represor care se exprimă
preferenţial în dezvoltatrea rfinichiului. Copii care moştenesc mutaţii atât la nivelul genei materne
cât şi paterne a WT1, nu vor produce o proteină funcţională WT1 şi vor dezvolta invariabil tumori
renale de foarte timpuriu. Proteina WT1 care are un domeniu de legare a ADN de tip “C2H2 zinc
finger”, se leagă la regiunea control a genei care codifică un factor de transcripţie numit EGR-1.
Această gena asemeni altor gene de la eucariote este supusă atât activării cât şi represării. Legarea
WT1 represează transcripţia genei EGR-1 fără a inhiba legarea a doi activatori care în mod normal
stimulează expresia acestei gene. Represorii transcripţionali eucariotici de tipul WT1 par să fie
opuşii funcţionali ai activatorilor. Ei pot inhiba transcripţia unei gene pe care ei în mod normal nu
o reglează când situsul lor de recunoaştere este plasat într-un intervalul de câteva sute de perechi
de baze faţă de situsul de start al genei respective.
Assemeni activatorilor, mulţi represori prezintă două domenii funcţionale: domeniul de
legare şi domeniul de represare. Aşa cum se întâmplă şi în cazul domeniilor activatoare, o varietate
de secvenţe de aminoacizi pot funcţiuona ca domenii represoare. Multe dintre acestea sunt relativ
scurte (de aproximativ 20 aminoacizi) şi conţin porţiuni întinse de animoacizi hidrofobi. Alte
domenii represoare conţin porţiuni mari de aminoacizi bazici. În unele cazuri, domeniile
represoare sunt mai mari şi bine structurate. De exemplu, în absenţa ligandului, domeniul de legare
RXRalfa funcţionează ca un domeniu represiv. Când acelaşi domeniu leagă ligandul său de
recunoaştere acidul 9-cis retinoic, el este transformat într-un domeniu de activare. Ca şi pentru
domeniile de activare, diferitele structuri ale domeniilor represoare sunt probabil a reflectare a mai
multor posibile mecanisme de a reglare a transcripţiei la eucariote.
SLIDE 64. Concluzii Factorii de transcripţie, care stimulează sau reprimă
transcripţia, se leagă la elemente situate în proximitatea promotorului şi la “enhancers”
(activatori) din structura ADN la eucariote;
Activatorii sunt în general proteine modulare, care conţin un singur domeniu de legare şi
unul sau mai multe domenii activatoare; diferitele domenii sunt adesea legate prin regiuni
polipeptidice flexibile. Acestea permit domeniilor diferiţilor activatori să interacţioneze chiar şi
când domeniile de legare la ADN recunosc situsuri separate de zeci de perechi de baze;
 Activatorii conţin, în general, mai multe situsuri de legare pentru factorii de transcripţie
grupate sub formă de clustere. Legarea cooperativă a mai multor
152
activatori la situsuri învecinate din structura unui activator formează un complex multi-proteic
numit “complex activator”. Asamblarea acestuia necesită adesea proteine mici care se lreagă la
fosa minoră a ADN şi determină curbarea rapidă a secventei permitând proteinelor de pe fiecare
parte a curburii să interacţioneze mult mai bine;
Majoritatea represorilor de la eucariote sunt proteine modulare. Similar cu activatorii,
aceştia conţin de obicei un singur domeniu de legare şi unul sau mai multe domenii represoare, şi
pot controla transcripţia când sunt legaţi la situsuri situate la sute sau mii de baze faţă de situsul de
start;
Domeniile de legare la ADN ale factorilor de transcripţie de la eucariote exprimă o varietate
de structuri. Printre cele mai comune motive structurale sunt homeodomeniile, domeniile bazice
“fermoar de leucină” (leucine zipper), HLH şi diferite tipuri de degete zinc (zinc finger). În general
una sau mai multe alfa-elice din domeniul de legare la ADN interacţionează cu fosa majoră la
nivelul unor situsuri de recunoaştere;
Capacitatea anumitor factori de transcripţie de a forma heterodimeri creşte numărul de
situsuri ADN pe care aceşti factori le pot controla şi modalităţile prin care le pot controla;
Deşi anumite domenii de activare şi de represare sunt bogate în aminoacizi particulari,
aceste domenii funcţionale manifestă o varietate de secvenţe de aminoacizi şi structuri proteice
caracteristice diferiţilor factori transcripţie.
SLIDE 65. Complexul ARN polimerazic II de iniţiere a transcripţiei
➢ Iniţierea de către Pol II necesită factori generali de transcripţie, care poziţionează Pol II la
nivelul situsului de iniţiere şi sunt necesari pentru transcrierea marii majorităţi a genelor
transcrise de către această polimerază; ➢ Factorii generali de transcripţie sunt structuri
multimere şi înalt conservate; ➢ Proteinele cuprinse în complexul Pol II de iniţiere a
transcripţiei se asamblează într-o ordine specifică “in vitro” dar majoritatea proteinelor se pot
combina pentru a forma un complex holoenzimatic “in vivo”. Anterior am discutat că ARN
polimeraza de la E. coli lipsită de subunitatea sigma70 nu poate iniţia transcripţia. Totuşi,
când “core” polimeraza este asociată cu subunitatea sigma70, holoenzima rezutată poate
iniţia transcripţia in vitro pornind de la promotori puternici. Astfel, subunitatea sigma70
funcţionează ca un factor de iniţiere care este absolut necesar pentru începerea transcripţiei şi
care este eliberat de pe matriţă o dată ce s-a produs polimerizarea primilor aproximativ 10
ribonucleotidtrifosfaţi.
Din contră, transcripţia in vitro cu ARN polimeraza II purificată necesită adăugarea unui
număr mare de factori de iniţiere care sunt separaţi de complexul polimerazic în timpul purificării.
Aceşti factori de iniţiere, care poziţionează ARN polimeraza II la nivelul situsurilor de iniţiere a
transcripţiei, sunt numiţi factori generali de transcripţie, deoarece se consideră că ei sunt necesari
pentru transcripţia majorităţii genelor de către acest tip de polimerază. Un complex de iniţiere a
transcripţiei conţine ARN polimeraza şi diferiţi factori generali implicaţi în transcripţie care se
leagă al regiunea promotoare.
 Mulţi dintre factorii generali de transcripţie necesari polimerazei II pentru iniţierea
transcripţiei de la nivelul majorităţii promotorilor care conţin o TATA box au fost izolaţi şi
caracterizaţi.
153
 Aceste proteine au fost desemnate cu terminologia TFIIA, TFIIB, etc, majoritatea fiind
proteine multimere. TFIID este unul dintre cei mai mari factori având o masă moleculară de aprox
750 kDa. Acesta conţine o singură proteină de aprox 38 kDa numita TATA box-binding protein
(TBP) şi 11 factori asociaţi TBP numiţi TAF (TATA Asociated factors) care nu au fost foarte bine
caracterizaţi. Factori generali de transcripţie cu activităţi similare au fost izolaţi din celule umane
în cultură, ficat de şobolan, embrfioni de Drosophila, şi drojdii. Genele care codifică aceste
proteine la drojdii au fost secvenţializate o dată cu secvenţializarea completă a genomului de
drojdii ca şi în cazul ADNc uman şi a celui de la Drosophila. În toate cazurile, factorii de
transcripţie echivalenţi de la diferitele tipuri de eucariote sunt foarte bine conservaţi. Deşi factorii
generaşi de transcripţie permit polimerazei II să iniţieze transcripţia in vitro la nivelul aceloraşi
situsuri prezente in vivo, proteine adiţionale sunt necesare pentru iniţierea transcripţiei in vivo.
SLIDE 66. Etapele procesului de asamblarea a complexului Pol II de iniţiere a transcripţiei in
vitro Figura: Etapele asamblării complexului de iniţiere atranscripţiei pornind de la ARN pol II
ţi factori de transcripţie izolaţi.
O dată ce întreg complexul de iniţiere a fost asamblat, se produce separarea catenelor ADN
la situsul de start pentru a forma complexul deschis care necesită hidroliza ATP. O dată ce
transcripţia iniţiază şi transcripţia începe să se deruleze de la nivelul prpmotorului, CTD se
fosforilează şi factorii generali de transcripţie disociază de complexul de legare TBP de la nivelul
promotorului. Numeroase alte proteine participă la iniţierea transcripţiei in vivo.
În majoritatea studiilor biochimice asupra asanblării complexului de iniţiere al Pol II,
cercetătorii au folosit mai degrabă TBP (TATA binding protein) decât complexul TFIID coimplet
format din multe subunităţi şi care este dificil de purificat. Legarea TBP şi a altor factori generali
de transcripţie la promotorii cu secvenţe consens TATA a fost analizată prin tehnica de “foot-
printing” cu DN-aza I şi prin tehnica electroforetică de întârziere în gel. Aceste studii demonstrează
că complexul PolII de iniţiere este asamblat in vitro în conformitate cu secvenţa de reacţii
determinată şi prezentată în imagine.
In vitro, TBP este prima proteină care se la promotorul TATA box. Toate proteinele
eucariote TBP analizate prezintă domenii C-terminale foarte similare de aproximativ 180 de
aminoacizi. Secvenţa acestei regiuni prezintă o omologie de 80% de la drojdii la om, majoritatea
diferenţelor fiind substituţii conservative. Acestea conservă funcţiile domeniului C-terminal ca şi
întreaga lungime a proteinei în urma transcripţiei in vitro. Domeniul N-terminal al TBP, care
variază foarte mult ca secvenţă şi lungime la diferite eucariote, funcţionează în transcripţia genelor
care codifică pentru ARNsn.
SLIDE 67. Asamblarea in vitro assembly a complexului de preinitiere a ARN polimerazei II
Factorii de transcriptie generali se leaga secvential la ARN polimeraza II purificata (Pol II), la
nivelul secventei ADN TATAbox pentru a forma complexul de preinitiatiere. Hidroliza ATP
furnizeaza energia pentru desfacerea moleculelor de ADN la situsul de start prin legarea
subunitatii TFIIH subunit. Initierea transcriptiei de catre Pol II conduce la formarea complexului
deschis, iar polimeraza se deplaseaza
154
de la nivelul promotorului iar domeniul CTD este fosforilat. In vitro, factorii generali de
transcriptie (cu exceptia TBP) disociaza de complexul TBP si promotor, dar nu se stie inca care
dintre factori raman asociati cu regiunea promotoare pentru fiecare runda de initiere a transcriptiei,
in vivo.
SLIDE 68. Domeniile C-terminale conservate ale TBP de legare la TATA-box
DNA Figura: Structura domeniului C-terminal al TBP legat la ADN TATA-box.
Deşi TBP este un monomer, lanţul polipeptidic al acestui domeniu este pliat într-o
conformaţie care are o simetrie bilaterală. Totuşi, resturile de de suprafaţă ale proteinei se disting
clar în două părţi. TBP se leagă la fosa minoră a ADN TATA-box, distorsionând structura normală
a dublului helix îndoind dramatic ADN.
Figura se bazează pe analizele de cristalografie cu raze X şi demonstrază legarea la TATA-
box. Asemeni HMGI şi altor proteine care produc îndoirea ADN care participă la formarea
“enhanceozomului” sau complexului de activare.
O dată ce TBP se leagă la TATA-box, se poate lega şi TFIIB care este o proteină monomer
mai mică decât TBP. Domeniul său C-terminal vine în contact atât cu ADN cât şi cu TBP.
Domeniul N-terminal al al TFIIB se extinde către situsul de start, dar structura sa tridimensională
nu este încă cunoscută. După plierea TFIIB, un complex pre-format din TFIIF (un tetramer
alfa2beta2) şi Pol II se leagă şi poziţionează polimeraza peste situsul de start. În complexul de
preiniţiere, care este stabil, cele două subunităţi mai mari ale Pol II (L şi L’) interacţionează cu
promotorul ADN de-a lungul unui canal de aproximativ 240 A care se extinde în amonte şi in aval
de situsul de start. La majoritatea promotorilor, se leagă încă doi factori generali înainte de
separarea duplexului ADN şi expunerea catemei matriţă. Primul care se leagă este TFIIE (un
tetramer alfa2beta2) care crează un situs de legare pentru TFIIH, un alt factor multimer care
conţine nouă subunităţi. Legarea TFIIH completează complexul de iniţiere a transcripţiei in vitro.
În prezenta ATP, se manifestă activitatea helicazică a TFIIH care desface duplexul ADN
la nivelul situsului de start, permitând ADN Pol II îformarea complexului deschis. Dacă sunt
adăugaţi nucleotidtrifosfaţi Pol II începe transcripţia matriţei. În timp ce polimeraza începe
transcrierea dincolo de regiunea promotoare o altă subunitate a TFIIH fosforilează Pol II CTD la
multiple situsuri.
Complexele minimale de transcripţie in vitro conţin numai aceste elemente generale şi Pol
II purificată. După iniţiere TBP rămâne legată la TATA-box în timp ce polimeraza realizează
transcripţia dincolo de promotor în timp ce ceilalţi factori disociază. Asa cum am discutat se pare
că in vivo transcripţia necesită si alţi factori transcripţionali; nu este clar care dintre factori rămân
asociaţi cu regiunea promotoare după iniţiere.
SLIDE 69. Modelul structural al complexului promotor ADN,
TBP, TFIIB, şi Pol II Figura: Modelul structural al complexului
compus din promotorul ADN, TBP, TFIIB şi ARN polimreraza II indicând mărimile relative ale
componentelor.
Cele două vederi ale complexului cu 180o din faţă şi din spate.
155
 SLIDE 70. Concluzii ARN polimeraza II necesită mai mulţi factori
generali de transcripţie pentru a localiza clar punctul de start la nivelul matriţei ADN şi a iniţia
transcripţia. Acestea includ TFIID care se leagă la TATA-box prin intermediul TBP;
Transcripţia genelor care codifică pentru proteine este controlată de către ARN polimeraza
II care poate fi iniţiată in vitro prin legarea secvenţială a factorilor: TBP, care se leagă la TATA-
box; TFIIB; un complex Pol II şi TFIIH; TFIIE; şi final TFIIH;
Activităţile helicazice ale celor două subunităţi TFIIH separă catenele la nivelul situsului
de start la majoritatea promotorilor, un proces care necesită hidroliza ATP. După ce pol II începe
transcrierea dincolo de situsul de start, elementele CTD sunt fosforilate de către o altă subunitate
a TFIIH;
Iniţierea de către Pol II in vivo necesită un complex multimediator multiproteic, care se
asociază cu elementele CTD nefosforilate ale Pol II, formând un mare complex holoenzimatic care
include şi majoritatea factorilor de transcripţie. Se crede că această holoenzimă preasamblată se
leagă la ADN promotor într-o singură etapă in vivo;
Complexul de iniţiere a transcripţiei care se asamblează la nivelul promotorilor in vivo
poate cuprinde 60-70 polipeptide cu o masă totală similară cu cea a unui ribozom.
SLIDE 71. Mecanismele moleculare ale controlului transcripţional la eucariote Controlul
transcripţional în celulele eucariote poate fi vizualizat ca implicând numeroase nivele de reglare.
Concentraţiile şi activităţile activatorilor şi represorilor care controlează transcripţia multor gene
care codifică pentru proteine sunt reglate în timpul diferenţierii celulare şi ca răspuns la hormoni
şi la semnalele celulelor înconjurătoare.
Aceşti activatori şi represori reglează în schimb şi modificările în structura cromatinei şi în
acetilarea şi deacitilarea histonelor, influentând astfel capacitatea factorilor generali de transcripţie
să se lege la promotori. În plus, activatorii şi represorii reglează direct asamblarea complexelor de
iniţiere a transcripţiei.
Reglarea prin controlul structurii cromatinei Cromatină-Nucleosomi (care conţin 146 pb
ADN) - fibre de cromatină de 30 nm.
Capetele N-terminale ale fiecărei histone (20-60 aminoacizi în funcţie de fiecare histonă)
se extind către suprafaţa nucleosomului. Aceste capete histonice N- terminale sunt bogate în resturi
de lizină care pot fi modificate reversibil prin acetilare, fosforilare şi metilare ca şi prin adăugarea
unei molecule singulare de ubiquitină, o proteină înalt conservată de 76 de resturi.
Fosforilarea are un rol important dar este încă puţin înţeleasă funcţia sa în condensarea
cromozomului în timpul mitozei. Funcţiile altor modificări sunt de asemenea puţin înţelese, cu
excepţia acetilării. Acetilarea histonelor N-terminale este asociată cu controlul genetic în timpul
interfazei. Alte proteine mai puţin abundente decât histonele sunt şi ele asociate cu cromatina.
Acestea includ proteinele HMG care participă la formarea “enhanceozomilor” (complexelor
activatoare).
SLIDE 72. Aranjament al locilor de conjugare pe cromozomul III de la drojdie
156
Figura: Genele de pe cromozomul III implicate în controlul conjugării (mating) la drojdii (S.
Cerevisiae)
Genele silenţioase (ne-exprimate) implicate în conjugare (fie a sau alfa în funcţie de suşă)
sunt localizate pe locusul HML. Genele de tip opus sunt prezente pe locusul silenţios HMR. O dată
la fiecare diviziune celulară, secvednţa ADN de pe HML este transferată locusului MAT; în
diviziunile celulare alternative, secvenţa ADN de pe HMR este transferată locusului MAT. Când
secvenţele alfa şi a sunt prezente la locusul MAT, ele pot fi transcrise în ARNm ale căror proteine
codificate sunt factori de transcripţie care reglează expresia genelor specifice implicate în
conjugare. Secvenţe silenţioase de legare a proteinelor situate lângă HML şi HMR leagă proteinele
care sunt critice pentru represia acestor loci silenţioşi.
Diferite experimente au demonstrat că represia locilor HML şi HMR este rezultatul
condensării structurale a cromatinei care blochează steric interacţia factoriilor de transcripţie cu
ADN. ADN din structura locilor silenţioşi este inaccesibil proteinelor in general (nici macar
metilazei), inclusiv factorilor de transcripţie şi ARN polimerazei. Studii asupra regiunilor N-
terminale ale histonelor H3 şi H4 au evidenţiat că acestea derepresează locii silenţioşi, lasând de
exemplu Dam metilaza să aiba acces la secvenţele GATC din strunctura HML şi HMR. Aceste
rezultate indică că interacţiile specifice care implică regiunile N-terminale ale histonelor H3 şi
H4 sunt necesare pentru represia la nivelul locilor silenţioşi de conjugare. Informaţii
suplimentare
Activatorii şi represorii care se leagă specific la situsurile ADN şi reglează expresia
genelor care codifică pentru proteine associate, realizează acest lucru prin două mecanisme
generale; aceste gene reglatoare acţionează concertat cu alte proteine pentru a modula structura
cromatinei, influentând astfel capacitatea de legare la promotori a factorilor generali de
transcriptie. Trebuie să ne reamintim că ADN din celulele eucariote nu este liber ci asociat cu o
masă aproximativ egală de proteine pentru a forma cromatina. Unitatea structurală de bază a
cromatinei este nucleosomul, care este compus din aproximativ 147pb ADN strâns înfăşurat în
jurul unei structuri în formă de disc formată din histone. Resturile din regiunile N-terminala şi C-
terminală a histonelor (ex. H2A), numite cozile histinei (histone tails), depăşesc suprafaţa
nucleosomului şi pot fi modificate reversibil. Astfel de modificări, în special acetilarea cozilor
histonelor H3 şi H4, influenţează condensarea relativă a cromatinei şi astfel şi accesibilitatea
proteinelor necesare pentru iniţierea transcriptiei. Pe lângă rolul lor în medierea controlului
transcripţional, realizată prin intermediul cromatinei, activatorii şi represorii interacţionează cu
un complex multiproteic mare numit complexul mediator al transcripţiei (mediator of
transcription complex) sau simplu mediator. Acest complex se leagă la randul lui la Pol II şi
reglează direct asamblarea complexelor de preiniţiere a transcripţiei. În această secţiune, reluam
înţelegerea curentă a modului în care activatorii şi represorii sunt controlaţi, astfel încat expresia
genelor să fie adaptată la nevoile celulei şi ale organismului. Formarea heterocromatinei
silenţiază (atenuează) expresia genelor la nivelul telomerilor, în proximitatea centromerilor dar şi
în alte regiuni.
 Ani la rând a fost clar că inactivarea genelor în celulele eucariote este adesea asociată cu
prezenţa heterocromatinei, regiuni ale cromatinei care sunt mult mai condensate şi se colorează
mult mai închis, cu cloranţi pentru ADN, decât eucromatina, la nivelul căreia se afla cele mai
transcrise gene. Regiunile de la nivelul cromozomilor situate în proximitatea centromerilor şi
telomerilor şi adesea alte regiuni adiţionale specific care variază în diferitele tipuri celulare sunt
organizate în heterocromatină. ADN din heterocromatină este mai puţin accesibil şi ţn consecinţă
157
este adesea numit cromatina “închisă”. De exemplu, aşa cum am văzut în capitolul anterior, ADN
din genele inactive a fost găsit ca fiind mult mai rezistent la digestie cu DNazaI decât ADN din
genele intens transcrise.
Studiul regiunilor de ADN din S. cerevisiae care se comportă ca şi heterocromatina de la
eucariotele superioare furnizează informaţii preţioase privind represia transcripţiei mediate de
cromatină (chromatin-mediated repression of transcription). Aceasta drojdie are în ciclul său de
creştere atât forme haploide cât şi diploide. Celulele haploide manifestă una din cele două forme
celulare care pot participa la procesul de conjugare: tipul a şi α (alfa). Celulele aparţinând la tipuri
diferite de conjugare se pot “conjuga” sau fuziona pentru a genera celule diploide. Când o celulă
haploidă se divide “prin înmugurire”, celula mai mare, mamă” suportă o modificare (switches) a
tipului celular de conjugare. Analizele genetice şi moleculare au evidenţiat existenţa a trei loci
genetici pe cromozomul III de drojdie care controlează procesul de conjugare a celulelor de
drojdie. Dintre cei trei loci, numai locusul central MAT este transcris activ. Ceilalti loci adiţionali,
numiţi HML şi HMR, situaţi lângă telomerii din stanga şi respectiv din dreapta, conţin copii
silenţioase (silent) netranscrise ale genelor a sau α (alfa). Aceste secvenţe sunt transferate alternativ
de pe HML sau HMRa pe locusul MAT printr-un tip de recombinare nereciprocă între cromatidele
surori în timpul diviziunii. Când locusul MAT conţine secvenţa ADN din HMLα, celulele devin α
(alfa). Când locusul MAT conţine secvenţele ADN din HMRa, celulele devin a. În acest capitol
noi suntem interesaţi să întelegem cum se realizează represia transcripţiei la nivelul locilor
silenţioşi de conjugare HML şi HMR. Dacă genele de la nivelul acestor loci sunt exprimate, aşa
cum se întâmplă în cazul suselor mutante cu defecte în mecanismele de represare, atât proteinele
a şi α (alfa) sunt exprimate, determinând celulele sa aibă un fenotip asemanator cu cel al celulelor
diploide, care nu se pot conjuga. Promotorii şi UAS (Upstream activating sequences) şi regiunile
care controlează transcripţia genelor a şi α (alfa) se află în apropierea centrului secvenţei care este
transferată şi sunt identice indiferent dacă secvenţele sunt pe locusul MAT sau pe unul dintre locii
silenţioşi. În consecinţă, funcţia factorilor de transcripţie care interacţionează cu aceste secvenţe
este într-ul fel blocată la nivelul HML şi HMR. Aceasta represie la nivelul locilor silenţiosi depinde
de secvenţele cu rol de silenţiere (silencer sequences) localizate în apropierea regiunii de transfer
a secvenţelor ADN la nivelul locusurilor HML şi HMR. Se constată că dacă silenţiatorul este
înlăturat, locusul silenţios este transcris.
Remarcabil, orice genă situată lângă secvenţa silenţiatoare a procesului de conjugare, prin
tehnici de recombinare a ADN, este represată sau silenţiată chiar dacă gena ARNt transcrisă de
către ARN polimeraza III, care foloseşte un set diferit de factori generali de transcripţie faţă de
ARN polimeraza II.
Numeroase studii indică că represia locilor HML şi HMR este determinată de o structură
cromatidică condensată care blochează steric factorii de transcripţie care interacţionează cu ADN.
Într-un experiment, gena care codifică pentru enzima care metilează resturile de Adenina din
secvenţele GATC, la E. coli, a fost introdusă în celulele de drojdii sub controlul unui promotor de
drojdie astfel încât enzima să fie exprimată. Cercetatorii au evidenţiat că secvenţele GATC din
interiorul locusului MAT şi din multe alte regiuni ale genomului acestor celule au fost metilate,
dar nu şi cele din structura locilor HML şi HMR. Aceste rezulate indică că secvenţele ADN de la
nivelul locusurilor silentioase sunt inaccesibile metilazei de la E. coli şi în general tuturor
proteinelor, inclusiv factorilor de transcripţie şi ARN polimerazei. Experimente similare realizate
cu diferite suse mutante de drojdii la nivelul histonelor
158
au indicat existenţa unor interacţii specifice care implică cozile histonelor H3 şi H4 sunt necesare
pentru formarea unor structuri cromatinice înalt represate. Alte studii au arătat că telomerii fiecărui
cromozom de drojdie devin structuri de tip silenţios. De exemplu, când o genă este plasată la câteva
kilobaze de orice telomer de drojdie, expresia sa va fi represată. În plus, aceasta represie este
exonerată de aceleaşi mutaţii în structura cozilor histonelor H3 şi H4 care interferă cu represia la
nivelul locilor silenţiosi de tip conjugare.
Studiile genetice au condus la identificarea mai multor proteine, RAP1 şi 3 proteine SIR,
care sunt necesare pentru represarea şi silenţierea locilor tip conjugare şi a telomerilor de la drojdii.
RAP1 a fost identificată ca fiind legată la nivelul secvenţelor ADN de silenţiere asociate cu HML
şi HMR şi cu o secvenţă multi- repetitivă care se găseşte la nivelul fiecărui telomer din cromozomii
de drojdie.
SLIDE 73. Numeroase gene codifică proteine care leagă locii silenţioşi specific
la nivelul telomerilor de drojdii Figura: Co-localizarea proteinei Sir3 cu
heterocromationa telomerică în nucleii de drojdii
a) Micrografii confocale pentru trei celule diploide de drojdii, fiecare conţinând câte 34
telomeri. Telomerii au fost marcaţi prin hibridizare cu o sondă marcată fluorescent, specifică
telomerilor (galben). ADN a fost colorat în roşu pentru a evidenţia nucleii. Cei 34 telomeri se
întrepătrund într-un număr mult mai mic de regiuni situate la periferia nucleului.
b) şi c) sunt imagini de microscopie confocală ale celulelor de drojdii marcate prin hibridizare
cu o sondă specifică telomerilor de drojdii (b) şi cu anticorp specfic faţă de Sir3 marcat fluorescent
(c). De reţinut că Sir3 este localizată la nivelul heterocromatinei represate de la nivelul telomerilor.
Experimente similare au fost realizate şi cu Rip1, Sir2 şi Sir4 au demonstrat că aceste proteine sunt
şi ele co- localizate cu heterocromatina telomerică.
Au fost realizate studii genetice cu numeroase gene: RAP1 şi 3 SIR (silent Information
regulator) care sunt necesare pentru represia locilor silenţioşi implicaţi în conjugare şi prezenţi la
nivelul telomerilor. De exemplu, RAP1 codifică pentru o proteină care se leagă în interiorul unor
secvenţe de ADN silenţiose asociate cu HML şi HMR şi cu o secvenţă care este repetată de mai
multe ori la nivelul fiecărui telomer al cromozomului de drojdie. Studii biochimice mai recente au
demonstrat că aceste proteine se leagă între ele şi că împreună se leagă la capetele terminale ale
histonelor H3 şi H4. Microscopia confocală în imunofluorescenţă asupra celulelor de drojdii
marcate cu anticorpi faţă de proteinele Sir şi Rap şi hibridizate cu o sondă ADN care recunoaşte
regiunea telomerică, evidenţiază că aceste proteine formează structuri multiproteice mari cu
localizare telomerică asemănătoare heterocramatinei evidenţiate la eucariotele superioare.
SLIDE 74. Model schematic al “silencing” la telomerii de drojdii (1) Figura: Modelul
schematic al mecanismului de “atenuare” (silencing) la nivelul telomerilor de drojdii
Mai multe copii ale Rap1 se leagă la o secvenţă repetitivă simplă situată în fiecare regiune
telomerică, care este lipsită de nucleozomi (sus). Aceasta determină asamblarea unui complex
multiproteic (jos) prin realizarea unor interacţii proteină- proteină între Rap1, Sir2, Sir3 şi Sir4 şi
cozile aminoterminale hipoacetilate ale histonelor H3 şi H4 din structura nucleozomilor învecinaţi.
Asterixurile marchează prezenţa cozilor amino-terminale hiperacetilate ale histonelor. Structura
159
heterocromatinei cuprinde aproximativ 4 kb din secvenţa ADN situată în vecinătatea situsurilor
de legarea ale Rap1 şi respectiv a secvenţei acesteia.
Structura actuală a heterocromatinei înalt organizate nu este încă cunoscută şi înţeleasă.
“silencing” (amortizare, atenuare) la organismele superioare Reglarea transcripţiei prin
intermediul “represiei mediate de heterocromatină” este foarte importantă la eucariotele
superioare. De exemplu, expresia factorilor de transcripţie Hox, care reglează factorii de
transcripţie, care reglează dezvoltarea “planul corpului” (de exemplu, anatomia normală) la
majoritatea animalelor. Mecanismul acestei represii este încă în curs de studiu dar analizele
genetice realizate la Drosophila au evidenţiat că multe proteine nucleare sunt implicate în
formarea regiunilor de heterocromatină la nivelul unor situsuri specifice din structura genelor
Hox.
SLIDE 75. Model schematic al “silencing” la telomerii de drojdii (2)
Mai multe copii ale RAP1 se leagă la o secvenţă simplă repetitivă de la nivelul fiecărei
regiuni telomere care este lipsită de nucleozomi (sus). Acestea determină asamblarea unui complex
multiproteic (jos) printr-un mecanism de interacţie proteină- proteină dintre RAP1, SIR2, SIR3,
SIR4 şi cozile N-terminale hipoacetilate H3 şi H4 ale nucleozomilor învecinaţi. SIR2 are rolul de
a deacetila cozile histonelor. Structura heterocromatinică pentru fiecare telomer conţine
aproximativ 4kb ADN din vecinatatea situsurilor de legare RAP1 indiferent de secvenţă. Asocierea
mai multor telomeri condensaţi formează complexe de cromatină înalt-ordonate care blochează
steric alte proteine în interacţia cu ADN [Adapted from M. Grunstein, 1997, Curr. Opin. Cell Biol.
9:383.]
Alte studii biochimice arată că proteinele SIR se leagă una la cealaltă şi că două astfel de
proteine se leagă la cozile N-terminale ale histonelor H3 şi H4 care sunt menţinute într-o stare
neacetilată extinsă prin activitatea deacetilazică a SIR2. Mai multe experimente bazate pe
microscopia confocală de fluorescenţă pe celule de drojdii, fie prin marcare cu anticorpi marcaţi
la oricare dintre proteinele SIR sau RAP1 sau prin hibridizarea cu o sondă marcată specifică
telomerilor, au evidenţiat că aceste proteine formează structuri nucleoproteice condensate cu
telomerii, asemănătoare heterocromatinei găsite la eucariotele superioare.
Modelul silenţierii mediate de către cromatină la telomerii de drojdie se bazează şi pe alte
studii. Formarea heterocromatinei la telomeri este nucleată prin mai multe proteine RAP1 care se
leagă la secvenţe repetitive într-o regiune lipsită de nucleozomi la extremitatea externă a
telomerilor. Se formează o reţea de interacţii proteine-proteine care implică telomerii la care se
leagă RAP1, trei proteine SIR (2,3 şi 4) şi histonele H3 şi H4 hipoacetilate şi care creează un
complex nucleoproteic supraorganizat care include mai multi telomeri şi în care ADN nu este deloc
accesibil (sau este puţin accesibil) proteinelor externe. O altă proteină, SIR1, care este necesară
pentru silenţierea locilor silenţiosi implicaţi în conjugare. Deşi funcţia SIR1 nu este inca bine
inteleasa, se stie ca aceasta este asociata cu regiunea de silentiere, unde se considera ca ar putea
determina asocieri ulterioare a complexului de silenţiere multiproteic de la nivelul telomerilor
astfel încât procesul de silenţiere se răspandeşte mai departe pornind de la capetele cromozomilor
cuprinzând HML şi HMR.
O trasatură importăntă a acestui model este dependenţa silenţierii de hipoacetilarea cozilor
histonelor. Aceasta a fost demonstrată în experienţe pe drojdii mutante care exprimă histone, în
care histonele de la capetele N-terminale sunt substituite cu arginine sau glutamine. Arginina este
pozitiv încărcată, asemeni lizinei,
160
dar nu poate fi acetilată. Se consideră că aceasta funcţionează în cozile N-terminale ale histonelor
la fel ca lizina neacetilată. Represarea la nivelul telomerilor şi la nivelul locilor silenţioşi de
conjugare a fost găsită deficientă la mutanţii cu substituţii pentru glutamină dar nu şi la mutanţii
cu substituţii pentru arginină. Hiperacetilarea cozilor histonelor H3 şi H4 ulterior a fost găsită ca
interferând cu legarea SIR3 şi SIR4. Deşi, represia transcripţiei mediată de cromatină este de
asemenea importantă la eucariotele multicelulare, mecanismul acestei represii este inactiv în curs
de elaborare. Studii genetice şi biochimice la Drosophila au evidenţiat că mai multe proteine
asociate într- un complex multi-proteic mare participă la acest proces. Acestea se numesc
complexe "Polycomb". Ca şi în cazul legării proteinelor SIR la telomerii de drojdie, aceste proteine
Polycomb de la Drosophila pot fi vizualizate legate la genele pe care le represează în mai multe
poziţii specifice din genom prin folosirea de anticorpi marcaţi faţă de cromozomii politeni din
glandele salivare.
SLIDE 76. Metoda de imunoprecipitare a cromatinei evidenţiază starea de
acetilarea a histonelor din structura cromatinei
Histonele pot fi usor cross-legate la ADN, in vivo, dacă se foloseşte un agent chimic care
asigură cros-linkarea reversibilă şi pentru care celula este permeabilă. În figură, nucleosomii cu
cozile histonelor acetilate sunt marcaţi ăn verde.
Etape: 1) cromatina cross-linkată este izolată şi tăiată la o lungime medie care corespunde la 2-3
nucleozomi;
2) se foloseşte un anticorp faţă de secvenţa unei cozi histonice pentru recunoaştere;
3) nucleozomii care se leagă sunt imunoprecipitaţi; 4) ADN din fragmentele de cromatină
imunoprecipitate este eliberat prin reversarea cross-linkării şi apoi este cuantificat folosind o
metodă PCR sensibilă. Metoda poate fi folosită pentru analiza asocierii in vivo a oricărei
proteine cu o secvenţă specifică de ADN prin folosirea de anticorpi faţă de proteina de interes
din aceea etapa. [See S. E. Rundlett et al., 1998, Nature 392:831.]
SLIDE 77. Analiza stării de acetilare a histonelor în cromatina asociată cu regiuni specifice ale
genomului Figura: Metodă experimentală pentru analiza stării de acetilare a histonelor în
cromatina asociată cu o regiune specifică a genomului.
Nucleozomii sunt slab înreţelaţi cu ADN in vivo folosind un agent de înreţelare reversibil
permeabil la nivel celular. Este izolată apoi cromatina şi scindată pe o lungime medie de trei
nucleozomi fiind supuşi imunoprecipitării cu un anticorp specific faşă de o secvenţă histonică
particulară N-terminală specifică. ADN din fragmentul de cromatina imunoprecipitat este eliberat
prin reversarea agentului de înreţelare şi apoi este cuantificat folodin o tehnică PCR sensibilă.
SLIDE 78. Represorii şi activatorii pot orienta deacetilarea histonelor genelor specifice Figura:
Rolul deacetilării şi hiperacetilării cozilor N-terminale ale histonelor în controlul transcripţiei la
drojdii. a) Deacetilarea dirijată de represor la nivelul cozilor N-terminale ale histonelor. “DNA
binding Domain” (DBD) al represorului Ume6 interacţionează cu un element
161
de control situat în amonte (URS1) ale genelor pe care le reglează. Domeniul represor al Ume6
(RD) leagă Sin3, o subunitate a unui complex multiproteic care include Rpd3, o deacetilază
histonică. Deacetilarea capetelor terminale ale histonelor din structura nucleozimilor din
regiunea de legarea a Ume6 inhibând legarea factorilor generali la TATA box, represând mai
degrabă expresia genelor. b) Hiperacetilarea dirijată de către activatori asupra cozilor N-
terminale ale histonelor. Domeniul ADN de legare a Gcn4 interacţionează cu secvenţele
specifice situate în amonte (UAS) de secvenţele activatoare ale genelor pe care le reglează.
Domeniul de activare al Ggn4 (AD) interacţionează apoi cu un complex multiproteic de acetilare
a histonelor care include subunitatea catalitică Gcn5. Hiperacetilarea ulterioară a capetelor N-
terminale ale histonelor din structura nucleozomilor aflaţi în vecinătatea situsului de legare a
Gcn4 facilitează accesul factorilor generali de transcripţie necesari pentru iniţiere. Represia şi
activarea unor gene din eucariotele superioare apar prin mecanisme similare. Informaţii
suplimentare
Rolul deacetilării histonelor în represia genetică mediată de către cromatină este susţinut
de descoperirea proteinelor de la drojdii care represează transcripţia mai multor gene situate în
regiuni interne ale cromozomului. Acum se ştie că aceste proteine acţionează parţial determinând
deacetilarea regiunilor N-terminale ale histonelor din structura nucleozomilor care sunt legaţi la
TATA box ale genelor pe care acestea le reprimă. Studiile in vitro au demonstrat că dacă secvenţa
de ADN promotor este asamblată într-un nucleozom cu histone neacetilate, factorii generali de
transcripţie nu se pot lega la TATA box şi la regiunea de iniţiere. În histonele neacetilate, lizinele
N-terminale sunt încărcate pozitiv şi interacţionează puternic cu grupările fosfat din structura
ADN, crescând afinitatea acestuia faţă de suprfaţă nucleozomului. Prevenind interacţia factorilor
generali de transcripţie cu regiunea promotor. Din contra legarea factorilor de transcripţie în cazul
hiperacetilării histonelor este mai puţin represată fiind din contră sti,mulată de către activatorii
transcripţionali.
Legătura dintre deacetilarea histonelor şi represarea transcripţiei a fost şi mai clară când a
fost purificată prima deacetilază histonică din celule umane şi ADNc a fost clonat. Aceste
deacetilaze au fost găsite ca fiind asociate cu represorii la euacriotele superioare. Acestea includ
doi represori heterodimeri care participă la reglarea ciclului celular la mamifere şi un grup de
receptori nucleari care sunt reglaţi de către hormoni liposolubili.
Studii recente furnizează o explicaţie pentru observaţiile anterioare că regiunile inactive
transcripţional de la vertebrate conţin adesea resturi de 5-metil- citidină (mC) urmate imediat de
G, în timp regiunile active transcripţional sunt lipsite de mC. S-a determinat că regiunile care
conţin mC leagă specific o proteină care la rândul ei interacţionează cu mSin3. Aceste descoperiri
sugerează că asocierea mSin3 care conţine cxmplexe de deacetilază histonică cu situsurile metilate
din structura ADN conduce la deacetilarea histonelor din structura nucleozomilor vecini, făcând
regiunea inaccesibilă la factorii de transcripţie generali şi la Pol II, făcând-o transcripţional
inactivă.
SLIDE 79. Mecanismul propus pentru deacetilarea histonelor şi hiperacetilare
 în controlul transcripţiei la drojdii a) Deacetilarea cozilor N-terminale ale
histonelor controlată de represori. Domeniul de legare la ADN (DNA-binding
domain - DBD) al represorului UME6
162
interacţionează cu elementul specific de control situat în amonte (upstream control element -
URS1) al genelor pe care le reglează.
Domeniul de represie (RD) al UME6 se leagă la SIN3, o subunitate a unui complex
multiproteic care include RPD3, care este o deacetilază a histonelor. Deacetilarea cozilor N-
terminale ale histonelor din nucleozomi în regiunea de legare a UME6- (binding site) inhibă
accesul factorilor generali de transcripţie TATA box, reprimând astfel expresia genelor. b)
Hiperacetilarea coordonată de activatori a cozilor N-terminale ale histonelor. Domeniul de legare
la ADN al activatorului GCN4 interacţionează cu secvenţe activatoare situate în amonte
(upstream activating sequences UAS) ale genelor pe care le reglează. Domeniul de activare al
GCN4 (AD) interacţionează ulterior cu un complex multiproteic cu activitate de acetilare a
histonelor care include subunitatea catalitică GCN5. Hiperacetilarea ulterioară a cozilor N-
terminale ale histonelor de la nivelul nucleosomilor din vecinatatea situsului de legare a GCN4
facilitează accesul factorilor generali de transcripţie necesari pentru iniţiere. Represia şi activarea
mai multor gene la eucariotele superioare apar prin mecanisme similare. Represorii pot
directiona deacetilarea histonelor pentru gene specifice
Importanţa deacetilării histonelor în represia genică mediată de către cromatină este
susţinută de studii pe represorii de la eucariote, care reglează genele situate pe poziţii interne în
cromozomi. Aceste proteine sunt cunoscute acum ca acţionând în parte prin deacetilarea cozilor
histonelor din nucleozomii care se leagă la TATA box şi la regiunea promotoare proximală a
genelor pe care acestia le represează.
Studiile in vitro au arătat că atunci când un promoter ADN este asamblat într- un nucleosom
cu histone neacetilate, factorii generali de transcripţie nu se pot lega la TATA box şi la regiunea
de inţiere a transcriptiei. În histonele neacetilate, lizinele terminale sunt încărcate pozitiv şi
interacţionează puternic cu gruparile fosfat din structura ADN. Cozile neacetilate ale histonelor
interacţionează şi cu octamerii vecini de histone favorizând plierea cromatinei în structuri
condensate şi înalt-ordonate a căror conformaţie precisă nu este bine cunoscută. Efectul net este
acela că factorii generali de transcripţie nu se pot asambla într-un complex de preiniţiere la nivelul
promotorilor care conţin histone hipoacetilate. În contrast, legarea factorilor generali de
transcripţie este represată mult mai puţin de prezenţa histonelor care conţin cozi hiperacetilate în
care lizinele încărcate pozitiv sunt neutralizate şi intracţiile electrostatice cu moleculele fosfat din
ADN sunt eliminate.
Legătura între deacetilarea histonelor şi represia transcrierii la aproape toţi promotorii
drojdiilelor a devenit foarte clară cînd a fost demonstrată homologia între ADNc ce codifică pentru
deacetilaza histonică umană şi gena RPD3, despre care se cunoaşte că este necesară pentru represia
normală a unui număr ridicat de gene la drojdie. S-a demonstrat că proteina RPD3 deţine activitate
histon deacetilazică. Capacitatea proteinei RPD3 de a deacetila histone la un anumit număr de
promotori depinde de două alte proteine: UME6, un repressor care se leagă la o secvenţă specifică
reglatoare (URS1) şi SIN3, care este parte a unui complex multiproteic, mare care conţine şi RPD3.
SIN3 se leagă, de asemenea, la un domeniu de represare al UME6, pozitionând deacetilaza
histonică RPD3 în cadrul complexului, astfel încât sa poată interacţiona cu promotorii asociaţi
nucleosomilor, îndepărtând grupările acetil de la nivelul histonelor în zona N-terminală.
Experimente suplimentare, folosind tehnica de imunoprecipitare a cromatinei, au demonstrat că,
la drojdiile de tip sălbatic, unul sau doi nucleosomi din apropierea situsurilor de legare la UME6,
sunt hipoacetilate.
163
 Aceste regiuni din ADN include promotori ale unor gene represate de UME6. În mutanții
cu deleții sin3 și rpd3, promotorii nu erau represați, dar și nucleosomii din zonele zonele adiacente
situsurilor de legare a UME6, erau hiperacetilate.
Aceste descoperiri susțin modelul deacetilării direcționate de repressor. În cadrul acestui
model, este demonstrate faptul că complexul SIN3-RPD3 funcționează ca un co-represor.
Complexele co-represor conțin deacetilaze histonice, care au fost associate cu mulți represori de
la nivelul celulelor mamaliene. Unele dintre aceste complexe conțin omologul mammalian al SIN3
(mSin3), care interacționează cu proteina [Link] complexe histonice deacetilazice
identificate în celulele mamaliene conțin proteine ce se leagă la represori, diferite sau suplimentare.
Aceste combinări represori sau co-represori au ca scop mediarea deacetilării histonelor la
nivelulul unor promotori specifici, printr-un mechanism similar cu cel de la drojdii. Totuși, ca
urmare a observației conform căreia la un număr ridicat de eucariote, proteinele represor inhibă
trascripția in vitro, în absența histonelor, se pare că există și alte mecanisme de represie, exceptând
deacetilarea histonelor.
Identificarea complexului de deacetilare a histonelor ce conține mSin3, oferă o explicație
pentru observațiile anterioare conform cărora, la vertebrate, regiuni de ADN inactive din punct
de vedere transcripțional, conțin frecvent resturi de citidină modificată (5-metilcitidină mC),
urmată de G, în timp ce regiuni de ADN active din punct de vedere transcripțional nu prezintă
resturi de mC. ADN ce contine mC se leagă la o serie de proteine specifice care interacționează
cu mSin3. Aceste observații sugerează o asociere a corepresorilor ce conțin mSin3 cu zone
metilate din ADN, ceea ce duce la deacetilarea histonelor situate în apropierea nucleosomilor.
Apar astfel zone inaccesiblie factorilor de trancripție și Pol II, devenind astfel inactive
transcripțional. Activatorii pot direcționa acetilarea histonelor la nivelulul unor gene specifice
Studii genetice și biochimice la drojdii au duc la descoperirea unor complexe multiproteice
mari ce conțin GCN5, cu activitate histon acetilazică. O altă subunitate a complexului histon
acetilazic de leagă la nivelul domenilor acide de activare a proteinelor activatoare precum GCN4.
Activarea maximă a transcriptiei de către GCN4 depinde de complexul histon-acetilazic, care
funcționează ca și co-activator.
Modelul prezentat este în concordanță cu observațiile conform cărora nucleosomii din
apropierea regiunii promotor a unei gene reglate de activatorul GCN4, sunt hiperacetilate într-o
maniera specifică. Acest proces modifică (deschide) structura cromatinei facilitând legarea altor
proteine necesare inițierii transcripției.
Un mecanim similar apare și la nivelul eucariotelor superioare. De exemplu, mamiferele
exprima două proteine cu mai multe domenii (≈400-kD), denumite CBP și P300, care se presupune
că funcționeză în același mod. După cum s-a menționat anterior, un domeniu al CBP leagă
domeniul activator fosforilat acid de la nivelul factorului de transcripție CREB. Alte domenii din
CBP interacționeză cu diferite domenii activatoare de la nivelul factorilor transcripționali. Totuși
un alt domeniu al CBP prezintă activitate histon-acetilazică, și un altul se asociază cu un complex
multiproteic histon-acetilazic, care este omologul complexului GCN5 de la drojdii. CREB și mulți
alți activatori mamalieni funcționează prin dirijarea CBP și atașarea complexelor histon-acetilazice
la nucleosomi specifici, unde acetilează cozile histonelor. Astfel este facilitată interacția factorilor
transcripționali generali cu promotrii de la nivelul ADN.
De asemenea, cea mai mare subunitate TFIID prezintă activitate histon- acetilazică și poate
funcționa ca și co-activator, prin acetilarea cozii N-terminale a histonei ce se găsește în vecinătatea
cutiei TATA.
164
 SLIDE 80. Example ale codului histonelor Figura: Modificări post-
translaționale specifice la nivelul cozilor N-terminale ale histonelor H3 și H4 au fost evidențiate
în eucromatina, care este accesibilă proteinelor și care este transcripțional activă. Modificări
diferite au fost găsite în heterocromatină, care este condensată și astfel mult mai inaccesibilă
proteinelor și transcripțional inactivă. Secvențele cozilor de histone sunt prezentate în codul cu o
literă al aminoacizilor. CENP-A este o variantă a histonei H3 găsită în nucleosomii asociați cu
centromerii cromozomilor de la mamifere. [Adapted from T. Jenuwein and C. D. Allis, 2001,
Science 293:1074.] Modificări ale resturilor specifice ale cozilor histonelor controlează
condensarea cromatinei
Pe lângă acetilarea reversibilă, cozile histonelor pot suferi fosforilarea reversibilă a
resturilor de serină și treonină, monoubiquitinarea resturilor de lizină din coada C-terminală a
H2A, metilare ireversibilă.
Există dovezi că nu numai nivelul total de acetilare a histonelor controlează condensarea
cromatinei și prin urmare accesibilitatea la ADN. Mai degrabă anumiți aminoacizi cu poziții
precise în cozile histonelor care sunt acelitați si astfel modificați pot constitui "codul histonelor"
care ajută controlul condensării cromatinei. De exemplu, lizina din poziția 9 din histona H3 este
adesea metilată în heterocromatină. Codul histonelor este "citit" de proteinele care se leagă la
aceste modificări specifice și care la rândul său promovează condensarea și decondensarea
cromatinei, formând structuri cromatinice "închise" sau "deschise". De exemplu, eucariotele
superioare exprimă un număr de proteine asociate cu heterocromatina conținând așa-numitele
cromodomenii, care se leagă la cozile histonelor H3 când aceasta este metilată la lizina 9. Se
postulează că aceste proteine contribuie la plierea înalt-ordonată caracteristică heterocromatinei,
oarecum, la fel ca proteinele SIR la nivelul telomerilor de drojdii. Alternativ, bromo-domeniul
găsit într-un număr de proteine asociate eucromatinei se leagă la cozile acetilate ale histonelor.
Cea mai mare subunitate a factorului TFIID, de exemplu, conține două bromodomenii apropiate,
care poat ajuta asocierea cu cromatina care conține un cod activ,în timp ce activitatea histon-
acetilazică al aceleiași subunitate menține cromatina într-o stare hiperacetilată.
Factorii care remodelează cromatina ajută la activarea sau represarea anumitor gene
Pe lângă complexele histon-acetilazei, un alt tip de complex multiproteic, numit "SWI/SNF
chromatinremodeling complex" este necesar pentru activare la nivelul unor promotori de drojdie.
Mai multe subunități SWI/SNF prezintă omologie cu ADN helicazele, enzime care folosesc
energia obținută prin hidroliza ATP pentru a rupe interacțiile dintre perechile de baze din structura
acizilor nucleici sau dintre aceștia și proteine. Complexul SWI/SNF se consideră că disociază
tranzitoriu ADN de pe suprafața nucleozomului, permitând nucleozomului să alunece de-a lungul
ADN și să promoveze desfacerea structurilor de cromatină condensate și înalt-ordonate. Rezultatul
net al unei astfel de remodelări a cromatinei este facilitarea legării factorilor de transcripție la ADN
din structura cromatinei. S-a demonstrat legarea câtorva domenii de activare la complexul
SWI/SNF, această legare stimulând transcripția in vitro de pe matritele de cromatină (de pe ADN
legat la nucleosomi). Astfel complexele SWI/SNF reprezintă un alt tip de complex de coordinare.
Alte complexe multi-proteice cu activități de remodelare a cromatinei similare au fost
165
identificate la drojdii, crescând posibilitatea ca diferitele complexe de remodelare a cromatinei să
fie necesare pentru diferite familii de activatori.
Eucariotele superioare conțin și ele complexe multi-proteice omologe cu complexul
SWI/SNF. Aceste complexe izolate din extractele nucleare de la mamifere și celulele de
Drosophila, s-a demonstrat că asistă legarea factorilor de transcripție la situsurile lor de
recunoaltere din ADN nucleosomal printr-un proces care necesită consum de ATP. În figură se
demonstrează cum un domeniu de activare poate determina decondensarea unei regiuni de
cromatină. Acest lucru se consideră că este rezultatul interacției dintre domeniile de activare și
complexele care acetilează histonele remodelând cromatina.
În mod surprinzător, complexele SWI/SNF sunt necesare și pentru represia anumitor gene,
probabil deoarece acestea ajutș expunerea cozilor de histone la acțiunea deacetilazelor sau
deoarece acestea asistă legarea activatorului la situsul lui de recunoaștere ADN și a PolII la
promotor. În plus, una dintre subunitățile mediator au activitate histon-acetilazică și pot funcționa
în scopul menținerii unei regiuni promotoare într-o stare hiperacetilată.
Experimente cu mutanți de drojdii sensibili la temperatura indică că anumite subunități
mediatoare sunt necesare pentru transcripția aproape a tuturor genelor de la drojdii. Aceste
subunități ajută, cel mai probabil, la menținerea structurii în ansamblu a complexului mediator sau
la legarea la PolII, și, prin urmare, sunt necesare pentru activarea realizată de către toate tipurile
de activatori. În contrast, alte subunități mediator sunt necesare pentru activarea unor subseturi
specifice de gene.
Analizele ADN microarray pentru expresia genică la mutanții cu defecte la nivelul acestor
subunități mediator indică că fiecare astfel de subunitate influențează transcripția a aproximativ 3-
10% din toate genele. Aceste subunități mediatoare se consideră că interacționează cu domenii
specifice de activare; astfel, atunci când una dintre subunități este defectivă, transcripția genelor
reglată de către activatorii care se leagă la acea subunitate este sever depresată în timp ce
transcripția altor gene nu este afectată. În concordanță cu această explicație sunt studiile de legare
care arată că anumite domenii de activare interacționează întradevar cu subunități mediatoare
specifice. Complexele mediatoare mari, izolate din culturi celulare de mamifere, sunt necesare
pentru activatorii de mamifere pentru a stimula transcripția realizată de către PolII in vitro.
Deoarece genele care codifică subunități omologe ale mediatorului de mamifere au fost identificate
în secvențele genomice de la C. elegans și Drosophila, se pare că majoritatea animalelor
multicelulare (metazoare) au complexe mediatoare omologe.
Aproximativ 1/3 dintre subunitățile mediatoare de la metazoare sunt clar omologe cu
subunitățile mediatoare de la drojdie, dar subunitățile care rămân, și care par să fie distincte față
de alte proteine de drojdie, pot interacționa cu domeniile de activare care nu au fost evidențiate în
drojdie. Ca și în cazul mediatorilor de la drojdii, unele dintre subunitățile mediatoare de la
mamifere au arătat că interacționează cu domenii activatoare specifice. De exemplu, subunitatea
Sur2 a mediatorului de la mamifere se leagă la domeniul de activare al factorului de transcripție
TCF care controlează expresia genei EGR-1. Funcția activatorului TCF in vivo este reglată normal
ca răspuns la hormoni proteici specifici prezenți în ser. Celulele stem embrionare de șoarece cu
knockout la nivelul genei sur2 eșuează inducerea expresiei proteinei EGR-1 ca răăspuns la ser,
întrucât mulți alți activatori funcționează normal în celulele mutante.
Aceste constatări demonstrează implicarea subunității mediator Sur2 în activarea funcției
TCF. Diferitele rezultate experimentale care indică că subunitățile
166
mediator individuale se leagă la domenii de activare specifice sugerează că mai mulți activatori
influențează transcripția unui singur promotor prin interacția simultană cu un complex mediator.
Activatorii care se leagă la "enhancer" sau la elemente promotor proximale pot interacționa
cu mediatorii asociați cu un promotor deoarece ADN este flexibil și poate forma o bucla care poate
aduce regiunile reglatoare și promotorii apropiați împreună. Astfel de bucle au fost observate în
experimentele cu activatorul NtrC de la E. coli și cu 54 ARN polimeraza. Complexele
multiproteice cu nucleoproteine care se formează la nivelul promotorilor de la eucariote pot să
conțină nu mai puțin de 100 polipeptide cu o masă totală de aproximativ 3 megadaltoni (MDa), la
fel de mare ca ribozomul.
SLIDE 81. Activatorii stimulează strânsa cooperare în asamblarea complexelor de iniţiere
Figura: Situsurile de legare ale activatorilor care controlează transcripţia genei trantiretinei
(TTR) din hepatocitele de şoarece
HNF= hepatocyte nuclear factor; EBP=enhancer binding protein; AP1=factor
transcripţional heterodimer cjun/cfos
După participarea la hiperacetilarea cromatinei în vecinătatea regiunii promotoare,
activatorii transcripţionali se crede că stimulează asamblarea unui complex de iniţiere şi reglează
frecvenţa cu care noi molecule de Pol II reiniţiază transcripţia. Această funcţie a activatorilor care
furnizează un al doilea nivel de control transcripţional, poate fi demonstrat adesea în reacţii in
vitro, în lipsa histonelor.
De exemplu, unii activatori stimulează legarea TFIID sau legarea simultană a TFIID şi
TFIIH la TATA box in vitro. Alţi activatori interacţionează cu alţi factori generali de transcripţie
şi cu subunităţile complexului mediator asociat cu elementele CTD ale subunităţii mari a Pol II.
Asamblarea complexului multiproteic de iniţiere la nivelul promotorului se consideră că
este rezultatul unor interacţii cooperative multiple. La organismele superioare, cooperativitatea
puternică a iniţierii asamblării complexelor este parţial responsabilă pentru expresia genică
specifică tipului celular.
De exemplu, gena TTR codifică transtiretina de la mamifere care se exprimă în hepatocite
şi în celulele plexului coroid. Transcripţia genei TTR în hepatocite este controlată de cel puţin 5
factori transcripţionali diferiţi:
- HNF1, o proteină hepatică specifică homeobox; - HNF3, o proteină hepatică specifică “winged-
helix”; - HNF4, un receptor nuclear care este exprimat şi în celulele epiteliale şi celulele tubulilor
renali;
- C/EBP, un heterodimer bazic cu elemente Zipper care este exprimat şi în celulele
epiteliale, celulele grase şi în unii neuroni.
-AP1, o familie mică de proteine bazice zipper care sunt exprimate în toate tipurile
celulare.
Cu toate că trei dintre aceşti activatori sunt exprimaţi şi în alte tipuri celulare, gena TTR
nu este transcrisă în aceste celule. Aceasta deoarece întregul set de activatori este prezent numai
în hepatocite. Toţi activatorii trebuie să fie prezenţi pentru a contribui la asamblarea înalt
cooperativă a complexului de iniţiere a promotorului TTR.
Diferite gene care codifică proteine hepatice specifice, cum sunt albumina serică sau
alfa1-antitripsina, posedă diferite aranjamente ale situsurilor de legare a
167
proteinelor şi folosesc seturi de factori comuni dar nu identice. Cu toate acestea nu numai factorii
activatori sunt cei care dictează proportia şi tipul proteinelor care vor fi transcrise (de exemplu
albumina este sintetizată in cantitate mult mai mare decât transtiretina) deci mecanismele de
reglare aexpresiei sunt mult mai complexe.
SLIDE 82. Structura complexelor mediator de la drojdii și de la om (a) Imagine reconstituită a
mediatorului de la S. Cerevisiae legat la Pol II. Imaginile de microscopie electronic prezintă
structura tridimensională a Pol II în albastru deschis asociată cu complexul mediator de la drojdie
(albastru închis). (b) Reprezentarea diagramată a subunităților mediatoare din celulele umane.
Subunitățile reprezentate în aceeiași culoare se pare că formează un modul. Subunitățile în
portocaliu, galben și verde sunt omoloage cu subunitățile din modulul de la drojdie. Studii de
genetică, la drojdii au demonstrate că mutații la nivelul unei subunități dintr-un modul inhibă
asocierea celorlalte subunități ăn același modul u restul complexului.
[Part (a) courtesy of Francisco J. Asturias, 2002, Mol. Cell 10:409. Part (b) adapted from S.
Malik and R. G. Roeder, 2000, Trends Biochem. Sci. 25:277.]
SLIDE 83. Modelul asamblării cooperative a unui complex de iniţiere activat la nivelul
promotorului TTR Figura: Modelul asamblării cooperative a complexului de iniţiere a
transcripţiei la nivelul promotorului TTR din hepatocite.
Patru activatori bine reprezentaţi în hepatocite plus factorul ubiqitar AP1 se leagă la
situsurile specifice de la nivelul “enhancerului” şi regiunea proximală promotorului genei TTR.
Domeniile de activare ale activatorilor legaţi interacţionează extensiv cu co-activatorii.
Subunităţile TAF ale TFIID, proteinele Srb/Mediator şi factorii generali de transcripţie determină
plierea ADN şi formarea unui complex activat stabil de iniţiere. Datorită naturii înalt cooperativă
a procesului de asamblare, complexul de iniţiere nu se formează la nivelul promotorului TTR din
celulele epiteliulu intestinal, care conţin numai două din cei patru factori transcripţionali mai bogat
reprezentaţi în ficat. Mulţi dintre factorii generali de transcripţie, proteinele Srb/Mediator şi ARN
polimeraza II (Pol II) vor fi pre-asamblate într-un complex holoenzimatic.
SLIDE 84. Represorii interferă direct cu iniţierea transcripţiei în mai multe feluri Figura:
Diferiţii represori de la eucariote pot inhiba transcripţia prin mecanisme care nu implică
deacetilarea histonelor.
În cele trei mecanisme exemplificate mai sus, represorul fie inhibă activarea fie interferă
direct cu formarea complexului de iniţiere. În plus, unii represori interacţionează cu proteine co-
represoare, care se consideră că interacţionează la rândul lor cu factorii generali de transcripţie
pentru a inhiba iniţierea.
Un represor este orice proteină care interferă cu iniţierea transcripţiei când se leagă la un
situs specific din structura ADN. Mai sus am arătat că unii represori pot direcţiona deacetilarea
histonelor prezente în nucleosomii din apropierea situsurilor de recunoaştere a acestora. La rândul
ei deacetilarea histonelor inhibă interacţia factorilor generali cu situsurile de legare ADN represând
astfel transcripţia. Totuşi, studiile care demonstrează că anumiţi represori sunt capabili să
represeze transcripţia in vitro, în absenţa histonelor indică existenţa altor mecanisme de represie
directă.
168
 Deşi mecanismele de represie nu sunt foarte bine înţelese, unii dintre represori acţionează
conform mecanismelor prezentate mai sus.
Două dintre mecanisme presupun legarea competitivă dintre represor şi activator sau un
factor general de transcripţie. În ambele cazuri, legarea unei molecule represoare la un situs ADN
specific blochează legarea proteinelor necesare iniţierii transcripţiei. Totuşi, în multe cazuri
represorii eucariotici inhibă transcripţia fără a interfera cu legarea unui activator sau a unui factor
general de transcripţie. În astfel de cazuri, represorul legat poate interacţiona cu un activator din
imediata vecinătate, împiedicând funcţionarea acestuia, sau cu factorii generali legaţi la promotor
împiedicând asamblarea acestora în complexul de iniţiere.
SLIDE 85. Hormonii liposolubili controlează activităţile receptorilor nucleari Figura: Exemple
de hormoni lipo-solubili care se leagă la membrii superfamiliei receptorilor factorilor de
transcripţie. Cortizolul este un hormon care se leagă la receptorul glucocorticoid (GR).
Asemeni altor hormoni steroizi, acesta este sintetizat din colesterol. Acidul retinoic este un
metabolit, derivat de la vitamina A care are efecte puternice asupra dezvoltării mugurelui limbic
la embrioni şi în reînnoirea pielii la mamiferele adulte. Ligandul pentru acidul retinoic este RAR
(receptorul pentru acid retinoic). Tiroxina este sintetizată din resturi de tirozină în proteina
tiroglobulină la nivelul glandei tiroide. Este un ligand pentru receptorul hormonului tiroidian (TR).
Activităţile multor factori de transcripţie sunt reglate de către hormoni care funcţionează
ca semnale extracelulare în organismele multi-celulare. Hormonii sunt secretaţi de un anumit tip
celular şi circulă prin fluidele extracelulare pentru a acţiona asupra funcţionării celulelor situate
în diferite regiuni ale organismului la distanţă considerabilă de locul sintezei lor. O clasă de
hormoni cuprinde molecule mici, lipo- solubile, care pot difuza prin plasmă şi membranele
nucleare. Așa cum am discutat anterior, aceşti hormoni lipodo-solubili, incluzând mulţi hormoni
steroidieni, retinoizi şi hormoni steroidieni, se leagă şi reglează factori de transcripţie specifici
aparţinând super-familiei de receptori nucleari. Domeniul structural al receptorilor nucleari.
Clonarea şi secvenţializarea genelor care codifică pentru mulţi receptori nucleari au permis
compararea secvenţei în aminoscizi a acestora. Aceste studii au evidenţiat o remarcabilă
conservare atât a secvenţei în aminoacizi cât şi a diferitelor regiuni funcţionale ale diferiţilor
receptori nucleari. Toţi receptorii nucleari posedă o regiune N-terminală de lungime variabilă (100-
500 aa) conţinând regiuni care funcţionează ca domenii de activare a transcripţiei. Domeniul de
legare la ADN este localizat lângă centrul secvenţei primare şi posedă 4 motive C4 “zinc finger”.
Domeniul de legare a hormonului este localizat capătul C-terminal al acestor receptori şi conţine
un domeniu de activare hormon-dependent. În unele cazuri domeniul de legare a hormonului
funcţionează ca un domeniu represor în absenţa ligandului.
SLIDE 86. Domeniile structurale ale receptorilor nucleari Figura: structura generală a
factorilor de transcripţie din super-familia receptorilor nucleari
Domeniul de legare a ADN localizat central manifestă o considerabilă omologie de
secvenţă între diferiţii receptori şi are un motiv C4 “zinc fingger”. Regiunea C-terminală de legare
a hormonului prezintă o omologie mult mai redusă. Regiunile N-terminale ale diferiţilor receptori
variază ca lungime, au o secvenţă unică
169
şi pot conţine unul sau mai multe domenii de activare. Această configuraţie generală a fost
determinată pentru receptorul estrogen (553 aa), receptorul pentru progesteron (946 aa), receptorul
glucocorticoid (777 aa), receptorul pentru hormonii tiroidieni (408 aa) şi receptorul pentru acid
retinoic (432 aa).
SLIDE 87. “Response elements” sunt secvenţe de ADN care leagă mai mulţi receptori nucleari
majori Figura: secvenţe consens ale situsurilor ADN, numite elemente răspuns, care leagă
receptorul glucocorticoid (GRE), receptorul estrogen (ERE), receptorul pentru vitamina D
(VDRE), receptorul pentru hormonii tiroidieni (TRE) şi pentru acid retinoic (RARE).
Repetiţiile inverse din GRE şi ERE şi repetiţiile directe din VDRE, TRE şi RARE sunt
indicate prin săgeţi roşii
Secvenţele nucleotidice caracteristice ale situsurilor de legare din structura ADN, numite
elemente răspuns, care leagă numeroşi receptori nucleari majori au fost determinate. Secvenţele
consens ale elementelor răspuns la glucorticoizi şi estrogeni sunt secvenţe repetitive inverse de 6
pb separate de oricare trei perechi de baze. Aceste descoperiri sugerează că aceşti receptori ai
hormonilor steroizi se vor lega la ADN sub formă de dimeri simetrici, aşa cum s-a demonstrat deja
prin cristalografie cu raze X asupra receptorului homodimer al hormonului glucocorticoid.
Unele elemente răspuns ale receptorilor nucleari, cum sunt cele pentru vitamina D3,
hormonii tiroidieni şi receptorii acidului retinoic, sunt secvenţe repetitive directe ale aceleiaşi
secvenţe recunoscute de către receptorul pentru estrogen, separate de trei la cinci perechi de baze.
Receptorii care se leagă la astfel de elemente răspuns direct repetitive ca şi heterodimerii care
conţin un monomer comun receptorilor nucleari numit RXR. De exemplu, elementul răspuns la
vitamina D3 este legat de către heterodimerul RXR-VDR şi elementul răspuns la acidul retinoic
este legat de către RXR-RAR. Monomerii care compun aceşti heterodimeri interacţionează unii cu
alţii într-un mod care face ca cele două domenii de legare la ADN să se lege la fel dar într-o
orientare inversă, permitând heterodimerilor RXR să se lege la repetiţiile directe ale situsului de
legare pentru fiecare monomer. În contrast, monomerii receptorilor nucleari homodimeri (ex, GRE
şi ERE) au o orientare inversă. Informații suplimentare
Receptorii steroidieni posedă domenii pentru legarea ADN, legarea hormonilor şi
activarea transcripţiei
Hormonii steroizi sunt sintetizaţi ca răspuns la o varietate de activităţi neuroendocrine şi
exercită efecte majore asupra creşterii, dezvoltării ţesuturilor şi homeostaziei corpului în lumea
animală.
Glandele adrenale secretă peste 30 de steroizi, cele două grupuri majore fiind
glucocorticoizii şi mineralocorticoizii. În categoria steroizilor intră hormonii reproducători
(hormonii de sex masculin şi hormonii de sex feminin). Vitamina D este necesară pentru o bună
dezvoltare a oaselor.
Alţi hormoni cu structuri şi funcţii neînrudite pot acţiona la nivel molecular în mod similar
hormonilor steroidieni. Hormonii steroizi şi tiroidieni pot avea şi ei un rol important în
metamorfoză (steroizii insectelor şi hormonii tiroidieni de la broaşte).
Acidul retinoic (vitamina A) este o substanţă morfogenă responsabilă de dezvoltarea axei
antero-posterioare în timpul dezvoltării mugurelui membrelor la pui. Metabolitul său, acidul-9-cis
retinoic se găseşte în ţesuturi care sunt situsuri majore de stocare şi de metabolizare a vitaminei A.
170
 Pe lângă aceste diferite acţiuni care presupun reglarea dezvoltării corpului trebuie să mai
adăugăm şi funcţiile de reglare a căilor de expresie genică. Aceşti compuşi diferiţi manifestă un
mod de acţiune comun: fiecare reprezintă o moleculă mică care se leagă la un receptor specific
care activează transcripţia genelor. (Receptorul poate să nu fie nominalizat: proteina este un
receptor pentru un hormon steroid sau tiroidian în acelaşi sens în care represorul lac este receptor
pentru β- galactozid: nu este un receptor în sensul de proteină legată de membrană (membranară)
care este expusă la suprafaţa celulelor).
Despre interacţiunea glucocorticoizilor cu receptorul lor se cunoaşte mai mult. Un hormon
steroid poate străbate membrana celulară pentru a intra în celulă prin simplă difuzie. În interiorul
celulei, glucocorticoidul se leagă la receptorul glucocorticoid. (Studiile pe receptorul
glucocorticoid au fost realizate cu hormonul steroid sintetic, dexametazonă). Localizarea
receptorilor liberi nu este pe deplin clarificată; ei pot fi în echilibru între nucleu şi citoplasmă. Dar
când hormonul se leagă la receptor, proteina este transformată într-o formă activată cu o afinitate
de 10x mai mare pentru ADN ne-specific; complexul hormon-receptor este totdeauna localizat în
nucleu.
Receptorul activat recunoaşte o secvenţă consens specifică care identifică GRE, elementul
răspuns la glucocorticoid. GRE este localizat tipic la nivelul unui activator situat în vecinătatea
generală a unei gene care răspunde la acţiunea glucocoiticoizilor. Secvenţa GRE poate fi
poziţionată la mai multe kilobaze în amont sau în aval de promotor. Când complexul steroid-
receptor se leagă la activator, este activat promotorul din vecinătate (corespunzător) iar transcripţia
este iniţiată. Activarea ‘activatorului’ furnizează mecanismul general prin care steroizii reglează
un set larg de gene ţintă. Acţiunea corespunde formal modelului bacterian de inducere a reglării
pozitive de către un reglator pozitiv (co-inductorul activează inductorul proteinei).
Prin clonarea ADNc care codifică receptorii hormonilor steroizi, au fost deduse structurile
proteinelor corespunzătoare. Introducerea ADNc, care codifică pentru un receptor, într-o celulă
conferă, în continuare, acelei celule capacitatea de a răspunde la steroid prin activarea oricărei
gene corelată cu unul dintre elementele răspuns. Acest sistem poate fi folosit pentru a analiza
proprietăţile receptorilor codificaţi de către ADNc în care au fost introduse mutaţii.
Receptorii diferitelor grupe de hormoni steroizi, hormoni tiroidieni, şi acid retinoic
reprezintă o ’ nouă super-familie’ de gene reglatoare, factori de transcripţie care răspund la liganzi
(ligand-responsive transcription factors).
Toţi receptorii prezintă domenii independente de legare a ADN şi a hormonilor.
Pentru diferiţii receptori steroizi domeniile centrale de legare a ADN sunt bine corelate iar pentru
alţi receptori rămân identificabile. Anumiţi liganzi posedă receptori multipli care sunt strâns
corelaţi, cum este cazul celor trei receptori ai acidului retinoic ( α, β şi γ) şi a celor trei receptori
ai acidului 9-cis -retinoic (RXRα, β, γ). Conversarea secvenţei reflectă probabil cerinţele comune
de legare la ADN, în timp ce variaţia este responsabilă pentru selecţionarea diferitelor secvenţe
ţintă. Actul (procesul) de legare a ADN nu poate fi deconectat de capacitatea de activare a
transcripţiei, deoarece mutaţiile prezente în acest domeniu afectează ambele activităţi. Regiunile
 N-terminale ale receptorilor arată secvenţa minimă conservată. Ele includ alte regiuni necesare
activării transcripţiei.
Domeniile C-terminale leagă hormonii. Cele din familia receptorilor steroizi prezintă o
înrudire de 30 la 57%, reflectând specificitatea pentru hormonii individuali.
171
Relaţiile cu alţi receptori sunt minime, reflectând specificitatea pentru o varietate de compuşi:
hormoni tiroidieni, vitamină D, acid retinoic etc.
Regiunea C-terminală reglează activitatea receptorului, diferit pentru fiecare tip de receptor
individual în parte. Dacă domeniul C-terminal al receptorului glucocorticoid este eliminat, proteina
N-terminală rămasă este constitutiv activă: aceasta nu mai necesită steroizi pentru activare (pentru
activitate). Aceasta sugerează că, în absenţa steroidului, domeniul de legare a steroidului împiedică
receptorul să recunoască secvenţa GRE; acesta funcţionează ca reglator negativ intern. Adăugarea
hormonului steroid inactivează inhibiţia, dând posibilitatea receptorului să se lege la secvenţa GRE
şi să activeze transcripţia. Baza represiei poate fi internă, corelată cu interacţiunile cu o altă parte
a receptorului. O altă ipoteză este că represia poate fi şi rezultatul interacţiunilor cu alte proteine,
care sunt eliberate (deplasate) când se leagă steroidul.
Interacţia dintre domenii este diferită în cazul receptorului pentru estrogeni. Dacă domeniul
de legare a hormonului este înlăturat, proteina este incapabilă să activeze transcripţia, chiar dacă
continuă să se lege la secvenţa ERE. Deci, această regiune este mai degrabă necesară să activeze
decât să reprime activitatea.
Fiecare receptor recunoaşte ‘elementele răspuns’ care sunt înrudite cu o secvenţă consens.
Aşa cum este prezentat în slide, aceste ‘elemente răspuns’ au o trăsătură caracteristică: fiecare
consens constă în două secvenţe repetitive scurte (or half sites=jumătăţi de situs). Această structură
sugerează imediat că legarea receptorului se face sub formă multimerică, astfel încât fiecare
jumătate a secvenţei consens este contactată de către o subunitate (reminescenţe ale interacţiei
operatorului şi represorului fagului λ).
‘Elementele răspuns’ ale diferiţilor receptori pot fi palindroame sau repetiţii directe în care
jumătăţile de situs sunt separate de 0-4 pb a căror secvenţă este irelevantă (neînsemnată). Numai
două dintre aceste jumătăţi de situs sunt folosite de diferiţi receptori. Orientarea lor şi distanţa
dintre ele determină tipul de receptor (receptorul) care va recunoaşte ‘elementul răspuns’. Acest
comportament permite ‘elementelor răspuns’, care au secvenţe consens limitate (restrânse) să fie
recunoscute specific de o varietate de receptori. Regulile care guvernează recunoaşterea nu sunt
absolute, dar pot fi modificate de context, şi există şi cazuri în care ‘elementele răspuns’
palindromice (cu structură de palindrom) sunt recunoscute permisiv de mai mult decât un receptor.
Receptorii se împart în două grupe: 1) Receptorii glucocorticoizi (GR), mineralocorticoizi (MR),
androgen (AR) şi progesteron (PR) sunt toţi homodimeri. Ei recunosc ‘elementele răspuns’ ale
căror jumătăţi de situs au o secvenţă consens TGTTCT. Jumătăţile de situs sunt aranjate sub
formă de palindroame, iar distanţa dintre situsuri determină tipul de element. Receptorul pentru
estrogen (ER) funcţionează într-un mod asemănător dar are ca jumătate de situs secvenţa
TGACCT. 2) Receptorii tiroidieni (T3R), pentru vitamina D (VDR), pentru acid retinoic (RAR)
şi pentru acid -9-cis-retinoic (RXR) formează heterodimeri, care recunosc ‘jumătăţi de elemente’
a căror secvenţă este TGACCT. Jumătăţile de situs sunt aranjate ca unităţi repetitive directe,
recunoaşterea lor fiind influenţată de separarea lor după cum urmează:
1 pb→ RXR 3 pb→ VDR 4 pb→ T3R 5 pb→ RAR
172
 Acest mod de recunoaştere caracteristic celui de al doilea grup este valabil pentru receptorii
dimeri a căror primă subunitate este receptorul de pe listă şi cea de a doua este formată din RXR
(în concluzie prima poziţie de pe listă este un homodimer). Necesităţile formării unui heterodimer
au fost descoperite deoarece receptorii pentru acid retinoic şi hormoni tiroidieni (RARs şi TRs) se
leagă mult mai eficient la situsurile ţintă în prezenţa unui factor adiţional, care se pare că este
reprezentat de RXR. Receptorul heterodimer răspunde ligandului prin intermediul primei
subunităţi, şi aparent nu necesită RXR pentru a cupla (lega) ligandul. Aceşti receptori pot forma şi
homodimeri care recunosc secvenţele palindromice.
Acum suntem în situaţia de a putea înţelege bazele specificităţii de recunoaştere.
Recunoaşterea secvenţei unei jumătăţi de situs se realizeaza prin intermediul secvenţei de
aminoacizi caracteristică primului deget. Specificitatea de formare a dimerului este dată de
secvenţa în aminoacizi a celui de al doilea deget. Se pare că formarea dimerilor determină probabil
distanţa dintre subunităţile care sunt poziţionate în curburile succesive ale fosei majore, controlând
astfel răspunsul la distanţa dintre jumătăţile de situs.
SLIDE 88. Translocarea “hormon-dependentă” a receptorilor homodimeri Figura:
Demonstraţie experimentală că domeniul de legare a hormonului al receptorului glucocorticiod
(GR) mediază translocarea către nucleu în prezenţa hormonului.
Celule animale în cultură au fost transfectate cu vectori de expresie care codifică proteinele
prezentate în partea de jos a imaginii. Marcarea imunofluorescentă a fost obţinută cu un anticorp
specific pentru beta-galactozidază şi folosit pentru a detecta proteinele exprimate în celulele
transfectate.
a) Când celulele au fost transfectate numai cu beta-galactozidază enzima exprimată a fost
localizată în citoplasmă în prezenţa şi în absenţa hormonului glucocorticoid dexametazonă (Dex);
b) Când o proteină de fuziune constând din beta-galactozidază şi întregul receptor
glucocorticoid de şoarece de 974 aa (GR) a fost exprimată în celulele în cultură, a fost prezentă în
citoplasmă în absenţa hormonului dar a fost transportată în nucleu în prezenţa hormonului.
c) O proteină de fuziune compusă dintr-o regiune de 382 aa a GR incluzând domeniul de
legare a ligandului (portocaliu) şi beta-galactozidază prezintă, de semenea, un transport către
nucleu dependent de hormon. Mecanismul de control hormonal al activităţii receptorilor nucleari
Legarea hormonilor la receptorul nuclear reglează activitatea acestuia ca factor de
transcripţie. Această reglare diferă sub unele aspecte între receptorii nucleari heterodimeri şi cei
homodimeri.
Când receptorii nucleari heterodimeri (ex. RXR-VDR, RXR-TR şi RXR- RAR) sunt legaţi
la situsurile lor de recunoaştere din structura ADN, ei acţionează ca represori sau activatori ai
procesului transcripţional depinzând de tipul de hormon care ocupă situsul de legare a ligandului.
În absenţa hormonului, aceşti receptori nucleari direcţionează deacetilarea histonelor de la nivelul
nucleozomilor situaţi în vecinătate. În prezenţa hormonului, domeniul de legare a hormonului
suferă o modificare conformaţională drastică. Aceşti receptori nucleari pot dirija hiperacetilarea
histonelor nucleosomilor vecini, reversând în felul acesta efectele represoare ale domeniului de
legare fără hormon. Domeniul N-terminal de activare al
173
acestor receptori nucleari reacţionează probabil apoi cu factori adiţionali, stimulând asamblarea
cooperativă a complexului de iniţiere.
În contrast cu receptorii nucleari heterodimeri, care sunt localizaţi exclusiv în nucleu,
receptorii homodimeri se găsesc atât în citoplasmă cât şi în nucleu, iar activitatea lor este reglată
prin controlul transportului lor din citoplasmă în nucleu. Translocarea hormon-dependentă a
receptorului homodimer glucocorticoid (GR) a fost demonstrată prin experienţe de transfecţie
conform figurii de mai sus. Domeniul de legare a hormonului glucocorticoid (GR) singur mediază
acest transport.
Studii ulterioare au arătat că în absenţa hormonului, receptorul glucocorticoid este
ancorat în citoplasmă ca un agregat proteic mare complexat cu proteine inhibitoare incluzând
Hsp90, o proteină înrudită cu Hsp70, proteina heat-shoc cea mai mare. În această situaţie,
receptorul nu poate reacţiona cu genele ţintă; deci, nu apare activare transcripţională. Legarea
hormonului eliberează receptorul glucocorticoid de ancora sa citoplasmatică, permitând acestuia
să intre în nucleu el se va lega la elementele răspuns asociate genelor ţintă. O dată ce receptorul
la care este legat hormonul interacţionează cu elementul răspuns, el activează transcripţia prin
determinarea hiperacetilării histonelor şi facilitarea asamblării cooperative a complexului de
iniţiere. Receptorii orfelini
Liganzii pentru domeniile de legare a hormonilor ai multor membrii ai super- familiei de
receptori nucleari sunt încă necunoscuţi. De exemplu, HNF4, care este implicat în expresia genei
transtireninei în hepatocite. Majoritatea acestor proteine de legare la ADN sunt denumite
“receptori orfani/orfelini”, au fost descoperite prin “screening-ul” băncilor de ADNc cu sonde
specifice pentru secvenţele nucleotidice înalt conservate ale domeniilor de legare a ADN ale
receptorilor nucleari. Rolul precis al receptorilor orfelini şi identificarea hormonilor necunoscuţi
care se presupun că reglează activitatea acestora sunt încă subiecte importante de cercetare.
SLIDE 89. Model de activare “hormon-dependentă” a genelor de către receptorul
glucocorticoid Figura: Modelul de activare homon-dependentă a genelor activate de către
receptorul glucocorticoid (GR).
În absenţa hormonului, GR este legat într-un complex cu Hsp90 în citoplasmă via
domeniului său de legare (portocaliu). Când hormonul este prezent, el difuzează prin membrana
plasmatică şi se leagă la domeniul de legare GR, determinând modificări conformaţionale în
domeniul de legare a ligandului care eliberează receptorul de Hsp90. Receptorul cu ligandul legat
este apoi translocat în nucleu unde domeniul său de legare la ADN (portocaliu deschis) se leagă la
elementele răspuns, permitând domeniului de activare (verde) să stimuleze transcripţia genelor
ţintă.
Diapozitiv 90. Hormonii polipeptidici semnalizează fosforilarea unor factori de
transcripţie Figura: Modelul de activare genică a IFNgama prin fosforilarea şi
dimerizarea Stat1alfa.
JAK kinaza este activată când receptorul IFNgama dimerizează prin legarea la IFNgama.
Kinaza JAK activată fosforilează un rest specific de tirozină din monomerii Start1alfa în
citoplasmă. Stat1alfa fosforilată dimerizează, şi dimerul fosforilat
174
translocă apoi în nucleu unde el se leagă elementele răspuns corespunzătoare, promovând
transcripţia genelor reglate de către IFNgama. Hormonii polipeptidici semnalizează fosforilarea
unor factori de transcripţie
Deşi hormonii lipo-solubili pot difuza prin membrana plasmatică şi interacţionează direct
cu factorii de transcripţie din citoplasmă sau nucleu, cea de a doua clasă majoră de hormoni,
peptidici şi proteici, nu poate. În schimb, aceşti hormoni funcţionează prin legarea la receptori
specifici de pe suprafaţa celulară, care apoi transmit semnalul că au legat hormonul la proteinele
din interiorul celulei, un proces numit “transducerea semnalului”.
În multe cazuri, mecanismul prin care un semnal hormonal este transdus într- un semnal
de activare pentru factorii de transcripţie implică fosforilarea. Un exemplu simplu este furnizat de
către interferonul gama (IFNgama), un hormon eliberat de către limfocitele T-helper stimulate
antigenic, care sunt critice în răspunsul imun. Când IFNgama se leagă la proteină receptoare
specifică care este prezentă la suprafaţa majorităţii celulelor, acesta induce expresia unui număr
de gene, producând o stare antivirală care scade susceptibilitatea celulelor la infecţiile determinate
de o serie de virusuri. INFgama stimulează funcţionarea altor celule care participă la răspunsul
imun. Pentru a analiza cum acest hormon determină inducţia unui set specific de gene, cercetătorii
au identificat mai întâi elementul răspuns la la IFNgama şi apoi au purificat o proteină din nucleii
celulelor tratate cu IFNgama care se leagă la această secvenţă. Proteina izolată are aproximativ 91
kDa şi este numită Stat1alfa, pentru signal transductor şi activator al transcripţiei.
După ce celulele în cultură au fost tratate cu IFNgama, activitatea de legare la ADN a
Start1alfa creşte rapid, în paralel cu creşterea transcripţiei genelor inductibile. Această inducere a
activităţii de legare a Stat1alfa apare chiar şi în tratate cu un inhibitor al sintezei proteice, indicând
că unele tipuri de modificări post-translaţionale ale proteinei pre-existente Stat1alfa activează
activitatea sa de legare la ADN. Prin marcarea (colorarea) celulelor cu anticorpi anti-Stat1alfa
marcaţi fluorescent, cercetătorii demonstrează că Stat1alfa translocă din citosol în nucleu în urma
tratamentului cu IFNalfa, cu cinetici similare cu cele ale inducerii genelor.
Analizele proteinei Stat1alfa din celulele tratate cu IFNgama demonstrează că tratamentul
hormonal conduce la fosforilarea unui rest specific de tirozină din structura proteinei. Mai mult,
proteina fosforilată Stat1alfa formează homodimeri în timp ce proteina nefosforilată este un
monomer. Când restul critic de tirozină a fost schimbat cu o fenilalanină prin mutageneză dirijată
situs-dirijată, proteina mutantă Stat1alfa nu mai activează genele ţintă într-un experiment de
transfecţie, şi opreşte translocarea în nucleu.
Fosforilarea unor resturi specifice de serină şi de treonină reglează de asemenea activitatea
unui număr mare de factori de transcripţie. Diferitele căi de transducere a semnalului care reglează
factorii de transcripţie vor fi prezentate mai târziu (capitolul 20).
În unele cazuri (de exemplu Stat1alfa), fosforilarea factorilor de transcripţie liberi
modulează activitatea sa de legare la ADN. În alte cazuri, (ex, CREB), factorii de transcripţie
inactivi, monofosforilaţi se leagă la secvenţele de recunoaştere din structura ADN; fosforilarea
modifică apoi funcţionarea domeniului de activare, astfel încât proteina poate stimula transcripţia.
 SLIDE 91. Concluzii Controlul transcripţional la eucariote operează pe
trei nivele: i) modularea nivelelor şi/sau activităţilor activatorilor şi represorilor;
175
ii) modificări în structura cromatinei determinate de activatori şi represori; iii) influenţa directă a
activatorilor şi represorilor în asamblarea complexelor de iniţiere;
Heterocromatina se referă la regiunile de cromatină condensată în care ADN este relativ
inaccesibil factorilor de transcripţie şi altor proteine, astfel încât expresia genei este represată;
Represarea mediată a heterocromatinei apare la nivelul telomerilor şi a locilor implicaţi în
conjugare la S. cerevisiae. Interacţiile diferitelor proteine şi hipoacetilarea regiunilor N-terminale
ale histonelor H3 şi H4 sunt responsabile pentru represarea structurii cromatinei în aceste regiuni;
Unii represori funcţionează parţial prin interacţia cu complexele de deacetilare a histonelor,
având drept rezultat deacetilarea histonelor din structura nucleosomilor situaţi în vecinătate.
Aceasta inhibă interacţia dintre promotorul ADN şi factorii generali de transcripţie, represând
astfel iniţierea transcripţiei;
Unii activatori funcţionează parţial prin interacţia cu complexele de deacetilare a
histonelor, având drept rezultat deacetilarea histonelor din structura nucleosomilor situaţi în
vecinătate. Aceasta facilitează interacţia dintre promotorul ADN şi factorii generali de transcripţie,
activând iniţierea transcripţiei;
SLIDE 92. Concluzii Factorii care remodelează cromatina determină
disocierea tranzitorie a ADN de “miezul” histonic printr-o reacţie ATP-dependentă şi
promovează astfel legarea altor proteine necesare procesului de iniţiere care se desfăşoară la
nivelul anumitor promotori ADN;
In vitro, combinarea activatorilor poate stimula asamblarea complexelor de iniţiere din
vecinatatea promotorului. Se crede că acest efect direct al activatorilor apare in vivo în urma
acetilării histonelor;
In vivo, asamblarea “înalt” cooperativă a complexului de iniţiere necesită mai mulţi
activatori. O celulă trebuie să producă un set specific de activatori necesari pentru transcripţia unei
anumite gene în scopul reglării expresiei acesteia;
Unii represori inhibă competitiv legarea activatorilor sau factorilor generali de
transcripţie. Alţii interacţionează direct cu factorii generali sau cu activatorii;
Activităţile super-familiei recptorilor nucleari sunt reglate de hormonii lipo- solubili.
Legarea hormonilor la aceşti factori de transcripţie induce modificări conformaţionale care
modifică interacţiile lor cu alte proteine;
Activităţile unor factori de transcripţie sunt reglate prin fosforilare indusă de legarea
hormonilor polipeptidici la receptorii lor situaţi la suprafaţa celulelor.
SLIDE 93. Transcripţia initiaţiată de Pol I şi Pol III este analogă celei realizată de Pol II În
continuare vom discuta procesul de iniţiera a transcripţiei realizat de alte ARN polimeraze.
Totuşi, aceste sisteme, în particular reglarea acestora, sunt mult mai puţin cunoscute
decât sistemele de transcripţie de la [Link]. Şi cele patronate de ARN polimeraza II. Iniţierea
transcripţiei realizată de Pol I şi de Poli III este anologă cu cea de la Pol II.
 Să ne reamintim că ARN polimeraza I (Pol I) este dedicată sintezei pre-ARNr, iar ARN
polimeraza III (Pol III) transcrie genele ARNt, genele ARNr 5S şi genele care codifică multe alte
molecule de ARN mici. Formarea complexelor de iniţiere a
176
transcripţiei care implică Pol I şi Pol III este similară în unele privinţe cu asamblarea realizată în
cazul Pol II. Totuşi, fiecare din cele trei ARN polimeraze eucariote nucleare necesită factori
generali de transcripţie specifici (sau de iniţiere) care recunosc diferite elemnete de control diferite.
Pe de altă parte nici Pol I şi nici Pol III nu necesită hidroliza ATP pentru a iniţia transcripţia, în
timp ce Pol II da.
Iniţierea de către Pol I. Genele umane pentru pre-ARNr prezintă două regiuni de control:
un element core, care include situsul de start şi care este esenţial pentru transcripţie, este un UCE
(upstream control element) de aproximativ 50 pb, care începe la aproximativ 100 pb fata de situsul
de start, şi care stimulează transcripţia in vitro de aproximativ 10 la 100 ori. Două proteine de
legare la ADN asistă Pol I pentru a iniţia şi transcrie corect genele pre-ARNr. Primul dintre ele
este factorul de legare din amonte UBF (upstream bin ding factor), care se leagă atât la UNC cât
şi la porţiunea din amonte a elementului core, chiar dacă se consideră că acestea au în aparenţă o
secvenţă puţin similară. Factorul de selectivitate I (SL1), o proteină multimeră se leagă şi
stabilizează astfel complexul. După legarea subunităţilor SL1, Pol I se leagă şi iniţiază transcripţia.
Una dintre subunităţile SL1 este TBP, aceeaşi proteină cu cea care joacă rolul central în iniţierea
Pol II.
Iniţierea de către Pol III. Spre deosebire de genele care codifică pentru proteine şi pre-
ARNr, regiunile promotoare ale genelor pentru ARNt şi ARNr 5S sunt în întregime în interiorul
secvenţei transcrise. Două astfel de elemente promotoare interne, numite box A şi box B sunt
prezente în toate genele pentru ARNt. Aceste sevenţe înalt conservate nu funcţionează numai ca
promotori dar codifică şi două porţiuni ale moleculelor de ARNt eucariot care sunt necesare
sintezei de proteine. La nivelul genelor ARNr 5S se află numai o regiune de control internă numită
cutia C, care acţionează ca un promotor.
Factorii generali de transcripţie necesari lui Pol III pentru a iniţia transcripţia genelor pentru
ARNt şi ARNr 5S au fost bine caracterizate la S. Cerevisiae. Doi factori multimeri, THIIIC şi
TFIIIB participă atât la iniţierea ARNt şi ARNr 5S la drojdii. Asamblarea complexului de iniţiere
ale genelor ARNt încep prin legarea singulară a TFIIIC la cutia A şi cutia B. Interacţia factorului
TFIIIC cu TFIIIB îl direcţionează pe acesta din urmă să se lege la secvenţele de aproximativ 30
pb situate în amonte de situsul de start al transcripţiei. Asamblarea complexului de iniţiere al
genelor pentru ARNr 5S începe cu legarea celui de al treilea factor, TFIIIA şi cutia C. Apoi TFIIIC
se leagă la TFIIIA şi este poziţionat prin intermediul interacţiilor proteină-proteină într-o poziţie
similară faţă de situsul de start ca şi în cazul legării TFIIIC la genele pentru ARNt. TFIIIB
interacţionează analog cu TFIIIC şi se leagă apoi la o secvenţă ADN situată la aproximativ –30
pb, asemeni legării la gena ARNt.
Jumătatea N-terminală a uneia dintre subunităţile TFIIIB, numită BRF (pentru TFIIB
related factor), este similară cu secvenţa TFIIB (un factor al Pol II). Similarităţile sugerează că
BRF şi TFIIB realizează o funcţie similară în iniţiere, adică direcţionarea polimerazei la situsul
corect de start. O dată ce TFIIIB se leagă atât la genele pentru ARNt cît şi pentru ARNr 5S, Pol
III se poate lega şi iniţia transcripţia în prezenţa ribonucleotidtrifosfaţilor Subunitatea BRF a
TFIIIB interacţionează specific cu una dintre subunităţile polimerazice unice pentru Pol III, aceasta
fiind elementul specific important pentru iniţierea procesului de transcripţie de către Pol III. După
legarea TFIIIB, TFIIIC poate fi înlăturat fără a afecta iniţierea realizată de către Pol III. Astfel,
TFIIIC se poate considera că ca fiind un factor de asamblare critic legarea factorului de iniţiere
TFIIIB.
O altă subunitate din cele trei care compun TFIIIB şi TBP, care este o componentă a a
factorului general de transcripţie comun pentru toate cele trei ARN
177
polimeraze nucleare. Aceste descoperiri că TBP participă în iniţierea transcripţiei atât cu Pol I cât
şi cu Pol III au fost surprinzătoare, deoarece promotorii recunoscuţi de această proteină nu conţin
TATA box. Pe de altă parte, studii recente indică că TBP ca subunitate a TFIIIB interacţionează
cu ADN similar cu interacţia cu TATA box.
SLIDE 94. Alte sisteme de transcripţie ➢ T7 şi alţi bacteriofagi înrudiţi exprimă
ARN polimeraze monomere ➢ ADN mitocondrial este transcris de către ARN polimeraze care
prezintă
similarităţi cu enzimele bacteriofagilor sau bacteriene ➢ Transcripţia ADN din cloroplaste se
aseamănă cu transcripţia bacteriană ➢ Transcripţia de la archaea este mai apropiată de
transcripţia de la eucariote
decât de cea de la bacterii T7 şi alţi bacteriofagi înrudiţi exprimă ARN polimeraze monomere
Bacteriofagul T7 domină complet sinteza macromoleculelor în gazdele sale de E. coli timp de
câteva minute după transfecţie. Toţi ribozomii celulei realizează sinteza exclusivă a proteinelor
codificate de virus. Virusul realizează acest lucru prin direcţionarea iniţială a sintezei ARN
polimerazei codificată de virus, care nu recunoaşte promotorii E. coli ci un set de promotori care
inactivează ARN polimeraza de la E. coli. În consecinţă când ARN polimeraza gazdei este
inactivată, transcripţia genomului gazdă se opreşte; deoarece ARNm de la E. coli au o durată de
viaţă foarte scăzută, sinteza marii majorităţi a proteinelor de la E. coli încetează curând. T7 ARN
polimeraza iniţiază transcripţia de la promotori care se suprapun cu situsrile de start din ADN
viral. Secvenţa de 23 pb a promotorului T7 este complet diferită de promotorii de la E. coli.
T7 ARN polimeraza, un singur lanţ polipeptidic de 98 kDa, este cea mai simplă ARN
polimerază cunoscută. Enzima este probabil cea mai simplă posibil moleculă proteică capabilă să
realizeze funcţiile unei ARN polimeraze: legarea specifică la promotori, iniţierea, elongarea şi
terminarea. Deoarece virusul este orientat să sintetizeze proteinele care formează capsula
virionului la un nivel maxim, T7 ARN polimeraza nu este reglată semnificativ. O astfel de ARN
polimerază foarte activă şi nereglată cum este T7 ARN polimeraza şi cum sunt polimerazele
bacteriofagilor înrudiţi T3 şi SP6 sunt foarte utile sintezei ARN in vitro şi expresiei sistemelor
bacteriene.
ADN mitocondrial este transcris de către ARN polimeraze care prezintă similarităţi cu
enzimele bacteriofagilor sau bacteriene
Mitocondria conţine un genom ADN distinct şi un sistem de sinteză proteică în interiorul
membranei mitocondriale interne, în compartimentul cunoscut sub numele de matrixul
mitocondrial. Acest ADN codifică un subset de proteine esenţial pentru principalelor funcţii:
sinteza ATP prin fosforilare oxidativă. ADNmt este transcris de către ARN polimeraze care sunt
codificate de către ADN nuclear. Acestea sunt mult mai simple decât cele trei ARN polimeraze
eucariote care transcriu ADN nuclear şi chiar de către polimerazelor sistemelor bacteriene actuale.
ARN polimeraza mitocondrială de la S. cerevisiae constă într-o subunitate polipeptidică de
145 kDa cu activitate polimerazică şi un factor specific de 43 kDa esenţial pentru iniţierea
transcripţiei la situsurile de start ADNmt. ARN polimeraza mitocondrială purificată de la Xenopus
laevis are o structură similară. Subunitatea mare a ARN polimerazei mitocondriale de la drojdii
este clar înrudită cu ARN polimeraza monomeră din a bacteriofagului T7 şi din bacteriofagii
similari. Totuşi, enzima mitocondrială este distinctă funcţional de enzima din bacteriofagi în ceea
ce priveşte dependenţa sa de subunitatea mică pentru a iniţia transcripţia de al nivelul
178
situsului de start. Această subunitate mică este înrudită cu factorii sigma ai ARN polimerazelor
bacteriene care interacţionează cu promotorul ADN. Astfel, ARN polimerazele mitocondriale se
pare că sunt structuri hibride între ARN polimeraza simplă a bacteriofagilor şi ARN polimeraza
bacteriana posedând o complexitate intermediară.
Similar cu ARN polimeraza din bacteriofagi, secvenţele promotor recunoscute de către
ARN polimerazele mitocondriale includ situsul de start, o secvenţă promotoare bogată în care a
fost bine caracterizată la drojdii, plante şi animale. Genomul mitocondrial uman, circular conţine
două secvenţe promotoare înrudite de 15 pb, câte una pentru transcripţia fiedcărei catene. Fiecare
catenă este transcrisă în integritatea sa; primul transcript primer lungeste apoi procesat la molecule
de ARNm, ARNr şi ARNt. O proteină bazică de 22 kDa numită mtTF1, care se leagă imediat în
amonte de cei doi promotori mitocondriali, stimulează foarte mult transcripţia. O proteină omologă
găsită în mitocondriile de drojdie este necesară pentru menţinerea ADMmt şi are probabil o funcţie
similară.
Transcripţia ADN din cloroplaste se aseamănă cu transcripţia bacteriană ADN circular existent
în cloroplaste este considerabil mai mare decât ADNmt, variind între 120 la 160 kpb la diferite
plante. ARN polimeraza care transcrie ADN din cloroplasteeste codificată de către acest genom.
Enzima prezintă subunităţi care au o omologie considerabilă cu subunităţile alfa, beta şi gama ale
ARN polimerazei de la E. coli, dar aparent lipseşte subunitatea echivalentă factorului sigma de la
E. coli.
Unii promotori de la cloroplaste prezintă reminescenţe ale promotorului reconoscut de
subunitatea sigma de la E. coli, având secvenţe similare în regiunile – 10 şi –35. Totuşi, transcripţia
unor promotori depind de secvenţe situate în regiunile – 20 la +60, foarte diferiţi de majoritatea
promotorilor de la E. coli. Acest promotor poate fi recunoscut de o a doua ARN polimerază care
este cel mai adesea codificată de genomul nuclear şi important în organit. Analizele transcripţiei
din cloroplaste sunt destul de puţin dezvoltate, dar în acest moment este clar că cel puţin un sistem
de transcripţie prezintă o omologie ridicată cu transcripţia de la E. coli şi de la alte bacterii.
Transcripţia de la Archaea este mai apropiată de transcripţia de la eucariote decât de cea
de la bacterii
Archeobacterii constituie cea de a treia ramură în evoluţia oranismelor, alături de bacterii
şi eucariote. Analize genomice recente sugerează puternic că evoluţia ramurii bacteriilor din
strămăşul comun înainte de despărţirea archeobacteriilor şi eucariotelor dovedeşte că
archeobacteriile sunt mult mai apropiate de eucariote decât bacteriile.
Ca şi bacteriile, archeobacteriile au o singură ARN polimerază, dar aceasta conţine 13
subunităţi distincte (chiar 14 la unele), o complexitate echivalentă cu cea a ARN polimerazelor
eucariote. Secvenţa de aminoacizi dedusă pentru 7 subunităţi arată o semnificativă omologie cu
subunitpţile eucariote, incluzând pe cele două mai mari, care sunt comune la toate trei ARN
polimerazele nucleare. Totuşi, unele dintre subunităţile de la archeobacterii manifestă o
similaritate scăzută cu alte secvenţe ale subunităţilor de la bacterii sau de la eucariote.
 Deşi archoebacteriile, ca şi bacteriile, transcriu operoni în ARNm policistronic, promotorii
archeo sunt similari cu promotorii de la eucariote. O secvenţă promotoare consens bogată în A/T
este poziţionată la 26 pb în amonte faţă de situsul de start de la acrheobacterii. Ca şi promotorii
TATA box de la eucariote, inserţiile şi deleţiile din apropierea acestei secvenţe conduc la o pierdere
a situsului de
179
start pentru menţinerea spaţiului din amonte faţă de promotor. În plus, archeobacteriile conţin
factori de iniţiere cu o omologie înaltă cu TBP şi TFIIB. În consecinţă, mecanismul iniţierii
transcripţiei la archeobacterii este probabil similar cu cel de la eucariote. În concluzie, se cunoaşte
puţin privind modul în care este reglată transcripţia la acest grup fascinant de organisme.
SLIDE [Link] in vitro a complexului de inițiere a transcripției Pol I la drojdii UAR si
CF, factori transcripționali multimerici, se leagă la un element upstream (UE) și la elemental
core, din promotorul ADN. TBP și un factor monomeric (Rnr3p) asociat cu ARN polimeraza I
(Pol I) participă și el la formarea complexului de inițiere.. [Adapted from N. Nomura, 1998, in R.
M. Paule, Transcription of Ribosomal RNA Genes by Eukaryotic RNA Polymerase I, Landes
Bioscience, pp. 157–172.]
SLIDE 96. Elemente de control transcripțional transcrie de polimerazele ARN Atît genele pentru
ARNt, cât și pentru ARNr-5S, conțin elemente promotor interne (galben) localizate downstream
de situsul de start și denumite A-, B- și C-. Asamblarea complexului de trancripție la nivelul
acestor gene începe cu legarea factorilor de transcripție TFIIIA, TFIIIB și TFIIIC la Pol III, și
legarea complexului rezultat la elementele de control. Săgețile verzi indică interacții puternice,
secvența- specifice protein-ADN. Săgețile albastre indică interacții între factori de transcripție
generali. Săgețile mov indică interacții între factori generali de trascripție și Pol III.
[From L. Schramm and N. Hernandez, 2002, Genes Dev. 16:2593.]
SLIDE 97. Concluzii Iniţierea transcripţiei de către Pol I este dirijată de
către un element promotor “core”, care se suprapune cu situsul de start, şi o regiune de control
situată în amonte (UCE). Aceata necesită doi factori de transcripţie generali, SL1 şi UBF;
Iniţierea transcripţiei de către ARN polimeraza III este cel mai adesea dirijată de către
elemente promotoare interne. Doi factori generali de transcripţie sunt necesari pentru iniţierea
transcripţiei ARNt (TFIIIC şi TFIIIB); un factor suplimentar (TFIIIA) este necesar pentru iniţierea
transcripţiei genelor ARNr 5S;
Iniţierea transcripţiei de către toate cele trei ARN polimeraze nucleare eucariote necesită
un factor de transcripţie specific general care conţine TBP ca subunitate;
Iniţierea de către Pol I şi Pol III nu necesită ATP spre deosebire de iniţierea realizată de
Pol II care depinde de hidroliza ATP;
Bacteriofagul T7 şi bacteriofagii înrudiţi exprimă o ARN polimerază monomeră simplă.
Aceste polimeraze recunosc o regiune promotoare de 23 pb care include situsul de start;
Mitocondria conţine molecule circulare de ADN transcrise de către o ARN polimerază
codificată nuclear compusă din două subunităţi. O subunitate este omologă cu ARN polimeraza
simplă din bacteriofagul T7; cealaltă se aseamănă cu factorii bacterieni sigma;
Cloroplastele conţin ADN care este transcris de către o ARN polimerază codificată de
cloroplast omologă cu ARN polimerazele bacteriane, cu excepţia că aceasta este lipsită de factorul
sigma;
180
 Archeobacteriile utilizează o ARN polimerază formată din mai multe subunităţi care se
aseamănă cu ARN polimerazele eucariote nucleare. Iniţierea transcripţiei în celulele de
archeobacterii necesită o proteină, omologă cu factorul eucariotic TBP, care se leagă la un element
promotor bogat în A/T situat imediat în amonte faţă de situsul de start şi o proteină omologă cu
TFIIB. Aceste rezultate susţin ipoteza că eucariotele şi acheobacteriile actuale au evoluat dintr-un
strămoş comun.
NOTE DE CURS BM4
PROCESAREA ARN, TRANSPORT NUCLEAR ŞI CONTROL POST-
TRANSCRIPŢIONAL
Slide [Link] ARN de către ARN polimeraza Figura: Elongarea catenei ARN
de către ARN polimerază
În regiunea care va fi transcrisă, dublul helix este deschis (desfăcut) cu aproximativ un tur
pentru a permite catenei sens să formeze un scurt segment hibrid ADN/ARN dublu catenar cu
capătul 3’ ARN. Cu cât ARN polimeraza avansează de-a lungul matriţei ADN (în dreapta), ADN
este derulat în faţa furcii de transcripţie în deplasare şi re-rulat în spatele acestuia, eliberând astfel
ARN nou sintetizat de catena matriţă (antisens).
a) O cale poate să fie urmată este aceea în care ARN polimeraza urmează deplasarea catenei
matriţă astfel încât transcriptul va rămâne ataşat la nivelul elicei duplexului;
b) O a doua posibilitate, mult mai plauzibilă, este aceea că ARN se deplasează în linie dreaptă
o dată ce ADN se roteşte dedesubtul său. În acest caz ARN nu se va răsuci în jurul ADN dar ADN
va rămâne suprarăsucit în faţa sa (luaţi în considerare plasarea degetului între catrenele de ADN
răsucit ăn acest model şi înpingând către dreapta). Modelul presupune că capetele ADN ca şi ARN
polimeraza sunt protejate de ataşamente în interiorul celulei.
Silde [Link]ţia a două gene ribozomale contigue la E. coli Figura: O micrografie
electronică şi o reprezentare schematică care prezintă două gene supuse transcripţiei la E. coli.
Săgeţile structurale rezultate o dată cu creşterea lungimii lanţurilor de ARN în formare in
timp ce moleculele de ARN polimeraza responsabile de sinteza se deplasează de la situsul de
iniţiere a transcripţiei către situsul de terminare din structura ADN.
Silde 4. Micografie electronică a transcripţiei şi translaţiei simultane la E. coli Figura:
Micrografie electronică şi reprezentare schematică a realizării simultane a transcripţiei şi
translaţiei unei gene de la E. Coli.
181
 Moleculele de ARN polimeraza transcriu ADN de la dreapta la stânga în timp ce
ribozomii traduc moleculele de ARN în formare.
Silde 5. Legarea actinomicinei D la duplexul ADN Figura: Structura determinată
prin analize cu raze X a complexului format de actinomicina D şi duplexul ADN la nivelul unei
secvenţe complementare d(GAAGCTTC).
Complexul este redat sub forma unui model cu bile în care structura catenei fosfat este
prezentată în galben, bazele în alb şi actinomicina D este colorată în funcţie de tipurile de atomi:
C în verde, N în albastru şi O în roşu. Cele două molecule de ADN cu simetrie înrudită sunt
prezentate vertical pentru a forma un pseudo-continuu helix. Actinomicina D se leagă la nivelu
fosei mari a ADN. Actinomicina D este un agent antineoplazic (anticancer) care este produs de
către Streptomyces antibioticus, inhibă puternic transcripţia şi replicarea ADN probabil prin
interferenţă cu trecerea ARN şi ADN polimerazei.
Silde 6. Terminarea Transcripţiei ➢ Există mai multe mecanisme care reglează terminarea
transcripţiei la
bacterii şi celule eucariote ➢ La bacterii principalele mecanisme implică ARN
polimeraza, unul dintre
mecanisme necesitând şi factorul de terminare Rho ➢ La eucariote, mecanismele
pentru terminarea transcripţiei diferă pentru
cele trei tipuri de ARN polimeraze Terminarea transcripţiei ADNr
Deoarece transcripţii pre-ARNr se termină în apropierea (proximitatea) sau exact la
extremitatea 3’ a secvenţei ARNr 28S, s-a crezut mai întâi că această regiune conţinea un teminator
recunoscut de ARN polimeraza I. Experienţele ulterioare au demonstrat că transcripţia, in vitro, a
genelor care codifică ARNr continuă dincolo de extremitatea 3’ a ARNr 28S matur. La Xenopus,
transcripţia se realizează dincolo de regiunea care conţine separatorul intragenic, şi se termină la
aproximativ 200 pb în amont de inima promotorului pre-ARNr 35S următor; o clivare
endonucleotidică realizată dincolo de extremitatea ARNr 28S formează extremitatea 3’. La drojdii,
transcripţii care încep la nivelul inimii promotorului, se termină la nivelul separatorului intergenic,
dincolo de ARNr 5S şi la 300 pb în amont de începerea secvenţei pre-ARNr următor.
La ADNr de şoarece, terminarea transcripţiei are loc între 550 şi 600 pb dincolo de
extremitatea 3’ a ADNr 28S. Semnalul de terminare a acestui sistem este o secvenţă foarte
conservată poziţionată pe catena sens (5’- AGGTCGACCAATTANTCCG-3’numită cutia SalI) şi
precedată, în general, de unul sau mai multe grupe de pirimidine bogate în timină (T). Se găsesc 8
grupe de acest tip între perechile de baze 500 şi 1 200 plecând de la extremitatea 3’ a ADNr 28S,
dar în general terminarea se realizează în grupul T care precede cutia Sal I. Secvenţa conservată
de 18 pb poate ea însăţi să determine terminarea, dar aceasta este mai eficientă şi mai precisă când
cele 18 pb sunt precedate şi urmate de grupuri (fragmente) bogate în T. Deleţii mici şi inserţii sau
numai schimbarea unor perechi de baze la nivelul segmentului de 18 pb, la fel ca şi inversarea sa,
duc la pierderea activităţii sale de terminator. Se consideră că un aranjament destul de asemănător
de secvenţe repetitive conservate (5’- GGGTTGACCA-3’) furnizează probabil semnalul de
terminare a pre-ARNr la om. Secvenţe repetitive conservate (5’-GACTTGC-3’ precedate de
grupări de T) există în separatorii intergenici de la Xenopus, terminarea
182
realizându-se cel mai adesea la nivelul secvenţei repetitive care precede promotorul situat la
extremitatea 3’ a regiunii separatoare.
Există argumente indirecte care sugerează că terminarea la nivelul acestor situsuri depinde
de fixarea unor proteine pe aceste situsuri specifice. Aceste indicaţii au fost confirmate prin
demonstraţia că unul sau mai mulţi factori proteici din extractul nuclear se fixează de secvenţa de
18 pb. În acest caz, fixarea proteinei la secvenţa de terminare a fost evidenţiată de protecţia faţă de
digestie cu endonuclează III a unui fragment marcat la 5’ şi care conţinea acest semnal. Principiul
acestei experienţe este că digestia enzimatică a unui segment este oprită de proteina legată. Trebuie
să ne amintim că endonucleaza III digeră ADN bicatenar pornind de la extremităţile 3’. În aceste
condiţii vor rezulta fibre marcate în 5’, care vor avea lungimea determinată de locul în care digestia
a fost blocată de proteina legată. Cum fiecare catenă poate fi marcată independent la capătul său
5’, se vor putea determina cele două limite ale secvenţei blocate. În figura 8.18 este redat
experimentul realizat cu două segmente care conţineau secvenţe de terminare probabile (cutiile Sal
I şi secvenţele vecine cuprinse între 583 şi 685 în aval de extremitatea 3’ a ADNr 28S). Se constată
că profilul fragmentelor obţinute în urma digestiei cu exonucleaza III este alterat de o incubare
prealabilă în prezenţa unui extract nuclear. Alterarea profilului de digestie indică că o proteină (sau
proteine) se leagă la secvenţa cutiei Sal I. Modificări la nivelul secvenţei cutiei Sal I sau
modificarea distanţelor între cele două secvenţe mai conservate împiedică legarea şi afectează
terminarea. În plus, dacă un oligonucleotid corespunzător secvenţei consens a cutiei Sal I, este
introdus într-o unitate de transcripţie a ARN polimerazei I, acesta favorizează, in vitro, terminarea
transcripţiei. Proteina care se leagă la cutia Sal I a fost purificată şi mecanismul său de acţiune
cunoscut (este în curs de desluşire).
Cuplarea terminării şi iniţierii transcripţiei
O caracteristică originală a secvenţelor de terminare este că acestea sunt adese situate
imediat în amont de promotorii gene care codifică pentru ARNr următor. Astfel de secvenţe de
terminare au fost detectate la aproximativ - 170 pb în raport cu demararea transcripţiei ADNr de
la şoarece, la - 185 în amont de regiunea control a ADNr de la om şi la - 200 în amont de regiunea
control a ADNr de Xenopus. O curiozitate o reprezintă faptul că eliminarea sau modificarea acestor
secvenţe de terminare provoacă o reducere marcantă a transcripţiei care demarează la poziţia + 1
a nucleului promotor următor. Iniţial, s-a presupus că un factor de terminare putea să reacţioneze
cu un factor de iniţiere sau cu ARN polimeraza I, sau că activarea putea fi rezultatul localizării
favorabile a enzimei la nivelul unor situsuri de juxtapunere apropiate promotorului ADNr. O altă
explicaţie este că terminarea împiedică polimerazele ocupate cu transcrierea să se rupă complet de
complexele de transcripţie care sunt asamblate în imediata vecinătate a următorului promotor.
Numeroase întrebări s-au pus privind transcripţia genelor de ARNr, în particular în ceea ce
priveşte coordonarea expresiei acestor gene care codifică pentru ARNr, ARNr 5S şi proteinele
ribozomale. Implicaţiile mecanice şi reglatoare ale prezenţei elementelor promotoare, activatoare
şi de terminare într-o regiune considerată înainte ca silenţioasă sunt de-a dreptul tulburătoare.
Aceste descoperiri pun de asemenea problema cunoaşterii modalităţilor de coordonare a terminării
şi iniţierii transcripţiei şi a proprietăţilor expresiei genelor din clasele II şi III. Din punct de vedere
biochimic este importantă izolarea şi caracterizarea factorilor de transcripţie şi de terminare astfel
încât să fie posibilă descifrarea completă a modului de acţiune a acestora pe baze moleculare.
Terminarea transcripţiei de către ARN polimeraza III
183
 Dacă iniţierea transcripţiei de către ARN polimeraza III necesită secvenţe de reglare
complexe şi mai multe proteine, terminarea nu necesită decât enzima şi un grup de resturi
dezoxiadenilate la nivelul matricei. Terminarea este realizată perfect in vitro cu o ARN polimerază
III înalt purificată şi cu o matrice de ADN duplex. O terminare corectă şi eficace se realizează
chiar pentru genele din clasa III lipsite de RCI, eliminând astfel ipoteza că asocierea matriţei cu
TFIII A, B sau C pot juca un rol în procesul de terminare. Au fost utilizate matriţe de transcripţie
formate din ADN clonat special pentru a încerca definirea semnalului de terminare. Aceste
experienţe au demonstrat că terminarea depinde de existenţa unui număr de resturi dezoxiadenilate
grupate pe catenele matricei şi de secvenţele situate de o parte şi de alta a acestui grup. De exemplu,
patru dezoxiadenozine înconjurate de dezoxitimidină nu determină terminarea eficace dar patru
dezoxiadenozine flancate de o parte de CG şi de cealaltă parte de GC (5’-GCAAAACG-3’), ca în
ADNr 5S din celulele somatice de Xenopus borealis, sunt un semnal de terminare eficace.
Mutaţiile care modifică numărul de resturi adenilate reduc eficacitatea terminării. Sinteza ARN se
opreşte la nivelul unui rest uridilat complementar unei adenine din grup. În acest caz nu par să
existe influenţe asupra terminării nici din partea unor secvenţe depărtate şi nici a unor secvenţe
secundare. Dacă extremitatea 3’ a ADNr 5S este eliminată din gena clonată, transcripţia este
continuată până când polimeraza III întâlneşte un semnal adecvat în secvenţa flancantă a
vectorului. Dacă o serie de dezoxiadenozine este inserată la un situs incorect din structura matricei
unei gene din clasa III, terminarea se realizează adesea la acest situs modificat.
Silde 7. Secvenţa ipotetică de baze care formează un terminator eficient la E. coli Figura:
Secvenţa de bază a unui element ipotetic puternic (eficient) a terminatorului de la E. Coli dedusă
din secvenţa mai multor transcripţi.
a) Secvenţa ADN împreună cu ARN-ul său corespunzător. Secvenţele bogate în A-T şi G-C
sunt prezentate în albastru şi roşu. Axa de simetria de pliere evidenţiază segmentele care flankează
segmentele care formează o repetiţie inversă.
b) Structura su formă de “ac de păr” şi coada poli A care dirijează terminarea transcripţiei.
Silde 8. Terminarea Rho-independentă apare la nivelul unor secvenţe
caracteristice ale ADN din E. coli Figura: Secvenţa de terminare a operonului
triptofanului trp, un situs independent Rho.
Operonul triptofan, compus din cinci gene (în albastru), este urmat de o secvenţă de 36 pb
la capătul căreia apare terminarea. Capătul 3’ al ARNm corespunzător la care apare terminarea.
Capătul 3’ al ARNm corespunzător prezintă o structură sub formă de buclă bogată în GC care
precede ultimile patru resturi U, o trăsătură caracteristică a ARNm produs de gene cu situsuri de
terminare Rho independente. În general, situsurile de terminare bacteriene apar între operoni dar
nu între gene din interiorul unui operon. Din acest motiv, genele din interiorul unui operon pot fi
reglate coordonat, în timp ce cele din diferiţi operoni sunt reglate independent
Silde 9. Terminarea prematură prin atenuare ajută la reglarea expresiei unor
operoni bacterieni
184
Figura: Atenuarea furnizează un mecanism secundar de control a expresiei operonului Trp
Secvenţa Leader (L), care este localizată între operator (O) şi prima genă structurală (E).
Conţine un situs atenuator (banda roşie) la care transcripţia este terminată în funcţie de concentraţia
citosolică a triptofanului. Regiunea promotor- operator-leader, care are o lungime de aproximativ
200 pb, nu este reprezentată la scară cu genele structurale. AUG indică codonii start pentru
translocarea secvenţei leader (roşu) şi aARNm pentru trpE (negru).
Silde 10. Mecanismul de atenuare pentru transcripţia operonului trp Figura:
Mecanismul de atenuare a transcripţiei operonului trp.
a) Diagrama celor 140 nucleotide ale ARN trp leader. Patru regiuni prezentate în culori pot
forma structuri sub formă de buclă alternative, numai una dintre acestea putând duce la atenuare.
b) Translaţia secvenţei trp leader începe de la capătul 5’ imediat după ce acesta este sintetizat, în
timp ce este realizată sinteza restului moleculei ARNm trp. La concentraţii crescute de trp,
formarea buclei stem 3-4 urmată de o serie de resturi U în 3’ determină terminarea printr-un
mecanism Rho-independent. La concentraţii scăzute de Trp, regiunea 3’ este sechestrată în bucla
stem 2-3 şi nu se poate împerechea cu regiunea 4. În absenţa structurii sub formă de buclă
necesară pentru terminare, transcripţia secvenţelor care codifică trp continuă.
Silde 11. Siturile pentru terminarea Rho dependentă sunt prezente în unele gene
ale fagului λ şi ale E. coli ➢ Factorul Rho factor este o proteină hexameră
dispusă de-a lungul unui
segment de 70 – 80 baze al transcriptului ARN în formare ➢ Rho alunecă apoi de-a lungul
ARN în direcţia 3′ până când acestă desface
hibridul ARN-ADN de la nivelul situsului activ al ARN polimerazei ➢ Dacă transcripţia este
terminată sau dacă nu depinde de factorul Rho, acesta se
eliberează de pe ARN polimerază ➢ Siturile Rho dependente nu posedă secvenţe consens
clare şi mecanismul de
terminare Rho dependent este caracteristic numai câtorva operoni
Silde 12. Cele 3 ARN polimerazele folosesc diferite mecanisme de terminare ➢ ARN polimeraza
I realizează terminarea printr-un mecanism care necesită factori specifici de terminare care se
leagă în aval de unitatea de transcripţie ➢ ARN polimeraza II conţine semnalul de terminare la
nivelul unei regiuni de 0.5-2 kb aparţinând situsului de adăugare a cozii poli(A), iar terminarea
este cuplată cu procesul care clivează şi poliadenilează capătul 3′ al transcriptului ➢ Transcripţia
realizată de către ARN polimeraza III este terminată după
adăugarea unei serii de resturi U Deşi se cunoaşte foarte puţin despre terminarea transcripţiei
la eucariote comparativ cu bacteriile, câteva trăsături de bază şi similitudinile lor cu aceasta dar
şi diferenţele faţă de terminarea de la bacterii este înţeleasă.
Transcripţia genelor pre-ARNr de către ARN polimeraza I este terminată printr-un mecanism
care necesită un factor de terminare specific polimerazei. Această proteină de legare la ADN se
poziuţionează în aval de unitatea de transcripţie, diferit de modul
185
de legare a factorului Rho de la E. coli, care este un factor de terminare care se leagă la ARN.
ARN polimeraza III purificată realizează terminarea după polimerizarea unei serii de U;
spre deosebire de terminarea Rho independentă de la bacterii, totuşi, terminarea realizată de ARN
polimeraza III nu necesită o structură secundară sub formă de buclă stem situată în amonte în
structura transcriptului ARN.
La majoritatea genelor de mamifere care codifică pentru proteine, ARN polimeraza II poate
termina la situsuri multiple localizate la nivelul unei regiuni de 0,5-2 kb aparţinând situsului de
agăugare a cozii poli(A). Experimentele cu gene mutante demonstrează că terminarea cu procesul
care clivează şi poliadenilează transcriptul ARNm în formare la nivelul unor secvenţe specifice
asociate cu domeniul fosforilat carboxil terminal (elementele/domeniul CTD) ale ARN
polimerazei după iniţiere. Acest complex de clivare/poliadenilare poate suprima terminarea cât
timp secvenţa care semnalizează scindarea şi poliadenilarea este transcrisă de către polimerază.
Studii pe mutanţii de drojdii indică că scindarea transcriptului în formare, mai mult decât
poliadenilarea, reprezintă un eveniment critic care semnalează ARN polimerazei să termine.
Aşa cum am discutat anterior terminarea transcripţiei la bacterii poate fi reglată prin
atenuare şi prin mecanisme de antiterminare. Mecanisme analoge de control, care implică o decizie
între elongarea catenei şi terminare apar la unele gene transcrise de către ARN polimeraza II
Silde 13. Secvenţe la nivelul cărora ARN polimeraza III termină transcripţia
Silde 14. Transcripţia genomului virusului HIV este reglată printr-un mecanism de antiterminare
Figura: Complexul de antiterminare compus din proteina HIV tat şi multe proteine celulare
eucariote
Elementul TAR al transcriptului HIV conţine secvenţe recunoscute de către Tat şi
proteina celulară ciclina T. Ciclina T activează şi ajută poziţionarea Cdk9, o protein kinază,
lângă substratul său, domeniul CTD al ARN polimerazei II. Transcripţia virusului HIV este
reglată printr-un mecanism de antiterminare
Curent, transcripţia genomului virusului imunodeficienţei (HIV) de către ARN polimeraza
II furnizează cel mai bine înţeles exemplu de reglare a terminării transcripţiei la eucariote.
Exprimarea eficientă a genelor HIV necesită a mică proteină virală codificată de locusul tat.
Celulele infectate cu mutanţi tat- produc transcripţi virali scurţi care hibridizează cu fragmente de
restricţie care conţin regiuniule proximale promotorului ADN HIV dar nu şi cu fragmentele de
restricţie poziţionate mai departe în aval faţă de promotor. În contrast, celulele infectate cu tipul
sălbatic HIV sintetizează transcripţi lungi care hibridizează cu fragmente de restricţie
corespunzătoare întregii şi singurei unităţi de transcripţie HIV. Astfel, proteina tat funcţionează ca
un factor antiterminator, care permite ARN polimerazei II să citească de-a lungul unui bloc
transcripţional, mai mult decât proteina N a fagului lambda. Deoarece mecanismul de
antiterminare coordonat de proteina tat este necesar pentru replicarea HIV, înţelegerea în viitoar a
acestui mecanism de control poate oferi posibilităţi de determinare efectivă a unor terapii pentru
rezolvarea sindromului de imunodeficientă dobândită (AIDS, Acquired immunodeficiency
sindrom)
186
 Asemeni proteinei N, proteina Tat este o proteină care se leagă la o secvenţă specifică din
structura ARN. Ea se leagă la o copie ARN a unei secvenţe numite TAR, care este localizată lângă
capătul 5’ al transcriptului HIV. Caţi secvenţa mut din transcripţii lambda, TAR conţine două
situsuri de legare: unul care interacţionează cu Tat şi unul care interacţionează cu o proteină
celulară numită ciclina T. Structurile secundare ale mut şi TAR, inclus amândouă o buclă stem,
sunt analoge şi trebuie să fie intacte pentru ca să se producă legarea proteinei. Mai mult, domeniul
de legare la ARN al Tat, ca şi cel al proteinei N, conţine o regiune bogată în arginină.
Asa cum putem vedea în figură, proteina Tat a virusului HIV şi ciclina T celulară se leaga
cooperativ la ARN TAR. Interacţia ciclinei T cu o protein kinază numită Cdks9 activează kinaza,
al cărei substrat este domeniul CTD al ARN polimerazei II. (Ciclinele sunt familii de proteine
omologe care se leagă şi reglează kinazele dependente de cicline, sau Cdk. Funcţia importantă a
ciclinelor şi a moleculelor Cdk este reglarea diviziunii celulare).
Studiile de transcripţie in vitro folosind inhibitori specifici ai Cdk9 sugerează că moleculele
de ARN polimerază II care iniţiază transcripţia la nivelul promotorului HIV termină după
transcrierea a aproximativ 50 de baze, numai dacă CTD este hiperfosforilată de Cdk9. Legarea
cooperativă a ciclinei T şi a Tat la secvenţa TAR la capătul 5’ al transcriptului HIV poziţionează
Cdk9 astfel încât aceasta poate fosforila domeniul CTD, prevenind astfel terminarea şi permitând
polimerazei să conţinue elongarea lanţului.
De remarcat că, Spt5 una dintre proteinele complexului ciclinei T-Cdk9, posedă o regiune
a sec<venţei de aminoacizi omologă cu NusG, una dintre proteinele implicate în procesul de
antiterminare dirijat de proteina N al bacteriofagului lambda. Această omologie sugerează că
aceste similitudini în medcanismul de reglare a elongării de la bacterii la animale.
Silde 15. Procesarea ARNm de la eucariote Figura: Schemă generală a
procesării ARNm la eucariote
La puţin timp după iniţierea transcripţiei de către ARN polimeraza II la primul nucleotid
al primului exon al unei gene, la capătul 5 al moleculei ARN în formare se adugă 7-metilguanină:
Transcripţia realizată de către ARN polimeraza II se termină la unul sau mai multe situsuri de
terminare situate în aval de situsul poli(A), care este localizat la capătul 3’ al exonului final. După
ce transcriptul primar este scindat la nivelul situsului poli(A), se adaugă o prelungire formată din
A. Coada poli(A) conţine aproximativ 250 resturi la mamifere, 150 la insecte şi 100 la drojdii.
Pentru transcripţii primari cu puţini introni, poliadenilarea, clivarea şi splicingul urmează de obicei
terminarea. Pentru genele mari, cu un numar mare de introni, intronii sunt adesea înlăturaţi din
pre-ARNm în formare înainte ca transcripţia genei să fie completă. De reţinut că “capişonul”
rămâne în moleculele de ARNm mature.
Informatii suplimentare Terminarea transcripţiei şi poliadenilarea
Transcripţia a numeroase gene eucariote se continuă dincolo de locul în care ARN este
clivat pentru a se forma extremitatea 3’ a ARNm matur. Terminarea are loc la situsuri diferite care
se întind pe sute sau chiar mii de perechi de baze ADN. Astfel, regiunea în care se opreşte
transcripţia β-globinei la vertebrate este situată la mai mult de 1 kpb de situsul de poliadenilare.
La fel, transcripţia primelor două gene în tandem ale α-globulinei de la mamifere se opreşte în
regiunea de separare de aproximativ 2
187
kpb care separă cele două gene. Un exemplu şi mai frapant este furnizat de transcripţia regiunii
tardive a adenovirusurilor. În acest caz, transcripţia continuă dincolo de cele cinci situsuri de
poliadenilare înainte de a se termina la capătul ADN viral.
Din contră, anumite gene eucariote par să aibă un semnal autentic semnal de terminare a
transcripţiei. De exemplu, în gena gastrinei umane, semnalul de terminare este situat la 193 pb în
aval de situsul de poliadenilare. Această secvenţă, care dictează terminarea transcripţiei, atât in
vivo cât şi in vitro, este un segment bogat în T, 5’-T9A2T5AT4AT4AT5-3’. Transcripţia unui
ADN care posedă această secvenţă undeva de-a lungul secvenţei sale se termină exact în 5’ de
acest semnal. O secvenţă similară, dar cu câteva diferenţe, este prezentă în amont şi în aval la mai
multe gene de vertebrate. Acest semnal care se presupune a fi de terminare şi anumite secvenţe
bogate în T din genele de drojdii, 5’-CAATCTTG-3’ şi 5’- T5ATA-3’, amintesc semnalele de
terminare dependente de ρ dependente de la E. coli.
Independent de prezenţa semnalelor specifice de terminare, transcripţia depăşeşte aproape
întotdeauna situsurile de poliadenilare. În consecinţă, extremităţile 3’ poliadenilate trebuie să fie
create prin clivare endonucleotidică urmată de polimerizarea de resturi adenilate la nivelul
hidroxilului 3’ astfel format. Pentru determinarea situsului de clivare sunt necesare două secvenţe
situate la distanţă mică. Una dintre acestea cvasi-invariantă, AATAAA, este localizată între 10 şi
30 pb în amont de un nucleotid CA în apropierea situsului de clivare-poliadenilare. Înlocuirea lui
T cu G în AATAAA reduce puternic eficacitatea poliadenilării dar cele câteva extremităţi formate
sunt poliadenilate. Înlocuirea ultimului A din secvenţă cu G la capătul primei gene din tandemul
celor două care codifică pentru α-globulinei reduce producerea normală a α-globulinei. Această
experienţă, la fel ca şi altele, indică necesitatea absolută a secvenţei AATAAA. Totuşi, deoarece
secvenţa AATAAA există şi în regiunea codantă a numeroase gene, unde nu există poliadenilare,
este evident necesară o a două secvenţă pentru a provoca reacţiile de clivare şi de poliadenilare.
Localizarea acestui semnal a fost studiată examinând efectul deleţiilor situate în vecinătatea
situsului de poliadenilare. Experienţele demonstrează că secvenţa şi poziţia precisă a acestui
semnal variază de la o genă la alta. În numeroase gene de vertebrate semnalul cel mai probabil este
un segment bogat în GT sau T, 5’- YGTGTGYY (Y fiind o pirimidină), situat cam la 25 pb în aval
de situsul de poliadenilare şi adesea urmat la o distanţă variabilă de o scurtă secvenţă de T.
În anumite circumstanţe situsurile autentice de poliadenilare pot să nu fie efective. În
maturarea ARNm tardiv al adenovirusului de tip 2, un singur situs de poliadenilare din cinci
potenţiale este utilizat pentru producerea fiecăruia din transcripţii primari. Abundenţa relativă a
celor cinci clase de ARNm tardiv la adenovirus reflectă, în parte, frecvenţa cu care transcriptul
primar este clivat şi poliadenilat la unul din situsurile sale caracteristice. În acest caz, abundenţa
relativă a moleculelor de ARNm produse plecând de la transcriptul primar de modifică în cursul
infecţiei, indicând că alegerea situsului de poliadenilare este controlată. Un al doilea exemplu este
cel de trecere de la producerea formei membranare la cea a formei secretate în cazul
imunoglobulinelor. Aceste două forme diferă printr-o regiune a lanţurilor lor grele. În acest caz
poliadenilarea pre-ARNm la prima pereche de semnale, cea care este folosită pentru formarea
ARNm care codifică forma secretată, este suprimată; molecula de ARNm este tăiată la semnalul
următor producând un pre- ARNm care poate fi maturat pentru a da naştere ARNm care codifică
forma membranară. Deci, trecerea de la forma membranară la forma secretată rezultă din
188
utilizarea reglării diferenţiale a reacţiei de poliadenilare. Fenomenul şi modalităţile sale de
control nu sunt deplin elucidate.
Secvenţa AATAAA a fost implicată şi în terminarea transcripţiei. Această secvenţă situată
la extremitatea 3’ a secvenţei codante a β-globinei majore de şoarece este necesară pentru
terminarea care se realizează la o distanţă de 1,5 kb. În plus, aceleaşi deleţii şi modificări care
blochează poliadenilarea corectă reduc şi eficacitatea cu care se realizează terminarea în aval.
Aceasta sugerează că recunoaşterea situsului de poliadenilare trebuie să se realizeze înainte de
terminarea transcripţiei la secvenţa adecvată situată în aval. Ipoteza prin care consideră că
complexul de transcripţie nu achiziţionează capacitatea de a realiza terminarea transcripţiei decât
după cea realizat transcrierea semnalului de poliadenilare constituie o modalitate interesantă de a
asocia poliadenilarea şi terminarea. Ea poate fi valabilă în cazul în care complexul de transcripţie
ar conţine un factor care ar putea împiedica terminările inoportune în timpul transcripţiei matricei
şi l-ar pierde pe acesta la trecerea peste semnalul de poliadenilare. Dacă lucrurile s-ar petrece astfel,
complexul de transcripţie lipsit de acest factor s-ar putea desprinde de matrice la nivelul secvenţei
bogate în T pe care o întâlneşte în continuare. Acest model este urmarea studiilor realizate in vitro
cu ARN polimerază II purificată, care demonstrează că transcripţia mai multor tipuri de matrice
ADN se termină frecvent la nivelul secvenţelor bogate în T prezente în genă. Este posibil ca
clivarea transcriptului la semnalul de poliadenilare să permită unei ARN nucleaze sau unei proteine
de tip ρ să se fixeze la polimerază şi să inducă terminarea la nivelul secvenţei bogate în T prezentă
în aval.
Clivarea şi poliadenilarea se pot realiza în diferite tipuri de extracte celulare singura
condiţie fiind ca acestea să posede moleculele ARN substrat purtătoare de semnale adecvate.
Studiile realizate in vitro cu astfel de sisteme au clarificat diferite aspecte ale acestor reacţii. Astfel,
clivarea şi poliadenilarea se pot realiza independent una de cealaltă. În prezenţa unor analogi ai
ATP (ex. cordicepina, care este 3’ dezoxiadenozin trifosfat), tăierea (ruperea) se realizează la
situsul exact dar nu este urmată de poliadenilare. Poliadenilarea se poate realiza la nivelul
radicalului oxidril din 3’ terminală care este precedată de o secvenţă AAUAA. Fracţionarea unui
extract de celule Hela care au capacitate de clivare şi de poliadenilare a unui substrat ARN
furnizează multe fracţii proteice care, împreună, catalizează aceste două reacţii. Una dintre
componente este o poli A polimerază, o altă fracţie conţine una sau mai multe particule
ribonucleoproteice nucleare mici (snRNP) şi cea de a treia este o proteină (64 kD) care se leagă la
o regiune care conţine secvenţa AAUAAA. Aceşti trei factori sunt necesari pentru a asigura
cuplarea clivării cu poliadenilarea, în condiţiile în care singură, poli A polimeraza poate realiza
poliadenilarea unei catene de ARN clivată corect. Cu toate că mecanismul nu este pe deplin
elucidat se poate considera că snRNP U11 împreună cu proteina 64 kD şi probabil cu alte snRNP
pot forma un complex în imediata vecinătate a secvenţei AAUAAA care asigură clivarea ARN şi
permit o poliadenilare corespunzătoare. Implicarea snRNP se bazează pe descoperirea unor
fragmente care conţin secvenţa AAUAAA în imunoprecipitalelor obţinute cu anticorpi anti snRNP
şi pe inhibarea poliadenilării, in vitro, realizată de aceşti anticorpi. Rolul snRNP în poliadenilare
este coerent în maturarea ARN: U7 snRNP este implicată în crearea extremităţilor 3’ ale ARNm
de histone, U3 snRNP în producerea extremităţii corecte a ARNr 28S şi U1, U2, U5 ŞI U4/U6 în
maturarea pre-ARNm. Cum genelor de la drojdii şi probabil de la celelalte eucariote inferioare le
lipsesc semnalul canonic de poliadenilare, AAUAAA, formarea cozii poli A poate fi cuplată cu
terminarea transcrierii. Secvenţe ca 5’-T5ATAT, care favorizează
189
terminarea, pot fi utile în crearea extremităţii 3’ necesare poliadenilării. Formarea extremităţii 3’
poate fi şi rezultatul clivării endonucleotidice a unui trancript mai lung urmată de poliadenilarea
realizată de poli A polimeraza. Nu s-a stabilit încă dacă la drojdii intervin snRNP.
Silde 16. *Procesarea post-transcripţională. Formarea “coifului” ARNm de la eucariote Figura:
Structura “capului” la ARNm eucariot. Acesta este prezentat drept cap 0, cap 1 sau cap 3 dacă nu
prezintă alte modificări ulterioare în funcţie de poziţia de metilare a nucleozidului (în O2’), sau
dacă primele două nucleozide sunt O2’ metilate.
Informatii suplimentare
Coiful În afară de o excepţie cunoscută (ARNm de la picornavirus) toate moleculele de ARNm
de la eucariote, celulare şi virale, posedă un coif la extremitatea 5’. Coifurile transcripţilor
nucleari şi citoplasmatici ai polimerazei II sunt asociate cu proteine care se leagă specific. Pentru
moment rolurile acestor proteine şi ale coifului nu sunt deplin clarificate. S-a stabilit totuşi că
coiful interacţionează specific cu factorii de iniţiere în asamblarea complexului de traducere.
Formarea coifului la extremitatea 5’ a transcripţilor polimerazei II are loc imediat după
iniţiere; chiar şi moleculele de ARN cele mai scurte posedă acest coif. Unul dintre substratele
enzimei care realizează adăugarea coifului (guanil transferaza) este GTP; celălalt este extremitatea
difosfat creată prin eliminarea fosfatului terminal al trifosfatului primului nucleotid al ARN în
formare. În reacţia de adăugare a coifului, fosfatul terminal al pre-ARNm este înlocuit cu gruparea
guanil a GTP cu pierderea a doi fosfaţi terminali din GTP. Nu se poate realiza reacţia dacă pre-
ARNm nu posedă decât un monofosfat 5’ terminal. Astfel coifurile marchează primul nucleotid la
nivelul căruia începe transcripţia. Restul de guanidină adăugat este metilat în poziţia 7 a ciclului
purinei de către guanin-7-metil transferaza; radicalii hidroxil 2’ ai primelor două nucleotide sunt
apoi metilaţi de către 2’-O-metil transferaza. Gruparea 7-metil-GTP nu poate constitui substrat
pentru reacţia de adăugare a coifului. Moleculelor ARN U sunt li se adaugă coiful în acelaşi mod;
dar în aceste caz metilările ulterioare furnizează 2, 2’ -7-trimetil guanozina la fel ca şi substituenţii
2’-O-metil prezenţi la primele nucleotide ale transcriptului. Deoarece moleculelor de pre-ARNm
formate în extractul celular, sau cu ARN polimerază II purificată li se adaugă coiful corect,
activităţile enzimatice responsabile sunt probabil asociate polimerazei. Reacţiile de iniţiere ale
procesului de adăugare a coifului realizate de către polimeraza II sunt probabil cuplate obligatoriu
deoarece transcripţii nucleari formaţi de către ARN polimeraza III, care posedă o extremitate
trifosfat (ex. ARN U6, ARNr 5S şi pre-ARNt), nu suferă procesul de adăugare a coifului. Ne
întrebăm care sunt parametrii care determină diferitele tipuri de coifuri ale pre-ARNm şi pre-ARN
U.
Rolul coifurilor în timpul transcripţiei şi maturării transcripţilor primari în ARNm nu este
clar. De exemplu, rezultatele obţinute privind implicarea coifului în maturare sunt contradictorii.
Este posibil ca coiful să aibă un rol în formarea complexelor nucleare de ribonucleoproteine
(nRNP) în care moleculele de pre-ARNm sunt sechestrate în timpul transportului ARNm în afara
nucleului sau în asamblarea particulelor ribonucleoproteice citoplasmatice (cRNP). Există indicaţii
care sugerează
190
că coifurile şi proteinele asociate acestora asigură protecţia moleculelor de ARNm de o degradare
care ar putea să demareze la extremitatea 5’. Mai bine stabilită este necesitatea coifului pentru
ataşarea ARNm de ribozomi înainte de demararea traducerii. Unul dintre factorii de iniţiere, eIF-
4 E, este un factor de recunoaştere specific coifului în timpul asocierii subunităţii 40S a
ribozomului la extremitatea 5’ a ARNm. Se consideră că eliminarea coifului unei molecule de
ARNm împiedică traducerea sa in vivo. In vitro s-a dovedit că moleculele de ARNm care nu
posedă coif pot fi totuşi traduse. Singura excepţie cunoscută de la această exigenţă este ARN
genomic de la picornavirus (de ex. virusul polio) care funcţionează ca ARNm pentru toate
proteinele codificate de virus. În plus, în celulele infectate de către virusul polio se opreşte sinteza
proteinelor gazdei deoarece o proteină virală inactivează proteinele celulare legându-se la nivelul
coifului.
Silde 17. Capătul 5′-cap este adăugat moleculei în formare după iniţierea
transcripţiei de către ARN polimeraza II
Figura: Adăugarea “coifului” la transcripţii ARNm în formare prin adăugarea 7’- metil citozină
Primele două reacţii sunt catalizate de o enzimă responsabilă de adăugarea coifului care se
asociază cu domeniul CTD al ARN polimerazei II la scurt timp după iniţierea transcripţiei. Două
metil-transferaze diferite catalizează reacţiile 3 şi 4. S- adenozin metionina (S-Ado-Met) este sursa
de grupări metil (CH3) pentru cele două etape de metilare; restul guanilat (G) este metilat primul,
apoi hidroxilul din poziţia 2’ al primului sau primelor două nucleotide (N) din transcript.
Silde 18. Pre-ARNm este asociat cu proteine hnRNP care conţin domenii conservate de legare a
ARN Figura: Vizualizarea hnRNP (heterogen nuclear ribonucleoproteine) asociate cu
transcripţii în formare într-un ovocit de la Nophthalmus viridescens (triton)
O porţiune a cromozomului “în perie”. ADN din axa cromozomului este colorat în alb cu
colorantul specific pentru ADN, DAPI. Filamentele lungi roşii sunt transcripţi în formare legaţi cu
hnRNP, care prezintă fluorescenţă roşie după colorarea cu un anticorp faţă de proteine hnRNP.
Silde 19. Interacţia unui motiv RNP la nivelul proteinei U1A şi a ARN Figura: Structura
complexului format între un motiv RNP format din proteina U1A şi ARN
a) Diagrama unui motiv al domeniului RNP. Regiunile conservate RNP1 şi
RNP2 sunt localizate în două catene beta poziţionate în mijloc; b) Reprezentare a suprafeţei
complexului format din proteina U1a şi ARN determinată prin cristalografie cu raze X. ARN
formează a buclă stem cu porţiunea monocatenară a buclei legată la suprafaţa proteinei. Capetele
C şi N terminale sunt orientate către dreapt aşi stânga. Aminoacizii acizi sunt coloraţi în roşu şi
albatru respectiv.
Silde 20. Proteinele hnRNP pot fi implicate în procesarea şi transportul ARNm Figura:
Hibridizarea moleculelor de ARN in vitro accelerată de către proteinele hnRNP.
191
 Prezenţa structurilor secundare complexe în structura moleculelor de ARN, hibridizarea
între secvenţele lungi complementare din molecule separate. Asocierea dintre proteine hnRNP şi
ARN se consideră că previne formarea structurilor ARN secundare, facilitînd astfel împerecherea
diferitelor molecule complemntare. Aceste molecule pot avea funcţii similare in vivo.
Silde 21. Pre-ARNm sunt scindate la situsuri specifice 3′ şi rapid poliadenilate
Figura: Model de clivare şi poliadenilare a ARNm în celulele de mamifere
Factorul specific de poliadenilare şi clivare (CPSF) se leagă la o regiune în amonte
AAUAAA de situsul de poliadenilare. CStF interacţionează cu o secvenţp din aval bogată în GU
sau U şi cu CPSF legat, formând o buclă în ARN; legarea CFI şi CFII ajută stabilizarea
complexului. Legarea poli(A) polimerazei (PAP) stimulează apoi clivarea la nivelul situsului
poli(A), care este de obicei poziţionat la 10-35 nucleotide în 3’ faţă de semnalul de poliadenilare
din aval. Factorii de clivare sunt eliberaţi, caşi produsul de clivare din aval care este rapid degradat.
Legarea PAP adaugă apoi aproximativ 12 resturi A la o rată scăzută la gruparea hidroxil 3’ generată
prin reacţia de clivare. Legarea proteinei de legare PABII (Poli(A) binding protein la coada poli(A)
iniţială scurtă accelerează rata de adăugare catalizată de PAP. După adăugarea a 200-250 resturi,
PABII semnalizează oprirea polimerizării.
Silde 22. Etapa finală de maturare: intronii sunt înlăturaţi iar exonii sunt sudaţi împreună Figura:
Demonstraţie că intronii sunt înlăturaţi, prin tehnica electronomicroscopica asupra hibrizilor
ADN-ARN formaţi de adenovirusul ADN şi ARNm care codifică hexon, o proteină virală
majoră.
Informatii suplimentare Secvenţele codante ale genelor eucariote (exonii) sunt frecvent întrerupţi
de către regiuni necodante (intronii). Această descoperire curioasă a ridicat numeroase întrebări
fundamentale.
1) Unde, când şi cum au apărut intronii la nivelul genelor şi care este rolul lor în evoluţie?
2) Cum transcripţii primari ai acestor gene mozaic sunt transformaţi în molecule ARN
mature, lipsite de introni?
3) Care este influenţa procesului de excizie-epissage asupra reglării expresiei genelor?
4) Care este funcţia, dacă există vreuna, intronilor în multitudinea operaţiilor care afectează
genoamele contemporane. Sunt intronii vestigii ale evoluţiei genelor şi au vreun rol în viaţa
organismelor contemporane?
Scopul nostru principal este de a expune ceea ce ştim despre structura intronilor, despre
mecanismele prin care aceştia sunt eliminaţi şi despre influenţa procesului de maturare asupra
expresiei genelor eucariote.
Roberts şi Sharp au obţinut premiul Nobel pentru Fiziologie şi Medicină în 1993, pentru
descoperirea structurii discontinue a genelor.
Silde 23. *Electrono-micrografie care evidenţiază formarea hibridului pre-
 ARNm/ARNm
192
Figura: O micografie electronică şi reprezentarea sa schematică privind formarea unui hibrid între
catena antisens a genei de ovalbumină de la pui (aşa cum a fost obţinută prin clonare moleculară)
şi ARNm corespunzător. Segmentele complementare ale ADN (linia punctată roşie) şi ARNm
(linia roşie) au fost anelate pentru a evidenţia poziţia exonilor. Segmentele care formează bucle
externe (I la VII), care nu au secvenţe suplimentare cu structura ARNm, sunt intronii.
Informatii suplimentare- Frecvenţa intronilor
Frecvenţa genelor în mozaic variază foarte mult în funcţie de speciile eucariote. Aceştia
sunt foarte frecvenţi la vegetale şi la animale şi la virusurile care le infectează. Intronii sunt mult
mai rari în genele nevertebratelor (ex. Drosophila, nematodele şi ariciul de mare). Totuşi, mai
multe gene care guvernează morfogeneza la Drosophila (ex. grupele Ultrabitorax şi Antennapedia)
prezintă aranjamente complexe de introni şi exoni. Cea mai mare parte a genelor S. cerevisiae sunt
lipsite de introni (genele pentru actină şi pentru alte câteva molecule de ARNt sunt excepţii) dar
genele mozaic sunt mult mai numeroase la o specie înrudită numită Schizosaccharomyces pombe.
Cu toate că intronii sunt rari în genele nucleare, ei sunt mult frecvenţi în genele mitocondriale ale
acestei drojdii. La descoperirea lor s-a crezut că genele mozaic sunt o caracteristică proprie genelor
eucariote. Evidenţierea lor în gena timidilat sintetazei bacteriofagului T4 a demonstrat că această
idee era falsă. De atunci, au mai fost descoperiţi introni şi în gena care codifică ARNtSer şi în gena
pentru ARNr de la Archeobacterii, etc. Acum nu mai este surprinzător că cercetări mult mai
avansate evidenţiază alţi introni în genele procariotelor . Au fost descoperiţi introni şi la anumite
bacterii.
Intronii există în genele nucleare care codifică pentru ARNm. ARNr (dar numai în genele
lungi pentru ARNr de la eucariotele inferioare) şi pentru un grup de gene care codifică ARNt. De
asemenea, intronii sunt frecvenţi în genele mitocondriale şi din cloroplaste, care codifică pentru
moleculele ARN mesager, ribozomic şi de transfer din aceste organite. Totuşi, în genele
mamiferelor unde prezenţa intronilor este o regulă, există şi excepţii. Cea mai mare parte a genelor
pentru histone nu conţin introni, ca şi cele două familii de gene care codifică pentru interferonii α
şi β, în timp ce gena pentru interferon γ conţine foarte mulţi. Nu se cunosc încă exemple privind
prezenţa intronilor în genele pentru ARNr 5S şi 5,8S şi nici pentru ARN U, 7SL şi 7SK.
Diferite tipuri de introni
Toţi intronii sunt transcrişi ca părţi integrante ale moleculelor precursoare de ARN şi sunt
apoi eliminaţi printr-un proces de tăiere-legare numit excizie-episaj. Structura şi mecanismele de
episaj stau la baza clasificării diferitelor tipuri de introni. Notă: Bazele sunt notate aşa cum apar
în structura ARN. Y reprezintă o pirimidină şi indicele n indică un număr multiplu de pirimidine.
R reprezintă o purină. Literele subliniate sunt bazele invariante şi săgeţile indică situsurile de
tăiere.
Silde 24. Secvenţe consens la nivelul a diferite tipuri de situsuri de “splicing”
Silde 25. Splicing-ul” se produce la nivelul unor secvenţe conservate, scurte Figura: Secvenţele
consens din jurul situsurilor de “splicing” 5’ şi 3’ din structura pre-ARNm de la vertebrate
193
 Cu toate că bazele 5(GU) şi 3’(AG) sunt aproape invariabile în structura intronului, totuşi
bazele care le flanchează pe acestea sunt prezente la frecvenţe mai mari decât cele aşteptate în
cazul unei distribuţii aleatoare. O regiune bogată în pirimidină (albastru deschis) situată în
apropierea capătului 3’ al intronului este prezentă în majoritatea cazurilor. Punctul de ramificare
adenozinic, de asemenea invariant este format de obicei de 20 la 50 baze în direcţia 3’. Regiunea
centrală a intronului, care poate fi cuprinsă între 40 pb şi 50 kilobaze lungime nu este necesară
procesului de spicing.
Informatii suplimentare Intronii genelor nucleare pentru ARNm - Intronii genelor nucleare care
codifică pentru proteine, primii care au fost descoperiţi, au o mărime de la 10 pb la 10kpb.
Intronii genelor omologe de la diferite specii de vertebrate pot să difere prin lungime şi secvenţă
asemeni intronilor din genele neînrudite. Mărimea exonilor pare să se situeze în jurul valorilor de
52, 140, 223 şi 229 pb, ultima fiind cea mai frecventă. Există şi situaţii (rare) în care lungimea
intronilor este de 15 la 30 pb sau de mai multe sute sau mii de pb. Caracteristicile cele mai
comune ale intronilor sunt secvenţele din 5’ (secvenţe situate în amont sau donatoare) şi în 3’ (în
aval sau acceptoare) adică joncţiunile exon-intron sau situsurile de excizie-episaj.
Secvenţele nucleotidice ale fiecărei joncţiuni exon-intron sunt conservate remarcabil în
aproape toate genele nucleare pentru ARNm la aproape toate speciile studiate. Secvenţa care
flanchează cel mai frecvent situsul de episaj din 5’ este CRG (unde R reprezintă o purină), cea care
formează capătul din 3’ fiind adesea reprezentată de un singur G. Cele mai mari variaţii se întâlnesc
în secvenţele care înconjoară intronii, însă mutaţii la nivelul acestor situsuri nu împiedică niciodată
episajul, chiar dacă există cazuri în care poate fi afectată viteza. Structurile cele mai puţin variabile
se găsesc în intron. Primele două nucleotide ale extremităţii 5’ ale intronului în ARN sunt aproape
întotdeauna GU (GC în cazuri excepţionale); următoarele cinci nucleotide nu sunt invariabile, cu
toate că secvenţa AGAGU pare să fie consensus. Modificările lui nucleotidelor G sau U prezente
la nivelul joncţiunii împiedică, în general, realizarea episajului, în timp ce modificările poziţiilor
adiacente afectează diferit episajul. Cele şase nucleotide de la extremitatea 5’ a intronului sunt
suficiente pentru situsul de episaj. Chiar şi joncţiunile criptice (ascunse), care nu sunt folosite decât
rar sau când situsurile dominante sunt pierdute sau modificate, posedă secvenţa GU la extremitatea
5’ a fragmentului care trebuie eliminat. Capătul 3’ al intronului se termină invariabil prin AG,
foarte adesea precedat, în intronii de mamifere, de o secvenţă bogată în pirimidină (YnNYAG). Şi
în acest caz mutaţiile care înlocuiesc invariabilele A sau G printr-o altă bază împiedică episajul
acestei joncţiuni.
Un rest A apropiat de extremitatea 3’ a intronului este un participant esenţial la episajul
moleculelor pre-ARNm. În intronii mamiferelor, poziţia acestui A nu este invariabilă deoarece
poate fi utilizat orice A dintre nucleotidele situate în poziţiile 18 la 37 în amont de situsul de episaj.
Totuşi, mutaţii la nivelul secvenţei vecine acestui A (cel utilizat) provoacă o importantă diminuare
a eficacităţii episajului in vitro; astfel, cu toate că nucleotidul A esenţial nu apare într-un context
invariant, secvenţa vecină influenţează folosirea sa. Din contră, în cazul moleculelor de pre-ARN
nucleare de la drojdie, restul A este furnizat de un heptanucleotid , 5’-UACUAAC-3’, situat între
nucleotidele 6 şi 59 în amont de situsul de episaj.
 Prezenţa secvenţelor consensus ale situsurilor de excizie-episaj nu semnifică întotdeauna
că intronul poate fi excizat. În anumite cazuri, una sau două secvenţe ale
194
acestui situs sunt situate în exoni şi în introni în locuri unde nu se produce în mod normal excizie-
episaj. Totuşi, astfel de situsuri criptice (ascunse) pot funcţiona în anumite circumstanţe (ex., când
situsurile autentice sunt modificate sau absente).
Ocazional, intronii posedă mai mult de o joncţiune 5’ sau 3’, permiţând procese de excizie-
episaj alternative. De exemplu, într-o regiune precoce a SV40 sunt doi introni care au amândoi
acelaşi situs 3’ dar joncţiunile 5’ sunt diferite. Rezultatul acestor procese de episaj alternativ duc
la formarea a două molecule de ARNm plecând de la acelaşi transcript primar. În anumite
circumstanţe, alegerea episajului este reglată în timp în funcţie de ţesut. Adesea, situsuri de episaj
există dar nu sunt folosite. Astfel, genoamele retrovirale provin din transcripţi de ADN proviral
care nu au suferit excizie-episaj, dar producerea de ARNm care codifică pentru anumite proteine
virale necesită excizie. În acest caz acelaşi transcript poate fi excizat sau nu.
Cum s-a menţionat anterior, intronii pot conţine alte elemente genetice, cum sunt
elementele activatoare (enhancers) ale altor gene, semnale de replicare şi de împachetare a
cromozomului sau secvenţe necesare asamblării pre-ARNm în particulele ribonucleoproteice
(RNP).
Silde 26. *Etapele procesului de producere a ARNm matur (gena ovalbuminei de pui) Figura:
Secvenţa etapelor de producere a ARNm eucariot aşa cum se poate vedea pentru gena
ovalbuminei de la pui.
În urma transcripţiei, transcriptului primar i se adaugă “capul” şi “coada” poliA. Intronii
sunt apoi excizaţi şi exonii sudaţi împreună pentru a forma structura ARNm matur.
Informatii suplimentare Splicingul intronilor moleculelor pre-ANRm nucleare Studiul
mecanismelor de splicing în cazul pre-ARNm nucleari a fost facilitat de existenţa genelor mozaic
clonate şi în particular a formelor modificate natural sau deliberat ale acestor gene. Substrate
special preparate, prin fuziune de exoni şi introni, au ajutat mult la identificarea structurilor
necesare pentru un splicing fidel. Cea mai bună a fost însă abordarea biochimică, graţie folosirii
de extracte celulare capabile să realizeze splicing şi de asemenea purificarea elementelor
maşinăriei acestei reacţii. Au fost utilizate substrate ARN purtătore de coif; acestea au fost
obţinute prin transcrierea matriţelor ADN special preparate, inserate în aval de promotorul
fagului SP6 şi utilizând ARN polimeraza specifică acestuia.
Caracteristici generale
Splicingul pre-ARNm nucleari are loc în nucleu, în acelaşi timp cu transcripţia pentru
anumite gene sau după transcripţie pentru altele. Există indicaţii care sugerează că adăugarea
coifului la extremitatea 5’ a transcriptului are implicaţii asupra procesului de maturare. Conceptual
şi practic, este foarte important să se cunoască cum o moleculă pre-ARNm care conţine mai mulţi
introni poate fi maturată astfel încât exonii vecini să poată fi asociaţi corect. Deoarece se ştie că
situsul 5’ al unui intron poate fi clivat în acelaşi timp cu situsul 3’ al altuia, este foarte important
să se înţeleagă cum, în cursul unei reacţii normale, acest lucru poate fi evitat pentru a se putea
realiza un splicing alternativ.
 Silde 27. Analiza produşilor ARN formaţi într-o reacţie de “splicing” in vitro
195
Figura: Analiza produşilor ARN formaţi printr-o reacţie de splicin “in vitro”.
Un extract nuclear de celule Hela a fost incubat cu 497 nucleotide ARN radiomarcate (în
partea de sus) care conţin porţiuni din doi exoni (roşu şi roz) din ARNm pentru beta-globină
separaţi de un intron de 130 nucleotide (albastru). După incubare perioade diferite de timp, ARN
a fost purificat şi supus electroforezei şi autoradiografiei în prezenţă de markeri ARN (linia M).
Este indicat numărul de nucleotide din diferite specii. Majoritatea moleculei iniţiale de care
migrează mai încet (497 b) a fost corect maturată conducând la un produs de 367 nucleotide.
Intronul excizat (aprox 130 b) migrază mai lent decât ne-am fi aşteptat ţinând cont de masa sa
moleculară, indicând că nu este o moleculă lineară. De asenmenea, unul din intermediarii reacţiei
(339 b) manifestă o mobilitate electroforetică anormal de lentă. Analize suplimentare au indicat că
în ambele cazuri intronul nu este o moleculă lineară ci op moleculă sub formp de “laso”. Banda de
252 b, un produa aberant în reacţia in vitro este mult redusă în reacţiile în care ARN posedă
structura “cap”.
Informatii suplimentare
Traseul reacţiilor de splicing În primul rând vor fi discutate etapele de clivare şi de legare care
constituie reacţiile de splicing. Etapa iniţială o constituie asamblarea unui complex de maturare
(splicing). Primii produşi detectaţi in vitro sunt rezultatul clivării la nivelul situsului de splicing
5’: unul conţine exonul 5’, celălalt intronul şi exonul 3’. Cum pentru nici o specie de ARN nu s-a
evidenţiat o alterare a produsului clivat la nivelul situsului 3’, înseamnă că tăierea la nivelul
situsului 5’ trebuie să preceadă decuparea situsului 3’. O dată ce reacţia progresează se
acumulează doi produşi: exonii asociaţi corect şi intronul complet liber. Atât produsul clivării
iniţiale şi intronul excizat conţin o structură în ‘loso’ asemănătoare celei descrise pentru intronii
mitocondriali de tip doi obţinuţi prin auto-splicing. Structura în laso a fost pentru prima dată
sugerată de mobilitatea electroforetică anormală a intronului eliberat, de incapacitatea sa de a
servi drept matriţă pentru realizarea unei transcripţii inverse pornind de la un punct apropiat de
extremitatea 3’ şi de rezistenţa acestuia la digestie completă cu mai multe ribonucleaze. Structura
a fost apoi confirmată prin izolarea ribonucleotidelor punctului de ramificare (închidere a
lasoului). Acesta conţine întotdeauna, indiferent de intronul eliberat, fosfatul 5’ al guanozinei de
la nivelul joncţiunii intronului asociată printr-o legătură diester cu hidroxilul din poziţia 2’ al
unei adenozine. A fost astfel explicată existenţa neaşteptată a unor molecule de ARN nuclear
care posedau o ramificare pornind de la hidroxilul 2’ al unui rest adenozil.
Silde 28. Mecanismul de “splicing” presupune două reacţii de transesterificare Figura:
“splicingul” exonilor din molecula pre-ARNm apare prin intermediul a două reacţii de
transesterificare.
În prima reacţie, legătura ester dintre griparea 5’-fosfat a intronului şi oxigenul din 3’ (roşu)
al exonului 1 este schimbată pentru o legătură ester cu oxigenul 2’ (albastru închis) al restului A
de ramificare. În cea de a doua reacţie, legătura ester dintre fosforul din 5’ al exenului 2 şi oxigenul
3’ (albastru deschis) al intronului este schimbată pentru o legătură cu oxigenul 3’ al exonului 1,
eliberând intronul sub forma unei structuri “in laso” şi resudând cei doi exoni. Săgeţile arată unde
atomii de oxigen din grupările hidroxil activare reacţionează cu atomii de fosfor.
196
Silde 29. Secvenţa reacţiilor de transesterificare implicare în unirea exonilor Figura: Secvenţa
reacţiilor de transesterificare care aduc împreună exonii moleculelor de pre-ARNm (exonii şi
intronii sunt desenaţi în albastru şi portocaliu; R şi Y reprezintă purina şi pirimidina): 1)
Gruparea 2’-OH a unui intron specific A atacă nucleofil gruparea 5’-fosfat de la capătul 5’ al
capătului intronilor pentru a ajunge la o structură sub formă de laso; 2) Gruparea 3’-OH eliberată
formează o legătură 3’-5’-fosfodiester cu restul terminal 5’ a exonului 3’ , determinând astfel
unirea celor doi exoni şi eliberarea intronului sub formă de laso.
Silde 30. Moleculele de “small nuclear RNAs (snRNAs) asistă reacţia de “splicing” Figura:
Diagrama interacţiilor dintre pre-ARNm, U1ARNsn şi U2ARNsn în procesul de splicing-ul
timpuriu
Regiunea 5’ a U1ARNsn iniţial împerecheate cu nucleotide la capătul 5’ al intronului
(albastru) şi capătul 3’ al exonului din 5’ (roşu închis) al pre-ARNm; U2ARNsn se împerechează
cu o secvenţă care include punctul de ramificare A, deşi acest rest nu este împerechiat. În figură
este prezentată secvenţa punctului de ramificare de la drojdii. Structurile secundare ale ARNsn
care nu sunt alterate în timpul “splicingului” sunt prezentate sunt formă de linii diagramate.
Dreptunghiurile roşii reprezintă secvenţe care leagă proteine snRNP recunoscute de către
anticorpii anti-Sm. Din motive necunoscute, antiserurile de la pacienţi cu boli autoimune sistemice
cum este “lupus eritematos” (SLE) conţin aceşti anticorpi. Aceşti anticorpi au fost utili în
caracterizarea componentelor reacţiilor de “splicing”.
Silde 31. Spliceozomul – complex ribonucledoproteic compus din multe molecule
de “snRNPs” Figura: Micrografia eloectronică a unui “spliceozom”
Extractele din celulele HeLa au fost amestecate cu pre-ARNm pentru beta- globulină;
reacţia a fost întreruptă înainte ca “splicingul” să fie complet, astfel încât să poată fi purificat
“spliceozomul” care conţine RNPsn şi pre-ARNm.
Informatii suplimentare Asamblarea spliceozomilor
Deoarece splicingul are loc la nivelul spliceozomilor apare necesitatea cunoaşterii
structurii, asamblării şi mecanismelor de acţiune ale acestora. Particulele de splicing izolate dintr-
un amestec de reacţie în care clivarea în 3’ a fost inhibată, sunt de formă elipsoidală şi cu
dimensiuni de 25 x 50 nm. În particular, intronul este asociat fiecăruia dintre snRNP U1, U2,
U4/U6 şi U5. Spliceozomii funcţionali conţin şi alte proteine şi în particular pe cele care sunt
implicate în legarea snRNP la ţintele lor care sunt normal fixate pe structura pre-ARNm nuclear.
O secvenţă minimală a exonului este necesară legării snRNP la intron. După schema
actuală de asamblare a spliceozomilor, se leagă primele particulele snRNP U1 la funcţiunea 5’,
chiar dacă există sau nu situsuri funcţionale pentru fixarea, în continuare, a snRNP U2 şi U5; dar
această singură legătură este insuficientă pentru a provoca clivarea situsului 5’. Prima legare este
apoi urmată de asocierea snRNP U2. U5 şi U4/U6, asociere care necesită ATP. Legarea snRNP
U2 la situsul său de pe intron se bazează pe împerecherea de baze; în timp ce încorporarea
complexului
197
snRNP U4/U6 şi U5 în spliceozom depinde de interacţiile dintre snRNP. O schemă asemănătoare
este valabilă pentru asamblarea particulelor de splicing pentru pre- ARNm de la drojdii. După
legarea exonilor evoluţia spliceozomului este incertă, dar snRNP sau sub-ansamble ale acestora
sunt probabil reciclate atunci când ARN intronic este degradat. Acest mers al reacţiilor reprezintă
a secvenţă posibilă dar nu obligatorie a asamblării spliceozomilor. Pentru a fi mult mai siguri este
necesară analiza relaţiilor precursor-produs. Modelul nu explică cum se realizează clivarea
situsului 3', cum se realizează legarea exonilor şi nici de ce acesta este limitată la exonii adecvaţi.
Silde [Link] de acţiune la nivelul spliceozomului Figura: Ciclul de
“splicing” al “sliceozomului”
RNPsn implicate în “splicing” (U1, U2, U4, U5 şi U6) asociate cu pre-ARNm şi între ele
într-o anumită ordine secvenţială în scopul formării “spliceozomului”. Acest complex
“ribonucleoproteic” catalizează apoi cele două reacţii de transesterificare care au ca rezultat
“splicingul” (sudarea) exonilor (roşu închis şi deschis) şi eliberarea intronului (albastru) sub forma
unei structuri “laso”. Cu toate că pentru reacţiile de transesterificare nu este necesară hidroliza
ATP, se consideră că acesta este necesar pentru a furniza energia necesară rearanjamentele
structurii care apar în timpul ciclului. De reţinut că proteinele snRNP din structura
“spliceozomului” sunt distincte faţă de RNPhn discutate anterior. La eucariotele superioare
asocierea U2ARNsn cu pre-ARNm este asistată de o proteină RNPhn numită U2AF, care se leagă
o regiune baogată în pirimidină situată lângă situsul 3’ de splicing. De asemenea U2AF acţionează
probabil şi cu alte proteine necesare pentru splicing prin intermediul uni domeniu care conţine
repetiţii dipeptidice serină-arginină (motivul SR). Punctul de ramificare A din structura pre-ARNm
este indicat cu caracter roşu boldit.
Silde 33. Auto-”splicing-ul” intonilor de grup II furnizează indicii pentru evoluţia snRNPs
Figura: Diagrame schematice care compară structurile secundare de auto-splicing ale
intronilor de grup II (a) şi UARNsn prezent în spliceozomi (b).
Prima reacţie de transesterificare este indicată prin săgeţi negre; ce a doua reacţie prin
săgeţi albastre. Punctul de ramificare A este prezentat boldit. Similitudinile acestor structuri
sugerează că structurile ARNsn evoluează din introni de grup II, cu aceste ARNsn care acţionează
în trans şi este funcţional analog cu domeniile corespunzătoare intronilor de grup II.
Informatii suplimentare Splicing autacatalitic sau catalizat de spliceozomi
Rezultatul final al splicingului intronilor din grupa II şi a pre-ARNm este acelaşi: intronul
eliberat sub formă de laso şi cei doi exoni vecini uniţi între ei. În plus, mecanismul reacţiilor celor
două procese este asemănător. În cele două cazuri, hidroxilul 2’ al intronului serveşte drept centru
nucleofil pentru realizarea clivării situsului 5’ şi un hidroxil 5’ al exonului situat în amont este
centrul nucleofil care clivează situsul 3’ pentru a forma legătura exon-exon. Diferenţa cheie este
că anumiţi introni din grupa II sunt automaturaţi in vitro, în timp ce splicingul pre-ARNm nucleari
necesită o maşinărie elaborată formată din mai multe snRNP şi proteine accesorii. Totuşi, anumiţi
introni din grupa II necesită maturaze pentru reacţia in vitro cu toate că nucleotidele şi centrele
catalitice implicate în cele două procese sunt
198
aceleaşi. Presupunând că splicingul autocatalitic necesită o repliere foarte specifică a ARN,
maturazele ar fi necesare pentru stabilirea şi stabilizarea unei structuri care permite transesterificări
secvenţiale adecvate. Astfel, singura diferenţă între cele două mecanisme ar fi maniera în care
intronul achiziţionează conformaţia sa catalitic activă.
Aceleaşi condiţii sunt valabile pentru splicingul catalizat de către particule. Este posibil
ca snRNP şi factorii asociaţi să creeze «un eşafodaj» pe care intronul să poată fi corect pliat,
astfel încât cele două joncţiuni şi punctul de ramificare să fie juxtapuse şi active. În acest sens,
implicarea spliceozomilor în splicingul pre-ARNm nucleari, este analogă celei a maturazei
pentru intronii din grupa II. Ne putem întreba de ce replierea pre-ARNm nucleari necesită un
astfel de complex în timp ce numai maturaza este suficientă pentru anumiţi introni din grupa II.
Răspunsul se poate găsi în complexitatea maturării care trebuie să se realizeze. Intronii
mitocondriali din grupa II se aseamănă fiecare posedând mai multe secvenţe foarte conservate.
Una sau două proteine sunt probabil suficiente pentru a realiza şi a menţine conformaţia activă a
intronilor. Problema este evident mult mai complexă pentru pre-ARNm nucleari dată fiind
diversitatea de mărime şi de secvenţă a acestora şi deci şi numărul de introni. O singură proteină
nu ar putea determina adoptarea unei conformaţii active pentru toţi intronii. Particulele snRNP,
foarte conservate se pot împerechia cu două sau trei secvenţe conservate prezente în toţi intronii,
pot interacţiona între ele şi pot impune o conformaţie care favorizează cele două transesterificări
catalizata de către ARN. Alt tip de auto-splicing
Intronii din grupa II din structura moleculelor de pre-ARNm mitocondriale de la drojdii
posedă şi ei secvenţe conservate şi structuri secundare definite dar aceste sunt distincte de cele
caracteristice intronilor grupei I. Şi intronii din grupa II sunt supuşi procesului de auto-splicng dar
, din păcate, cunoştinţele noastre sunt mai reduse în ceea ce priveşte structurile secundare şi terţiare
ale acestor substrate, şi privind detaliile moleculare ale reacţiei de maturare. Sunt clare două puncte
ale acestui mecanism: 1) contrar reacţiilor de automaturare pe care le suportă intronii din grupa I,
maturarea intronilor din grupa II nu necesită un nucleotid iniţiator şi 2) produsul de reacţie are o
structură de ‘laso’.
Ca şi în cazul intronilor din grupa I, procesul de auto-splicing implică două etape de
transesterificare, una în urma clivării la nivelul situsului 5’, şi cealaltă pentru clivajul situsului 3’
şi legarea celor doi exoni. Totuşi, diferenţa fundamentală constă în natura atacului nucleofil:
guanozina pentru intronii din grupa I şi hidroxilul 2’ aparţinând unui nucleotid al intronului în
cazul intronilor din grupa II. Structura în laso rezultă din realizarea unei nou legături 2’-5’
fosfodiester în mijlocul secvenţei ARN.
Structura tridimensională a intronului, spontană sau facilitată de proteine asociate, trebuie
să aducă hidroxilul 2’ al lasoului în apropierea situsului de splicing 5’ şi să activeze
transesterificarea. Alegerea legăturii internucleotidice care este clivată depinde probabil de
secvenţele, specifice grupei II, GUGCG prezentă la extremitatea 5’ şi secvenţa YAU prezenţă la
extremitatea 3’ a intronului. Acest mecanism se aseamănă cu cel folosit la maturarea pre-ARNm
nucleari. Necesitatea particulelor ribonucleoproteice care acţionează în trans pentru realizarea
splicingului intronilor din pre-ARNm este datorată faptului că procesul, în acest caz, este mult mai
complex şi specific diferitelor tipuri de pliere a diferitelor specii de pre-ARNm, necesare asigurării
splicingului corect la nivelul joncţiunilor exon-intron.
199
 Silde 34. Secvenţele elementelor conservate în mai mulţi introni din clasa I Slide 35. Auto-
splicing-ul intronilor de grup 1 - ARN catalitic Figura: Mecanismele de splicing ale intronilor
din grupul I şi din grupul II automatisabili şi spiceozomul care catalizează splicingul ARNm.
Intronul este marcat în albastru şi exonii care urmează a fi matisaţi în roşu. In intronii din grupul
I, un cofactor guanozinic (G) care nu face parte din catena ARN se asociază cu situl activ.
Gruparea hidroxil 3’al acestei guanozine participă la o reacţie de transesterificare cu fosfatul de
la capătul 5’ al intronului. Această reacţie este analogă cu cea care implică gruparea hidroxil 2’ a
situsului de ramificare A din intronii de grup I şi din intronii pre-ARNm matizaţi în spliceozomi.
Transesterificarea următoare care leagă capetele 5’ şi 3’ ale celor doi exoni este similară în toate
cele trei mecanisme de splicing . De reţinut că intronul de grup I se eliberează sub forma unei
structuri lineare spre deosebire de produşii ramificaţi din celelalte două cazuri.
Autosplicingul intronilor din grupa I.
Splicingul intronului pre-ARNr de la Tetrahymena, care reprezintă prototipul grupei I, se
realizează printr-o serie de transesterificări concertate în cursul cărora fosfoesterii sunt schimbaţi
fără hidroliză intermediară. Cu excepţia etapei de iniţiere, favorizată de prezenţa guanozinei libere
sau a nucleotidelor sale, toate grupele reactive implicate în transesterificare sunt conţinute în
secvenţa intronului. În plus, specificitatea de schimb a legăturilor este o consecinţă a organizării
tridimensionale a intronului, rezultată din împerecherea între secvenţe distante dar conservate ale
intronului.
Prima etapă a splicingului este legarea guanozinei la o secvenţă a intronului. Perechea de
electroni liberi ai hidroxilului 3’ ai guanozinei poate provoca un atac nucleofil asupra fosfatului
joncţiunii exon-intron 5’ (-UpA-) provocând clivarea acestui situs. Hidroxilul 3’ creat la situsul de
clivare (extremitatea 5’ a exonului) reacţionează cu fosfatul 3’ al joncţiunii, provocând legarea
celor doi exoni şi eliberarea intronului linear, de 413 nucleotide. Segmentul de intron linear suportă
apoi alte două transesterificări intramoleculare şi hidrolize, cu eliberarea mai întâi a 15 nucleotide
şi apoi formarea intronului final prin eliberarea altor 4 nucleotide. Trebuie să reţinem că reacţiei
globale nu îi este asociată nici o modificare netă de energie: fiecare rupere a unei legături
fosfodiester fiind compensată prin formarea concomitentă a unei alte legături fosfodiester.
Guanozina sau unul dintre derivaţii ei 5’ fosforilaţi, este specifică iniţierii reacţiei de
splicing. Modificarea grupărilor hidroxil 2’ sau 3’, sau potenţialului de împerechere a guanozinei
cu un rest de citozină, modifică (alterează) capacitatea de iniţiere a splicingului. Evident,
împerecherea guanozinei cu un rest complementar al intronului este importantă pentru poziţionarea
corectă a hidroxilului 3’ al guanozinei şi pentru reacţia sa cu fosfatul 5’ al joncţiunii.
Cele două joncţiuni exon-intron sunt probabil apropiate una de alta pentru a permite legarea
celor doi exoni după clivarea iniţială realizată de guanină. Acest proces este uşurat de replierea
intronului astfel încât cele două joncţiuni să se poată suprapune, probabil, în vecinătatea situsului
de legătură al guanozinei. O posibilitate este ca, în intron, o anumită secvenţă să fie capabilă să se
împerecheze cu o secvenţă a exonului situată la fiecare joncţiune. Prezenţa unei astfel de secvenţe
«ghid intern» ar permite reacţia grupării hidroxil 3’, creată prin clivarea joncţiunii exon-intron 5’
de către guanozină, cu fosfatul 3’ al situsului de splicing pentru a forma produsul
200
matisat. Restul G care termină intronul şi nucleotidele adiacente acestuia determină situsul de
splicing 3’. Modificările conformaţionale în intronul linear eliberat se presupune că facilitează
circularizarea şi eliberarea de mici oligonucleotide.
Mecanismul de autosplicing evidenţiat pentru gena ARNr de la Tetrahymena este aplicabil
şi altor introni din grupa I. Aceştia posedă cu toţii 4 secvenţe conservate (A, B, 9L şi 2) şi alte două
secvenţe neconservate 9R şi 9R’ (tabel 8.5 şi figura 8.75). Aceste 6 elemente apar întotdeauna în
aceeaşi ordine: 5’-9R’-A-B-9L-9R-2-3’. În plus, cea mai mare parte a intronilor din grupa I posedă
şi o secvenţă care poate servi drept ghid intern. Mutaţii care împiedică splicingul au fost evidenţiate
şi caracterizate la drojdii şi ciuperci. Astfel de mutaţii modifică în general posibilitatea
împerecherii bazelor. Astfel, de exemplu, inactivarea splicingului determinată de modificarea
secvenţelor 9R sau 9R’ este reversibilă prin schimbări compensatorii în altă secvenţă.
Splicingul in vitro al anumitor introni din grupa I aparţinând genelor mitocondriale de
drojdie pentru pre-ARNm depinde de aceleaşi secvenţe conservate ca şi cele care sunt necesare
splicingului pre-ARNr de la Tetrahymena, produşii de reacţie fiind analogi. Totuşi, aceşti pre-
ARNm nu suferă procesul de auto-splicing in vitro. Splicingul acestor introni depinde de proteine,
care acţionează în trans, codificate de aceleaşi gene sau de gene înrudite, de către secvenţe de
lectură deschise constituite din exoni şi introni. Aceste proteine, maturaze, nu sunt prezente decât
pentru o perioadă scurtă de timp şi par să favorizeze replierea intronului din structura pre-ARNm
într-o conformaţie care permite splicingul. Aceasta explică de ce mutaţiile fără sens (non-sens) sau
alunecarea fazei de lectură în secvenţa intronului care codifică pentru maturază, împiedică
splicingul acestui intron ca şi pe cel al intronilor din grupa I caracteristici altor gene mitocondriale.
Acest model explică şi de ce mutaţiile supresoare sau care conţin o alunecare de fază, care readuc
la normal producerea maturazei restabilesc şi splicingul corect. Plierea corectă a anumitor introni
din grupa I este spontană şi stabilă in vitro în timp alţii necesită proteine pentru formarea şi/sau
stabilizarea structurii active autocatalitic. Există şi posibilitatea ca diverse interacţii proteine-
proteine să aibă rol în pliere.
Splicingul în trans
Reacţiile de splicing trecute în revistă până în prezent sunt intramoleculare şi sunt deci
reacţii în cis. Se pune problema existenţei unor procese de splicing intermolecular deci despre care
putem considera că se desfăşoară în trans. Mai specific, se pune problema dacă doi exoni situaţi
pe molecule de ARN separate se pot asocia cu eliminarea concomitentă a intronilor pe care îi
conţin. Existenţa acestui proces de splicing intermolecular a fost demonstrat in vitro utilizând
substrate ARN special preparate. S-a stabilit că splicingul in trans este o etapă esenţială în
producerea celulară a tuturor moleculelor de ARNm la Trypanosoma şi a trei din cei patru ARNm
ai genelor actinei de la C. elegans. Primul exemplu de splicing in trans în care erau implicate unităţi
transcripţionale situate pe cromozomi diferiţi a fost descris în cazul proto-oncogenei c-myb
(Vellard et al, Oncogene, 1991). În fiecare caz, situsurile de clivare sunt de tip clasic, GU la
joncţiunea 5’ şi AG în poziţia 3’, produsul fiind şi el o structură ramificată (laso).
Pentru demonstrarea splicingului in trans au fost utilizate două modele experimentale. În
primul, exonul 5’ şi intronul care îl flanchează fac parte din aceeaşi moleculă de ARN, iar exonul
3’ şi intronul asociat cu acesta pe o a doua catenă ARN (lanţ ARN). Împerecherea bazelor
complementare între secvenţele celor două segmente intronice are loc cu o eficacitate de 15% (în
extractele celulare) faţă de rezultatele obţinute în cazurile în care intronii sunt pe aceeaşi moleculă
de ARN.
201
Deci, nici existenţa structurilor secundare nici întreruperea covalentă a intronului nu împiedică
splicingul.
Cea de a doua experienţă se bazează pe prezenţa secvenţelor complementare la nivelul a
doi introni necesare pentru întâlnirea (apropierea) moleculelor de ARN maturabile (supuse
procesului de splicing), În această configuraţie este posibilă obţinerea a patru produşi: doi formaţi
prin splicingul în trans şi doi prin splicing in cis. Rezultatul splicingului in vitro al acestui substrat
este formarea produşilor de reacţie trans 5’ adeno-adeno 3’ şi cis 5’ globină-adeno 3’. Se obţin
produşii cis 5’ adeno-globină 3’ şi trans 5’ globină-globină 3’, dar în cantităţi reduse probabil din
cauza apropierii bazelor împerechiate de punctul de ramificare.
Formarea ARNm al actinei funcţionale şi a multor alte molecule de ARNm de la C. elegans
se realizează prin splicing în trans (trans-splicing). În cazul actinei, coiful şi primele 22 nucleotide
ale ARNm provin dintr-un transcript de 100 nucleotide obţinut plecând de la ADNr 5S situat pe
un cromozom diferit. Totuşi, exemplul cel mai bine studiat de splicing in trans este cel de formare
a ARNm de la Trypanosoma. Toate moleculele de ARNm de la tryponosoma conţin o secvenţă 5’
identică de 35 nucleotide, netradusă, care precedă o secvenţă codantă întreruptă. Aceşti mini-exoni
5’ provin de la extremitatea 5’ a unui ARN de 137 nucleotide transcris plecând de la sute de copii
în tandem ale unui segment de ADN de 137 pb. Un splicing în trans asociază mini-exonul 5’ de
35 nucleotide cu un ARN al cărui exon codifică pentru o proteină cu un alt ARN formând o
moleculă de ARN ramificată. În etapa următoare, situsul de maturare 3’ este clivat şi cei doi exoni
sunt reuniţi. Segmentul ramificat, conţinând secvenţele «intronilor» de la două molecule de ARN
separate, este apoi tăiat de o enzimă care realizează deramificarea (debranşarea) rezultatul fiind
separarea intronilor care erau asociaţi celor două molecule de ARN. În exemplul analizat mai sus
trebuie remarcat: 1) secvenţa situată imediat în aval de mini-exonul de la Trypanosoma este
conform cu secvenţa consens 5’(GUAUGA), 2) joncţiunea intronului asociat cu exonul codant este
analogă secvenţei 3’ a situsurilor de excizie ([C/Un NNAG) 3) un nucleotid al intronului reprezintă
punctul de ramificare, sugerând că mecanismele de splicing în trans şi în cis sunt analoge. Pentru
moment modul de realizare a complexului de splicing, pentru două molecule de ARN separate, nu
este pe deplin elucidat.
Slide 36. Auto-splicingul pre-ARNr de la Tetrahymena
Figura: Auto-splicingul pre-ARNr de la Tetrahymena thermophila
Informatii suplimentare Intronii din grupa I au diferite localizări. Ei apar în gene care codifică
pentru ARNr în nucleul eucariotelor inferioare cum sunt Tetrahymena thermophila (un ciliat) şi
Physarum polycephalum (viermele de noroi sau râma). Ei sunt comuni în genele mitocondriale
ale fungilor. Prezenţa lor la nivelul a trei gene din genomul fagului T4 extinde întinderea lor
evolutivă până la procariote. Intronii au fost pierduţi în întregime de eubacterii, iar aceste gene
prezente la T4 sunt unicul exemplu unde splicingul este necesar la eubacterii. Intronii din grupul
una au comune două proprietăţi:
1) ARN izolat are capacitatea de a se matura singur, reacţie numită self- splicing (auto-
maturare sau auto-splicing). Proprietatea nu este unică deoarece se întâlneşte şi la intronii din grupa
II. În vitro reacţia de maturare se realizează prin self- splicing în timp ce in vivo aceasta trebuie
asistată de proteine.
202
 2) Un intron din grupa I se poate organiza într-o structură secundară distinctă, cu 9 (stem-
loop) bucle pe structură (bucle pe tijă). Unele dintre aceste bucle sunt generate prin reacţia dintre
secvenţe consensus scurte. Lungimea intronilor din grupa I variază larg, secvenţele consensus fiind
localizate la o distanţă considerabilă de joncţiunile implicate în splicing.
Auto-splicingul a fost descoperit ca o proprietate a transcripţilor genelor ARNr de la T.
thermophila. Genele pentru cele două forme majore de ARNr au organizarea obişnuită, în care
ambele sunt exprimate ca o parte a unei unităţi comune de transcripţie. Produsul este un precursor
ARN 35S care posedă secvenţa pentru molecula mică de ARNr în regiunea 5’, şi secvenţa pentru
molecula ARNr mare (26S) către capătul 3’.
La anumite tulpini de T. thermophila, secvenţa care codifică ARNr 26S este întreruptă de
un singur intron mic. Când precursorul 35S este incubat, in vitro, splicingul apare ca o reacţie
autonomă. Intronul este excizat (eliminat) de pe precursor şi se acumulează ca o formă lineară de
400 pb, care este apoi convertită într-o formă circulară. Reacţia necesită numai un cation
monovalent, un cation divalent un guanidin nucleotid ca cofactor. Nici o altă bază nu poate
substitui guanina, fără a fi neapărat necesară prezentă unui trifosfat (se poate utiliza la fel de bine
GTP, GDP, GMP sau chiar guanozină liberă). Nucleotidul guanilic trebuie să posede gruparea 3’-
OH liberă
Parcursul nucleotidului guanilic poate fi urmărit prin marcare radioactivă. Radioactivitatea
iniţială intră şi elimină intronul linear. Restul G rămâne legat de capătul 5’ al intronului printr-o
legătură fosfodiester normală. În proces apar trei reacţii de transfer. În primul transfer, nucleotidul
guanilic se comportă ca un cofactor care furnizează 3’-OH liber la capătul exonului. Al doilea
transfer implică o reacţie chimică similară, în care acest 3’-OH atacă cel de al doilea exon. Cele
două transferuri sunt conectate; nu au fost observaţi exoni liberi, deci legarea lor trebuie să apară
ca o parte a aceleiaşi reacţii în care se eliberează intronul. Intronul este eliberat ca o moleculă
lineară, dar cel de al treilea transfer îl transformă în una circulară.
Fiecare stadiu al reacţiilor de auto-splicing constau într-o transesterificare, în care un ester
fosfat este convertit direct în altul fără hidroliză intermediară. Datorită legăturilor care sunt
schimbate direct, energia este conservată, deci reacţia nu necesită energie din hidroliza ATP sau
GTP
Dacă fiecare dintre reacţiile consecutive de transesterificare nu implică o modificare netă
de energie, de ce reacţia de splicing se realizează complet în loc să apară un echilibru între produşii
maturaţi şi precursor? Concentraţia GTP este relativ mare faţă de cea a ARN, şi astfel reacţia este
orientată înainte. Reacţia inversă este prevenită de modificările structurii secundare a ARN.
Sistemele in vitro nu includ proteine care să fie absolut necesare auto- maturării ARN.
ARN formează o structură secundară/terţiară specifică în care grupările relevante sunt juxtapuse
astfel încât nucleotidul guanilic se poate lega la un situs specific, astfel încât să fie apoi posibilă
reacţia de rupere şi de reunire. Deşi reacţia poate fi realizată numai de ARN, se pare că in vivo
acesta este asistat de proteine, care pot să stabilizeze structura ARN.
 Abilitatea de a se angaja în astfel de reacţii de transfer rezidă în structura intronului, care
continuă să fie reactiv şi după eliminarea sa sub forma unei molecule lineare. Sunt însumate
urmatoarele activităţi:
1. Intronul se poate circulariza când G situat 3’ terminal atacă fiecare dintre cele două
poziţii de lângă capătul 5’. Legătura internă este ruptă şi capătul 5’ eliberat este transferat capătului
3’-OH al intronului. Ciclizarea primară implică de obicei
203
reacţia dintre G414 terminal şi A16. Aceasta este cea mai comună reacţie. Mai rar G414
reacţionează cu U20. Fiecare reacţie generează un intron circular şi un fragment linear care
reprezintă regiunea 5’ originală 8lung de 15 baze dacă atacul se produce la A16 şi de 19 baze dacă
atacul se face la U20). Fragmentul terminal conţine nucleotidul guanilic adăugat.
2. Fiecare tip de cerc poate genera o moleculă lineară in vitro prin hidroliza specifică a
legăturii (G414-A16 sau G414-U20) care au închis cercul. Acesta se numeşte reversul ciclizării şi
molecula lineară generată prin inversarea ciclizării la A16 rămâne reactivă şi poate realiza o a doua
ciclizare prin atacarea U20.
3. Produsul final al reacţiilor spontane eliberează intronul ARN L-19, o moleculă lineară
generată prin reversarea formei circulare scurte. Această moleculă are activitate enzimatică, şi
poate cataliza extinderea oligonucleotidelor scurte.
4. Reactivitatea intronului eliberat se extinde numai prin inversarea reacţiei de ciclizare.
Adăugarea oligonucleotidului UUU redeschide cercul primar reacţionând cu legătura G414-A16.
Oligonucleotidul UUU (care se aseamănă cu capătul 3’ de 15 baze eliberat în prima
ciclizare) devine capătul 5’ al moleculei lineare formate. Aceasta este o reacţie intermoleculară, şi
demonstrează astfel capacitatea de conectare a două molecule diferite de ARN.
Aceste serii de reacţii demonstrează clar că activitatea autocatalitică reflectă o abilitate
generalizată a moleculei de ARN pentru a forma un centru activ care poate lega cofactorii guanilici,
recunoaşte oligonucleotidele, şi poate aduce împreună grupări reactive într-o conformaţie care să
permite ruperea şi reformarea de legături. Alţi introni din grupa I nu au fost aşa investigaţi în
detaliu ca intronul de la Tetrahymena, dar proprietăţile lor sunt în general similare.
Reacţia de automaturare (auto-splicing) este o proprietate intrinsecă a ARN, in vitro, dar
în ce grad sunt implicate proteinele in vivo? Câteva indicaţii pentru implicarea proteinelor au fost
furnizate de către sistemele mitocondriale, unde splicingul intronilor din grupa I necesită trans-
activare de către produşi ai altor gene. Unul dintre cazuri îl reprezintă mutantul cyt 18 al N. crassa,
care este defectiv în realizarea splicingului mai multor exoni din grupa I. Produsul acestei gene se
pare a fi tirozil-ARNt sintetaza. O posibilă implicare este aceea că intronul se poate dispune într-
o structură terţiară asemănătoare cu structura terţiară a ARNt şi astfel poate fi recunoscut de
sintetază. Legarea enzimei poate fi implicată direct în splicing sau poate avea un efect indirect cum
ar fi stabilizarea conformaţiei ARN.
Relaţia dintre sintetază şi splicing este în concordanţă cu ideea că splicingul este originar
o reacţie mediată de ARN, care cu timpul a fost asistată de proteine care se leagă la ARN şi care
originar au alte funcţii. Capacitatea de auto-splicing a ARN in vitro poate reprezenta interacţia
biochimică de bază; structura ARN creează situsul activ, dar este capabilă să funcţioneze eficient
in vivo numai când este asistată de un complex proteic.
Conservarea structurii şi a mecanismului de splicing printre intronii din grupa I sugerează
că membrii nucleari şi mitocondriali au o origine evolutivă comună. O migrare trebuie să fi avut
loc între nucleu şi mitocondrie, dar pentru moment nu avem nici o informaţie privind direcţia în
care aceasta a avut loc.
Slide 37. Secvenţe consens la nivelul a diferite tipuri de situsuri de splicing
204
Slide 38. Mărimea moleculelor ARN U
Slide 39. Proteine din structura snRNP de la mamifere
Slide 40. Majoritatea transcripţiei şi procesarea ARN apare într-un număr limitat de domenii din
nucleul celulelor de mamifere Figura: Localizarea poliadenilării ADN şi afactorilor de splicing în
nucleul fibroblastelor de mamifere Imagine microscopică digitală folosită pentru reconstruirea
unei secţiuni de groase de 1 micro-metru dintr-un nucleu de fibroblaste colorat.
a) Secţiune colorată în urma marcării cu poli-dT cu rodamină roşie pentru a detecta procesul
de poliadenilare a ARN (roşu) şi cu DAPI pentru a detecta ADN (albastru). ARN poliadenilat este
localizat la un număr limitat de loci discreţi poziţionate între regiunile de cromatină, deşi nu toate
regiunile care conţin nivele scăzute de ADN conţin ARN poliadenilat detectabil (săgeţile).
b) Aceeaşi secţiune prezentată în a) colorată pentru a detecta ARN poliadenilat (roşu) şi
proteina esenţială implicată în splicing SC-35, care a fost vizualizat cu un antcorp monoclonal
marcat cu fluoresceină verde. Regiunile unde coloranţii s-au suprapus apar în galben. SC-35 este
prezentat în centru multor loci (săgeţi).
Slide 41. Concluzii
Precursorii ARNm de la eucariote sunt procesaţi prin adăugarea structurii “cap”, scindare 3’ şi
poliadenilare, sudarea exonilor (splicing) şi înlăturarea intronilor înainte de transportul ARNm în
citoplasmă unde urmează a fi tradus de către ribozomi;
Structura “cap” este adăugată la capătul 5’ al pre-ARNm, în formare, de către o enzima
specifică care este asociată cu domeniul CTD fosforilat al ARN polimerazei II, la puţin timp după
iniţierea transcripţiei;
Transcripţii pre-ARNm, în formare, sunt asociaţi cu o clasă de proteine de legare a ARN
numite hnRNP;
La majoritatea genelor care codifică pentru proteine, un semnal de poliadenilare conservat
(AAUAAA) este situat la 10-30 nucleotide în amonte de situsul poli(A) unde apare clivarea şi
poliadenilarea.
Un complex multiproteic care include poli(A) polimeraza (PAP) realizează scindarea şi
poliadenilarea pre-ARNm. O proteină nucleară de legare la poli(A), PABII, stimulează adăugarea
de resturi A de către PAP şi opereşte procesul odată ce “coada” poli(A) atinge 200-250 resturi;
Splicingul ARN este realizat de către un complex ribonucleo-proteic, numit “spliceozom”,
care este asamblat prin interacţiile a cinci particule RNPsn diferite, între ele, şi de asemenea cu
pre-ARNm. Spliceozomul catalizează două reacţii de transesterificare care sudează exonii şi
inlătură intronul sub forma unei structuri in “laso”, care este ulterior degradată.
Intronii autocatalitici de grup II, care au fost evidenţiaţi în genele cloroplastelor şi
mitocondriilor de la plante şi fungi, prezintă o structură secundară înalt conservată, care este
necesară pentru auto-splicing. Se consideră că particulele RNPsn din spliceozomi că au o structură
secundată similară cu cea a intronilor de grup II;
205
 Majoritatea transcripţiei şi procesarea ARN din nucleii celulelor eucariote se realizează la
nivelul unui număr limitat de domenii. O reţea proteică fibroasă din interiotul nulcleului formează
o matrice nucleară. Aceasta poate servi la organizarea unor centre de transcripţie şi procesare a
ARN
Slide 42. Reglarea procesării ARNm: proteina U1A inhibă poliadenilarea propriului pre-ARNm
Figura: Diagrama capătului 3’ al pre-ARNm care codifică proteina U1A, o secvenţă specifică a
unei proteine de legare la ARN care este parte componentă a complexului U1RNPsn. Legarea
proteinei U1A la ambele situsuri situate în amonte de blocurile situsului poli(A) de poliadenilare,
dar nu de clivare, a pre-ARNm. De reţinut că secvenţa semnalului de poliadenilare din amonte
diferă uşor de semnalul singular uzual AAUAAA. Această secvenţă neobişnuită se găseşte în
puţine molecule pre-ARNm.
Silde 43. “Splicing-ul” ţesut specific controlează expresia fibronectinelor alternative Figura:
“Splicingul” pre-ARNm al fibronectinei specific fibroblastelor şi hepatocitelor (splicing specific
tipului celular).
Gena fibronectinei (sus) conţine mai mulţi exoni care se pare că provin dintr-o genă
ancestrală care a suferit un număr de duplicări ale exonilor. Exonii cu secvenţe omologe sunt
prezentaţi cu aceeaşi culoare. În această diagramă, intronii (liniile subţiri albastre) nu sunt desenaţi
la scală; majoritatea lor sunt mult mai lungi decât orice alţi exoni. ARNm pentru fibronectină
produs de către fibroblaste include exonii EIIIA şi EIIIB, în timp ce aceştia sunt eliminaţi din
structura ARNm pentru fibronectină prezent în hapatocite.
Informatii suplimentare Splicingul alternativ: mai multe proteine codificate de o singură genă
Cea mai mare parte a genelor pre-ARNm sunt maturate după un mecanism care exclude
fiecare intron decupându-l la nivelul situsurilor de clivare 5’ şi 3’. Astfel, diferiţii exoni ai unui
transcript sunt conservaţi în ordinea iniţială sub forma unei secvenţe continue în molecula de ARN
matur (splicing constitutiv). Totuşi, anumite molecule de pre-ARNm pot fi maturate în mai multe
moduri determinând formarea unei familii de ARNm înrudite structural, fiecare posedând o
înşiruire diferită de exoni diferiţi, şi putând codifica o familie de proteine izoforme. Acest tip de
maturare a ARN este numit splicing alternativ. Un număr mare de gene de la Drosophila, om şi
virusuri sunt transcrise într-o moleculă pre-ARNm care suferă maturare (splicing) alternativă.
Aceste gene codifică pentru un număr mare de proteine dintre care unele sunt implicate în
constituirea citoscheletului, în contacţia musculară, sunt receptori membranari, hormoni
polipeptidici, sunt implicate în metabolismul intermediar şi în transpoziţia ADN.
Splicingul alternativ furnizează o modalitate de diversificare a informaţiei purtate de o genă
fără a modifica organizarea sa genomică. Acest mod de maturare reprezintă o manieră eficace de
a produce o varietate de ARNm care codifică pentru proteine înrudite în care secvenţele comune
sunt specificate de exoni comuni în timp ce secvenţele distincte derivă din exoni maturaţi diferit.
În anumite cazuri, moleculele de ARNm maturate diferit sunt produse în acelaşi timp, şi diferitele
molecule proteice izoforme pot asigura funcţii identice sau diferite. Cele patru proteine izoforme
care
206
stau la baza constituirii mielinei sunt toate componente ale anvelopei mielinice ale celulelor
sistemului nervos central; cele două izoforme de imunoglobuline sunt respectiv membranară şi
secretată. Anumite molecule transcript sunt maturate diferit în funcţie de ţesut. Astfel, o genă unică
exprimă calcitonina în tiroidă şi izoforma sa, o proteină înrudită prezentă în creier, fiecare fiind
formată de la acelaşi pre-ARNm maturat distinct. În anumite sisteme genetice (ex. gena troponinei
T de la mamifere şi din complexul Ultrabitorax de la Drosophila), cantităţile relative şi tipul de
splicing al moleculelor pre-ARNm sunt reglate în cursul dezvoltării. Splicingul alternativ are un
rol important în determinarea sexului în cursul embriogenezei la Drosophila. Diferenţele de
activitate ale genelor de reglare la masculi şi femele sunt datorate, în principal, diferitelor tipuri de
splicing, specific pentru sex, care conduce la producerea de molecule transcript cu funcţii distincte
la cele două sexe. În plus, activitatea genelor individuale în această ierarhie de reglare nu este
controlată numai la nivel de splicing, dar determină o schemă de splicing care acţionează ca urmare
a rezultatului acestei ierarhii.
Schema de splicing alternativ Au fost evidenţiate trei clase generale de splicing. Tipul I este
rezultatul utilizării de promotori diferiţi pentru a da naştere la molecule de pre-ARNm înrudite
formate din regiuni 5’ proximal distincte şi de lungimi variabile. Genele amilazei de la şoarece şi
a lanţului uşor al miozinei (CLM) de la vertebrate sunt exemple caracteristice acestei clase. Gena
CLM este transcrisă plecând de la doi promotori situaţi la aproximativ 10 kpb unul de celălalt.
Molecula de pre-ARNm cea mai lungă conţine toţi exonii în timp ce celei mai scurte îi lipseşte
primul. Splicingul alternativ produce două molecule de ARNm aproape egale conţinând fiecare
cinci exoni constitutivi în regiunea 3’ proximală dar diferă prin exonii poziţionaţi în 5’.
Maturarea celui mai lungi molecule de pre-ARNm, exonul 1 este legat de exonul 4, fiind
ignorate situsurile de clivare 3’ ale exonilor 2 şi 3. Din contră, la maturarea pre- ARNm mai
scurt sunt asociaţi exonii 2, 3 şi 5 şi nu se produce asocierea exonilor 3 şi 4. Analiza secvenţei a
demonstrat că situsul 3’ care flanchează exonul 2 este defectiv, ceea ce explică defectul de
asociere a exonilor 1 şi 2. Absenţa joncţiunii exonilor 1 şi 3, 3 şi 4 este atribuită altor cauze
distincte pe care le vom discuta mai târziu.
Cel de al doilea tip de splicing implică moleculele pre-ARNm care posedă secvenţe 3’
proximal de lungimi variabile, în general deoarece poliadenilarea transcriptului se face plecând de
la situsuri diferite. Cele cinci grupe diferite de ARNm tardiv de la adenovirusul 2 sunt rezultatul
splicingului alternativ posibil numai datorită folosirii a cinci situsuri de poliadenilare diferite.
Aceeaşi explicaţie ţine cont de originea celor două specii de ARNm ale lanţurilor grele ale
imunoglobulinei. Gena unică a calcitoninei de la mamifere produce două molecule de ARNm; una
provine dintr-un pre-ARNm scurt, cealaltă codifică pentru o peptidă înrudită cu calcitonina. Cei
patru exoni ai pre-ARNm scurt ai calcitoninei sunt reţinuţi. Molecula pre-ARNm lung conţine doi
exoni suplimentari, 5 şi 6; aceştia sunt prezenţi în ARNm al peptidei înrudite, dar exonul 4 este
absent. Situsul de joncţiune 3’ al intronului 4 este partenerul preferat al situsului 5’ al celui de al
treilea intron. În acest caz, maturările realizate sunt determinate de utilizarea de semnale de
poliadenilare diferite şi specifice de (pentru) ţesut.
În al treilea tip de splicing alternativ, care este cel mai variat şi cel mai neaşteptat, o
moleculă de pre-ARNm dă naştere la diferite molecule de ARNm funcţionale. Sunt prezenţi toţi
exonii potenţiali în pre-ARNm şi alegerea posibilităţilor de maturarea se realizează folosind exonii
existenţi. Schema joncţiunilor α şi β este
207
realizată în numeroase gene. Un bun exemplu îl constituie gena pentru troponina T din muşchii
scheletici rapizi. Grupele α şi β de ARNm ale troponinei T conţin respectiv exonul 16 sau exonul
17. Acesta este rezultatul asocierilor exonilor 15, 16 şi 18 sau 15, 17 şi 18. Alegerea exonului
utilizat este reglată în cursul dezvoltării. Astfel, exonul 16 este specific ARNm pentru troponina
din muşchiul adult şi exonul 17 este folosit în moleculele ARNm adulte şi embrionare. Cele 32 de
combinaţii posibile care implică exonii 4 la 8 sunt reprezentate în grupele α şi β; eşantionul de
molecule ARNm mature merge de la excluderea completă la reţinerea tuturor celor cinci exoni.
Pot exista şi procese de maturare care implică situsurile de clivare 5’ şi 3’ interne ale
exonilor sau ale intronilor. Astfel, clivarea la nivelul unui situs 5’ autentic este de obicei însoţită
de clivarea la nivelul situsului 3’ normal de la extremitatea intronului, dar există posibilitatea
clivării unui alt situs 3’ situat în intron, având ca rezultat lungirea exonului următor. Un rezultat
similar se obţine dacă are loc o clivare alternativă în intron sau în exon. Existenţa şi folosirea, unor
astfel de situsuri de joncţiune, «criptice» presupune că splicingul alternativ determină formarea
unor faze de lectură reale. Un astfel de splicing alternativ este folosit de către SV40 şi de către
virusul polioma pentru a exprima mai multe molecule de ARNm plecând de la un singur transcript
al regiunii precoce. Această modalitate de splicing atenuează distincţia între proprietăţile codante
ale exonilor şi intronilor.
Un exemplu interesant de splicing alternativ specific pentru ţesut este cel al genei care
codifică pentru elementul transpozabil P de la Drosophila. În acest caz, conservarea intronului care
conţine un codon «fără sens» (STOP), împiedică expresia transpozazei (proteinei responsabile de
transpoziţie) în ţesuturile somatice. Expresia acesteia în ţesuturile liniei germinale este rezultatul
eliminării intronului în aceste ţesuturi, permiţând extinderea secvenţei fazei deschise de lectură la
un exon necesar activităţii acestei enzime (transpozazei).
Un exemplu extrem de splicing diferenţial există în expresia genelor pentru retrovirus.
Provirusul integrat este transcris într-o copie completă de ARN genomic viral care este în final
împachetată în virion: nu are loc nici o clivare în molecula de ARN destinată virionilor. Dar
acelaşi transcript reprezintă şi ARN, care codifică pentru transcriptaza inversă şi proteina «core».
În plus, acelaşi transcript este un pre- ARNm care în urma maturării produce ARNm pentru
proteinele anvelopei. În cazul leucemiei umane a celulelor T şi a imunodeficienţei umane,
diferitele moduri de splicing al transcriptului primar produc diferite molecule de ARNm care
produc fiecare o proteină particulară necesară multiplicării virale sau patogenităţii. Selecţionarea
situsului de clivare
Principala enigmă relativ la splicingul constitutiv sau alternativ al pre-ARNm, este modul
în care sunt alese perechile de joncţiune corectă a exonilor. Pentru acest fenomen există două mari
categorii de explicaţii posibile. Una presupune existenţa unor structuri intrinseci ale pre-ARNm
sau a unor intermediari care apar în cursul formări ARNm: aceştia sunt factorii cis. O altă explicaţie
presupune implicarea unor factori care sunt poziţionaţi în trans, proteine sau alte molecule de ARN
care pot influenţa «alegerea» intronului care trebuie eliminat. Este foarte probabil să existe o
ierarhie de eficienţă a situsurilor de clivare, care ar putea reflectarea avantajului relativ al formării
spliceozomilor la situsurile 5’ şi 3’ cele mai favorizate. În cazul moleculelor de ARNm pentru
două antigene T ale SV40, cele două reacţii de clivare alternativă sunt determinate prin alegerea
punctului branşare a intronului. Există numeroase exemple care demonstrează că prezenţa unei
mutaţii la nivelul unui situs de joncţiune determină folosirea altui situs care de obicei nu era utiliza.
Există
208
numeroase argumente în favoarea idei că factorii care acţionează în trans determină rezultatul
reacţiilor de splicing. Acest lucru este adevărat când molecule de pre- ARNm, presupuse identice,
sunt maturate diferit, în funcţie de condiţiile fiziologice sau în ţesuturi particulare. Este posibil ca
particulele snRNP sau proteine de tipul maturazelor să poată fi exprimate, şi să funcţioneze, într-
un mod programat în timpul dezvoltării specifice a anumitor ţesuturi, influenţând astfel schema de
splicing. Multe dintre aceste puncte vor fi clarificate cu certitudine în anii următori.
Silde 44. Expresia proteinei Sxl 11.3 (Sex-lethal) în timpul embriogenezei la
Drosophila
Figura: Expresia proteinei “Sex-lethal” (Sxl) în timpul embriogenezei la Drosophila.
În moleculele de pre-ARNm, exonii sunt prezentaţi sub forma unor cutii roşii şi intronii ca
nişte linii albastre; splicingul este indicat prin linii punctate. O săgeată verticală roşie indică
codonul de start AUG de la care începe translaţia ARNm.
a) Timpuriu, în dezvoltare, pre-ARNm sxl este sintetizat din PE, care este activă numai la
embrionii femeli. Acest pre-ARNm este întotdeauna maturat aşa cum este prezentat în figură.
b) Mai târziu, în timpul dezvoltării, este sintetizat un pre-ARNm pentru sxl este sintetizat din
PL atât la femele cât şi la masculi. La masculi, acest transcript este maturat (spilice) pentru a da
naştere unui ARNm format din patru exoni. Deoarece exonul 3 conţine în structură un codon stop
(banda roşu închis), la masculi nu se produce o moleculă funcţională. La femele, fixarea proteinel
Sxl timpurii la pre- ARNm pentru Slx, împiedică splicingul exonilor 2 şi 3. ARNm rezultat, care
conţine trei exoni, este tradus într-o proteină funcţională Sxl, care şi aceasta se leagă la pre- ARN
pentru Sxl sintetizat mai târziu, asigurând producerea sa continuă la femele. De reţinut că exonul
2 al transcriptului timpuriu prezentat în a) este identic cu exonul 4 al transcriptului tardiv; b) Acest
exon codifică domeniul RNP care mediază legarea proteinei Sxl la ARN.
Silde 45. Cascada “splicing-ului”adaptativ care controlează diferenţierea sexuală la Drosophila
Figura: Cascada splicingului adaptativ (regulated = de reglare) care controlează expresia
genelor sxl (sex-lethal), tra (transformer) , şi dsx (doule-sex) din embrionii de Drosophila.
Pentru claritate, numai exonii (dreptunghiurile roşu deschis) şi intronii (liniile albastre)
supuşi splicingului reglator sunt prezentaţi. Splicingul este indicat prin linii punctate în faţă
(femele) sau în spate (mascul) faţă de pre-ARNm. Benzile roşu închis semnifică prezenţa unor
codoni stop în fazele de lectură, care împiedică sinteza unei proteine funcţionale. Numai embrionii
femeli produc proteine funcţionale Sxl, care împiedică splicingul între exonii 2 şi 3 din pre-ARNm
Sxl şi dintre exonii 1 şi 2 din pre-ARNm pentru tra. În contrast, legarea complexului Tra-Tra2 la
pre-ARNm pentru dsx activează splicingul între exonii 3 şi 4. Ca un rezultat al acestei cascade de
reglare a splicingului, proteine Dsx distincte sunt produse în embrionii femeli şi masculi.
209
Aceştia represează transcripţia genelor necesare pentru diferenţierea sexuală a sexelor opuse.
Silde 46. Mai multe izoforme proteice sunt comune sistemului nervos al vertebratelor Figura:
Splicingul alternativ al ARNm pentru slo care codifică canalul pompei de Ca2+/K+, în celulele
perilor auditivi care contribuie la percepţia sunetelor de diferite frecvenţe. (splice=matisare,
îmbinare)
a) Cohlea de pui, un tun de 5 mm, conţine un epiteliu cu celule ale perişorilor auditivi care
sunt adaptate unui gradient de frecvenţe vibraţionale de la 50 Hz la capătul apical (stânga) la 5000
Hz la capătul bazal (dreapta).
b) Proteina Slo conţine 7 alfa elice transmembranare (S0 la S6), care se asociază pentru a forma
canalul de K+. Domeniul citosolic, care include 4 regiuni hidrofobe (S7 la S10), reglează
deschiderea canalului ca răspuns la Ca2+. Izoformele canalului Slo, codificate de izoforme ARNm
obţinute prin de splicing alternativ pornind de la acelaşi transcript primar, se deschid la concentraţii
diferite de calciu. Numerele roşii se rteferă la regiunile în care splicingul alternativ produce diferite
secvenţe aminoacide în diferitele izoforme Slo. De exemplu, două secvenţe aminoacide (prezentate
în codul cu o literă) obţinute prin splicing alternativ în regiunea 3’ sunt prezentate în partea de jos
a figurii. Liniile de unire indică joncţiunile exonice. Splicingul la unul dintre situsurile de îmbinare
şi de reunire...AVS codifică în unul din exoni la GRK.... Celulele perişorilor de la capătul apical
al cohleei realizează numai splicing de secvenţe scurte, în timp ce celulele perişorilor de la capătul
bazal realizează ambele tipuri de splicing alternativ. Alte forme de splicing alternativ sunt
îmbogăţite în celulelor perişorilor auditivi în diferite localizări specifice de-a lungul lungimii
cohleei.
Silde 47. Concluzii Expresia anumitor proteine este reglată prin
controlarea procesării transcriptului primar al genei care codifică pentru aceasta. Acest tip de
reglarea genică este în special comun pentru genele care codifică proteine importante pentru
funcţionarea sistemului nervos la vertebrate;
Poliadenilarea pre-ARNmcare codifică proteina U1A este inhibată prin chiar legarea
proteinei U1A la două situsuri identice situate foarte aproape în amonte faţă de situsul poli(A) al
pre-ARNm pentru U1A. Drept rezultat, nu se produce ARNm funcţional, expresia proteinei U1A
fiind represată. Reglarea de acest fel nu este foarte comună;
“Splicingul” alternativ al transcripţilor primari produşi din unităţi complexe este adesea
reglat. Ca rezultat, pot fi exprimate diferite tipuri de ARNm pentru aceeaşi genă în diferite tipuri
celulare sau în diferite stadii de dezvoltare;
Splicingul alternativ poate fi reglat de către proteinele care se leagă la diferite situsuri
specifice din apropierea situsului reglare a matisării din structura ARN. Se consideră că inhibitorii
de splicing acţionează pentru a bloca steric accesul acestor factori la secvenţa ARN. Activatorii
procesului pot determina splicingul prin asocierea lor cu situsurile dfe reglarea a îmbinării
(matisării).
Silde 48. Porii nucleari asigură transportul activ al macromoleculelor între
 nucleu şi citoplasmă Figura: Complexul porului nuclear (NPC)
210
a) Anvelopa nucleară a ovocitelor de Xenopus vizualizată prin microscopie electronică Sus: faţa
citoplasmatică a complexului porului nuclear (NPC); Mijloc: faţa nucleoplasmică a anvelopei
nucleare după îndepărtarea membranei nucleare a NPC, arătând structura sub formă de coş; Jos:
Faţa nucleoplasmatică a anvelopei nucleare după îndepărtarea membranei nucleare prin
tratament blând cu detergent. Reteaua laminară, care se inserează în inelul nuclear al NPC, este
expus după acest tratament. b) Modelul schematic al NPC
Silde 49. Model pentru trecerea moleculelor de “mRNP” prin complexele porului nuclear
Figura: Modelul trecerii moleculelor RNPm prin complexul porului nuclear (NPC) bazat pe
studiile de microscopie electronică la Chironomous tentans
După curbare RNPm se deplasează prin inelul terminal, se extinde si trece prin regiunea
centrală a NPC cu capătul 5’ înainte asociindu-se cu ribozomii din citoplasmă. Se crede că NPC
suferă o modificare conformaţională în timpul transportului.
Silde 50. Determinarea heterocarionului evidenţiază diferenţele dintre proteina
A1 şi proteina C din “hnRNP” de la om privind trecerea prin porii nucleari
Figura: Utilizarea heterocarionilor demonstrează că proteina A1hnRPN poate
cicliza în şi în afara citoplasmei, în timp ce proteina umana C hnRNP nu poate
Heterocarionii au fost separaţi prin tratamentul celulelor Hela şi a celulelor de Xenopus în
cultură cu polietilen glicol. Celulele au fost tratate cu cicloheximidă imediat după fuziunea lor
pentru a împiedica sinteza proteică. După 2 ore, celulele au fost fixate şi colorate anticorpi specifici
pentru proteinele C şi A1 hnRNP marcaţi cu fluoresceină. Aceşti anticorpi nu se leagă la proteinele
de Xenopous omologe.
a) Un preparat fixat vizualizat prin microscopie în contrast de fază conţine celule HeLa
(capătul săgeţii) şi de Xenopous nefuzionate (săgeata punctată) ca şi heterocarioni fuzionaţi
(săgeata solidă). În heterocarionul din figură, nucleul rotund HeLa este în dreapta nucleului oval
de Xenopous.
b) şi c) Când acelaşi preparat este vizualizat prin microscopie de fluorescenţă , proteinele
colorate ChnRNP sunt colorate în verde şi A1 hnRNP în roşu. De reţinut că celulele nefuzionate
de Xenopous sunt necolorate confirmând că anticorpii sunt specifici pentru proteinele umane. În
heterocarion, hnRNP C apare în ambii buclei HeLa c);
b) Cu toate că sinteza proteică a fost blocată după fuziunea celulară, o parte din hnRPN A1
trebuie să fi părăsit nucleul celulelor HeLa să se deplaseze prin citoplasmă şi să intre în nucleul de
Xenopous di heterocarion.
Silde 51. Model privind exportul proteinelor nucleare cargo purtătoarea a unui semnal de export
nuclear bogat în leucină Figura: Mecanismul propus pentru transportul proteinelor “cargo”
conţinând un semnal de export nuclear bogat în leucină (NES nuclear export signal)
În nucleoplasmă, proteina exportina 1 se leagă cooperativ la NES din structura proteinei
cargo pentru a fi transportată şi la Ran-GTP. După formarea complexului cargo, acesta trece prin
complexul porului nuclear NPC şi RanGAP, localizat în
211
citoplasmă, stimulează transformarea ran-GTP în Ran-GDP. Modificările conformaţionale la
nivelul Ran care însoţesc acest proces conduce la disocierea complexului. Proteina cargo care
conţine semnalul de export nuclear NES este eliberată singură în citosol, în timp ce exportina 1 şi
Ran-GDP sunt transportate înapoi în nucleu prin intermediul prin complexele porului nuclear.
RCC1 localizată în nucleu stimulează transformarea Ran-GDP în Ran-GTP. Repetarea acestui
ciclu duce la exportul mai multor molecule de proteină cargo.
Silde 52. Model de export nuclear al moleculelor de ARNm mediat de “hnRNP” Figura:
Mecanismul propus pentru exportul nuclear al ARNm prin intermediul hnRNP
a) Capătul 5’ al complexului format din ARNm-hnPNP (RNPm) se asociază cu CBC (Cap
Binding Complex), care trece mai întâi prin Complexul Porului Nuclear (NPC).
b) hnRNP care trebuie să rămână în nucleu (potocaliu si albastru) sunt îndepărtate în timpul
trecerii RNPm prin NPC, aceste proteine cărora le lipseşte secvenţele NES (Nuclear Export Signal)
vor rămâne ăn nucleu în timp ce hnRNP purtătoare de NES, cum este A1 hnRNP , sunt transportate
pri NPC împreună cu ARNm pe care îl transportă în citoplasmă.
c) Complexul RanGAP stimulează hidroliza GTP de către Ran. Proteinele navetă hnRNP
disociază apoi de pe proteinele receptoare (exporetina 1 pentru semnale de export nujclear bogate
în leucină) care sunt transportate înapoi în nucleu. Apoi ARNm este disponibil să interacţioneze
cu prpteinele citosolice RNPm, inclusiv cu poli(A) binding protein (PABP), care se leagă în 3’ la
coada poli(A) a ARNm.
Silde 53. Proteinele purtătoare de semnale nucleare de localizare sunt recunoscute de receptori
şi transportate în nucleu Figura: Demonstraţie că Semnalul de Localizare Nucleară (NLS
Nuclear Localization Signal) al antigenului T al SV40 poate direcţiona o proteină citoplasmatică
în nucleul celular.
a) Piruvat kinaza normală, vizualizată prin imunofluorescenţă după tratarea celulelor în
cultură cu un anticorp specific, este localizată în citoplasmă.
b) O piruvat kinază himeră, care conţine un semnal NLS al SV40 la capătul său N-terminal,
este direcţionată către nucleu. Proteina himeră a fost exprimată în urma transfecţiei unei gene
modificate produsă prin fuziunea unui fragment al unei gene virale care codifică NLS al SV40 cu
gena piruvat kinazei.
Silde 54. Model de import a proteinelor citosolice purtătoare de semnale NLS Figura:
Mecanismul propus pentru proteinele de transport “cargo”care conţin un semnal de localizare
nucleară (NLS) din citoplasmă în nucleu.
În citoplasmă, importinele alfa şi beta interacţionează cooperativ cu proteina cargo pentru
a fi transportate, cu NLS care se leagă la importina alfa. Subunitatea beta a importinei beta al
complexului cargo trimeric rezultat cu componentele NPC, translocând complexul în
nucleoplasmă prin mecanisme slab înţelese, mecanisme care necesită hidroliza ATP. În
nucleoplasmă, Ran-GTP interacţionează cu importina beta,
212
determinând disocierea complexului cargo, eliberând proteina cargo liberă în nucleoplasmă.
Pentru a susţine un alt ciclu de import, importina alfa monomeră şi complexul importină
beta-Ran-GTP sunt transportate înapoi în citoplasmă. Proteina de activare RanGAP (Ran GTP
activating protein) din citoplasmă stimulează transformarea ran- GTP la Ran-GDP având drept
rezultat o transformare conformaţională la nivelul Ran care determină disicierea de importina beta.
Importina beta liberă interacţionează apoi cu importina alfa şi se formează un nou complex cargo
purtător al unui semnal bazic NLS, care iniţiază un alt ciclu de import nuclear. Se presupune că
Ran-GDP este de asemenea translocat prin porii nucleari din citoplasmă în nucleoplasmă, unde
factorul nucleotidic de schimb Ran (RCC1) determină eliberarea GDP şi relegarea GTP.
Silde 55. Proteina Rev a HIV Rev reglează transportul moleculelor de ARNm viral ne-maturate
Figura: Rolul proteinei Rev ăn transportul moleculelor de ARNm ale HIV din nucleu către
citoplasmă
Genomul HIV, care conţine regiuni codante suprapuse, este transcris într-un singur
transcript primar de 9 kb. În urma splicingului se obţin mai multe molecule ARNm de aproximativ
4 kb în urma splicingului unuia dintre introni (linia albastra în unghi), şi mai multe molecule de
ARNm de aproximativ 2 kb în urma splicingului a doi sau mai multi introni. După transportul în
citoplasmă, fiecare specie de ARNm este tradusă în citoplasmă în diferite proteine virale. Proteina
Rev, codificată de către ARNm de 2 kb, interacţionează cu RRE (rec Reponse Element) de la
nivelul moleculelor supuse şi nesupuse procesului de splicing, stimulând transportul lor în
citoplasmă.
Silde 56. Concluzii Anvelopa nucleară conţine numeroase
complexe ale porilor nucleari (NPC), sub forma unor structuri complicate, mari, compuse din
multe copii a aproximativ 50-100 proteine numite nucleoporine;
Ionii, metaboliţii şi proteinele mici difuzează liber prin porii nucleari, dar macromoleculele
mai mari de 60 kDa trebuie transportate activ prin procese care necesită ATP şi presupun probabil
modificări conformaţionale la nivelul complexului porului nuclear;
Atât în importul cât şi în exportul nuclear, proteinele care trebuie transportate conţin o
secvenţă de aminoacizi specifică care funcţionează ca semnal de export nuclear (NES) sau ca
semnal de localizare nucleară (NLS). Proteinele prezente numai în nucleu conţin un semnal NLS
dar nu şi unul NES, în timp ce proteinele care fac transferul între nucleu şi citosol conţin ambele
semnale;
În concordanţă cu modelele actuale, semnalele NES şi NLS din structura unei proteine
“cargo” interacţionează cu proteine receptor specifice implicate în transportul nuclear localizate în
nucleu în cazul exportului în citosol sau în citosol în cazul importului. Ambele procese de transport
necesită şi participarea proteinei Ran o GTP-ază care există în diferite conformaţii când leagă GTP
sau GDP;
O dată ce este asamblat un complex “cargo” se consideră că proteina receptor din complex
are contacte multiple cu nucleoporinele, transportând astfel complexul prin porul nuclear. După ce
un complex “cargo” ajunge la destinaţie (citoplasmă în timpul exportului şi nucleu în timpul
importului), disociază, eliberând proteina “cargo” şi celelalte proteine. Ultimele sunt transportate
prin porii nucleari în direcţie inversă pentru a participa la transportul altor molecule.
213
 Silde 57. Concluzii Dimensiunea unidirecţională atât a exportului
cât şi a importului se consideră că derivă din localizarea factorului RCC1 (Ran nucleotide-
exchange factor) în nucleu şi a RanGAP (Ran GTP-ase-activating protein) în citoplasmă;
În timpul exportului unei RNPm nucleare, compusă dintr-o moleculă de ARNm matură,
funcţională şi proteine hnRNP, sunt înlăturate moleculele hnRNP cu localizare nucleară, în timp
ce moleculele hnRNP purtătoare de semnale NES leagă molecula de ARNm şi o transportă prin
complexul porului nuclear. După trecerea în citosol, aceste molecule hnRNP navetă care posedă
şi semnale NLS sunt eliberate de ARNm şi transportate înapoi în nucleu pentru a participa la altă
etapă de export nuclear;
Au fost identificate multe tipuri diferite de semnale NES şi NLS. Se consideră că fiecare
clasă de semnale nucleare de transport interacţionează cu receptori proteici specifici. Receptorii
implicaţi în transportul nuclear se caracterizează prin prezenţa unor regiuni omologe care
interacţionează cu Ran şi cu anumite nucleoporine;
Moleculele pre-ARNm din structura unui “spliceozom” nu sunt exportate din nucleu. Nu
se cunoaşte mecanismul acestei inhibiţii de transport care acţionează până în momentul procesării
corecte. Sunt exportate numai moleculele de ARNm funcţionale care pot fi traduse în citoplasmă;
Proteina Rev a virusului HIV, care conţine un semnal NES, poate anula restricţiile
privind transportul moleculelor pre-ARNm cu situsuri specifice.
Silde 58. Editarea ARN modifică secvenţele moleculelor pre-ARNm
Figura: Editarea pre-ARNm pentru apo-B
ARNm pentru apo-B produsă în ficat are aceeaşi secvenţă ca şi exonii din transcriptul
primar. Acest ARNm este tradus în Apo-B 100, care prezintă două domenii funcţionale: unul N
terminal (verde) care se asociază cu lipidele şi un domeniu C-terminal (portocaliu) care se leagă
la receptorii LDL de pe membrana celulară. În cazul ARNm pentru apo-B din intestin, codonul
CAA din exonul 26 este editat la codonul UAA stop. Ca rezultat celulele intestinale produc Apo-
B48, care corespunde domeniului N-terminal al Apo-B100.
Informatii suplimentare
Editarea ARN (RNA editing) utilizează informaţii din diferite surse. O primă axiomă a
biologiei moleculare este aceea că secvenţa ARNm poate reprezenta numai ceea ce este codificat
în ADN. Dogma centrală propune o relaţie lineară în care o secvenţă de ADN este transcrisă într-
o secvenţă ARNm care este direct transformată într-o proteină. Existenţa genelor întrerupte şi
îndepărtarea intronilor prin splicingul ARN introduce un pas în plus în procesul de expresie al
genelor: secvenţele codante (exonii) din ADN trebuie să reconstituiţi în ARN. Procesul rămâne
astfel unu transfer al informaţiei în care codul purtat de secvenţa ADN nu este modificat.
Modificări ale informaţiei codificate de ADN apar în circumstanţe excepţionale, cel mai
reprezentativ exemplu fiind generarea de noi secvenţe care codifică pentru imunoglobuline la
mamifere şi păsări. Aceste modificări apar specific în celulele somatice (limfocitele B) în care
imunoglobulinele sunt sintetizate. Noua informaţie este generată în ADN-ul unui individ în timpul
procesului de reconstrucţie a genei imunoglobulinei; informaţia codificată în structura ADN este
modificată
214
printr-o mutaţie somatică. Informaţia din ADN continuă să fie transcrisă cu exactitate în ARN.
Editarea ARN (RNA editing-prelucrarea ADN) este un proces în care informaţia este
modificată la nivelul ARN. S-au evidenţiat situaţii în care secvenţa codantă din ARN diferă de
secvenţa ADN după care a fost transcrisă. Prelucrarea ARN apare în două situaţii diferite,
determinate de diferite cauze. În celulele de mamifere sunt situaţii în care substituţia (modificarea)
apare la o singură bază din structura ARNm, determinând o modificare a secvenţei proteinei
codificate. În mitocondriile de la Trypanosoma, modificări mai extinse apar în transcripţii multor
gene, când bazele sunt sistematic adăugate sau înlăturate.
În figură sunt prezentate secvenţele genei pentru apolipoproteina-B (apo-B) din intestinul
şi ficatul mamiferelor. Genomul conţine o singură (întreruptă) genă a cărei secvenţă este identică
în toate ţesuturile, cu o regiune codantă de 4563 codoni. Gena este transcrisă într-un ARNm care
este tradus într-o proteină de 512 000 Da reprezentând întreaga secvenţă codantă în ficat.
O formă mai scurtă a proteinei, aproximativ 250 000 Da, este sintetizată în intestin. Această
proteină constă în regiunea A-terminală a proteinei întregi. Ea este tradusă de pe o moleculă de
ARNm a cărei secvenţă este identică cu cea din ficat cu excepţia unei modificări a lui C în U la
codonul 2153. Această substituţie modifică codonul CAA pentru glutamină în UAA codon Stop
(ocru).
Cine poartă responsabilitatea acestei substituţii (ce realizează această modificare)? Nu a
fost evidenţiată în genom o genă alternativă sau un exon care să codifice pentru noua secvenţă, şi
nici nu a fost descoperită o modificare a modului de splicing (de maturare). În aceste împrejurări
se impune concluzia că modificarea s-a realizat direct în secvenţa transcriptului. Există o enzimă
care recunoaşte specific transcriptul apo-B şi modifică C2153 în T? O astfel de enzimă trebuie să
recunoască o anumită regiune a structurii secundare în mod analog enzimelor capabile să modifice
structura ARNt. Conceperea unui sistem in vitro pentru acest cercetarea acestui proces de
prelucrare sugerează că o secvenţă relativ mică (aprox. 50 baze) situată în vecinătatea situsului de
editare este o ţintă suficientă.
Prelucrarea în acest mode este rară, dar apo-B nu este unică. Un alt exemplu este furnizat
de receptorul pentru glutamat din creierul de şoarece. Prelucrarea unei singure poziţii modifică
codonul pentru glutamină, de pe ADN, într-un codon pentru arginină pe ARN; arginina joacă un
rol important în controlul fluxului ionic prin neurotransmiţător, astfel încât prelucrarea (editarea)
este în mod clar necesară pentru funcţionarea fiziologică.
Modificări dramatice ale secvenţei au fost detectate la numeroase gene mitocondriale de la
Trypanosoma. În primul rând s-a descoperit că în secvenţa subunităţii II a citocrom oxidazei
proteina are -1 frameshift (o modificare de cadru) faţă de secvenţa genei coxII. Secvenţele genei
şi proteinei, sunt conservate la mai multe specii de Trypanosoma. Cum funcţionează această genă?
ARNm al coxII prezintă un insert de patru nucleotide (toate uridine) lângă situsul de
frameshift. Inserţia restaurează faza de lectură corespunzătoare; aceasta inserează un aminoacid în
plus şi modifică aminoacizii pe fiecare parte pentru a crea faza de lectură corectă. Nu a mai fost
descoperită o a doua genă pentru această secvenţă, şi oamenii de ştiinţă sunt forţaţi să conchidă,
pentru moment, că aceste baze în plus au fost inserate în timpul sau după realizarea transcripţiei.
O discrepanţă asemănătoare între ARNm şi secvenţele genomice a fost găsită pentru genele SV5
şi în cazul para-mixovirusului care provoacă pojarul. În aceste cazuri este vorba de adăugarea unui
rest G în structura ARNm.
215
 Au fost evidenţiate secvenţe ARN prelucrate similar şi pentru alte gene. Aceste includ
deleţii sau adiţii de uridină. Este interesant cazul extraordinar al coxIII. Mai mult de jumătate din
resturile din structura ARNm constau în uridine care nu sunt codificate de genă. Compararea
ADN genomic şi a ARNm demonstrează că nu există structură mai mare de 7 nucleotide care să
nu fie modificată; inserţiile sunt formate din fragmente care conţin mai mult de 7 uridine. De
unde provine informaţia pentru inserarea specifică a uridinelor? O moleculă de ARN ghid
conţine secvenţa care este complementară cu ARNm corect prelucrat (editat). În figura este redat
un model pentru această acţiune în gena citocromului b de la Leishmania.
Secvenţa de sus arată transcriptul original, sau ARN pre-editat. Golurile reprezintă bazele
care urmează a fi inserate în urma procesului de prelucrare (editare). Pentru a crea o secvenţă
ARNm validă, în această regiune, trebuiesc inserate 8 uridine.
ARN ghid este complementar cu ARNm pe o distanţă semnificativă care includ regiunile
din jurul regiunii care urmează a fi prelucrată (edited region). Tipic, complementaritatea este mai
extinsă în regiunea 3’ a regiunii de prelucrare şi adesea mai redusă în regiunea 5’. Împerecherea
dintre ARNm ghid şi ARN pre-editat (pre- edited RNA) lasă spaţii (locuri) unde resturi
neîmperechiate din ARN ghid nu găsesc complementaritate în ARN pre-editat. Când reacţia este
completă, ARN ghid se separă de ARNm, care devine disponibil pentru translaţie (traducere).
Specificarea secvenţei finale editate poate fi complexă; în acest exemplu în acest exemplu
o secvenţă mai lungă este editată prin inserarea împreună a 39 de resturi U, dar acest proces pare
să necesite două molecule ARNs ghid, care acţionează la situsuri adiacente, fie simultan fie
succesiv. Ne putem imagina situaţii mult mai complicate în care, de exemplu, după ce o moleculă
ARN ghid ajută la crearea secvenţei prelucrate, aceasta este preluată de o altă moleculă ghid pentru
continuarea editării.
Moleculele ARNs ghid sunt codificate ca unităţi de transcripţie independente, exemplu la
harta regiunii mitocondriale la Leishmania Aceasta include ‘gena’ pentru citocromul b, care
codifică pentru secvenţele pre-editate şi două regiuni care specifică moleculele ARNs ghid. Genele
pentru regiunile codante majore şi pentru moleculele lor ARNs ghid sunt răspândite (separate)
În principiu, o mutaţie fie în ‘genă’ sau în structurile care codifică ARNs ghid pot schimba
secvenţa primară a ARNm, şi astfel pe cea a proteinei. Pe criterii genetice, fiecare dintre aceste
unităţi pot fi considerate că conţin o regiune ‘genă’. Dacă unităţile sunt exprimate independent, ele
pot complementa desigur in trans. Dacă mutaţiile sunt valabile, putem găsi prin urmare că sunt
necesare 3 grupe de complementare pentru a codifica pentru secvenţa primară a unei singure
proteine.
Analiza şi caracterizarea intermediarilor parţial editaţi (prelucraţi) sugerează că reacţia se
desfăşoară de-a lungul ARN pre-editat în direcţia 3’-5’. Molecula ARN ghid are nu numai rolul
de a dicta specificitatea inserării uridinelor prin împerecherea sa cu ARN pre-editat dar şi de a
furniza concret resturile U care sunt inserate.
Molecula ARN ghid se termină în cu regiuni de 3-5 resturi de uridină, după care
următoarele uridine sunt adăugate pentru a genera cozile 3’-oligo U. Cozile au o lungime
eterogenă, variind de la 5 la 24 resturi U. Aceste uridine sunt inserate în ARN prelucrat printr-o
reacţie care se aseamănă cu splicingul intronilor din grupa I. Împerecherea dintre ARN ghid şi
ARN pre-editat se aseamănă cu împerecherea dintre regiunea IGS a intronului şi exonul 5’. Reacţia
se realizează prin două transesterificări.
216
 În primul transfer, regiunea care urmează a fi prelucrată este atacată de 3’-OH al ultimului
rest de uridină din coada ARN ghid cu care este împerechiat. Aceasta realizează ruperea ARN pre-
editat în două părţi. O parte o reprezintă regiunea 5’, terminată printr-o grupare 3’-OH. Cealaltă
parte este o moleculă hibrid în care coada 3’ a ARN ghid este legată covalent la ARN care urmează
a fi prelucrat. Acest intermediar este o moleculă lineară a cărei structură este menţinută prin
împerecherea bazelor.
În cel de al doilea transfer, gruparea 3’-OH generată în urma primului transfer atacă
legătura dintre cele două resturi U din regiunea cozii ARN ghid. Se reface astfel integritatea
moleculei ARN pre-editată, care a câştigat un rest U şi se reface structura ARN ghid, care a pierdut
un rest uridină din coadă. Ciclul se repetă până la terminarea procesului.
Structurile moleculelor parţial prelucrate sugerează că resturile de uridină sunt adăugate
una câte una şi nu în grup. Este posibil ca reacţia să se realizeze prin mai multe cicluri în care
resturi de uridină sunt adăugate, testate pentru complementaritatea lor cu molecula ATN ghid,
reţinute dacă sunt acceptate şi dacă nu înlăturate. Astfel ia naştere gradat o moleculă de ARN
corect prelucrată. Nu se ştie încă dacă acelaşi tip de reacţii se desfăşoară şi în cazul în care
prelucrarea moleculelor presupune înlăturarea de resturi U sau adăugarea de C.
Silde 59. Editarea ARN la protozoare Figura: Mecanismele de editare a
moleculelor de ARNm din kinetoplastul de la Tripanosoma.
O secvenţă ancoră (albastru) din moleculă de pre-ARNm ne-editată hibridizează cu o
secvenţă ancoră (galben) situată în poziţia 5’ a unei secvenţe ARN ghid (ARNg), care
direcţionează apoi adăugarea sau îndepărtarea de resturi U. Este prezentată numai o mică regiune
a pre-ARNM. Resturile U adăugate sunt prezentate în roşu iar cele ăîndepărtate prin delta.
Numerele încercuite identifică situsurile la nivelul cărora apare editarea.
Silde 60. Durata de viaţă a moleculelor de ARNm
Silde 61. Efectul destabilizator al secvenţelor AUUUA asupra timpului de înjumătăţire al ARNm
(t1/2) Figura: Demonstraţia experimentală a efectului de destabilizare a secvenţelor AUUUA
asupra jumătăţii de viaţă (T1/2) a ARNm
Celulele în cultură au fost transfectate separat cu vectori de expresie care conţin secvenţele
beta-globinelor prezentate în diagramă şi au fost determinate jumătăţile de viaţă ale ARNm
exprimaţi . Secvenţele AUUUA (roşu) au fost ale genei care codifică pentru o citokină numită
factor care stimulează coloniile granulocite- macrofage (GMCSF), al căror ARNm are o durată de
viaţă de aproximativ o oră. Inserarea lor în genele beta-globinei, care în mod normal exprimă o
moleculă de ARNm stabilă, având drept rezultat scurtarea vieţii ARNm recombinant pentru beta-
globină.
Silde 62. Viteza de degradare a moleculelor de ARNm de la eucariote este reglată Figura:
Reglarea Fe-dependentă a stabilităţii ARNm pentru receptorul pentru transferină
217
 Elementele de răspuns la Fe (IRE) poziţionate în 3’ în structura ARNm prezintă o structură
stem sub formă de buclă bogată în secvenţe AU (galben) care promovează degradarea ARNm. La
concentraţii intracelulare scăzute în Fe, conformaţia IRE-BP (verde închis) este aceea care se leagă
la IRE, inhibând astfel degradarea. Drept rezultat, nivelul receptorului pentru transferină creşte,
astfel încât mai mult Fe poate fi adus în celulă.
Silde 63. Translaţia unor molecule de ARNm este reglată specific de proteine de
legare Figura: Reglarea dependentă de Fe a translaţiei ARNm pentru feritină.
La concentraţii scăzute în Fe legarea IRE-BP blochează iniţierea translaţiei. Acelaşi
mecanism controlează translaţia ARNm care codifică ALA sintaza. Elementele IRE ale acestor
două molecule de ARNm sunt localizate la capătul 5’ şi nu conţin secvenţe bogate în AU care să
promoveze degradarea şi sunt prezente în regiunea 3’ a ARNm al receptorului pentru transferină.
Silde 64. ARN antisens reglează translaţia ARNm al transpozazei la bacterii Figura: Controlul
antisens al translaţiei ARNm al transpozazei codificată de elementul bacterian mobil IS10
Capătul 5’ al ARNm al transpozazei (roşu) produs de pe catena mai mică care începe la
PIN, este complementar cu capătul 5’ al moleculei ARN antisens (negru), produsă de catena de
deasupra care începe la POUT. Deoarece POUT posedă un promotor mai puternic decât PIN, se
va produce mai mult ARN antisens decât transpozază, astfel încât tot ARNm pentru transpozază
hibridizează cu ARN antisens mai abundent. Atât timp cât codomul de start AUG (verde) şi
secvenţa de legare la ribozom Shine-Dalgarno (galben) sunt în regiunea hibridizată, iniţierea
translaţiei ARNm al transpozazei este blocată. Foarte rar translaţia ARNm pentru transpozază este
iniţiată înaintea hibridizării cu ARN antisens, conducând la o rată redusă a transpoziţiei IS10
Silde 65. Concluzii
Editarea ARN reprezintă modificarea secvenţei nucleotidice a pre-ARNm în nucleu. Cele câteva
exemple de editare descoperite la vertebrate implică dezaminarea unei singure baze din secvenţa
ARNm, având drept rezultat modificarea aminoacidului specificat de codonul corespunzător şi
producerea unei proteine funcţionale diferite. Procese de editare mult mai ample sunt prezente la
ARNm mitocondrial de la protozoare;
Anumite molecule de ARNm sunt direcţionate către localizări subcelulare de către secvenţe
poziţionate, de obicei, în regiunea 3’ netradusă. Se consideră că aceste secvenţe sunt ţinte pentru
proteine care se leagă specific la ARNm şi care sunt asociate cu proteinele motoare. Proteinele
motoare transportă apoi ARNm în poziţii specifice prin deplasarea de-a lungul filamentelor de
actină ale citoscheletului sau microtubulilor;
Stabilitatea diferitelor molecule de ARNm în citoplasmă variază foarte mult. Totuşi, multe
molecule de ARNm de la eucariote sunt destul de stabile iar altele au durate de viaţă foarte scurte.
Acestea din urmă, codifică adesea pentru proteine si, în general, posedă copiii repetitive ale
secvenţei AUUUA la capătul 3’ netradus. Printr-
218
un mecanism necunoscut aceste secvenţe bogate în AU stimulează degradarea ARNm;
Celulele eucariote pot regla rata de degradare sau traducere a unor molecule de ARNm. De
exemplu, interacţia unei proteine specifice de legare la ARN cu situsurile regiunii 3’ netraduse din
structura ARNm pentru receptorul transferinei protejează ARNm de degradarea mediată de
secvenţele bogate în AU. Aceeaşi proteină, a cărei activitate este reglată de concentraţia
intracelulară de Fe, blochează translaţia mai multor tipuri de ARNm legându-se la secvenţe
specifice din regiunea 5’ netradusă;
La bacterii, translaţia anumitor molecule de ARNm este represată de molecule ARN
antisens, care hibridizează la capătul 5’ al ARNm, prevenind astfel translaţia prin blocarea
accesului subunităţii ribozomale mici la codonul de iniţiere.
Silde 66. Genele pre-ARNr sunt similare la toate eucariotele Figura: Structura generală
a unităţilor transcripţionale pre-ARNr
Cele trei regiuni codante (albastru) codifică pentru ARNr 18S, 5,8S şi 28 S prezente în
ribozomii eucariotelor superioare sau a echivalenţilor lor de la alte specii. Ordinea acestor trei
regiuni codante în genom este întotdeauna 5’-3’. Variaţiile de lungime ale regiunilor spacer
transcrise (tan) sunt responsabile de diferenţa majoră de lungime a unităţilor de transcripţie de la
diferite organisme.
Silde 67. Genele pre-ARNr funcţionează ca organizatori nucleolari Figura: Micrografie a
cromozomilor politeni preparaţi de la muscă şi care conţin o singură transgenă pre-ARNr
Silde 68. snoRNAs (small nucleolar RNAs) asistă procesarea ARNr şi
asamblarea subunităţilor ribozomale Figura: Procesarea pre-ARNr şi
asamblarea ribozomilor la eucariote
a) Intermediarii majori şi timpul necesar pentru diferitelor etape de procesare a pre-ARNr la
eucariotele superioare. Proteinele ribozomale şi nucleolare asociate cu pre-ARNr 45S imediat
după sinteza sa, formează o moleculă pre-RNP de 80S. Sinteza ARNr 5S apare în afara
nucleolului. Secvenţa secundară extinsă a ARNr nu este reprezentată. De reţinut că acest ARN
constituie aprope 2/3 din masa subunităţilor ribozomale şi proteina numai 1/3.
b) Calea de procesare a transcriptului primarpre-ARNr de 6,6 kb (35 S) la Sacharomices
cerevisiae. Regiunile spacer transcrise (tan) care sunt înlăturate în timpul procesării, separă
regiunile corespunzătoare formelor mature 18S, 5,8 S şi 25 S ARNr. Au fost identificaţi toţi
intermediarii trecuţi în diagramă.
Silde 69. Moleculele de pre-ARNt suferă scindare şi modificarea bazelor Figura: Procesarea
pre-ARNt pentru tirozină implică patru tipuri de modificări
Un intron de 14 nucleotide (albastru) din bucla anticodon este îndepărtat prin splicing. O
secvenţă de 16 nucleotide (verde) de la capătul 5î este clivată de către RN- aza P. Resturile U de
la capătul 3’ sunt înlocuite de către secvenţa CCA (roşu) care se găseşte în toate moleculele ARNt
mature. Numeroase baze din bucla stem sunt transfoirmate în baze modificate caracteristice
(galben). Nu toţi ARNt conţin introni care sunt matisaţi în timpul procesării, dar toţi suferă alte
tipuri de modificări evidenţiate în figură.
219
D=dihidrouridină; Ψ=pseudouridină
Silde70. “Splicing-ul” moleculelor pre-ARNt diferă de celelalte mecanisme de
“splicing” Figura: Mecanismul splicingului ăn pre-ARNt
pre-ARNt este clivat în două locuri, de o parte şi de alta a intronului, excizând astfel
intronul. Mecanismul de clivare generează un fosfomonoester 2’-3’ ciclic la capătul 3’ al exonului
5’. Reacţia de joncţiune dintre doi exoni este o reacţie în multe etape care necesită doi nucleozid
trifosfaţi: GTP, care contribuie la gruparea fosfat (galben) pentru joncţiunea 3’-5’ din molecula
finală ARNt; şi o moleculă ATP care formează un intermediar ligază-AMP activat- Gruparea 2’
fosfat a exonului 5’ este înlăturată în etapa finală.
Informatii suplimentare Splicingul ARNt
Modul în care sunt eliminaţi intronii ARNt a fost cel mai bine studiat şi înţeles la drojdie,
dar anumite informaţii au fost oferite în urma studiului altor eucariote inferioare şi plante. Toate
enzimele implicate sunt cunoscute şi purificate şi toţi intermediarii sunt caracterizaţi. O
endonuclează specifică pentru ARNt taie pre-ARNt la nivelul joncţiunii 5’ a intronului, formând
un 2’, 3’-fosfodiester ciclic la extremitatea regiunii 5’ a ARNt. Aceeaşi enzimă taie joncţiunea
celuilalt intron producând o grupare 5’ hidroxil la extremitatea părţii 3’ a ARNt. Aceste clivări ne
aduc aminte de cele realizate de anumite RN-aze. Fosfodiesterul ciclic este apoi deschis de către o
fosfodiesterază ciclică pentru a forma un 2’ fosfomonoester. După fosforilarea extremităţii sale 5’
hidroxil, exonul 3’ este adenilat de către o ligază specifică pentru ARNt; această ultimă reacţie
este identică cu cea catalizată de către ADN ligaze. Legarea celor două jumătăţi de molecule prin
intermediul extremităţilor lor activate creează o legătură neobişnuită 2’ fosfat, 3’, 5’ fosfodiester.
Eliminarea fosfatului din 2’, de către o fosfatază duce la formarea ARN matur. De reţinut că
fosfatul noii legături diester provine din ATP. Aceasta este o caracteristică care distinge maturarea
ARNt de la drojdii de cea de la vertebrate. În această serie de reacţii, clivarea endonucleazică
iniţială determină formarea de extremităţi 5’ hidroxil şi 3’ fosfomonoester, acesta din urmă fiind
convertit în 2’, 3’ fosfodiester de către o ciclază ATP dependentă. O ligază specifică pentru ARNt
uneşte apoi cele două jumătăţi fără a necesita activarea extremităţilor.
Fracţionarea sistemului de splicing de la drojdii a dus la obţinerea unor preparate înalt
purificate a două enzime. Una catalizează clivarea endonucleotidică la nivelul joncţiunilor
intronului, iar cealaltă posedă, la nivelul unei singure polipeptide, activitatea fosfodiesterazică,
kinazică, de adenilare şi ligazică. Cele două enzime sunt foarte specifice pentru reacţiile de splicing
ale ARNt; ele reacţionează totuşi fără a face distincţie asupra tuturor intronilor ARNt şi unesc
oricare două fragmente de ARNt. Astfel au putut fi construite molecule de ARN hibride foarte
interesante, formate din două jumătăţi de molecule de la ARNt diferiţi.
Silde 71. *Organizarea transcriptului primar ARNr 45S Structura “cap de
ciocan” a unei ribozime Figura: Organizarea transcriptului primar ARNr 45S;
Structura “cap de ciocan” a unei ribozime
220
Informatii suplimentare Capacitatea catalitică a ARN de a schimba conţinutul
informaţional al ARN şi rolul intronilor
Ideea că numai proteinele au activitate enzimatică a fost total răsturnată în biochimie.
Multă vreme identificarea enzimelor cu proteinele a condus la punctul de vedere că numai
proteinele, cu variatele lor structuri tridimensionale şi grupări laterale, posedă flexibilitatea să
creeze situsuri active care să catalizeze reacţiile biochimice. Caracterizarea sistemelor implicate
în procesarea ARN a demonstrat că acest punct de vedere era deosebit de simplist.
Numeroase tipuri de reacţii catalitice sunt acum cunoscute ca fiind catalizate de ARN.
Pentru a desemna un ARN cu proprietăţi catalitice se foloseşte termenul de ribozime şi este deja
posibilă caracterizarea activităţii enzimatice ca şi în cazul enzimelor convenţionale. Unele
activităţi catalitice ale ARN sunt direcţionate către substrate separate, în timp ce altele sunt
intramoleculare şi sunt descrise ca auto- maturare sau auto-splicing, în funcţie de tipul de reacţie:
- Enzima ribonucleaza P este o ribonucleoproteină care conţine o singură moleculă de ARN
legată la o proteină. ARN posedă capacitatea de a cataliza clivarea substratului ARNt, în timp ce
componenta proteică are un rol indirect, probabil în menţinerea structurii ARN catalitic.
- Moleculele mici de ARN din clasa viroizilor au capacitatea de a realiza reacţii de auto-
clivare (self-cleavage). Cu toate că aceste reacţii sunt intramoleculare, molecula poate fi împărţită
într-o parte «enzimatică» şi o parte «substrat» ale căror funcţii sunt independente.
- Intronii din grupa I posedă capacitatea de a-şi realiza propria maturare din pre-ARNm în
care sunt conţinuţi Reacţia poate fi realizată în vitro numai de către ARN, dar in vivo ea este
asistată de proteine. Acţiunea intronilor din grupa I generează molecule ARN care posedă multe
alte activităţi catalitice corelate cu activitatea de origine.
Tema comună a acestor reacţii este că ARN poate realiza reacţii intra şi inter- moleculare
care implică clivarea sau reunirea legăturilor fosfodiester in vitro. Cu toate că specificitatea
reacţiilor şi a activităţii catalitice de bază este furnizată de ARN, proteinele asociate cu acesta sunt
necesare pentru realizarea reacţiei in vivo.
Splicingul ARN nu reprezintă singura modalitate prin care se pot introduce modificări în
conţinutul ARN. În procesul de «ARN editing», modificările sunt introduse la nivelul unor baze
individuale, sau prin adăugarea de baze particulare în anumite poziţii din interiorul ARNm.
Inserarea de baze (de obicei resturi de uridină) apare pentru transcripţii diferitelor gene
mitocondriale de la anumite eucariote inferioare; anumite forme de splicing sunt utilizate pentru
ruperea sau refacerea legăturilor dintre nucleotide, dar necesită, în acelaşi timp, o matriţă pentru
codificarea informaţiei în noua secvenţă.
Intronii au fost prima dată descoperiţi la eucariotele superioare. Nu au fost evidenţiaţi la
eubacterii (E. coli) dar au fost descoperiţi acum câţiva ani la anumite archeobacterii (ceea ce ridică
câteva probleme de filogenie). Acum nu se mai admite, cum se credea în anii 1970-1980, că
eucariotele descind din procariote. La ora actuală considerăm, în urma diferitelor studii
comparative ale secvenţelor acizilor nucleici că nu există omologie, că archeobacteriile,
procariotele şi eucariotele sunt linii independente. În 1981, Woese propune să se considere că cele
trei direcţii au un strămoş comun «progenotele». De aceea Woese propune termenul de «archeas»
în locul celui de archeobacterii pentru a evita ideea unei filiaţii între acestea şi bacterii.
221
Intronii din grupa I au o structură secundară caracteristică
Toţi intronii din grupa I au o structură secundară caracteristică (şi probabil şi secundară).
În figură este dat un model pentru structura secundară a intronului de la Tetrahymena care constă
în formarea a 9 scurte regiuni de baze perechi (P1-9). Două dintre aceste perechi de baze sunt
generate între elemente de secvenţă conservate care sunt comune intronilor din grupa I. P4 este
construit din secvenţele P şi Q, care au fiecare o lungime de 10 baze; 6-7 baze fiind implicate în
împerechere. P7 este format din secvenţele R şi S, care au o lungime de 12 baze, dar numai 5 baze
sunt implicate în împerechere. Celelalte perechi de baze variază ca secvenţă în fiecare intron
individual. Analize de mutaţii au identificat un o regiune «core» (intron core) care conţine P3, P4,
P6 şi P7, care furnizează a regiune minimă care poate realiza reacţia catalitică. P1 include capătul
3’ al exonului stâng. Secvenţa din interiorul intronului care se împerechează cu exonul este
denumită IGS (internal guide sequence). (Acest nume reflectă faptul că iniţial regiunea situată
imediat în 3’ faţă de secvenţa IGS se considera că se împerechiază cu joncţiunea de splicing 3’,
aducând astfel cele două joncţiuni împreună). O secvenţă foarte scurtă de două perechi de baze
situată între P7 şi P9 se împerechează cu secvenţa care precede imediat guanina reactivă (G414 la
Tetrahymena) la capătul 3’ al intronului.
Importanţa împerecherii bazelor în crearea structurii «core» în ARN este demonstrată de
proprietăţile mutaţiilor cu acţiune în cis (cis-acting) care împiedică splicingul intronilor din grupa
I. Astfel de mutaţii au fost izolate pentru intronii mitocondriali de la mutanţi care nu putea
îndepărta un intron in vivo, şi au fost izolate pentru intronul de la Tetrahymena prin transferarea
reacţiei de splicing într-un mediu bacterial.
Construcţia arătată în figură permite ca reacţia de splicing să fie realizată la E. coli. Intronul
auto-maturabil (intronul care suferă auto-splicing) este plasat într-o poziţie care întrerupe cel de al
10-lea codon secvenţei codante a β-galactozidazei. Proteina poate fi astfel tradusă cu succes după
ARN numai după înlăturarea intronului.
Sinteza β-galactozidazei în acest sistem indică că splicingul poate să apară în condiţii foarte
diferite de cele în care s-a realizat pentru Tetrahymena in vitro. O interpretare a acestor rezultate
este că auto-splicingul poate să se realizeze şi în celulele bacteriene. O altă posibilitate este aceea
ca enzimele bacteriene să realizeze această reacţie.
Folosind această încercare, putem introduce mutaţii în intron pentru a vedea dacă acestea
împiedică reacţia. Mutaţiile în secvenţele consens ale intronilor din grupa I care modifică
împerecherea bazelor împiedică splicingul. Mutaţiile pot fi inversate (reversie) prin realizarea unor
modificări compensatoare care să restaureze împerecherea bazelor.
Mutaţiile în secvenţele consensus corespunzătoare intronilor mitocondriali din grupa I au
efecte similare. O mutaţie într-o secvenţă consens poate fi inversată printr- o mutaţie în secvenţa
consens complementară pentru a restaura împerecherea; de exemplu, mutaţiile în regiunea consens
R pot fi compensate prin mutaţii în regiunea consens S.
Împreună aceste rezultate sugerează că reacţia de splicing a intronilor din grupa I depinde
de formarea structurii secundare între secvenţele consensus pereche din interiorul intronului.
Principiul stabilit în urma acestor cercetări este că secvenţele distante de joncţiunile de splicing
sunt necesare pentru formarea situsului activ care este capabil să realizeze auto-splicingul.
Ribozimele pot avea activităţi catalitice variate
222
 Activitatea catalitică a intronilor din grupa I a fost descoperită în virtutea capacităţii lor de
automaturare, dar aceştia pot realiza şi alte reacţii catalitice in vitro, care le-a adus numele de
ribozime. Toate reacţiile pe care ei le realizează se bazează pe transesterificări. Noi analizăm aceste
reacţii în termenii relaţiilor acestora cu reacţia de auto-splicing.
Activitatea catalitică a intronilor din grupa I este conferită de abilitatea acestora de a genera
o structură secundară şi terţiară particulară, care creează situsuri active, echivalente cu situsurile
active ale enzimelor convenţionale. În figură este ilustrată reacţia de splicing în termenii acestor
situsuri (luând în considerare formarea acestor situsuri)(este vorba de aceeaşi serie de reacţii
prezentată anterior.
Helixul P1 reprezintă formarea situsului care leagă substratul (substrate- binding site), în
care capătul 3’ al primului intron se împerechează cu IGS într-o reacţie intramoleculară . Situsul
care leagă guanozina (guanosin binding site) este format de secvenţele din P7. Acest situs poate fi
ocupat fie de un nucleotid guonozilic liber, fie de un rest de guanozină din poziţia 414. În prima
reacţie de transfer este folosit nucleotidul guanozilic care apoi este înlocuit cu G414. De reţinut că
acest fapt implică modificări ale conformaţiei (comparabile probabil cu modificările
conformaţionale care au loc într-o enzimă). Cel de al doilea transfer realizează unirea exonilor şi
cel de al treilea creează intronul circular.
ARN L-19 este generat prin deschiderea intronului circular. Acesta păstrează încă abilităţi
enzimatice. Acestea sunt asemănătoare cu activităţile implicate în reacţia originală de splicing.
considerăm că o moleculă are funcţie de ribozimă în condiţiile în care păstrează capacitatea de a
se lega la o secvenţă intramoleculară complementară cu IGS la nivelul situsului de legare a
substratului, în timpul legării fie a nucleotidului G414 terminal sau a nucleotidului guanilic liber
la G-binding site.
În figură este ilustrat mecanismul prin care se realizează extensia unui nucleotid C5 pentru
a genera un lanţ C6. Oligonucleotidul C5se leagă la nivelul «substrate binding site», în timp ce
G414 ocupă «G-binding site». Prin reacţiile de transesterificare, un C este transferat de pe C5 pe
G situat în poziţie 3’ terminală şi apoi înapoi pe o nouă moleculă C5. Următoarele reacţii de
transfer conduc la acumularea unui oligonucleotid citozinic mai lung. Reacţia este o adevărată
cataliză deoarece ARN L-19 rămâne neschimbat, şi este disponibil să catalizeze mai multe cicluri.
Ribozimul se comportă astfel ca o nucleotidil-transferază.
O serie de alte reacţii enzimatice sunt prezentate în figură. Ribozima poate funcţiona ca o
endoribonuclează specifică pentru un anumit tip de secvenţă prin folosirea capacităţii IGS de a se
lega la secvenţe complementare. În acest exemplu, IGS leagă o matriţă externă care conţine
secvenţa CUCU, în loc să lege secvenţa analogă care se află de obicei la capătul exonului stâng.
Un nucleotid guanilic este prezent în «G-binding site», şi atacă secvenţa CUCU exact în modul în
care este atacat exonul în prima reacţie de transfer. Se realizează clivarea secvenţei ţintă într-o
moleculă 5’ care se aseamănă cu exonul stâng, şi într-o moleculă 3’ care poartă la capăt un rest G.
Prin introducerea de mutaţii la nivelul elementului IGS, este posibilă modificarea specificităţii
ribozimei, astfel încât acesta să recunoască secvenţele complementare noii secvenţe din regiunea
IGS.
Reacţia de clivare poate fi realizată şi cu un substrat dezoxiribonucleotidic complementar
dar legarea moleculei de ADN se realizează mult mai slab ier reacţia de clivare are lob mult mai
lent. Deoarece unica diferenţă între substratele ADN şi ARN este lipsa grupării 2’-OH din structura
ADN, se sugerează ideea că aceste grupări sunt importante pentru legarea/sau desfăşurarea
reacţiei. Acest lucru
223
reprezintă un argument în sprijinul ipotezei că splicingul este o proprietate a «lumii ARN», în
care ARN constituia forma iniţială de material genetic.
Odată cu modificarea IGS se schimbă şi specificitatea «substrate binding site» fiind
permisă utilizarea altor secvenţe ARN ţintă şi generarea unei activităţi de tip ligază. O moleculă
ARN care posedă un capăt 3’-OH se poate lega la «substrate binding site», iar ARN care posedă
un capăt 5’-G se leagă la «G-binding site». Atacul grupării hidroxil asupra grupării fosfat
realizează conectarea celor două molecule de ARN şi eliberarea restului G.
Reacţia fosfatazei nu este direct legată de reacţiile de transfer ale splicingului (maturării).
O secvenţă oligonucleotidică care este complementară cu IGS şi terminată în 3’-fosfat poate fi
atacată de G414, fiind astfel eliberat un oligonucleotid care posedă o extremitate 3’-OH. Fosfatul
poate fi transferat fie pe un oligonucleotid terminat în 3’-OH (realizarea efectivă a reacţiei inverse)
fie apei (eliberarea de fosfat anorganic)
Reacţiile catalizate de ARN pot fi caracterizate la fel ca şi reacţiile enzimatice clasice, în
termenii cineticii Michaelis-Menten. În tabel sunt trecute în revistă reacţiile catalizate de ARN.
Valorile KM ale reacţiilor catalizate de ARN sunt scăzute, ceea ce implică o legare foarte
specifică a ARN la substratele asupra cărora acţionează. Numerele de turnover sunt şi ele scăzute
reflectând o viteză catalitică scăzută. De fapt, moleculele de ARN, definite ca enzime la modul
general, nu pot fi comparate cu catalizatorii proteici unde numărul de turnover tipic este de 103-
106. Cazul intronilor care codifică pentru maturază
Studiul ADN din mitocondriile de om (şi bovine) au permis observaţia că ADN din aceste
mitocondrii este lipsit în întregime de introni. Nu se poate spune acelaşi lucru despre drojdii care
posedă introni în ADN mitocondrial. Echipa lui Slonimski (Gif-sur Yvette) a demonstrat că un
anume intron (intronul 2 al genei citocromului b din mitocondriile de drojdii) codifică pentru o
proteină. Această proteină provine nu numai din traducerea intronului 2, ci mai precis a exonului
1 + exon 2 +ORF a intronului 2 (open reading frame, partea fără codon stop, în fază cu exonul
precedent). Această proteină posedă curioasa proprietate de a exciza intronul 2 (care îi dă naştere).
Din acest motiv, până nu demult, nu se putea pune în evidenţă această «maturază matricidă» care
nu există decât în cantităţi foarte mici deoarece imediat formată aceasta distruge intronul din care
provine («Tradusă, trădătoare» a modalitate clară şi expeditivă de a spune că proteina tradusă este
«trădătoare» deoarece ea distruge chiar intronul care i-a dat naştere).
Din contră, se poate pune în evidenţă această maturază utilizând o suşă de drojdie mutantă
pentru care maturaza produsă este inactivă fiziologic. În acest caz intronul nu poate fi eliminat, şi
deci el poate continua să producă maturază.
Aceeaşi echipă a pus în evidenţă şi maturaza produsă prin expresia intronului 4. Această
maturază nu elimină numai propriul său intron, dar şi un intron provenind dintr-o genă vecină (care
codifică o subunitate a citocrom-oxidazei). Se speră că aceşti introni au alte funcţii decât numai să
codifice proteinele cu rol de excizie (eliminare) a intronilor.
Cu toate că astfel s-a demonstrat, într-un mod foarte estetic, că un intron poate fi tradus în
proteină în aceste câteva cazuri excepţionale, nu se cunoaşte încă bine rolul intronilor. În plus, nu
putem încă generaliza aceste rezultate obţinute pentru genele mitocondriale de la drojdie.
Cazul intronilor care codifică pentru endonuclează
224
 S-a observat, la anumite tulpini de S. cerevisiae, că un intron situat în gena ARNr codifică
pentru o endonuclează care permite ca ADN din alte tulpini să fie decupat şi să primească un
intron.
Anumiţi introni atât din grupul I cât şi din II conţin faze de lectură care pot fi traduse în
proteine. Sunt cunoscute mai bine funcţiile proteinelor codificate de anumiţi introni din grupa I.
Rolul acestora este să ajute intronul să perpetueze singur la hibrizi în care alelele genei relevante
diferă între ele prin posesia acestor introni.
Polimorfismul prezenţei sau absenţei intronilor este destul de comun în mitocondriile
fungilor (ciupercilor). Aceasta este în concordanţă cu ipoteza că aceşti introni sunt la origine
inserţii la nivelul genelor. Puţină lumină în acest proces se poate face prin analiza recombinării la
hibrizi care privesc gena pentru molecula mare ARNr de la mitocondriile de drojdie.
Această genă are un intron din grupa I care conţine o secvenţă codantă. Intronul este prezent
la anumite tulpini de drojdie (numite ω+) dar absent la altele (ω). Hibrizii genetici între ω+ şi ω-
sunt polari: progeniturile sunt de obicei ω+.
Dacă ne gândim că tulpina ω+. reprezintă donorul şi tulpina ω- este privită ca recipient
(primitor), constatăm că în hibrizii ω+ x ω- se generează o nouă copie a intronului în genomul ω-
. Drept rezultat toate progeniturile sunt ω+.
Mutaţii pot să apară la oricare din părinţi şi să elimine polaritatea. Mutanţii manifestă o
segragare normală cu un număr egal de progenituri ω+ sau ω-. Mutaţiile indică natura acestui
proces. Mutaţiile în tulpinile ω- apar lângă situsul unde intronul trebuie să se insereze. Mutaţiile
în tulpinile ω+ sunt prezente la nivelul fazei de lectură a intronului şi împiedică producerea
proteinei. Aceasta sugerează modelul din figură în care proteina codificată de intron în tulpina ω+
recunoaşte situsul la nivelul căruia intronul trebuie inserat în tulpina ω- şi face ca acesta să fie
moştenit preferenţial.
Care este acţiunea proteinei? Produsul intronului ω este o endonuclează care recunoaşte
gena ω- drept ţintă pentru o clivare dublu catenară. Endonucleaza recunoaşte o secvenţă ţintă de
18 pb care conţine situsul unde intronul va fi inserat. Secvenţa ţintă este clivată pe fiecare catena
ADN la 2 baze către capătul 3’ al situsului de inserţie. Deci situsul de clivare are 4 pb separate , şi
generează monocatene libere (care atârnă). Acest tip de clivare este asemănător clivării
caracteristice transpozomilor când aceştia migrează la situsuri noi. Ruperea dublei catene iniţiază
probabil un proces de conversie genică în care secvenţa genei ω+ este copiată pentru a înlocui
secvenţa genei ω-. De reţinut că inserarea intronului întrerupe secvenţa recunoscută de către
endonuclează, asigurând astfel stabilitatea procesului.
Şi alţi introni care conţin faze deschise de lectură sunt şi mobili. Seria exemplelor de introni
mitocondriali la fungi poate fi continuată. Un alt caz este al celor doi introni de la fagul T4 care
sunt moşteniţi preferenţial asemenea intronului ω, şi a unui intron prezent în gena nucleară pentru
ADNr de la Physarum care se inserează în orice moleculă acceptor de la hibrizi adecvaţi. În general
mecanismul perpetuării unui intron pare să fie acelaşi: intronul codifică pentru o endonuclează
care taie specific o secvenţă ţintă la nivelul căreia va fi inserat. Există totuşi diferenţe privind
detaliile inserării: de exemplu, endonucleaza codificată intronul fagului T4 td taie o secvenţă ţintă
situată la 24 pb mai sus situsul (în amont) la nivelul căruia intronul se va insera.
În ciuda mecanismului comun de mobilitate a intronului, nu există omologie între
secvenţele situsurilor ţintă sau ale regiunilor codante ale intronului. Putem considera că intronii au
avut o origine evolutivă comună, dar evident ei au suferi o
225
mare divergenţă. Secvenţele ţintă sunt dintre cele mai lungi şi totodată cele mai specifice cunoscute
pentru endonucleaze. Specificitatea asigură perpetuarea intronului numai prin inserare la un singur
situs aparţinând secvenţei ţintă şi nu oriunde în genom.
Aceste descoperiri întăresc punctul de vedere că intronii care posedă secvenţe codante îşi
au originea în elemente independente care codifică pentru o funcţie corelată cu capacitatea de
splicing a ARN sau de migrare între moleculele ADN. În concordanţă cu această idee, modul de
utilizare al codonilor este diferit în regiunile codificate de introni comparativ cu situaţia existentă
în exoni. În acelaşi timp, intronii de acest tip diferă probabil de intronii nucleari prin originea lor.
Se pare că aceştia sunt mai degrabă inseraţi în gene pre-existente, în timp ce intronii nucleari par
să reprezinte structuri remanente ale genelor primare.
ARN poate avea activitate ribonucleazică
Una din primele demonstraţii privind capacitatea ARN de a avea activităţi enzimatice a
fost analiza ribonucleazei P, o endonuclează izolată de la E. coli care este responsabilă de
procesarea ARNt. Ribonucleaza P poate fi disociată în cele două componente ale sale, o moleculă
de ARN de 375 baze şi o polipeptidă de 20 000. În condiţiile iniţiale folosite pentru a caracteriza
activitatea enzimatică in vitro, ambele componente erau necesare pentru a realiza scindarea
substratului.
Modificarea condiţiilor ionice, creşterea concentraţiilor de Mg2+, fac componenta proteică
inutilă. În aceste condiţii singur ARN poate cataliza reacţia. Analizând rezultatele considerând că
ARN este o enzimă, fiecare «enzimă» catalizează clivarea a cel puţin patru substrate. De fapt,
activitatea ARN nu este mult mai mică decât activitatea preparatelor crude de ribonuclează P.
Prin analiza diferitelor mutaţii prezente în gena ARN sau în gena care codifică proteina şi
care determină inactivarea RN-azei P, se cunoaşte faptul că in vivo ambele componente sunt
necesare pentru activitatea naturală a enzimei. Iniţial s-a considerat că enzima asigură activitatea
catalitică şi că ARN are un rol secundar, de exemplu de a coopera în legarea substratului (prin
intermediul unor secvenţe scurte complementare cu regiuni expuse din ARNt). De fapt aceste
roluri sunt inverse.
Cum se poate demonstra că ARN conţine centrul catalitic? Această capacitate pare
rezonabilă dacă considerăm existenţa unui centru activ ca o regiune (suprafaţă) care expune o serie
de grupări active într-o relaţie fixă. Pentru proteină, grupările active sunt furnizate de lanţurile
laterale ale aminoacizilor, care posedă o apreciabilă varietate, incluzând grupări ionice pozitive şi
negative şi grupări hidrofobe. Într-o moleculă de ARN, părţile disponibile sunt mult mai restrânse,
constând în principal în grupările expuse ale bazelor. Putem presupune că scurte regiuni sunt
dispuse într-o conformaţie moleculară secundară sau terţiară, furnizând o suprafaţă de grupări
active capabilă să menţină un mediu în care legăturile pot fi rupte şi refăcute într-o altă moleculă.
Pare inevitabil ca interacţiile între ARN cu funcţie catalitică şi ARN substrat să se bazeze pe
crearea unui micromediu rezultat din împerecherea bazelor.
Implicaţiile evolutive ale acestor descoperiri sunt curioase. Personalitatea debordantă a
aparatului genetic, în care ARN este prezent la nivelul tuturor componentelor, dar proteinele
realizează reacţiile catalitice, a fost sfărâmată. Pare puţin probabil ca cele mai îndepărtate evolutiv
sisteme de replicare să fi avut în compoziţia lor atât acizi nucleici cât şi proteine.
Se poate considera (emite ipoteza) că primele sisteme conţineau numai acizi nucleici cu
capacitate de autoreplicare şi cu activităţi catalitice primitive, exact cele care să realizeze ruperea
legăturilor fosfodiester. Dacă presupunem că implicarea legăturilor 2’ în reacţiile curente de
splicing este derivată din aceste reacţii catalitice
226
primitive, putem argumenta că acidul nucleic original (ancestral) a fost ARN, atâta timp cât ADN
care nu posedă grupări 2’-OH nu poate realiza aceste reacţii. Proteinele au putut fi adăugate
(cooptate) datorită capacităţii lor de a stabiliza structura ARN, care erau precar menţinută fără
existenţa unui astfel de suport. Se poate considera că versatilitatea (capacitatea de a îndeplini mai
multe funcţii, multilateral) proteinelor le-a permis să preia (o parte din) cataliza reacţiilor chimice,
conducând eventual la un complex şi la un aparat sofisticat al expresiei moderne a genelor.
Activitatea catalitică a RN-azei P necesită ARN pentru a funcţiona drept catalizator al unui
substrat extern. Un alt exemplu pentru capacitatea ARN de a funcţiona ca o endonuclează este
furnizat de câteva molecule mici de ARN de la plante (aprox 350 baze) care realizează o reacţie
de auto-clivare. Ca şi în cazul intronilor din grupa I este posibilă realizarea unor construcţii care
să funcţionează cu substrate externe.
Trei tipuri de molecule mici de la plante se încadrează în două grupuri generale: viroizii
şi virusoizii. Viroizii sunt molecule de ARN infecţioase care funcţionează independent fără
încapsidare cu orice proteină. Virusoizii sunt similari ca organizare, dar sunt încapsidaţi de către
virusurile plantelor, fiind împachetaţi împreună cu genomul viral. Aceşti virusoizi nu se pot
replica independent şi necesită asistenţă de la virus (virală). Virusoizii sunt numiţi adesea ARNs
sateliţi.
Atât viroizii şi virusoizii par să se replice după modelul cercului rotativ. Catena ARN care
este împachetată în virus este denumită catena plus. Catena complementară. generată în timpul
replicării ARN este denumită catena minus. Au fost detectaţi multimeri ai celor două forme.
Ambele tipuri de monomeri sunt probabil generate prin clivarea cozii unui cerc rotitor: catena
circulară plus este generată prin legarea capetelor monomerului linear.
Ambele catene plus şi minus ale viroizilor suferă auto-clivare in vitro: Reacţia de clivare
este promovată de către cationi metalici divalenţi; aceştia generează capete 5’-OH şi 2’-3’-
fosdiester ciclic. Unele dintre moleculele ARNs clivează in vitro în condiţii fiziologice. Altele
suferă procesul numai după un ciclu de încălzire şi răcire; aceasta sugerează că moleculele izolate
de ARN au o conformaţie inadecvată, dar că se poate genera o conformaţie activă când sunt supuse
procesului de denaturare- renaturare.
S-a demonstrat că majoritatea viroizilor şi virusoizilor care suferă auto-clivare au, în
principiu, o structură secundară sub formă «de ciocan». Secvenţa acestei structuri este suficientă
pentru clivare. Când secvenţele înconjurătoare sunt eliberate nu mai este necesar ciclul de
încălzire-răcire, şi micile molecule de ARN auto- clivează spontan. Aceasta sugerează că
secvenţele aparţinând structurii «cap de ciocan» interferă cu formarea sa.
Situsul activ este o secvenţă de numai 58 nucleotide. «Capul de ciocan» (hammerhead)
conţine 3 regiuni stem-loop (bucle) ale căror poziţie şi mărime sunt constante, şi 13 nucleotide
conservate, marea majoritate în regiunile care conectează (leagă) centrul structurii. Bazele
conservate şi duplexul stem generează o conformaţie a moleculei de ARN (un ARN) cu o
capacitate intrinsecă de clivare.
 Nu este necesar ca structura să se formeze prin împerechere intramoleculară a bazelor. O
structură activă «cap de ciocan» poate fi generată prin împerecherea unui ARN care reprezintă o
parte a structurii cu un ARN care reprezintă cealaltă parte. În partea de jos a figurii este dat un
exemplu de «cap de ciocan» generat prin hibridizarea a 19 baze ale unei molecule cu 24 de baze
ale altei molecule. Hibridul
227
mimează structura «cap de ciocan», cu omiterea buclelor (loops) I şi III. Când împerecherea dintre
cele 19 şi baze se realizează clivarea într-o poziţie adecvată de la nivelul structurii.
Putem să privim partea de sus a structurii ca reprezentând «substratul» şi partea de jos ca
reprezentând «enzima». Când moleculele ARN care conţin regiunea de 19 baze sunt puse în
contact cu un exces de molecule ARN de 24 baze, mai multe copii de 24 baze sunt clivate. Aceasta
sugerează că există un ciclu al împerecherii fragmentelor de 19 şi 24 baze, clivare, disocierea
fragmentelor clivate de molecula ARN de 19 baze, şi re-împerecherea acesteia cu un nou substrat
de 24 baze. Astfel molecula de ARN de 19 baze este o ribozimă cu activitate endonucleazică.
Parametrii reacţiei sunt similari cu cei ai altor reacţii catalizate de ARN.
S-a demonstrat că este posibilă desemnarea unor combinaţii emzimă-substrat care să
formeze structuri «cap de ciocan», şi acestea să poată fi folosite pentru a demonstra că introducerea
în mediu a unor molecule adecvate de ARN permite apariţia reacţiei de clivare in vivo. O ribozimă
proiectată astfel furnizează o activitate de restricţie specifică orientată către o ţintă ARN. Prin
plasarea ribozimei sub controlul unui promotor reglator, aceasta poate fi folosită în acelaşi fel ca
(de exemplu) construcţiile antisens construite special pentru a modifica expresia unei gene ţintă în
anumite circumstanţe.
Slide 72. Concluzii Asemeni moleculelor pre-ARNm, transcripţii
primari produşi din genele pre- ARNr şi ARNt suferă procesări extensive;
Sinteza unui precursorului pre-ARNr (45S în eucariotele superioare) de către ARN
polimeraza I şi procesarea acestuia apare în nucleol;
Clivarea, digestia exonucleotidică, şi modificarea bazelor pre-ARNr 45S conduce la
molecule mature 28S, 18S şi 5,8S ARNr, care se asociază cu proteinele rizozomale în subunităţile
ribozomale. O serie de snoARN (small nucleolar RNA) participă la procesarea ARNr;
ARNr 5S, care este sintetizat în nucleoplasmă de către ARN polimeraza III, nu este produs
extensiv înaintea asamblării cu alte molecule de ARNr şi proteine pentru a forma subunitatea
ribozomală;
Primele molecule de ARNr catalitic (ribozime) descoperite au fost intronii de grup I din
ARNr de la Tetrahymena. Auto-splicingul intronilor de grup I şi II, şi splicingul pre-ARNm la
nivelul spliceozomilor se realizează prin intermediul a două reacţii de transesterificare;
Transcripţia genelor ARNt de către ARN polimeraza III şi procesarea transcripţilor primari
apare în nucleoplasmă. În toate moleculele de pre-ARNt, secvenţa capătului 5’ este îndepărtată de
RN-aza P, o ribonucleoproteină care conţin un ARN catalitic; CCA este adăugat la capătul 3’; o
serie de baze interne sunt modificate;
Unele molecule de pre-ARNt conţin un intron scurt în interiorul buclei anticodon. Acesta
este înlăturat de enzime printr-un mecanism distinct de mecanismul de splicing al pre-ARNm şi
auto-splicingul intronilor;
228
NOTE DE CURS BM5
TRADUCEREA
Produşii transcripţiei (ARNt, ARNr şi ARNm) participă toţi la transferul informaţiei
genetice în proteine, dar numai ARNm este depozitarul (cel care depoziteaza informaţia)
informaţiei. Termenul de traducere desemnează ansamblul mecanismelor care transforma
informaţia secvenţei ARNm în proteine. Transferul informaţiei de la secvenţa nucleotidica la
secvenţa proteica presupune existenţa unui sistem de codificare între cele două tipuri de
secvenţe, numit cod genetic. Ribozomii şi ARNt sunt celelalte două componente implicâte
puternic în masinaria de traducere (in mecanismul de traducere). Pe langa acestea, intervin mai
multe zeci de alte proteine şi molecule diferite (aminoacil-ARNt transferazele, nucleozid
trifosfatii (ATPşi GTP), proteinele de iniţiere (IF), de alungire (EF)şi de oprire (RF). Codul
genetic
Codul genetic girează corespondenţa între secvenţa nucleotidica a unui ARNm şi secvenţa
aminoacizilor unei proteine. Secvenţele nucleotidice sunt citite secvenţial sub forma de triplete.
Fiecare triplet este numit codon nu există suprapunere în lectura codonilor succesivi. Un nucleotid
care a servit pentru lectura unui codon nu poate servi pentru lectura altui codon. Astfel, primul
codon al unei secvenţe este foarte important deoarece el defineşte cadrul de lectura pentru restul
secvenţei. Deoarece nu exista suprapunere, sunt posibile doar trei cadre de lectura. În funcţie de
cadrul de lectura secvenţa în aminoacizi va fi diferita.
Descifrarea codului genetic a fost realizată (a fost permisă) de experienţele in vitro cu
polinucleotide de sinteză. Nirenberg şi Matthaei (1961) au sintetizat poliribonucleotide cum este
poli U şi au furnizat (imaginat) condiţiile necesare pentru traducerea lor. Polipeptida obtinuta este
o polifenilalanina. Aceeasi experienta, repetata cu polimeri de A şi C au dat polipeptidele poliLys
şi poliPro. A şi CCC codifica respectiv pentru lizina şi prolina.
Ceilalţi codoni au fost elucidaţi prin traducerea poliribonucleotidelor cu secvenţe
dinucleotidice sau trinucleotidice alternative. De exemplu, un poliAC poartă doi codoni posibili
ACA şi CAC indiferent de cadrul de lectură adoptat. Traducerea sa furnizează un amestec
echimolecular de histidină şi de treonină. Identificarea codonilor acestor aminoacizi a fost realizată
printr-o altă experienţă. Este vorba de sinteza unui polimer format din A şi din C în rapoarte molare
de 5:1. În acest polimer codonul AAA va fi cel mai reprezentat statistic iar codonul CCC cel mai
puţin reprezentat. Amestecurile codonilor (A
2

)C (AAC, ACA şi CAA) vor fi mult mai frecvente

decât A(C
2

) (CCA, CAC şi ACC). Analiza compoziţiei în aminoacizi, a produşilor de

traducere, indică că numai histidina poate fi codificată de A(C
2
 ). Rezultă
că CAC codifică histidina şi ACA treonina.
În alte experienţe, au fost utilizaţi, într-un sistem de traducere, polimeri formaţi din trei
sau patru nucleotide. Un polimer format din trei nucleotide ([UUG]n
229
de exemplu) furnizează trei tipuri de peptide: poliLeu, poliCys şi poliVal, în funcţie de cadrul de
lectură utilizat. Un polimer format din patru ([UUAC]n de exemplu) furnizează un tetrapeptid Leu-
Leu-Thr-Tyr. În final, aceste experienţe şi altele au permis stabilirea în întregime a codului genetic.
Iniţierea traducerii utilizează adesea codonul AUG şi uneori codonii GUG şi UUG.
Aminoacidul încorporat este în toate cazurile Met (sau formil-Met la bacterii). Aceeaşi codoni
codifică pentru Met, Val şi Leu când nu sunt folosiţi ca semnal pentru începerea traducerii.
Încheierea (terminarea) traducerii se realizează când ribozomul întâlneşte unul dintre
codonii “non sense” (UAA, UAG, UGA) indicaţi în tabel prin “Stop”. Aminoacizii sunt desemnaţi
prin trei litere şi respectiv o literă de cod.
Ştiind că codonii sunt triplete şi că există patru baze în structura ARN (G, A, U, C), sunt
posibile teoretic 43 adică 64 de triplete diferite. 61 dintre acestea au sens, adică codifică pentru
aminoacizi şi trei sunt numiţi “non sens” ‘(fără sens) (UAA, UGA, UAG) deoarece nu există
ARNt care să posede anticodoni complementari. Aceşti codoni „fără sens” sau “Stop”, sunt
codonii care marchează terminarea sintezei proteice. Acelaşi aminoacid poate să fie codificat de
mai mulţi codoni diferiţi (tabel V). Astfel, histidina este codificata de doi codoni, CAU şi CAC,
iar arginina de codonii: CGU, CGC, CGA, CGC, AGA şi AGG. În medie, unui aminoacid îi
corespund trei codoni. Din această cauză codul genetic este numit degenerat sau redundant.
Codul genetic este în acelaşi timp numit universal deoarece aminoacizii au aceeaşi codoni
indiferent de sistemul biologic care asigură traducerea. Totuşi există câteva excepţii ale codului
universal, mai ales în cazul sintezei proteice mitocondriale. Astfel, la nivel mitocondrial, UGA
nu are semnificaţia de codon “non sens” ci codon Trp. Metionina poate fi codificată de AUG şi
AUA. AGG şi AGA nu mai reprezintă codoni pentru Arg ci codoni Stop la fel ca si AUA şi
UAG. Moleculele de ARNt izoacceptoare
Aminoacizii nu au afinitate specifică pentru ARNm. Ei se ataşează matricelor de ARNm prin
intermediarul adaptatorilor, moleculele de ARN de transfer (ARNt). Moleculele de ARNt sunt
molecule de mărime mică (masa lor este de aproximativ 25 000, 75 de baze). Ele prezintă
particularitatea de a fi modificate după sinteză. Astfel, anumite baze sunt metilate, altele
transformate în baze rare (cum sunt dihidrouridina, inozina), etc.
Moleculele de ARNt adoptă o configuraţie spaţială compactă în formă de L inversat. Din
comoditate, structura este frecvent reprezentată depliată sub forma unei frunze de treflă cu patru
tije formate din baze împerecheate prin legături de hidrogen şi trei regiuni în formă de buclă
(limburile frunzei) ne-împerecheate. Extremitatea 5’ a ARNt este tot timpul ocupată de către G, în
timp ce extremitatea 3’OH se termină prin secvenţa CCA a cărei funcţiune 3’OH a adenozinei este
esterificată cu gruparea COOH a aminoacidului.
Bucla anticodonului poartă o secvenţă de trei baze, încadrată în 3’de o purină şi în 5’ de un
U. Aceasta recunoaşte şi hibridizează codonul complementar existent pe ARNm. Astfel, există o
corespondenţă specifică între aminoacidul fixat la ARNt şi anticodon. Anumite molecule de ARNt
conţin nucleotidul inozină (nucleotid a cărui bază azotata este hipoxantina). Inozina poate forma
legături de hidrogen cu U, C şi A. In concluzie, acelaşi ARNt se poate împerechea cu trei codoni
diferiţi care corespund aceluiaşi aminoacid.
Înainte de a participa la traducerea ARNm, moleculele de ARNt fixează aminoacidul
corespunzător anticodonului lor: Fiecare aminoacid este mai întâi activat,
230
în prezenţă de ATP, de către enzima aminoacil ARNt sintetaza care catalizează într- o primă
etapă formarea aminoacil-AMP:
Aminoacil-ARNt sintetaza Aminoacid + ATP [Aminoacil-AMP] - Enzimă + PPi
Enzima rămâne legată de complexul aminoacil-AMP până la întâlnirea unui ARNt specific
aminoacidului. În a două etapă, aminoacidul este transferat pe extremitatea 3’OH a ARNt şi
formează un aminoacil-ARNt numit şi ARNt încărcat: [Aminoacil-AMP]-Enzima + ARNt
Aminoacil-ARNt + AMP + Enzimă
Asamblarea proteinelor se realizează plecând de la aceşti aminoacil-ARNt. În funcţie de
aminoacidul transportat, aminoacil-ARNt va fi numit alanilARNtAla (sau Ala-ARNtAla), Glicil
ARNtGly(sau Gly-ARNtGly), etc.
Evidenţierea relaţiilor codon: anticodon: aminoacid transportat de ARNt a fost realizată
în urma experienţelor lui Nirenberg şi Leder (1964). Ribozomii incubaţi cu ARNm poliU şi Phe-
ARNtPhe fixează cei doi acizi nucleici. Dacă Phe-ARNtPhe este înlocuită de către un alt
aminoacil-ARNt, nu are loc fixare de către ribozomi. Deci, Phe-ARNtPhe recunoaşte specific
codonul UUU graţie anticodonului său. Prin modificarea secvenţei ARNm, a fost posibilă
determinarea speciilor (moleculelor) de ARNt care recunosc diferiţii codoni. Deci, într-o celulă
se găsesc douăzeci de aminoacizi diferiţi care sunt transportaţi de aproximativ şaizeci de
molecule de ARNt la încărcarea cărora participă acelaşi număr de ARNt sintetaze
corespunzătoare. În consecinţă, anumiţi codoni pot fi recunoscuţi de mai mulţi ARNt care
transportă acelaşi aminoacid, ARNt izoacceptori, în timp ce alţii, codonii Stop, nu sunt
recunoscuţi de nici unul. Ribozomii
O dată încărcaţi, ARNt se combină cu ribozomii pentru a asigura sinteza proteică.
Ribozomii, particulele citoplasmatice constituite dintr-o subunitate mare şi o subunitate mică,
ambele formate din ARNr şi proteine, au compoziţii diferite la procariote şi la eucariote. Ribozomii
sunt constituenţi majori în celulă. Colibacilul conţine aproximativ 15 000 ribozomi reprezentând
aproximativ 25% din masa uscată a celulei. Comparaţia secvenţelor proteinelor ribozomale de la
mai multe organisme relevă o foarte mare conservare în cursul evoluţiei. Moleculele de ARNr sunt
şi ele la fel de bine conservate. Cele două subunităţi sunt adesea libere şi nu se asociază decât în
momentul traducerii ARNm. Funcţia principală a ribozomilor este de a orienta corect ansamblul
aminoacil-ARNt în raport cu ARNm pentru a crea legăturile peptidice. Mai mulţi ribozomi pot
începe traducerea succesivă a aceleiaşi molecule de ARNm, ei găsindu-se astfel legaţi sub forma
unui şirag de mărgele care constituie un polizom sau un poliribozom.
Sinteza proteică
Traducerea ARNm în proteine se realizează întotdeauna în sensul 5’-3’. La procariote,
traducerea începe chiar înainte de terminarea transcripţiei. La eucariote, transcripţia se realizează
în nucleu în timp ce traducerea are loc în citoplasmă. Deci, moleculele de ARNm sunt transcrise
şi apoi maturate în nucleu. Ele migrează apoi în citoplasmă pentru a fi traduse în proteine.
Traducerea poate fi împărţită în trei etape esenţiale: demararea sau iniţierea, alungirea sau
elongarea şi oprirea sau terminarea.
Demararea sau iniţierea
231
 Iniţierea traducerii corespunde legării ribozomului la ARNm, căutării codonului de iniţiere
(orientării după codonul de iniţiere) şi fixarea primului aminoacil-ARNt.
Demararea sintezei proteice la bacterii începe deci cu formarea unui complex între
subunitatea mică, 30S, primul aminoacil-ARNt şi o moleculă de ARNm.
Subunitatea mare, 50S, se leagă la acest complex pentru a forma ribozomul 70S funcţional.
În cursul sintezei tuturor peptidelor bacteriene, primul aminoacid incorporat este N-formil-
metionina (metionină modificată care posedă o grupare formil fixată de radicalul amino-terminal)
al cărui codon principal este AUG, adesea GUG. Datorită faptului că gruparea amino a formil-Met
(fMet) este blocată, un astfel de aminoacid nu poate fi inserat decât la începutul catenei (lanţului).
Factorii denumiţi de iniţiere (IF pentru Initiation Factors) necesari sunt proteinele IF1, IF2
şi IF3 (la eucariote au fost evidenţiaţi cinci astfel de factori). Aceşti factori se fixează la subunitatea
30S în timpul primei etape de iniţiere, iar GTP legat la IF2 este elementul stabilizator al acestei
fixări. În acest stadiu, factorul IF3 împiedică asocierea subunităţilor 30S şi 50S. Cea de a două
etapă este asocierea fMet- ARNtfMet şi a ARNm la ansamblul IF-30S-GTP. Asocierea presupune
intervenţia unei secvenţe mici din structura ARNm AGGAGGU, numită situs de fixare la ribozom
sau rbs (ribosome binding site) sau secvenţă Shine-Dalgarno complementară unei secvenţe
prezentă în structura ARNr care participă astfel direct la iniţiere selecţionând situsul de demarare
a traducerii: codonul AUG iniţiator este definit prin hibridizarea dintre secvenţa rbs şi o secvenţă
apropiată de extremitatea 3’ a ARNr 16s (fig. 3. 20).
Eliberarea IF3 permite asocierea celor două subunităţi, hidroliza GTP şi eliberarea altor
doi factori de iniţiere. Complexul obţinut este numit complex de iniţiere 70S.
La eucariote, ribozomii recunosc coiful (capişonul) metilat graţie unor factori numiţi
proteine de fixare a coifului (cap binding protein). Aceştia alunecă apoi de- a lungul ARNm
plecând de la extremitatea 5’ până la întâlnirea primului codon AUG iniţiator. Factorii adiţionali
de iniţiere favorizează, în această etapă, desfacerea structurilor secundare susceptibile de oprirea
procesului. Alungire sau elongare
Elongarea implică formarea unei legături peptidice între aminoacizi şi deplasarea
ribozomului de-a lungul ARNm.
Lectura ARNm începe de la extremitatea 5’ şi se realizează în direcţia 5’-3’. Fiecare
ribozom posedă două situsuri de fixare a ARNt. Acestea sunt situsurile P (Peptidil) şi A
(Aminoacil).
Fixarea ribozomului la ARNm se realizează astfel încât fMet-ARNfMet să fie poziţionat
în situsul P pentru a se putea împerechea cu codonul AUG de pe ARNm. Situsul A disponibil poate
astfel primi aminoacil-ARNt al cărui anticodon corespunde celui de al doilea codon din structura
ARNm. O legătură peptidică se stabileşte între gruparea COOH al primului aminoacid şi gruparea
NH
2

a celui de al doilea graţie enzimei

numită peptidil-transferază, componentă a subunităţii 50S. Formarea legăturii peptidice transferă
gruparea COOH a aminoacidului din situsul P grupării amino a aminoacidului care se găseşte în
situsul A. Astfel, extremitatea COOH a catenei în formare se termină întotdeauna cu o moleculă
de ARNt. Lanţul peptidic este sintetizat începând de la extremitatea NH
2

către extremitatea COOH. În urma formării legăturii peptidice

ARNtfMet descarcă aminoacidul si părăseşte situsul P. În acest moment (atunci) dipeptida se
găseşte legată la ARNt care purta al doilea aminoacid şi este poziţionată (plasată) în situsul A. În
continuare, acest peptidil-ARNt se deplasează în situsul P prin mişcarea relativă a ARNm cu o
lungime de trei baze. În acest moment
232
situsul A liber poate primi un nou aminoacil-ARNt. O dată ajuns în situsul A, o altă legătură
peptidică asociază aminoacidul cu cel care îl precede în situsul P. Elongarea polipeptidului se
realizează prin repetarea acestor mişcări.
Alungirea catenei polipeptidice necesită două molecule de GTP care sunt hidrolizate pentru
fiecare aminoacid adăugat. Factorii de elongare (EF pentru Elongation Factors) sunt şi aceştia
indispensabili. EF-Tu reacţionează cu GTP şi ARNt încărcat pentru a forma complexul aminoacil-
ARNt-GTP-EF-Tu care plasează aminoacil-ARNt în situsul A de pe ribozom folosind energia
eliberată prin hidroliza GTP în GDP. Deplasarea peptidil-ARNt din situsul A în situsul P este
dependentă de factorul de elongare G (EF-G) numit şi translocază. EF-G reacţionează prin
asocierea GTP la ribozom. Acesta permite translocarea şi eliberarea ARNt din situsul P.
Reutilizarea acestui factor de elongare necesită de asemenea hidroliza unei molecule de GTP în
GDP şi Pi.
Mecanismele de alungire (elongare) a catenei polipeptidice la eucariote s-au dovedit
similare cu participarea factorilor de elongare eEF-1 şi EF2 care au roluri similare cu EF-Tu, EF-
Ts şi EF-G. Oprirea sau terminarea
Terminarea cuprinde detectarea codonului de oprire, ruperea legăturii ester dintre ultimul
ARNt şi catena polipeptidică şi eliberarea acesteia. Sunt necesare două condiţii:
- prezenţa unui codon care specifică (codifică) oprirea elongării;
- intervenţia unui factor de disociere (RF sau Release Factor) capabil să recunoască
semnalul de terminare a catenei şi să favorizeze ruperea legăturii cu ARNt şi eliberarea catenei.
În componenţa codului genetic există trei codoni de oprire recunoscuţi (citiţi) de proteine
specifice care la E. coli sunt RF1 (recunoaşte UAG şi U A) şi RF2 (recunoaşte UGA şi U A).
Aceştia favorizează interacţia catenei în formare cu o moleculă de apă şi eliberarea lanţului.
Când mărimea unei catene polipeptidice atinge douăzeci şi cinci de aminoacizi, codonul de
iniţiere AUG de pe ARNm este complet liber şi se poate iniţia o nouă demarare. Fenomenul se
reproduce de mai multe ori până când ARNm este acoperit de ribozomi distanţaţi între ei prin
aproximativ douăzeci şi cinci de nucleotide. Această unitate de traducere mare, numită
poliribozom sau polizom, permite celulei reproducerea mai multor copii ale unei proteine plecând
de la o moleculă de ARNm.
Dacă ARNm este policistronic şi dacă al doilea codon de iniţiere nu este situat (poziţionat)
prea departe de primul codon de oprire (de terminare), ribozomul se deplasează alunecând şi se
leagă la codonul de iniţiere al cistronului următor.
La eucariote, nu există reiniţiere a sintezei proteice după întâlnirea codonului de
terminare. TRADUCEREA INFORMAŢIEI GENETICE LA EUCARIOTE
Sinteza proteica sau traducerea este activitatea de sinteză cea mai complexă din celulă. În timp
ce sinteza altor molecule celulare este rezultatul unor reacţii enzimatice relativ directe, asamblarea
unei proteine necesită prezenţa tuturor moleculelor de ARNt şi a tuturor aminoacizilor
corespunzători ataşaţi la aceştia, de ribozomi, de molecule de ARNm, de mai multe proteine cu
funcţii diverse, de cationi şi de GTP. Această complexitate nu trebuie să ne mire dacă ţinem cont
că sinteza proteică necesită incorporarea a peste 20 aminoacizi în funcţie de o secvenţă precisă
dictată de un mesaj codificat scris într-o limbă care foloseşte simboluri diferite. Procesul de
traducere de la eucariote seamănă remarcabil cu cel de la procariote.
233
Principală diferenţă este că în celula eucariotă traducerea implică un mare număr de factori
proteici solubili (neribozomici).
INITIEREA
Etapele fundamentale de iniţiere a traducerii depind de ataşarea corectă a ribozomului la o
secvenţă bine determinată din structura ARNm pentru ca mesajul să poată fi citit într-un cadru de
lectură corect. Aceasta se realizează deoarece ribozomul începe traducerea la nivelul unui situs
specific de pe structura mesagerului numit codon de iniţiere. ARNm nu se fixează la ribozomii
constituiţi (întregi). Acesta se uneşte la cele două subunităţi în momente diferite. Prima etapă
esenţială este unirea subunităţii ribozomale mici la prima (sau la una din primele) secvenţe AUG
ale mesajului care funcţionează ca un codon de iniţiere. Care este modalitatea prin care subunitatea
mică alege codonul AUG iniţial şi nu un alt codon intern. Aşa cum am arătat anterior, procariotele
posedă o secvenţă specifică de nucleotide numită Shine- Dalgarno care este complementară cu o
secvenţă nucleotidică apropiată de extremitatea 3’ a ARN ribozomal 16S din subunitatea mică.
ARNr _ _ACCUCCUUUA3’ ARNm _ _ GGAGGA_ _ _5’ Recunoaşterea codonului de iniţiere
AUG este consecinţa unei interacţii între aceste secvenţe complementare de pe ARNm şi de pe
ARNr când subunitatea mică recunoaşte mai întâi extremitatea 5’ a mesajului , care poartă un
capişon de metilguanozină. După această subunitatea mică baleiază secvenţa ARNm până când
întâlneşte o secvenţă de nucleotide (de obicei 5’-CCACCAUGC-3’) care aproximativ 90% din
moleculele de ARNm eucariot, tripletul AUG este codonul de iniţiere.
Dacă ţinem cont de atribuirea codonilor putem spune că AUG este mai mult decât un codon
de iniţiere: este singurul codon pentru metionină. De fapt metionina este întotdeauna primul
aminoacid incorporat la extremitatea amino a catenei polipeptidice în formare (la procariote
metionina din poziţia 1 poartă întotdeauna o grupare formil). În cea mai mare parte a cazurilor
metionina (sau formil-metionina) este ulterior înlăturată enzimatic, cu toate că metionina rămâne
aminoacidul terminal în aproximativ 50% din catenele polipeptidice mature. Celulele posedă două
molecule de ARNt pentru metionină (deux Met-ARNt): una este folosită pentru iniţierea sintezei
proteice (ARNiMet) iar celălalt (reprezentat de ARNMet) intervine în incorporarea resturilor de
metionină în interiorul polipeptidului. Trebuie să reţinem că mitocondriile şi cloroplastele celulelor
eucariote folosesc N-formil-metionină în locul metioninei pentru a iniţia traducerea, ceea ce dă
cele mai bune argumente în favoarea originii procariote a acestor organite.
Mai multe dintre etapele de iniţiere necesită prezenţa unor proteine solubile numite factori
de iniţiere (reprezentate de IF la procariote şi de eIF la eucariote). De exemplu, la eucariote, se
consideră că eIF4E se ataşează coifului la extremitatea 5’ a mesagerului şi înlătură regiunile
bicatenare care interferă cu deplasarea ribozomului în căutarea codonului de iniţiere. În plus, pe
lângă factorii proteici este necesară şi prezenţa GTP pentru a realiza o iniţiere reuşită. O moleculă
de GTP se uneşte cu ARNtiMet înainte de cuplarea sa cu subunitatea ribozomală mică.
Imediat ce ARNt iniţiator este ataşat, subunităţile mari care se anexează complexului, factorii
solubili sunt eliberaţi şi GTP este hidrolizat. Hidroliza GTP poate fi cauza unei modificări a
conformaţiei ribozomului necesară iniţierii traducerii. Fiecare ribozom posedă două situsuri de
 asociere a moleculelor de ARNt. Aceste două situsuri, situsul A (aminoacil) şi a situsului P
(peptidil) joaca roluri diferite în traducere. Aminoacil-ARNt intră în complexul ribozom-ARNm
la nivelul situsului A,
234
în timp ce la nivelul situsului P ARNt livrează aminoacizi catenei polipeptidice în creştere. De fapt
ARNt de iniţiere (ARNtiMet) apare mai întâi la nivelul P al ribozomului.
ELONGAREA O dată ce ARNt de iniţiere este plasat în situsul P, ribozomul este gata pentru
fixarea celui de al doilea aminoacil-ARNt în situsul A vacant, prima etapă de elongare (etapa 1).
Înainte ca cel de al doilea aminoacil-ARNt sau că următorii să se poată uni efectiv la situsul A de
pe ARNm, acesta trebuie să se combine cu unul dintre factorii proteici de elongare (aceşti factori
de elongare particulari sunt numiţi Tu la procariote şi eEF1 la eucariote) uniţi cu GTP.
Cu toate că orice complex aminoacil-ARNt-Tu-GTP poate intra în situsul A, va fi blocat la
nivelul ARNm printr-o specifică numai cel al cărui anticodon este complementar codonului de pe
ARNm situat în situsul A. Imediat ce complexul aminoacil-ARNt-Tu-GTP adecvat recunoaşte
codonul de pe ARNm, GTP este hidrolizat şi se eliberează complexul Tu-GDP. Complexul ARNt-
Tu-GTP este regenerat.
Cea de a doua etapă a ciclului de elongare este formarea unei legături peptidice între
aminoacizii ataşaţi la cele două molecule de ARNt. Reacţia se realizează prin transferarea
metioninei (sau a N-formil metioninei) de pe ARNt iniţiator din situsul P pe aminoacidul ataşat la
ARNt care este complementar celui de al doilea codon prezent în situsul A. Reacţia este catalizată
de către peptidil transferază, element au subunităţii mari a ribozomului. Mult timp s-a considerat
că peptidil-transferaza era una dintre proteinele ribozomului. Mai târziu, când capacitatea catalitică
a ARN a devenit evidentă, atenţia s-a îndreptat către ARN ribozomal ca fiind posibilul catalizator
al legăturii peptidice. În ultimul s-a demonstrat că activitatea peptidil-transferazică este efectiv
localizată pe molecula mare de ARN ribozomal din subunitatea mare a ribozomului. Cu alte
cuvinte, peptidil transferaza este o ribozimă.
Formarea primei legături peptidice lasă o extremitate a moleculei de ARNt în situsul A încă
ataşat la codonul său complementar de pe ARNm în timp ce cealaltă extremitate este ataşată la o
dipeptidă. ARNt prezent în situsul P nu mai posedă acum un aminoacid ataşat. Cea de a treia etapă
a ciclului de elongare implică eliberarea ARNt neîncărcat prezent în situsul P şi deplasarea
ribozomului cu trei nucleotide (un codon) de-a lungul ARNm în direcţia 3’. Această ultimă etapă,
numită translocare, este însoţită de deplasarea ARNt-dipeptidei, încă unită prin legături de
hidrogen la al doilea codon al ARNm, în situsul P al ribozomului. Translocarea necesită un factor
de elongare numit G la procariote şi eEF2 la eucariote şi hidroliza GTP. Pentru fiecare ciclu de
elongare sunt hidrolizate cel puţin două molecule de GTP, una (sau mai multe) în timpul selecţiei
aminoacil-ARNt şi una în timpul translocării.
Îndată ce peptidil-ARNt se deplasează în situsul P, situsul A este din nou disponibil unui
nou aminoacil-ARNt al cărui anticodon este complementar cu al treilea codon. Când cel de al
treilea ARNt încărcat este asociat la ARNm în situsul A, dipeptida legată de molecula de ARNt
prezentă în situsul P este transferată aminoacidului ARNt din situsul A. ARNt din situsul P este
din nou eliberat de aminoacid. Formarea unei noi legături peptidice este urmată de eliberarea
ARNt din situsul P şi de translocarea ribozomului către cel de al patrulea codon, şi ciclul este
gata să re-înceapă. PRECIZIA TRADUCERII
 Interacţia între tripletele din structura ARNm şi ARNt nu este una foarte puternică pentru
a asigura ea însăşi precizia bine cunoscută a sintezei proteice (mai
235
puţin de un aminoacid din 10 000 este incorect incorporat). Au fost propuse mai multe ipoteze care
să explice frecvenţa foarte scăzută a erorilor. O ipoteză sugerează că numai codonii şi anticodonii
complementari sunt capabili să se insereze la nivelul fosei formate de către ARN ribozomal.
Legătura peptidică se poate forma numai în cazul în care fosa mare este ocupată. O altă ipoteză
pune accent pe intervalul aparent care separă unirea complexului ARNt-Tu-GTP la ARNm şi
momentul în care aminoacidul este adăugat catenei polipeptidice în creştere. Cu cât codonul şi
anticodonul neadecvat (necomplementari) sunt mai mult în contact, cu atât este mai mare
probabilitatea ca sa se producă separarea celor două molecule de ARN. O altă ipoteză face apel la
faptul că hidroliza GTP poate asigura fidelitatea traducerii. Cu toate că până în prezent se
presupunea că pentru fiecare ciclu de elongare se realizează hidroliza a două molecule de GTP
există din ce în ce mai multe argumente în sprijinul ideii că numărul real de molecule de GTP
hidrolizate este mult mai mare (cel puţin trei). Este posibil ca energia suplimentară să fie folosită
pentru eliberarea moleculelor de ARNm ce nu sunt bine împerecheate.
Streptomicina, care este unul dintre cele mai prescrise antibiotice acţionează unindu-se
selectiv la subunitatea ribozomală mică a celulelor bacteriene provocând o lectură eronată a
anumitor codoni ai ARNm, crescând sinteza proteinelor aberante. Acest antibiotic nu acţionează
asupra ribozomilor de la eucariote si deci nu are efect asupra traducerii din celulele gazdă. Se pare
că streptomicina se uneşte cu proteina ribozomală numită S12 care intervine care intervine într-un
fel sau în altul în controlul preciziei interacţiei dintre moleculele de ARNt specifice şi complexul
ribozom- ARNm. Rezistenţa bacteriilor la streptomicină se poate explica prin modificări la nivelul
proteinelor ribozomale şi în particular la nivelul S12. Multe antibiotice acţionează interacţionând
cu diferite etape ale sintezei proteice în celulele bacteriene (tabel).
Eu, Pro: celule eucariote, procariote; G, P: subunitatea mare sau mică; R: recunoaştere; P:
transferul polipeptidului; T: translocare; I: iniţiere; TERMINAREA
Cum s-a remarcat anterior trei din cei 64 codoni (de trei nucleotide) potenţiali sunt codoni
stop ale căror funcţie este semnalizarea opririi asamblării polipeptidelor. Deci, nu există anticodoni
în structura ARNt care să fie complementare codonilor stop. Când ribozomul ajunge la unul dintre
aceşti codoni, UAA; UAG sau UGA , semnalul opreşte orice nouă elongare şi eliberează
polipeptidul asociat ultimului ARNt. Terminarea necesită prezenţa factorilor de eliberare care
reacţionează direct cu codonii stop; bacteriile posedă doi factori de eliberare (RF1 care recunoaşte
UAA şi UAG şi RF2 care recunoaşte UGA) în timp ce celule eucariote nu au decât un eRF.
Factorul de eliberare poartă un GTP legat care este apoi hidrolizat. Imediat ce traducerea
se opreşte, legătura polipeptidei la ARNt este scindată şi factorul de eliberare, ca şi ARNt dezacilat,
sunt eliberaţi de pe ribozom. Hidroliza legăturii între polipeptid şi ultimul ARNt poate fi realizată
de către aceeaşi regiune a ARNr care este responsabilă de formarea legăturii peptidice în timpul
elongării. Imediat ce se realizează terminarea, ribozomul se separă de mesager şi se disociază în
subunităţi până la iniţierea unui nou ciclu de traducere.
Cum cei trei codoni de terminare pot fi uşor obţinuţi prin modificarea bazelor plecând de
la alţi codoni, ne-am putea aştepta la apariţia unor mutaţii care dau codoni stop la interiorul unei
gene. Aceste mutaţii ar putea provoca o terminare prematură a catenei polipeptidice în creştere.
Mutaţiile de acest tip sau mutaţiile non-sens, au fost studiate timp de ani de zile şi se ştie că acestea
sunt responsabile de diferite maladii ereditare la om. Mutaţiile non-sens antrenează de obicei
formele de maladii ereditare
236
cele mai severe deoarece se realizează numai sinteza unei porţiuni a proteinei şi aceasta este
întotdeauna nefuncţională. Terminarea prematură a creşterii catenei poate fi determinată şi de
adăugarea unui antibiotic, cum este puromicina. Această moleculă seamănă cu extremitatea 3’ a
unui ARNt încărcat şi poate intra în situsul A al ribozomului (figura). Când aceasta se plasează la
acest nivel, polipeptida din situsul P este transferată puromicinei din situsul A cu formarea unei
legături covalente. Transferul catenei polipeptidice., în formare, pe puromicină determină
formarea unui capişon la extremitatea carboxil , astfel încât alţi aminoacizi nu se mai pot ataşa
complexului peptidil-puromicină iar acesta se desprinde de pe ribozom. FORMAREA DE
POLIRIBOZOMI
Dacă observăm la microscopul electronic o moleculă de ARNm în curs de traducere vedem
întotdeauna un anumit număr de ribozomi ataşaţi de-a lungul fragmentului de ARNm. Acest
complex format din ribozomi şi ARNm numit poliribozomi. Mai întâi, toţi ribozomii se
asamblează din subunităţile lor la nivelul situsului de iniţiere, apoi ei se deplasează de la acest
punct către extremitatea 3’ a ARNm până când ating codonul de terminare. Imediat ce primul
ribozomi se află la o distanţă destul de mare de codonul de iniţiere, un al doilea ribozom se ataşează
la ARNm şi demarează o altă activitate de traducere. Traducerea simultană a aceluiaşi ARNm de
mai mulţi ribozomi creşte puternic viteza de sinteză a proteinelor celulare. Chiar dacă procesele se
aseamănă ele sunt diferenţiate la eucariote si la procariote deoarece la eucariote procesul de
transcripţie şi cel de traducere sunt compartimentate şi se desfăşoară fiind separate în citoplasmă
şi în nucleu. În celulele bacteriene, sinteza proteică debutează la nivelul moleculelor de ARNm
chiar înainte de terminarea transcripţiei acestora. Sinteza unei molecule de ARNm progresează în
acelaşi sens ca şi deplasarea ribozomilor care traduc mesajul, adică în direcţia 5’- 3’. În concluzie,
o moleculă de ARNm la procariote va fi tradusă pentru traducere imediat ce extremitatea sa 5’ este
disponibilă pentru fixarea ribozomilor. În figură este reprezentat filamentul de ADN pe care
transcripţia este în curs. Se pot observa molecule de ARNm din ce în ce mai lungi la nivelul cărora
sunt ataşaţi ribozomi pentru a forma poliribozomii. Catenele proteinelor în formare nu sunt vizibile
în micrografiile realizate în cazul traducerii unor proteine normale dar se pot observa la nivelul
singurului poliribozom izolat dintr-o celulă a glandelor sericigene de la viermele de mătase.
Proteina de mătase în curs de sinteză este vizibilă din cauza mărimi sale şi a maturii sale fibroase.
Posibilitatea vizualizării transcripţiei şi traducerii, oferită de Oscar Miller de la Ridge National
Laboratory, a constituit o etapă în vizualizarea unui proces care până în acel moment numai în
termeni biochimici.
Pornind de la discuţia privind evoluţia conceptului de genă care la început a fost considerată
o unitate ereditară care controlează caracteristicile unei plante de mazăre, gena a devenit apoi un
locus pe cromozom, un segment de moleculă de ADN şi, mai recent, o unitate de transcripţie. Este
remarcabil că, în ciuda schimbărilor intervenite în felul nostru de a vedea factorii ereditari, toate
conceptele privind gena au rămas valabile, chiar dacă fiecare a fost adaptat pentru a răspunde la
noi criterii citologice şi moleculare. Descoperirea secvenţelor intermediare a modificat din nou
conceptul de genă, îndepărtându-l de dogma care domina şi care considera că o secvenţă lineară
neîntreruptă de nucleotide generează o secvenţă corespunzătoare de aminoacizi, revelând şi
complexitatea transferului informaţiei în celula eucariotă. Cum este adesea cazul, descoperirea
unei enigme ajută la explicarea altora. În acest caz, descoperirea în marea majoritate a genelor, a
unui ansamblu de introni a căror lungime depăşeşte pe cea a segmentelor codante a permis
realizarea unui pas
237
important şi a explicat de ce există atâta ADN în genomul organismelor superioare şi de ce
transcripţii primari sunt mult mai lungi decât mesagerii produşi în final.
(1) Reglarea expresiei genelor Principii de reglare a activităţii
genelor
Cantităţile de proteine sintetizate de către o celulă nu sunt neapărat fixe şi variază în funcţie
de necesităţile celulei. Colibacilul E. coli poate la fel de bine să sintetizeze metaboliţi ca triptofanul
sau histidina sau să le preia din mediul de cultură. Oricare dintre aceste mecanisme este declanşat
în funcţie de necesităţile celulei şi în funcţie de prezenţa sau absenţa metaboliţilor respectivi în
mediu. În general bacteria nu sintetizează metaboliţi decât în cazul în care nu îi poate obţine
(preleva) din mediu. Ea realizează (face) astfel economie de sinteze inutile. (Ea economiseşte astfel
sintezele inutile). Diferitele niveluri de expresie a genelor sunt dovada (constituie dovada) acestei
ajustări permanente între nevoile celulare şi mecanismele moleculare destinate asigurării acestora.
Această reglare este rezultatul diferenţelor de recunoaştere a diferiţilor promotori (a promotorilor)
de către ARN polimerază şi de diferenţele în începerea traducerii (demararea traducerii). De
asemenea, există sisteme de reglare tip care realizează (determină) expresia (exprimarea) la
comandă. Alte sisteme ajustează concentraţia unei proteine în celulă în funcţie de necesităţile
impuse de mediu. Toate aceste mecanisme poartă numele (au fost denumite) reglarea expresiei
genelor.
Mecanismele de reglare sunt diferite la procariote şi la eucariote. Mecanismele de la
bacterii şi de la fagi sunt cele mai bine cunoscute. (Sunt mai bine cunoscute mecanismele de la
bacterii şi de la fagi); acestea controlează în primul rând transcripţia (dacă este nevoie de proteină,
transcripţia este activată, dacă nu transcripţia este încetinită dar nu se opreşte niciodată). La
eucariote, sistemele de reglare se pot opri complet transcripţia unei gene, expresia în acest caz
bazându-se în esenţă pe stimulare.
Mecanismele de reglare se pot împărţi în două categorii: reglare pozitivă şi reglare
negativă.
Într-un sistem de reglare negativă, un inhibitor, prezent în celulă, blochează transcripţia.
Într-un sistem de reglare pozitivă, o moleculă efectoare de natură proteică sau de altă natură
(moleculă mică, complex molecular) activează promotorul. Cele două sisteme de reglare nu se
exclud şi anumite gene sunt în acelaşi timp reglate pozitiv şi negativ.
Într-un proces de degradare, reglarea se realizează adesea implicând însăşi molecula de
degradat şi poate fi negativă sau pozitivă (exemplul operonului lactoză). Din contră, într-un proces
de biosinteză, produsul final realizează reglarea şi de cele mai multe ori în manieră negativă (cazul
operonului triptofan).
Reglarea se poate realiza fie asupra sintezei enzimelor implicate într-o cale de biosinteză
sau de degradare fie asupra activităţii enzimelor. În acest proces de biosinteză produsul final în
activează frecvent enzima. Acest tip de reglare se numeşte retroinhibiţie. În afară de produşii de
reacţie există şi ale molecule numite efectori alosterici care pot inhiba o enzimă. Reglarea la
procariote
Expresia genelor depinde de ARN polimerază şi de un anumit număr de proteine de reglare
(implicate în reglare). La bacterii, anumite molecule acţionează ca inductori şi drept co-represori
determinând astfel viteză de biosinteză a proteinelor controlând sinteza ARNm corespunzători.
Aceste molecule se combină cu inhibitorul transcripţiei adesea desemnat ca represor, pentru a-l
inactiva (molecula este în acest
238
caz inductoare a expresiei deoarece înlătură inhibiţia) sau activa (molecula este inhibitoare
deoarece provoacă inhibiţie). Reglarea expresiei genelor este esenţial (în esenţă) transcripţională
şi post-transacripţională.
Reglarea transcripţiei Modelul operonului lactozei
Pentru a trăi colibacilul trebuie să dispună de o sursă de carbon organic a cărei degradare
furnizează energie şi precursorii (scheletul carbon) necesar propriilor sinteze. Această sursă este
constituită preferenţial din glucoză (biomolecula cea mai abundentă din biosferă) dar şi din alte
glucide cum sunt galactoza, lactoza şi aminoacizii. Pentru a metaboliza lactoza, E. coli sintetizează
o permează, pentru a autoriza (pentru a permite) intrarea glucidului în celulă, şi o β-galactozidază
care degradează lactoza în galactoză şi glucoză.
permează Lactoza externă Lactoză internă β-galactozidază Lactoza înternă galactoză + glucoză
Controlul negativ al operonului Când E. coli este cultivată într-un mediu de cultură conţinând ca
singură sursă de carbon lactoza (deci în absenţa glucozei), cantitatea intracelulară de β-
galactozidază creşte brusc. De fapt, există un sistem de reglare care nu autorizează sinteza acestei
enzime decât în prezenţa substratului. Acest mecanism de reglare, evidenţiat de către Jacob şi
Monod în 1961, a fost dedus din următoarele observaţii:
- În absenţa lactozei (sau a unei molecule din familia β-galactozidelor), concentraţiile în
permează şi în β-galactozidază sunt foarte reduse în celulă. În prezenţa lactozei, concentraţiile
cresc de aproximativ 105.
- Când lactoza este adăugată în mediu de cultură al unei culturi bacteriene capabilă să o
utilizeze, sunt şintetizate permeazele şi β-galactozidaza aproape simultan. Înainte de adăugarea
lactozei nu există ARNm care codifică pentru cele două enzime (ARNm lac), astfel încât lactoza
declanşează sinteza ARNm lac.
Aceste observaţii ne permit să afirmăm că sistemul de reglare al căii de degradare a lactozei
este inductibil, inductorul fiind lactoza. Cele trei enzime ale operonului sunt numite inductibile, şi
în absenţa lactozei se consideră că operonul este reprimat.
1) Sistemul de utilizare a lactozei presupune gene de structură şi gene ale secvenţelor de
reglare. Ansamblul formează operonul lactoză.
2) Genele lacZ (β-galactozidază) şi lacY (permează) sunt transcrise într-o singură moleculă
de ARNm policistronic care conţine şi transcriptul unei a două gene LacA ce codifică enzima
transacetilază a cărei funcţie este necunoscută.
3) Promotorul care îniţiază transcripţia genelor lacZ, lacY şi lacA este situat în amont de
o secvenţă reglatoare numită operator.
4) Gena lacI situată în amonte de promotor produce de manieră constitutivă (într-o
concentraţie aproape constantă) o proteină, represor care se fixează cu foarte mare afinitate la
operator.
5) Fixarea represorului la operator blochează promotorul şi împiedică astfel ARN
polimeraza să se ataşeze şi să iniţieze transcripţia ARNm lac.
6) Inductorii (lactoză şi β-galactozide) stimulează sinteza ARNm lac combinându-se cu
represorul ceea ce diminuează foarte tare afinitatea sa pentru
239
secvenţa ADN a operatorului făcându-l astfel inactiv. Acest proces este numit derepresie. Astfel
inductorul decroşează represorul şi eliberează promotorul, ceea ce autorizează începerea
transcripţiei de către ARN polimeraze.
Funcţionarea operonului lactoză a fost confirmată prin utilizarea de mutanţi lacI-, lacIs şi
lacOc. Mutanţii lacI au pierdut capacitatea de a sintetiza represorul;sistemul rămâne în permanenţă
indus în absenţa lactozei. Mutanţii lacIs sintetizează un represor mutant care nu se mai poate
combina cu inductorul. Acesta rămâne deci fixat la ADN iar sistemul este reprimat în permanenţă.
Mutanţii lacOc au un operator care a pierdut o parte din secvenţa sa prin deleţie şi care nu poate
fixa corect represorul astfel încât sistemul este indus chiar şi în absenţa inductorului.
Controlul pozitiv al operonului Pentru a funcţiona normal, chiar în prezenţa unui inductor care
neutralizează represorul, operonul lactoză trebuie să primească un semnal de control pozitiv.
Acest sistem de reglare a operonului lactoză a fost descoperit studiind (cercetând) maniera
(modalitatea) prin care glucoza inhibă funcţionarea anumitor operoni.
Dacă mediul conţine glucoză şi lactoză, transcripţia operonului lactoză nu este necesară.
Glucoza este metabolizată preferenţial şi ea exercită o represie, numită catabolică, asupra
operonului lactoză. Deci, nu există sinteză de β-galactozidază atât timp cât în mediu există glucoză.
Astfel, în ciuda prezenţei inductorului, lactoza, care inactivează precursorul, transcripţia genelor
operonului lactoză nu se produce. Transcripţia are loc dacă operonul este reglat de manieră pozitivă
(în mod pozitiv). Reglarea pozitivă implică două gene, cea a adenilat ciclazei care produce AMP
ciclic (AMPc) şi cea a unei proteine receptoare de AMPc (cRP) sau proteina de activare catabolică
(CAP pentru Catabolite gene Activator Protein). Concentraţia AMPc în celulă este invers
proporţională cu cea a glucozei. Când concentraţia de glucoză este scăzută, AMPc devine
abundent, se fixează la proteina CAP şi activează astfel operonul lactoză. Complexul AMPc-CAP
se fixează pe un situs particular al operonului (situs CAP între poziţiile –72 şi –52) şi activează
transcripţia genelor adiacente favorizând o mai bună ataşare a ARN polimerazei la promotor. El
acţionează ca un stimulator, regulator pozitiv al transcripţiei operonului lactoză şi al multor altor
operoni.
ROLUL CATALIZATOR AL ARN
Cercetările realizate în biochimie şi biologie moleculară în cursul anilor ’70 au întărit
înţelegerea rolului proteinelor şi acizilor nucleici. Proteinele erau considerate ca agenţi care
permiteau funcţionarea celulară şi enzimele ca accelerând reacţiile biochimice. Pe de altă parte,
acizii nucleici erau considerate moleculele care stochează informaţia celulară, conţinând
informaţiile genetice în structura lor nucleotidică. Repartiţia sarcinilor între proteine şi enzime
părea să fie una dintre diferenţele cele mai bine definite în ştiinţele biologice. Acest lucru a fost
valabil până în 1981 când a fost publicat un articol care a început să umbrească această diferenţiere.
Thomas Cech şi colaboratorii săi de la Universitatea din Colorado studiau procesul de
transformare în ARNr matur a precursorului ARN ribozomal sintetizat de către protozoarul ciliat
Tetrahymena thermophila. Contrar moleculelor de pre-ARNr de la mamifere, cel de la
Tetrahymena thermophila conţinea o secvenţă intermediară de aproximativ 400 de nucleotide care
trebuiau îndepărtate din transcriptul primar înainte de reunirea (legarea) segmentelor.
Cech observase înainte că nucleele izolate de celule erau capabile să sintetizeze
precursorul pre-ARNr şi să efectueze întreaga reacţie de maturare
240
(splicing/epissage). Nu se realizase încă izolarea enzimelor de splicing/epissage de la alte tipuri
celulare şi Tetrahimena părea să fie un sistem bun pentru studiul acestor enzime. Prima etapă era
izolarea precursorului pre-ARNr intact, apoi determinarea numărului minim de elemente nucleare
care trebuiau adăugate amestecului de reacţie pentru ajunge la un splicing/epissage corect. Când
nucleele izolate au fost incubate în mediu care conţine o concentraţie scăzută de cationi
monovalenţi (NH
4

+ 5mM), molecula
de pre-ARNr era sintetizată dar intronul nu era îndepărtat. Acest lucru a permis cercetătorilor să
purifice precursorul intact pe care doreau să îl folosească drept substrat pentru a testa activitatea
de maturare a extractelor nucleare. Totuşi, aceştia au constatat că, dacă precursorul purificat era
incubat singur la concentraţii mai crescute în ioni de NH
4

+, în prezenţă de Mg2+ şi a unui derivat de guanozină (cum este GMP

sau GTP), secvenţa intermediară era obţinută plecând de la precursorul matur. Analiza secvenţelor
nucleotidice a confirmat că fragmentul mic de ARN care era îndepărtat din precursor era intronul
care conţinea un nucleotid cu guanidină în plus la extremitatea 5’. Nucleotidul adăugat provenea
din GTP adăugat amestecului de reacţie.
„Splicingul” unui intron este o reacţie complicată care cere recunoaşterea secvenţelor care
îl flanchează, ruperea legăturilor fosfodiester de o parte şi de alta a intronului şi legarea
fragmentelor învecinate. Toate eforturile au fost făcute pentru a elimina orice proteină care ar putea
fi fixată la ARN înainte de a testa capacitatea de „splicing” a acesteia. ARN a fost tratat cu un
detergent fenolic, centrifugat într-un gradient şi tratat cu o enzimă proteolitică. În această situaţie
nu existau decât două explicaţii rezonabile: fie „splicingul” era datorat unei proteine legată foarte
intim la ARN, fie unei molecule de ARN sau de pre-ARN capabile ea însăşi de „splicing”. Această
ultimă explicaţie nu a fost deloc uşor de admis.
Pentru a rezolva problema prezenţei unui contaminant proteic, Cech şi colaboratorii au
utilizat un sistem artificial care nu putea să conţină proteine nucleare de „splicing”. ADN care
codifică precursorul ARNr a fost multiplicat prin clonare în E. coli, apoi purificare şi folosire
drept model pentru procesul de transcripţie „in vitro” realizat de o ARN polimerază bacteriană
purificată. Pre-ARNr sintetizat in vitro a fost apoi purificat şi incubat în prezenţă de ioni
monovalenţi şi bivalenţi şi un derivat de la guanozină. ARN folosit nu poate fi contaminat cu
enzime de „splicing” celulare. Totuşi, pre-ARN suportă aceeaşi reacţie de „splicing” care se
produce în celula eucariotă. Deci, ARN trebuie să fi realizat singur propriul „splicing”.
Aceste experienţe au demonstrat că ARN este capabil să catalizeze o reacţie complexă,
formată din mai multe etape. Calculele demonstrează că reacţia a fost accelerată de aproximativ
zece milioane de ori în raport cu viteza de reacţie ne- catalizată. Ca o enzimă proteică, ARN era
activ la concentraţii scăzute , nu era modificată în reacţie şi era capabilă să accelereze puternic o
reacţie chimică. Singura diferenţă între acest ARN şi „enzimele clasice” era că ARN acţiona asupra
lui însăşi şi nu asupra unui substrat independent. Cech a desemnat acest ARN ca fiind o „ribozimă”.
În 1983, s-a descoperit un al doilea exemplu de cataliză realizat de către un ARN ne-înrudit.
Sidney Altman de la Yale University şi Norman Pace, de la National Jewish Hospital de Denver
şi colegii lor, studiau în colaborare ribonucleaza P, enzimă implicată în maturarea unui precursor
de ARN de transfer la bacterii. Enzima era neobişnuită: ea era compusă dintr-o proteină şi ARN.
În urma incubării cu tampoane cu concentraţii ridicate (60 mM) de Mg2+, subunitatea ARN
purificat[ era capabilă să înlăture extremitatea 5’ a precursorului ARNt exact cum acest proces era
realizat de
241
molecula întreagă de ribonuclează P în celulă. Molecula de ARNt matură, transformată, se găsea
printre produşii de reacţie „in vitro”. Din contră, subunitatea proteică izolată din enzimă era lipsită
de activitate catalitică.
Pentru a exclude posibilitatea ca un contaminant proteic catalizează de fapt reacţia,
porţiunea de ARN a ribonucleazei P a fost sintetizată in vitro plecând de la un model de ADN
recombinant. Ca şi ARN extras din celulele bacteriene, acest ARN sintetizat artificial, fără nici o
proteină suplimentară, era capabil să cliveze corect precursorul ARNt. Contrar enzimei de
maturare a ARN studiată de Cech, ARN ribonucleaza P acţiona asupra unei alte molecule de
substrat şi nu asupra ei însăşi. Deci, s-a dovedit că ribozimele puteau avea ele însăle proprietăţi
catalitice asemeni enzimelor formate din proteine. În figura este redat un model recent de interacţie
între subunitatea ARN catalitică a ribonucleazei P şi un precursor de ARNt care serveşte drept
substrat.
Dovada că ARN putea cataliza reacţii chimice a creat un mediu propice unor noi cercetări
asupra unei probleme vechi: care este elementul din subunitatea mare ribozomală cu activitate
peptidil-transferazică, şi care este cel care catalizează formarea legăturii peptidice. În cursul anilor
1970 au fost făcute mai multe descoperiri independente care au sugerat că ARN ribozomal ar putea
avea un rol mult mai important decât să servească de eşafodaj pentru menţinerea structurii
proteinelor ribozomale individuale într-o poziţie propice derulării unor activităţi importante.
Printre aceste argumente enumerăm:
1. Anumite suşe de E. coli posedă gene care codifică proteine capabile să omoare bacterii,
numite colicine. Se ştia că una dintre aceste toxine, colicina E3 inhibă sinteza proteică în celulele
bacteriene sensibile. Ribozomii izolaţi din celulele tratate cu colicină E3 par destul de normali
pentru majoritatea criteriilor, dar nu permit sinteza proteinelor in vitro. Un studiu mult mai
aprofundat al acestor ribozomi demonstrează că deficienta era prezentă la nivelul ARNr şi nu în
structura proteinelor ribozomale. ARN 16S din subunitatea mică era clivată de colicină la
aproximativ 50 de nucleotide faţă de capătul 3’, ceea ce făcea întreaga subunitate incapabilă să
realizeze sinteza proteică.
2. S-a constatat că tratamentul subunităţilor mari ribozomale cu ribonucleaza T1, enzimă
care clivează legăturile dintre nucleotidele continue din ARN şi fac subunităţile incapabile să
realizeze reacţia peptidil-transferazică.
3. Diferite cercetări asupra antibioticelor care inhibă formarea legăturii peptidice, cum este
cazul cloramfenicolului, carbomicina şi eritromicina, au sugerat că aceste substanţe acţionează
asupra ARN şi nu asupra proprietăţilor ribozomale. De exemplu, s-a constatat că ribozomii devin
rezistenţi la efectele cloramfenicolului ca urmare a substituirii unor baze în structura ARN
ribozomal.
4. S-a demonstrat că moleculele de ARN ribozomal sunt foarte conservate la nivelul
secvenţelor de baze, mult mai mult decât în secvenţele de aminoacizi ale proteinelor ribozomale.
Anumite regiuni din structura ARN ribozomal sunt practic identice în ribozomi provenind din
bacterii (archeobacterii ca eubacterii), ciuperci, plante şi animale, ca şi în ribozomii izolaţi din
mitocondrii şi cloroplaste. Cea mai mare parte a regiunilor foarte conservate sunt situate la
suprafaţa ribozomului. O astfel de conservare a secvenţelor de ARNr ne lasă să credem că aceste
molecule au un rol fundamental în funcţionarea ribozomului. În 1975, C.R. Woese concluziona:
„deoarece nu există sau există puţine corelaţii între regiunile conservate şi de situsuri cunoscute
de fixare la proteinele ribozomale, există puternice presupuneri în favoarea unei implicări directe
a regiunilor importante ale ARN în funcţionarea ribozomului”.
242
 Ca urmare a descoperirii unor proprietăţi catalitice ale ARN în laboratoarele conduse de
Cech şi Altman, cercetările privind rolul ARN ribozomal au fost intensificate. Multe cercetări
realizate de Harry Noller şi colegii săi de la Universitatea din California, Santa Cruz, s-au focalizat
pe situsul ARN ribozomic care se găseşte în apropierea centrului peptidil-transferazic. În cursul
unui studiu, ei au sintetizat o versiune modificată a fenilalanil-ARNt care, atunci când se află în
situsul P al unui ribozom, se uneşte el însuşi la molecula de ARNr. Chiar dacă el este astfel fixat,
analogul ARNt rămâne capabil să participe la formarea legăturii peptidice: aceasta demonstrează
că analogul trebuie să fie situat la situsul P şi să fie orientat corect. Analiza ulterioară a ARNr
provenind din aceste experienţe indică că nucleotidele din structura ARNr care sunt astfel fixate
se găsesc într-un situs conservat care formează o buclă centrală situată în domeniul V al moleculei.
Mai precis această regiune a ARNr care a fost înainte considerată ca situsul mutaţiilor care conferă
rezistenţă la cloramfenicol sau la eritromicină. Luate împreună, aceste descoperiri desemnează clar
această buclă a ARN ca fiind unul dintre elementele care fac parte din centrul peptidil-transferazic.
În cursul altor experimente, s-a demonstrat că moleculele de ARNt fixate de ribozom protejează
bazele specifice ale ARNr din subunitatea mare contra unui atac care poate fi realizat de către
agenţi chimici specifici. Această protecţie demonstrează că ARNt trebuie să fie situat foarte
aproape de bazele de ARNr care sunt protejate. În funcţie de fixarea ARNt în situsul A sau în
situsul P, sunt protejate loturi diferite de baze, însă în fiecare caz acestea se află în sau în apropierea
buclei centrale a domeniului V. Protecţia dispare dacă extremitatea 3’ a ARNt (extremitatea CCA
unită la aminoacid) este înlăturată. Este vorba de extremitatea ARNt implicată în formarea legăturii
peptidice, care trebuie să se găsească foarte aproape de situsul peptidil-transferazic.
Tentativele făcute pentru a atribui o funcţie particulară ARN ribozomal izolat au eşuat
întotdeauna. S-a presupus că, deşi proteinele ribozomale nu au funcţii specifice, prezenţa lor este
necesară cel puţin pentru a păstra o conformaţie adecvată a ARNr. Dacă ţinem cont de faptul că
proteinele şi ARN ribozomal au co-evoluat timp de miliarde de ani, puteam să ne aşteptăm ca
cele două molecule să fie interdependente. În ciuda acestui raţionament, puterea catalitică a
ARNr izolat a fost în sfârşit dovedită de către Harry Noller şi colaboratorii săi în 1992. Noller a
lucrat pe ribozomii de la Thermus aquaticus (cu o stabilitate particulară), o bacterie care trăieşte
la temperaturi crescute. Noller a tratat preparatele de subunităţi ribozomale mari cu un detergent
destinat extracţiei proteinelor (SDS), o enzimă proteolitică (proteinaza K) şi mai multe treceri în
fenol pentru denaturarea proteinelor. Ansamblul acestor agenţi înlătură cel puţin 95% din
proteinele subunităţii ribozomale şi asigură păstrarea ARNr. S-a demonstrat că cea mai mare
parte din proporţia de 5% de proteine care a rămas asociată la ARNr consta în peptide mici care
reprezentau fragmente de proteine ribozomale. Totuşi, în ciuda eliminării aproape totale a
proteinelor, ARNr conservă aproape 80% din activitatea peptidil-transferazică a subunităţii
intacte. Activitatea catalitică era blocată de către cloramfenicol şi prin tratament cu ribonuclează.
Când ARN era supus unor tratamente suplimentare pentru a elimina restul de proteine (cele 5%),
preparatul pierdea activitatea sa catalitică. Deoarece este puţin probabil ca micile fragmente
peptidice să fie responsabile pentru activitatea catalitică, considerăm că acest eperiment
dovedeşte că peptidil-transferaza este o ribozimă. Perspective pentru om
 Ribozimele posedă două proprietăţi care fac din acestea agenţi importanţi în lupta contra
anumitor maladii cronice:
243
1. ele conţin segmente nucleotidice care le permit să se împerecheze cu un
ARN complementar. 2. ele posedă un situs catalitic capabil să cliveze scheletul ARN
complementar Graţie acestor proprietăţi, ribozimele sunt un subiect de manipulare
ideal în inginerie genetică deoarece ele pot fi fabricate „la comandă” pentru a recunoaşte şi
distruge orice ţintă ARN specifică.
Ribozimele „la comandă” încep a fi folosite în lupta contra maladiilor virale. Pentru ca un
virus să provoace „probleme” într-o celulă infectată, trebuie ca genomul viral să fie transcris în
ARN şi apoi tradus în proteine. Să ne gândim la ceea ce se poate întâmpla dacă o celulă infectată
posedă o genă care codifică o ribozimă capabilă să se unească specific la moleculele de ARN viral
şi să le distrugă. Ne-am putea aştepta ca celula să fie protejată de virus, chiar dacă genomul său
este integrat în ADN-ul celulei gazdă. Experienţe destul de recente realizate de Flossie Wong-
Staal, Universitatea din California, şi Arnold Hempel, de la Northern Illinois University, au
demonstrat că este posibilă folosirea ribozimelor în acest mod.
În experienţa lor, Wong-Staal şi Hempel au izolat limfocite T de la pacienţii suferinzi de
SIDA şi au transfectat celulele cu o secvenţă de ADN modificată genetic care codifică o ribozimă
capabilă să recunoască şi să scindeze ARNm al virusului HIV. Gena ribozimei este plasată în aval
faţă de un promotor „puternic”, care garantează transcrierea activă genei. Testele indică că
ribozima reduce de aproximativ 10. 000 ori cantitatea de virus produsă de celulele infectate de
HIV în comparaţie cu celulele ne-transfectate. Un punct la fel de important, este că ribozima
distruge moleculele de ARN viral cu o eficacitate manifestă, fără a afecta moleculele de ARN
normale din celulă. Etapa următoare a proiectului o reprezintă punerea la punct şi în practică a
unor teste clinice la scară mică, constând în repunerea limfocitelor care conţin o genă pentru
ribozimă în organismul pacientului din care provin celulele. Speranţa pe care o avem este ca
celulele transfectate să fie rezistente la virus şi să protejeze sistemul imunitar al pacientului.
Scopul ultim al acestei terapii genice este introducerea unei ribozime care distruge ARN în
toate celulele organismului infectate de către virus, şi să nu se mai limiteze la celulele care circulă
în fluxul sanguin.
Ribozimele pot fi utile şi pentru a lupta contra anumitor tipuri de cancer care au apărut ca
urmare a inducerii unei mutaţii într-o genă (sau o oncogenă) care codifică pentru o proteină
implicată în reglarea diviziunii celulare. Aceste celule devin maligne din cauza sintezei unui ARN
diferit de cel pe care îl produc celulele normale. Este posibilă suprimarea stării maligne a celulei
prin distrugerea ARN modificat, sarcină care poate fi realizată de către o ribozimă. S-a realizat
izolarea celulelor canceroase de vezică de la om şi acestea au fost transfectate cu o genă de aceeaşi
mărime care codifică pentru o ribozimă capabilă să recunoască şi să distrugă moleculele de ARN
transcrise de către oncogena modificată. În mod normal, celulele maligne de vezică sunt capabile
să producă tumori când ele sunt injectate la şoareci de laborator, dar celulele transfectate cu gena
care codifică pentru ribozimă nu mai sunt maligne şi nici capabile să producă tumori la animalul
gazdă. Pentru a fi eficiente în tratamentul cancerului, gena care codifică ribozima trebuie introdusă
în toate celulele unei tumori, ceea ce, aşa cum am arătat mai înainte, necesită punerea la punct a
vectorului capabil să elibereze gena în ţesuturile interne ale organismului.
244
NOTE DE CURS BM6
REPLICAREA
Slide 12. Replicarea la E. Coli este iniţiată de către proteina DnaA
Secvenţele de 9 şi 13 pb sunt secvenţe repetitive din figura anterioară. Mai multe copii ale
proteinei DnaA se leagă la secvenţa de 9 pb din orfigine şi apoi “topeşte” (sepqară catenele)
segvenţei de 13 pb. Singura funcţie a DnaC este de aelibera DnaB, care este compusă din 6
subunităţi identice cu matriţa. Un hexamer DnaB se fixează pe fiecare catenă ADN la nivelul oriC,
formând un complex de promar. DnaB este o helicază, iar cele două molecule se vor orienta în
cele două direcţii diferite ale furcii de replicare îndepărtându-se de origine.
Slide 12. La E. coli DnaB helicaza este responsabilă de desfacerea
duplexului ADNÎn prezenţa ATP şi a SSB (single strand binding protein) DnaB purificată poate
desface (desfăşura) duplexul ADN in vitro. Desfacerea apare predominant în direcţia capatului 3’
al catenei la care este ataşată molecula DnaB. Această catenă acţionează ca matriţă pentru sinteza
catenei întârziate (lagging strand). Proteinele SSB se leagă la catenele de ADN desfăcute pentru
a împiedica reasocierea. Pentru simplificare, legarea DnaB la catena complementară din partea
dreaptă nu este luată în considerare. Slide 32: Procesivitatea ADN polimerazelor creşte datorită
prezenţei subunităţii dimere b “clamp” Subunitatea beta dimeră a ADN polimerazei III, creşte
procesivitatea enzimei. a)Modelul spaţial al legării subunităţii la ADN dedus ca urmarea a
studiilor cristalografice cu raze X privind legarea subunităţii bata la ADN. Cele două subunităţi
(roşie şi galbenă) formează o structură sub forma unui inel (agrafe) care rămâne intim legată
circular la molecula de ADN, dar care se desprinde la capetele ADN linear. b) Diagrama
schematică a asocierii propuse pentru “core” ADN polimeraza III (verde) cu subunitatea beta
clamă (croşetă) de la capătul primerului Această interacţie ţine structura “core” împiedicând-o să
alunece pe matriţă şi permitându-i să rămână la nivelul punctului la care se adaugă nucleotidele,
crescând procesivitatea structurii “core” mai mult de o mie de ori.
Slide 33: Sinteza catenei continue şi discontinue este concurentă
1) O DnaB helicază se deplasează de-a lungul matriţei catenei lagging către capătul său
3’ , determinând astfel desfacerea duplexului ADN la nivelul furcii.
2) O “core” polimerază (core 1) adaugă rapid nucleotide la capătul 3’ al catenei leading şi
la nivelul matriţei sale monocatene nu se află o DnaB care să îşi manifeste activitatea sa helicazică.
Această subunitate polimerazică rămâne legată la ADN împreună cu subunitatea sa beta,
sintetizând astfel continuu catena leading.
3) O a doua polimerază “core 2” sintetizează catena lagging discontinuu sub forma unor
fragmente Okazaki. Cele două polimeraze “core” sunt legate prin intermediul unei proteine dimere
t (teta). Deoarece nu întreaga matriţă monocatenară a catenei lagging nu este acoperită pe ea se
fixează protein SSB şi formează o buclă. După ce sinteza fragmentelor Okasaki este completă,
polimeraza de pe catena lagging disociază de pe ADN dar rîmâne legată de subunitatea dimerului
t. Structura “core” eliberată se refixează cu ajutorul unei alte subunităţi beta în regiunea unui nou
primer pentru a sintetiza un alt fragment Okazaki.
245
Slide 42: Maşinăria de replicare eucariotă este “în general” similară cu cea de la E. coli. modelul
furcii de replicare de la SV40 şi a proteineloradiacente (a) Un hexamer al antigenului mare T (1),
o proteină virală, funcţioneză ca o helicază desfăcând catenele ADN. Catenele singular
desfăcute, din catena mamă sunt legate de către copii multiple ale proteinei heterodimerice RPA
(2). Catena leading este sintetizată de un complex format din ADN polimeraze (Pol), PCNA şi
Rfc (3). Primerii utilizaţi pentru sinteza de pe catena lagging (ARN roşu, ADN blue deschis) sunt
sintetizaţi de un complex format din ADN polimerază şi primază (4). Capătul 3’ al fiecărui
primer este sintetizat de Pol–primaza, iar apoi este legat de către un complex PCNA–Rfc–Pol,
care începe extinderea primerului şi sintetizează o mare parte a fragmentului Okazaki (5). (b)
Cele trei subunităţi ale PCNA, prezentate în diferite culori, formează o structură circulară cu un
gol în mijloc, pe unde va trece catena de ADN. (c) Subunitatea mare a PRA conţine două
domenii care leagă ADN monocatenar. În stânga, cele două domenii de legare la ADN ale RPA
sunt arătate perpendicular pe ADN. De remarcat este că ADN monocatenar este extins şi cu
bazele expuse, conformaţie optimă pentru replicarea de către ADN polimeraza. Îm dreapta se
opate observa cum RPA se ataşează la ADN. [Part (a) adapted from S. J. Flint et al., 2000,
Virology: Molecular Biology, Pathogenesis, and Control, ASM Press; part (b) after J. M. Gulbis
et al., 1996, Cell 87:297; and part (c) after A. Bochkarev et al., 1997, Nature 385:176.]
Mecanismul bidirecţional al replicării ADN.
Două helicaze antigen–T se leagă, în primul rand la nivelul originii de replicare cu
orientări diferite. 1. Folosind energia eliberata în urma hidrolizei ATP, helicazele înaintează în
direcţii opuse, despachetând ADN mamă şi generând ADN monocatenar care sunt apoi legate de
proteinele RPA. 2. Complexul primază-Pol sintetizează primeri scurţi legaţi de capetele fiecărei
catene. 3. Complexul PCNA-Rfc-Pol înlocuieşte complexul primază-Pol şi extinde primerii,
generâmd astfel catena leading (verde închis), la fiecare fus de diviziune. 4. Helicaza va desface
catena mamă, şi proteinele RPA se vor lega la nou-expusa regiune. 5. Complexul PCNA-Rfc-Pol
extinde catena leading şi mai mult. 6. Complexul primază-Pol sintetizează primeri pentru catena
lagging la fiecare punct de diviziune. 7. Complexul PCNA-Rfc-Pol detaşează complexul
primază-Pol şi extinde catena ce conţine fragmentele Okazaki (verde deschis), care vor fi ligate
la capetele 5’. Locul unde ligaturarea are loc este reprezentat cu un cerc. Replicarea continuă
repetându+se paşii menţionaţi. Deşi au fost analizaţi separat, în vederea unei mai bune înţelegeri,
toţi paşii au loc simultan Modelul replicării in vitro a SV40 de către enzimele sistemului eucariot
Figura conţine atât creşterea furcii de replicare cât şi formarea originii SV40: catena de sus
este catena leading pentru furca care se deplasează către stânga, iar catena de jos este catena
leading pentru furca care se deplasează în dreapta. Iniţierea începe prin legarea antigenului T (Tag)
şi a altor proteine la nivelul originii de replicare (1), care induc desfacerea structurii dublu-
catenare. Aceasta este urmată de legarea unei forme hexamere a Tag la matriţa catenei leading
pentru fiecare furcă de
246
replicare. 2) Funcţionând ca o helicază fiecare structură hexameră a Tag se deplasează de-a
lungul catenei la cere s-a legat către capătul 5’ , desfăcând structura dublu catenară; astfel Tag
helicaza şi DnaB se deplasează în direcţii opuse de-a lungul ADN . Polimeraza alfa (pol alfa) ,
care este strâns asociată cu o primază formează capătul 5’ al catenelor leading (3) şi apoi este
transferată de pe matriţă (4). Asocierea polimerazei d (Pol d) cu PCNA creşte procesivitatea
acestei polimeraze, astfel încât aceasta poate sintetiza restul de catene leading (5). Sinteza
catelelor lagging este realizată prin acţiunea combinată a a primazei şi a Pol a (alfa). RFC
stimulează activitatea Pol a. RPA= Replication Protein A RFC= Replication Factor C PCNA=
Proliferating Cell Nuclear Antigen Modelul furcii de replicare ADN și a proteinelor adiacente la
SV40 (a) Un hexamer al antigenului mare T (1), o proteină virală, funcţioneză ca o helicază
desfăcând catenele ADN. Catenele singular desfăcute, din catena mamă sunt legate de către copii
multiple ale proteinei heterodimerice RPA (2). Catena leading este sintetizată de un complex
format din ADN polimeraze (Pol), PCNA şi Rfc (3). Primerii utilizaţi pentru sinteza de pe catena
lagging (ARN roşu, ADN blue deschis) sunt sintetizaţi de un complex format din ADN
polimerază şi primază (4). Capătul 3’ al fiecărui primer este sintetizat de Pol–primaza, iar apoi
este legat de către un complex PCNA–Rfc–Pol, care începe extinderea primerului şi sintetizează
o mare parte a fragmentului Okazaki (5). (b) Cele trei subunităţi ale PCNA, prezentate în diferite
culori, formează o structură circulară cu un gol în mijloc, pe unde va trece catena de ADN. (c)
Subunitatea mare a PRA conţine două domenii care leagă ADN monocatenar. În stânga, cele
două domenii de legare la ADN ale RPA sunt arătate perpendicular pe ADN. De remarcat este că
ADN monocatenar este extins şi cu bazele expuse, conformaţie optimă pentru replicarea de către
ADN polimeraza. Îm dreapta se poate observa cum RPA se ataşează la ADN. [Part (a) adapted
from S. J. Flint et al., 2000, Virology: Molecular Biology, Pathogenesis, and Control, ASM
Press; part (b) after J. M. Gulbis et al., 1996, Cell 87:297; and part (c) after A. Bochkarev et al.,
1997, Nature 385:176.] Imagini de microscopie electronic a replicării ADN de la SV40 indică o
creștere bidirecțională a catenei nascente de la origine
ADN replicativ din celulele infectate cu SV40-, a fost tăiat cu enzima de restricție EcoRI,
care recunoaște un situs specific de la nivelul ADN circular. Micrografii electronice ale probelor
tratate indică o colecție de molecule tăiate cu un număr crescător de bucle de replicre, ale căror
centru se găsește la o distanță constant de capetele moleculelor tăiate. Aceste descoperiri se
corelează cu modelul bidirecțional de replicare. [See G. C. Fareed et al., 1972, J. Virol. 10:484;
photographs courtesy of N. P. Salzman.]
Replicarea ADN
Are la bază modelul semiconservativ, astfel că fiecare catenă din molecula mamă de ADN
se comport ca o matriță pentru sinteza unei catene fiice, cu care rămâne împerecheată pe bază de
complementaritate. Noile catene sunt formate pe direcție 5’-3’.
Replicarea începe la nivelul unei secvențe denumite origine de replicare. Fiecare
cromozom eucariot prezintă mai multe origini de replicare.
247
 AND polimerazele, spre deosebire de ARN polimerazele, nu pot desface catenele
duplexului de ADN și nici nu pot iniția sinteza unei noi catene complementare.
La nivelule furcii de replicare, catena fiică (leading) este elongată continuu. Cealaltă catena
(lagging) este format dintr-o serie de fragmente Okazaki discontinue, pe baza primerilor sintetizati
la fiecare câteva sute de nucleotide.
Replicarea la drojdii
Ribonuleotidele de la capătul 5’ al fiecărui fragment Okazaki sunt îndepărtate și înlocuite
prin elongarea capătului 3’ al următorului fragment Okazaki. În final, fragmentele adiacente astfel
rezultate sunt sudate de o ligază.
Helicazele utilizează energia rezultată în urma hidrolizei ATP pentru separarea catenei
matriță. Primaza sintetizează un primer ARN scurt, care rămîne atașat pe bază de
complementaritate la catena matriță. Inițial, acesta este elongate la capătul 3’ de către ADN
polimeraza (Pol), rezultând o scurtă porțiune hibridă (5)ARN-(3)ADN.
Majoritatea ADN din celulele eucariote este sintetizat de către Pol, care contiuă elongarea
catenei fiice într-o direcție 5’-3’. Pol rămâne asociată stabil cu matrița prin legarea proteinei Rfc,
de care se leagă PCNA, o protein trimerica care înconjoară duplexul ADN.
Replicarea ADN are loc, în general pe un model bidirecțional în care două furci de
diviziune formează câte o origine de replicare și înaintează în direcții opuse, ambele catene matriță
fiind copiate la fiecare furcă.
Siteza ADN in vivo este reglată prin controlarea activității helicazei MCM, care inițiază
replicarea ADN la mai multe origini de replicare situate la distanță unele de celelalte de-a lungul
cromozomului.
Slide 77. Activitatea de “proofreading” a ADN polimerazei corectează erorile de
copiere Demonstraţie experimentală a funcţiei de editare a ADN polimerazei I de
la E. coli.
Au fost construiţi: o matriţă artificială Poli(dA) şi un primer corespunzător marcat cu
timidină tritiată. Complexul matriţă-primer a fost incubat cu ADN polimerază I purificată. În
prezenţa timidinei trifosfat pppT s-a constatat o pierdere foarte rapidă citidinei marcată cu P32 şi
reţinerea întregii radiaoactivităţi a timidinei tritiate. Aceasta indică că enzima înlătură numai C
terminal incorect adăugând în acelaşi timp mai multe resturi de T complementare cu matriţa. În
absenţa pppT, atât timidina tritiată cât şi citidina marcată cu P32 sunt înlăturate. Aceasta indică că
în lipsa pppT pentru a realiza activitate de polimerizare, enzima îşi manifestă activitatea 3’-5’
exonucleazică fiind astfel înlăturate bazele corecte.
Slide 79. Telomeraza previne scurtarea catenelor întârziate în timpul replicării
eucariotelor Mecanismul de acţiune al telomerazei
Aceast complex ribonucleoproteic alungeşte capetele telomerice 3’ ale matriţei ADN a
catenei lagging printr-un mecanism de revers-transcripţie. În figură este vorba de activitatea
telomerazică a enzimei din Oxytricha, care adaugă unităţi repetitive T4G4; alte polimeraze pot
adăuga secvenţe de mărimi diferite.
Telomeraza conţine o matriţă ARN (roşu) care se împerechează la capătul 3’ al matriţei
catenei lagging. Situsul catalitic activ al telomerazei (verde) adaugă apoi deoxiribonucleotide
(albastru) folosind molecula de ARN drept matriţă; această
248
revers-transcripţie începe cu poziţia 35 a matriţei ARN (Pasul 1). Catenele duplexului ADN-ARN
rezultat se pare că alunecă apoi una în raport cu cealaltă conducând la deplasarea unei regiuni
monocatenare către catena de ADN telomeră şi la descoperirea parţială a secvenţei ARN matriţă
(pasul 2). Secvenţa telomerică a catenei întârziate este apoi extinsă către poziţia 35 de către
telomerază şi duplexul ADN- ARN suferă translocari şi hibridizare ca şi în etapele anterioare (paşii
3 şi 4). Se pare că mecanismul de alun ecare este uşurat de împerecheri neobişnuite (punctele
negre) care apar între resturile G care sunt mult mai puţin stabile decât împerecherile Watson-
Crick. Astfel, telomerazele pot adăuga structuri lungi repetitive prin reluarea aetapelor mai sus
prezentate (pasul 4 şi 5).
Topoizomeraza de tip I relaxează ADN prin inducerea de tăieturi la nivelul unei singure
catene a duplexului ADN Acţiunea topoizomerazei Topo I de la E. Coli
Intermediarul ADN-enzimă conţine o legătură covalentă între capătul 5’P al ADN şi restul
tirozinic al proteinei. După scindare capătul 3’OH liber (roşu) trece pe sub cealaltă catenă, înlătură
constrângerea, suprarăsucirea şi se reface eliberând enzima. După fiecare etapă de scindare se
elimină o suprarăsucire. Nu se consumă ATP.
Separarea topoizomerilor ADN SV40 DNA evidenţiază existenţa mai multor topoizomeri
cu un număr diferit de suprarăsuciri
ADN extras din virioni SV40 în condiţii care să asigure obţinerea unui ADN cu un număr
maxim de supra-răsuciri (linia 1).
Cîteva probe au fost tratate cu topoizomeraza de tip I din E. coli timp de 3 minute (linia 2)
sau de 30 minute (linia 3). Aproximativ 25 de benzi, egale cu numărul aproximativ de topoizomeri,
sunt vizibile în electroforegrame după tratamentul cu Topo I, incluzând şi forma deplin relaxată,
care nu prezintă supra-răsuciri. Deoarece ADN cu puţine supra-răsuciri tinde să se extindă, acestea
migrază mult mai încet decât moleculele compacte care posedă un număr mai mare de supra-
răsuciri.
Topoizomeraza de tip II modifică topologia ADN prin scindarea si resudarea ambelor catene
Actiunea ADN girazei de la E. Coli, topoizomerază de tip II a) Introducerea de suprarăsuciri
negative. Plierea iniţială nu determină o schimbare stabilă, dar activitatea ulterioară a girazei
produce o structură stabilă cu două supra- răsuciri negative. Topizomeraza II de la eucariote nu
poate induce supra-răsuciri dar poate înlătura supra-răsucirile negative din structura ADN. b)
Catenarea şi decatenarea a două molecule duplex diferite.- Această reacţie poate fi catalizată de
topoizomerazele de tip II de la pro- şi eucariote.
Modelul activităţii catalitice a topoizomerazei II (ADN giraza) din E. coli Modelul molecular al
activităţii cataliticve a topoizomerazei II de la E. Coli
Enzima este un dimer cu două subunităţi identice. Iniţial, enzima leagă o parte a catenei
ADN, segmentul G (albastru mai închis), inducând o madificare conformaţională la nivelul
domeniilor B, B’, A şi A’ ale enzimei (2). După legarea ATP (indicată prin asterix) şi a altei părţi
a catenei ADN, segmentul T (albastru deschis) se produc o serie de reacţii în care segmentul G
este scindat de către domeniile A şi A’ (portocaliu deschis) ale enzimei şi capetele segmentului G
din
249
ADN se leagă covalent la un rest de tirozină cu trei domenii (3 şi 3a). Simultan domeniile de legare
al ATP (verde) se deplasează unele către altele, transportând segmentul T către şi în deschiderea
cedntrală (4). Segmentul G tăiat este apoi resudat şi segmentul T este eliberat ca urmare a unei
modificări conformaţionale care separă domeniile A şi A’ la capătul enzimei (5). Refacerea
interfeţei dintre domeniile A şi A’ se reformează printr-o reacţie care necesită utilizarea unei
molecule de ATP (2). În acest punct, segmentul G poate disocia de pe enzimă prin conversia 2 în
1. Alternativ, enzima poate trece către un alt ciclu, trecînd segmentul T peste segmentul G şi astfel
să înlăture încă două superture.
ADN giraza înlătură super-răsuricirile pozitive care apar în mod normal la nivelul furcii
de replicare
Mişcarea furcii în creştere în timpul replicării ADN induce formarea de supra- răsuciri
păozitive la nivelul duplexului ADN, înaintea furcii de replicare.
Pentru ca sinteza ADN să se continue, supra-răsucirile pozitive trebuiesc înlăturate
(relaxate). Acest lucriu va fi realizat de către ADN giraza şi de către topoizomerazele eucariote de
tip I şi II.
Separarea moleculelor de de ADN circular replicate este realizată de topoizomeraza de tip
II
Denaturarea capetelor nereplicate urmată de supra-răsuciri conduce la instalarea unor
constrângeri topologice care determină încetarea copierii (replicării). În cazul ADN de la SV40,
cele două etape finale (sinteză şi decatenare) pot să apară în orice ordine în funcţie de condiţiile
experimentale. Catenele parentale sunt reprezentate în culori închise iar catenele fiice în culori
deschise. Studiile de microscopie electronică ale celor molecule de SV40 complet replicate
demonstrează că acestea se îmbucă (se împletesc) de două ori.
Această structgură se obţine dacă sinteza este completă înainte de decatenare. Topo II
catalizează decatenarea unor astfel de cercuri împletite (îmbucate) in vitro.
Slide 105: Carcinogeni chimici care acţionează asupra ADN direct sau după activare
Carcinogenii cu acţiune directă sunt compuşi înalt electrofili care interacţionează direct cu ADN.
Carcinogenii indirecţi trebuiesc metabolizaţi înainte de a reacţiona cu ADN. Toate aceste
substanţe chimice reacţionează ca [Link] mutagenă a majorităţii compuşilor a fost
demonstrată majoritoar prin experienţe realizate pe sisteme bacteriene. Deoarece potenţialul
mutagen este adesea proporţional cu potenţialul carcinogen, mutageneza bacteriană reprezintă
teste de bază pentru testarea carcinogenilor.
Primul şi cel mai popular test este testul Ames, numit astfel după Bruce Ames cel care l-a
pus la punct. În una dintre versiunile testului, compusul chimic este incubat cu mai întâi cu un
extract de ficat pentru a permite apariţia oricărui tip de activare. Şi apoi este adăugat unei culturi
bacteriene pentru a detecta tipurile specifice de mutaţii.
Problema este că testul Ames poate evidenţia produşii cu potenţial carcinogen dar de cele
mai multe ori nu se pot demonstra mecanismele de inducere a acestora.
Cea mai bună dovadă a faptului că substanţele carcinogene acţionează ca mutageni
provin din obsrvaţiile că ADN celular este modificat (alterat) în urma
250
expunerii celulelor în cultură la acestea şi posibila transformare în celule de tip canceros.
Exemplu: extras ADN din celule umane în cultură expuse la acţiunea unui carcinogen sau
din tumori de colon. Acest ADN este pus în contact cu fibroblaste 3T3 de şoarece cultivate în
monostrat. Se constată o hiperproliferare a acestora. Analiza ADN din aceste celule 3T3
transformate oncogenic demonstrează că majoritatea acestora au integrat un segment de ADN
uman care conţinea una sau mai multe mutaţii la nivelul unei gene celulare normale, numite proto-
oncogene, implicate în controlul creşterii şi diviziunii celulare. Exprimarea acestei gene mutante
umane determină proliferarea anormală a fibroblastelor 3T3. Formele mutante ale proto-
oncogenelor care determină o proliferare anormală a celulelor sunt numite oncogene.
Astfel, au fost identificate mutaţiile de la nivelul proto-oncogenei ras, genă cu un
important rol în apariţia cancerului de colon.
Slide 106: Dezaminarea bazelor conduce la formarea sponatană a mutaţiilor punctiforme Pe
lângă activitatea de proof-reading a ARN polimerazei care corectează neîmperecherile induse în
timpul replicării, celulele au dezvoltat o serie de mecanisme pentru repararea alterărilor din
structura ADN cauzate de produse chimice şi radiaţii.
În organismele complexe cu genoame mari există multe tipuri celulare care care se divid
încet sau deloc (celule hepatice, neuronale, etc). Astfel de celule folosesc informaţia din structura
ADN săptămâni, luni sau chiar ani, crescând şansele menţinerii alterărilor în structura ADN. Dacă
procesele de reparare lucrează cu o eficienţă de 100% aceste neajunsuri sunt depăşite. Din
nefericire, repararea leziunilor cauzate de agenţi de mediu este destul de ineficientă şi aceste
leziuni pot conduce la apariţia de mutaţii care în final pot duce la apariţia cancerului. Teoretic, un
carginogen poatre acţiona legându-se la ADN şi determinând o modificare a secvenţei care este
perpetuată în timpul replicării.
Mecanismele de reparare au fost studiate mai intens la E. coli, folosind o combinaţie de
abordi genetice şi biochimice. Datorită diversităţii mecanismelor de reparare acetea pot fi împărţite
în trei categorii:
- mecanisme de reparare a neîmperecherilor, care apar imediat după sinteza ADN, foloisind
catena parentală drept matriţă pentrui a corecta nucleotidul incorect incorporat în catena nou
sintetizată;
- mecanisme de excizie şi reparare care înlocuiesc regiunile afectate din structura ADN cu
ajutorul unui sistem nucleazic specializat şi apoi umplerea “gap- urilor”;
- repararea breşelor dublu-catenare care apar la organismele multicelulare prin procese de
sure (legare) a capetelor (end-joining process). Repararea neîmperecherilor punctiforme
(Mismatch repair of Single-Base Mispairs) Figura: Formarea mutaţiilor punctiforme spontane
prin dezaminarea citozinei (C) pentru a forma uracil (U)
După dezaminarea citozinei (C) care conduce la formarea U, dacă nu se reuşeşte restaurarea
împerecherii normale C-G prin mecanisme de reparare, mutaţia va fi fixată în timpul replicării.
După un ciclu de replicare, o moleculî fiică va fi purtătoarea mutaţiei U-A şi cealaltă va aparţine
tipului sălbatic. Uracilul este înlăturat şi înlocuit cu timină generând un ADN mutant în care
perechea T-A înlocuieşte perechea C-G.
251
 Multe mutaţii spontane sunt punctiforme, fiind implicată o singură bază din structura ADN.
Acestea pot apărea în urma procesului de replicare sau particular prin procese de dezaminare unde
un rest de C se transformă într-o timină ca în figura de mai sus. Sitemele bactetiene şi eucariote
posedă un sistem de recunoaştere şi reparare a neîmperecherilor punctiforme, cu excepţia
neîmperecherilor C-C, ca şi a inserţiilor şi deleţiilor mici.
Problema conceptuală a cu reparaţiile punctiforme este determinarea catenei normale şi a
celei mutante, şi repararea acesteia din urmă pentru împerecherea corectă cu catena normală.
Slide 107: Repararea împerecherilor nepotrivite la nivelul unui defect punctiform Mecanismul de
acţiune al reparării mutaţiilor punctiforme a fost elucidat în urma descoperirii sitemului MutHLS
de la E. coli.
Astfel, la E. coli, resturile de adenină din secvenţa GATC sunt metilate la nivelul poziţiei
6. Pe catena nou formată aceste resturi de adenină nu sunt metilate urmînd a fi metilate de către o
enzimă specifică numită Dam metilază, care acţionează numai la câteva minute după sinteză. În
timpul acestei perioade de lag, ADN nou replicat este hemi-metilat la nivelul secvenţelor GATC.
În acest interval o proteină numită MutH se poate lega specic la catenele hemi-metilate,
fiind capabilî să distingă între catena parentală şi cea nou sintetizată. Astfel, orice eroare de
împerechere apărută în timpul replicării care determină apariţia unei neîmperecheri va fi
identificată de către altă proteină numită MutS care va determina legarea MutL, o proteină care
conectează MutH cu MutS şi determină clivarea secvenţei de către MutH. După excizia iniţială,
segmentul de pe catena fiică este excizat şi înlocuit cu secvenţa ADN corectă.
La tulpinile de E. coli mutante pentru sistemul MutHLS, proteinele prezintă o rată mare de
mutaţii spontane faţă de tipul sălbatec. De asemenea tulpinile care nu pot sintetiza Dam metilaze
au şi ele o rată ridicată de mutaţii spontane. Deoarece tulpinile Dam- nu pot metila adeninele din
structuta GATC, sistemul de reparare MutHLS nu pot distinge între catena parentalî şi cea nou
sintetizată.
Un mecanism similar de reparare a leziunilor rezultate din depurinare, pierderea unei
guanine sau adenine din structura ADN rezultând din clivarea legăturilor glicozidice dintre
dezoxiriboze şi baze. Depurinarea apare spontan şi este destul de comună la mamifere. Siturile
apurinice rezultate, dacă rămân nereparate, generează mutaţii în timpul replicării ADN deoarece
acestea nu pot specifica baza pereche. Toate celulele posedă endonucleaze apurinice (AP) care
taie catena ADN în apropierea situsului apurinic. Ca şi în cazul reparării neîmperecherilor
punctiforme, tăietura este extinsă de către exonucleaze, şi distanţa lipsă este reparată de către
ADN polimerază şi ligază. Figura: Model de reparare a neîmperecherilor de către sistemul
MutHLS de la E. Coli Sistemele de reparare operează adesea după încorporarea unei baze
greşite, înainte de metilarea catenei nou formate. MutH se leagă specific la secvenţa
hemimetilată GATC, şi MutS şe leagă la situsul de neîmperechere. Legarea proteinei
MutLsimultan cu MutS şi în proximiktatea MutH activează activitatea endonucleazică a MutH,
care apoi taie catena nemetilată la nivelul secvenţei GATC . Regiunea de pe catena fiică care
conţine neîmperecherea este excizată (înlăturată). În continuare se repară defectul (se umple
gaura) de către ADN polimeraza I, se produce ligarea şi metilarea secvenţei fiice reparată.
252
 Slide 109: Baze modificate chimic: dimeri timină-timină Celulele folosesc repararea prin
excizie pentru a fixa regiunile de ADN care conţin baze chimic modificate, adesea numite aducţi
chimici, care distorsionează copmportamentul local normal al ADN. Cheia acestui tip de reparare
o reprezintă capacitatea anumitor proteine de a aluneca de-a lungul moleculei de ADN dublu-
catenare căutând o protuberanţă sau iregularităţi în structura dublului helix. De exemplu, acest
mecanism repară dimerii de timină-timină, cea mai comun tip de modificare cauzată de razele
UV. Aceşti dimeri interferă atât cu replicarea cât şi cu transcripţia. Mecanismele de excizie-
reparare pot corecta şi regiunile care conţin baze alterate prin ataşarea unor grupări chimice mari
(cum sunt carcinogenii ca benzopirenul).
Probabil cel mai bine înţeles mecanism de excizie-reparare UvrABC de la E. coli. Celulele
cu mutaţii la nivelul locusurilor uvrA, B, C sunt foarte sensibile la UV şi compuşi chimici care
adaugă grupări mari la structura ADN.
Slide 111: Mecanismul UvrABC de excizie-repair a ADN la E. coli
Figura : Două molecule de UvrA şi una de UvrB formează un complex care se deplasează
aleator de-a lungul ADN (etapele 1 şi 2). Dacă complexul întâlneşte o leziune conformaţională la
nivelul ADN, denaturează local dublul helix ADN şi în îndoie la 1300, folosind energia furnizată
de hidroliza ATP (etapa 3). După ce dimerul UvrA disociază (etapa 4), endonucleaza UvrC se
leagă şi taie (înlătură) întreaga catenă afectată la nivelul a duoă situsuri separate de 12 sau 13 pb
(etapele 5 şi 6). În continuare, UvrB şi UvrC disociază şi helicaza II înlătură definitiv regiunea
afectată (etapa 7), fragmentul monocatenar fiind degradat în mononucleotide. Breşa este umplută
de ADN polimeraza I şi ligarea este realizată de ADN ligază (etapa 8).
Figura ilustrează cum sistemul UvrABC repară modificările din structura ADN. Iniţial, un
complex care conţine două molecule de UvrA şi o moleculă de UvrB se cuplează şi apoi se leagă
la ADN. Atât formarea cât şi legarea la ADN necesită ATP. Se pare că complexul UvrA-UvrB se
leagă iniţial la un segment neafectat şi suferă o translocare de-a lungul helixului ADN până când
este recunoscut aductul; această translocare de-a lungul helixului necesită şi ea ATP. O modificare
conformaţională ATP-dependentă la nivelul regiunii ADN se leagă la complexul UvrA-UvrB şi
apoi produce o îndoitură, răsucitură la nivelul sitului afectat. După disocierea dimerului UvrA,
proteina UvrC care are şi activitate endonucleazică se leagă la situl afectat. Interacţia dintre UvrC
şi îndoitura din structura ADN determină deschiderea catenei şi permite sitului cxatalitic al enzimei
să aibă acces la ţinta sa. Pozioţionarea precisă a sitului de clivare este determinată de natura
problemei de la nivelul ADN. În cazul dimerilor de timină, UvrC clivează două legături
fosfodiester: una este localizată la opt nucleotide către 5’ faţă de leziune, şi una este localizată la
4 sau 5 nucleotide în 3’ faţă de leziune. După ce UvrC clivează regiunea afectată aceasta este
îndepărtată de către o helicază şi degradată; regiunea lipsă este reparată cu participarea ADN
polimerazei I şi ADN ligazei.
Slide 116: Repararea capetelor ADN neomolog Figura : Repararea breşelor dublu-catenare
prin unirea capetelor ADN ne- omolog (în albasxtru deschis şi închis), adică, cu secvenţe ne-
similare la capete.
 Aceste tipuri de ADN pot fi fragmente ale aceleiaşi gene, sau fragmente de ADN de pe
diferiţi cromozomi. Un complex din două proteine, Ku şi o protein-kinază ADN dependentă, se
leagă la capetele pauzei bicatenare. După formarea unei sinapse la nivelul căreia capetele rupte se
suprapun, Ku înlătură capetele, până când are şansa
253
detectării de secvenţe omologe pe cele două catene ADN care se vor împerechia în regiunea de
microomologie. Capetele monocatenare 5’ neîmperechiate sunt înlăturate prin mecanisme care
nu sunt destul de bine cunoscute, iar cele două molecule dublu- catenare sunt ligate împreună.
Drept rezultat, pauza dublu catenară este reparată dar o serie de baze de la nivelul situsurilor de
legare sunt îndepărtate. Repararea capetelor ADN neomolog
O celulă care a suferit o rupere particulară a capetelor dublu-catenare conţine de obicei şi
alte rupturi; fiecare ruptură poate fi reparată prin unirea capetelor libera ale ADN. Unirea capetelor
rupte care aparţin la diferiţi cromozomi duce adesea la translocări ale unor fragmente de ADN de
pe un cromozom pe altul. Aceste translocări pot conduce la o creşţtere anormală a celulelor prin
plasarea unei proto- oncogene după sau în apropierea regiunii control al unui promotor aparţinând
altei gene.
Ruperile dublu-catenare pot fi cauzate de radiaţii ionizante şi de medicamente
anticanceroase, cum sunt bleomicina (reprezintă calea prin care aceşti compuşi omoară celulele în
creştere)
Ruperile dublu-catenare pot fi corect reparate numai dacă capetele libere ale ADN se
reunesc exact. O astfel de reparare este complicată prin absenţa regiunilor monocatenare care se
pot împerechea direct în timpul procesului de unire. Unul din cele două mecanisme implicate în
repararea rupturilor dublu-catenare o reprezintă recombinarea omologă. În acest proces, rupturile
dublu-catenare de pe un cromozom sunt reparate folosind informaţia de pe cromozomul omolog
intact.
Totuşi, la organismele multicelulare, mecanismul predominant de reparare a dublelor
catene rupte implică reunirea capetelor a două molecule de ADN. Molecula obţinută va păierde un
număr de baze la nivelul regiunii de reunire a celor două catene. Formarea unei astfel de deleţii
mutagene este un exemplu de modalitate de introducere de mutaţii prin procesul de reparare. Un
proces similar poate aduce împreună oricare două molecule de ADN, chiar şi acelea care prfovin
de la cromozomi diferiţi.
Slide 117: Eucariotele au sisteme de reparare a ADN analoge cu cele de la E. coli Este evident că
mecanismele de reparare ale ADN au fost conservate de-a lungul evoluţiei. De exemplu, studii
biochimice recente demonstrează că celulele umane posedă mecanisme similare de repararea
neîmperecherilor similare cu cele de la E. Coli. Procesul de reparare poate fi iniţiat de proteina
Muta, un omolog al MutS bacterian, care se leagă atât la bazele neîmperechiate cât şi la micile
inserţii sau deleţii, sau prin MutSb, care leagă în principal inserţiile şi deleţiile. Proteina umană
MutL recrutată în structura de legare a ADN de către MutSa şi MutSb, dar identitatea nucleazei
umane (echivalentă MutH de la E. Coli) care scindează ADN, nu este cunoscută. După clivarea,
care apare fie în 3’ fie în 5’ faţă de neîmperechere, o exonuclează îndepărtează 100 la 200
nucleotide ănlăturând neîmperecherea. ADN polimeraza d este principala responsabilă pentru
umplerea breşei iar ligarea este realizată de către ADN ligază.
Studiile genetice realizate pe sisteme eucariote care se întind de la drojdii la om sugerează
că mecanisme similare de excizie-reparaţie sunt folosite de diferite organisme. Strategia de bază
este determinarea de mutanţi care manifestă o creştere a sensibilităţii la UV şi l alţi agenţi care
determină leziuni ADN. Astfel de mutanţi se presupune că sunt deficienţi în mecanismele normale
de excizie-reparare. La drojdii (S. Cerevisiae) există, de exemplu genele radiosensibile (RAD).
Prin folosirea unor
254
tehnici de inginerie genetică au fost generaţi mutanţi de linii celulare CHO (Chinese Hamster
Ovary) care prezintă o sensibilitate anormală la UV sau la mitomicina C, care formează aducţi
ADN voluminoşi. Aceste mutaţii se pot împărţi în opt grupuri de complementare, sugerând că cel
puţin 8 gene diferite sunt implicate în procesul de excizie reparare la hamster.
Experimentele de transfecţie au evidenţiat că anumite gene umane pot să “ssalveze”
anumite celule mutante CHO UV sensibile. Două dintre genele umane evidenţiate în acest mod s-
a demonstrat că sunt înrudite cu genele RAD3 şi RAD10 de la drojdii. Proteinele umane care
reprezintă omologie parţială cu proteina RAD10 conţin, de asemenea, o regiune care este similară
cu o parte a UvrC de la E. Coli.
Remarcabil, cinci polipeptide necesare pentru procesele de excizie-reparare din celulele
eucariote, incluzând două care prezintă omologie cu helicazele, sunt şi ele subunităţi ale TFIH, un
factor general de transcripţie necesar ARN polimerazei II. Se pare că natura foloseşte proteine
similare de asamblare în două procese celulare diferite care necesită activitate helicazică. Folosirea
subunităţilor citate mai sus în procesul de transcripţie şi de reaparare a ADN, pot explica cuplarea
transcripţiei cu repararea. Acest fenomen este observat în cazul îndepărtării alterărilor de la
eucariotele superioare care se fac cu o viteză mult mai mare în cazul regiunilor intens transcrise în
comparaţie cu cele ne-transcrise (să ne reamintim că numai o mică proporţie din genele
eucariotelor superioare sunt transcrise activ în orice celulă).
Slide 118: Sistemele inductibile de reparare a ADN predispoziţie spre erori Când celulele suferă
foarte multe alterări la nivelul ADN, după un timp scurt sistemele de reparare sunt saturate, apare
pericolul păstrării unui număr foarte mare de leziuni care vor fi perpetuate. În astfel de situaţii,
atât sistemele bacteriene cât şi celulele animale pot folosi sisteme de reparea inductibile. Astfel
de sisteme nu sunt exprimate în celulele normale sau în cele care suferă un număr scăzut de
mutaţii.
Unul dintre aceste sisteme este sistemul de reparare SOS de la bacterii. Deoarece acest
sistem generează, la rândul lui multe erori în repararea leziunilor ADN, spunem că acestă
furnizează o anumită predispouiţie la erori (error-prone). Sistemul SOS, care repară leziunile
create de UV diferă de sistemul constitutiv UvrABC discutat anterior prin faptul că activitatea sa
este este independentă de proteina RecA care este implicată şi în procesul de recombinare
neomologă.
Erorile induse de sistemul SOS apar la nivelul regiunii lezate, sugerând că mecanismul de
reparare duce la inserţia aleatoare de nucleotide în locul celor afectate. Acest sistem este folosit
numai în ultimă instanţă. Bacteriile cărora le lipseşte sistemmul SOS de excizie-reparare păstrează
mutaţiile provocate de UV şi de agenţi chimici dar în acelaşi timp rata mutaţiilor nu este foarte
crescută.
Celulele animale posedă sisteme de reparare inductibile, dar nu se cunoaşte dacă acestea
determină o anumită predispoziţie la introducerea de erori. Totuşi, aşa cum am văzut mai înainte
principalul mecanism de reparare a fragmentelor dublu catenare rupte determină inducerea de
erori. Astfel, repararea structurilor bicatenare, sistemele de reparare care determină predispoziţie
spre erori joacă, cu siguranţă un rol foarte important în procesul de mutageneză şi astfel în
carcinogeneza animală. În orice caz, mulţi cercetători consideră că multe dintre mutaţiile care apar
şi se păstrează în structura ADN sunt mai degrabă consecinţa alterărilor indirecte decât directe
asupra ADN.
255
 Deoarece alterările din structura ADN determinate de radiaţii sau de agenţi carcinogeni
trebujie reparate înainte de replicare deoarece celulele posedă mecanisme care vor sesiza alterările
şi vor stopa replicarea. Aceste mecanisme care vor constitui subiectul altor discuţii implică un
punct de control reprezentat de proteina p53, care acţion ează pentru a stopa ciclul celular dacă
ADN este alterat, împiedicând dezvoltarea tumorilort. Celulele care nu exprimă p53 funcţională
manifestă proporţii mari de mutaţii şi se constată accelerarea formării tumorilor.
Slide 121: Prezentare Recombinarea omologă apare în timpul meiozei în
organismele cu reproducere sexuală. Fiecare cromozom omolog patern şi matern reprezintă o
combinaţie de diferite alele. Prin generarea de noi cromozomi care conţin părţi din fiecare
omolog parental şi maternal, recombinarea va avea drept rezultat o nouă combinaţie de alele
pentru un anumit cromozom. Astfel recombinarea furnizează un mecanism de generare a
diversităţii genetice obţinută prin segregare independentă a cromozomilor. Schimburi genetice
prin recombinare apar nu numai la animale şi plante dar şi la procariote, virusuri plasmide şi
chiar ADN din organite cum este mitocondria.
Evenimentele recombinării reciproce sunt echivalente cu o rupere a două molecule
duplex ADN omologe, un schimb între cele două catene la nivelul rupturii, şi rezolvarea celor
două duplexuri fără probleme. De obicei, recombinarea apare aleator ăntre două segmente de
ADN omologe, astfel frecvenţa de recombinare între două situri fiind proporţională cu distanţa
dintre acestea. Structura inter-catenară Holliday reprezintă un intermediar de recombinare (partea
I) Figura: Modelul Holliday pentru recombinare genetică
Cromozomii omologi distincţi genetic sunt indicaţi cu roşu şi albastru, alelele fiind
marcate cu majuscule şi minuscule (A, a). Catenele complementare sunt marcate cu culori mai
închise iar alelele nu prezintă asterix. Rezolvarea structurilor Holliday poate să apară prin două
căi diferite.
Modelul din figură a fost propus de Robin Holliday în 1964. Cu excepţia etapelor iniţiale
acest model pare să descrie cu acurateţe evenimentele moleculare care conduc la recombinare
genedtică. În concordanţă cu modelul original, după alinierea a două molecule de ADN dublu-
catenare , se realizează o ruptură pe fiecare ADN implicat în recombinare (etapa 1). Cele două
catene care prezintă crestătură (nick) trec una peste alta, proces numit “strand exchange”, la
nivelul tăieturilor, şi capetele 3’ se unesc cu capetele 5’ ale catenelor omologe, producând o
structură încrucişată Holliday (pasiul 2). Punctul de ramificare migrează apoi creând o regiune
heterodupledx care conţine câte o catenă de la fiecare moleculă de ADN parental (etapa 3).
Pentru separarea sau rezolvarea acestor structuri au fost propuse două mecanisme:
a) În concordanţă cu propunerea originală, toate cele 4 catenme sunt scindate la nivelul situsului
de crossing over (etapa 4). Dacă partea stângă a cromozomului 1 se uneşte cu partea dreaptă a
cromozomului 2 şi invers (pasul 5a) astfel ambele catene ale fiecărui duplex rezultat sunt
recombinate; adică toţi markerii din stânga şi din dreapta au suferit recombinare reciprocă. Totuşi,
regiuni scurte, genele B şi b din figură sunt numite heteroduplex; ele au material genetic de pe o
catenă a unui cromozom şi de pe cealaltă catenă a celuilalt cromozom. Deoarece fiecare cromozom
va fi duplicat, jumătate din
256
progenituri vor poseda markerul genetic B de pe un cromozom iniţial şi jumătate markerul
genetic b. b) In contrast, dfacă partea stângă a cromozomului I şi II sunt reunite cu capetele lor
respective (pasul 5b) , fiecare duplex rezultat va fi nerecombinat; astfel, toţi markerii de pe
partea stîngă şi de pe partea dreaptă a cross overului vor proveni dfe pe cromozomul iniţial.
Totuşi, aceste molecule vor pooseda şi ele un segment heteroduplex pentru markerii B şi b.
Structura inter-catenară Holliday reprezintă un intermediar de recombinare (partea II) Figura : În
etapele 4, 5a, 6, şi 8a demonstrează formarea produşilor de recombinare AC/ac la AC/aC cu
heteroduplexul ADN care conţine locusul B la mijloc.
Pe de altă parte etapele 5b sau 7b şi 8b pot şi ele rezolva catenele interconectate în
structurile Holliday. Produşii rezultaţi nu sunt recombinanţi, dacă toţi markerii care înconjoară
situsul de recombinare (A la stânga şi C la dreapta) sunt derivate din structura cromozomului
iniţial. Totuşi, aceste molecule sunt heteroduplexuri pentru segmentul B, şi cum fiecare dintre
aceste molecule este duplicată, jumătate dintre progenituri prezintă markerul genetic B şi cealaltă
jumătate markerul b.
O altă propunere simplifică scindarea enzimatică necesară pentru rezolvarea răsucirilor
intermediare. Rotaţia structurii Holliday la nivelul situsului de crossover formează un izomer
rotaţional , sau structură Holliday izomeră (etapa 6). De reţinut că nici o catenă nu este scindată
sau ligată la trecerea de la structura 3 la 6. Cele două duplexuri conectate în această structură pot
fi rezolvate (deconectate) prin tăierea şi reunirea numai a două catene. Dacă aceasta implică cele
două care nu au fost scindate pentru a da intermediarul Holliday original, produşii de “splice”
rezultaţi sunt cromozomi recombinaţi conţinând o regiune heteroduplex. Totuşi, dacă rezolvarea
implică scindarea celor două catene care care original au forst “tăiate” original, produşii rezultaţi
sunt cromozomi dupălex care conţin o regiune heteroduplex dar care nu sunt consideraţi
recombinaţi (etapele 7a şi 7b).
Recombinarea plasmidelor ADN Figura: Imagine electronomicroscopică a unei plasmide ADN
în procesul de recombinare
a) Plasmida circulară sub forma unei structuri de recombinare Holliday. b) O imagine mărită care
evidenţiază inelul central care se formează la nivelul structurii izomere şi care rezultă ca urmare
a rotaţiei punctului de răscruce.
Faptul că produşii Holliday există a fost evidenţiat prin microscopie electronică pentru
cromozomi virali şi pentru plasmide.
Scindare dublu catenară în iniţierea recombinării ADN (partea I) Figura: Model de scindare
dublu catenară evidenţiată în meioză la S. Cerevisiae O pereche de cromatide omologe (molecule
dublu catenare de ADN) sunt schematizate una în albastru şi alta în roşu. Liniile una mai închisă
şi cealaltă mai deschisă marchează catenele complementare. Alelele sunt indicate prin litere
majuscule şi minuscule (ex D şi d).
Catenele complementare ADN sunt indicate şi prin prezenţa sau absenţa asterixului (de
ex D şi D’ /c şi c’.
257
 În acest exemplu, dublu catena se scindează şi secţionarea capetelor 5’ apare la nivelul
cromatidei a, îndepărtând markerul d’ (etapa 1). Aceasta este urmată de invaziunea (etapa 2)
catenei şi sinteza ADN folosind markerul D al cromatidei alfa drept matriţă (etapa 3).
Au fost propuse multe variaţii ale modelului Holliday; acestea diferă prin modul în care
catenele sunt scindate pentru a iniţia schimbări între catene şi dacă sinteza ADN este sau nu
implicată în procesul de recombinare. O serie de date favorizează un model în care recombinarea
omologă este iniţiată de o dublă scindare a unuia dintre duplexurile ADN în timp ce cromozomul
omolog intact este folosit pentru repararea breşei prin sinteză ADN.
Asa cum se vede în figură, scindarea dublu-catenară apare dacă o pereche de molecule de
ADN omologe sunt aliniate. Tăietura este lărgită la o breşă prin acţinuea unei exonucleaze 5’-3’,
dând naştere unui capăt monocatenar 3’ (etapa 1). Acest capăt monocatenar 3’ invadează
cromatida omologă alfa (etapa 2) şi este elongată la capătul 3’ de către ADN polimeraza, folosind
catena D complementară a cromatinei alfa drept matriţă (etapa 3). Apoi capătul 3’ al celeilate
catene a cromatidei a este elongat folosind drept matriţă cealaltă catenă D’ a cromatidei alfa,
producând o structură intermediară care conţine două regiuni ale heteroduplexului ADN şi două
joncţiuni Holliday (etapa 4). Urmând rotaţia puntelor de crossover, fiecre structură Holliday este
rezolvată prin scindarea şi legarea a două monocatene, conducând la două molecule dublu-catenare
intacte (etapa 5 şi 5b). De reţinut că dubla catenă a cromatidei a scindată iniţial a fost în întregime
reparată.
Modelul de scindare dublu-catenară poate fi luat în considerare pentru segregarea ne-
mendeliană care a fost observată în timpul recombinării meiotice. Acest fenomen a fost bine studiat
la drojdii la care toţi cei 4 produşi meiotici poit fi transformaţi în spori haploizi. Majoritatea
tulpinilor de drojdii segregă memdelian 2:2 dar există şi altele care manifestă segregare 3:1 şi 1:3
în funcţie de localizarea punctului de crossing over. Acest eveniment nereciproc este numit
conversie genică deoarece una dintre alele este aparent convertită în celaltă.
Scindare dublu catenară în iniţierea recombinării ADN (partea II) Figura : Sinteza reparatorie a
celeilalte catene a (folosind secţiunea complementară de pe catena alfa) şi ligarea conduce la
obţinerea unei structuri Holliday cu două răsduciri (structuri în cruce) (etapele 4a şi 4b).
Structurile reparate sunt marcate prin linii punctate.
Rezolvarea acestor intermediari în cruce (crossover) apare pe două căi: Scindarea la nivelul
situsurilor 2 şi 4 (etapa 5b) şi la nivelul situsurilor 1 şi 3 (nu este prezentată), conduce la cromozomi
ne-recombinanţi, dacă toţi markerii care înconjoară situsul de crossing-over provin de pe acelaşi
cromozom iniţial. Dacă markerii suferă o recombinare reciprocă discutăm de o recombinare dublu-
catenară. De reţinut că un duplex conţine o regiune complementară D/D’, dar celelalte conţin un
heteroduplex, regiunea de împerechere greşită (anormală) d/D’ (în galben). Celulele pot repara
astfel de regiuni de împerechere anormală prin excizarea segmentului monocatenar care conţine
neîmperecherea şi folosind cealaltă catenă ca matriţă pentru sinteza catenei complementare (etapa
6). În acest exemplu, d este înlăturat şi D este sintetizat (segmentul roşu dinţat) , realizând astfel
conversia d în D. Consersia inversă D-d poate fi evidenţiată cu frecvenţă egală.
Iniţierea recombinării de către enzima RecBCD
258
Figura : Această enzimă multifuncţională, care posedă capacitatea de a lega capetele libere şi
drepte ale unei molecule dublu catenare de ADN, acţionează ca o helicază, ca o exonuclează 3’-5’
dar şi ca o exonuclează 5’-3’. Când enzima întâlneşte un situs CHI, se produce inhibarea activităţii
sale 3’-5’ exonucleazică şi este exacebată activitatea 5’-3’ exonucleazică care are drept rezultat
obţinerea unui capăt 3’-OH. Acest capăt 3’-OH recombinpogenic (cu veleităţi de recombinare)
este apoi acoperit de proteine Rec A care catalizează invaziunea acestuia şi formarea unei structuri
Holliday.
Mecanismul de actiune al proteinei RecBCD a fost imaginat pentru studiile realizate cu
bacteriofagul λ. Anumite regiuni ale acestui bacteriofag, numite sutusuri CHI, suferă recombinare
cu o frecvenţă mult mai mare decât alte regiuni în celule de E. Coli normale dar nu ţi în celule
recBCD mutante. Experimente cu proteină recBCD purificată şi cu ADN al fagului λ indică că
complexul proteic recunoaşte şi leagă capetele libere ale cromozomului fagului λ.
Trei căi diferite dar înrudite realizează recombinarea omologă la E. Coli. Toate aceste căi
folosesc mecanismul de scindare dublu-catenară descrisă anterior pentru a genera structuri tip
Holliday, care suferă migrari ale braţelor urmate de scindare edndonucleazică şi apoi ligarea
recombinanţilor obţinuţi. În acestă secţiune vom descrie calea primară de recombinare la E. coli
care este considerată omologă la eucariote.
Cea mai comună cale prin care celulele de E. coli generează o regiune monocatenară
recombinogenă echivalent etapei 1 din schema anterioară este acţiunea RecBCD care are
activităţi exonucleazice şi helicazice. Acest complex enzimatic compus din proteinele codificate
de către genele recB, Cşi D, recunosc specific rupturile dublu-catenare. Fiecare ruptură apare
natural în timpul conjugării bacteriene, un proces în care ADN cromozomal este transferat de la
o bacterie la alta prin contact celular direct şi în timpul transducţiei mediată de bacteriofagi.
Scindări ale dublei catene pot să apară şi prin expunerea la raze X şi substanţe chimice.
Mecanismul de acţiune al RecBCD a fost determinat pri studii cu bacteriofagul λ.
Anumite regiuni ale fagului numite situsuri CHI, suferă recombinare cu frecvednţe foarte ridicate
comparativ cu alte regiuni din celulele normale gazdă de E. Coli dar nu şi în celulele gazdă
mutante recBCD. Experimentele cu enzimă RecBCD purificată şi cu ADN de fag λ indică că
complexul proteic recunoaşte şi se leagă la un capăt drept al cromozomului fagului (echivalent
cu ruptura dublu- catenară). Enzima se deplasează apoi de-a lungul ADN, activitatea sa
helicazică desfăcând helixul. Iniţial RecBCD degradează ambele catene folosind dubla sa
activitate exonucledazică 5’-3’ şi 3’-5’. Totuşi, când RecBCD întâlneşte situsul CHI, activitatea
sa 3’-5’ exonucleazică este îndepărtată iar activitatea 5’-3’ este stimulată. Astfel, după trecerea
de regiunea CHI, RecBCD începe să genereze catete monocatenare 3’-OH care vor fi acoperite
de multe proteine RecA şi care poate participa la procesul de invazie. Proteina RecA
coordonează modificari catenare, împerechere omologă şi formarea unei structuri tip Holliday
Figura: Experimente biochimice au demonstrat că proteina codificată de către gena RecA se
poate lega la orice monocatenă ADN (ssDNA). În prezenţa unei ţinte omologe de ADN dublu
catenar, complexul RecA-ssDNA poate avea două funcţii remarcabile: a) RecA aliniază ssDNA
cu această secvenţă ţintă dublu-catenară pentru a forma un complex; b) RecA inserează ssDNA
la nivelul ţintei şi formează un heteroduplex cu o structură de tip Holliday.
259
 În alte studii s-a evidenţiat că RecA se leagă la capătul monocatenar recombinogenic (cu
capagităţi de recombinare) generat prin acţiunea RecBCD. De fapt acţiunea RecA este stimulată
de activarea RecBCD odată ce întâlneşte situsuri CHI.
Reacţia realizată de RecA este stimulată de proteinele SSB de la E. Coli, care se leagă
imediat la structurile monocatenare prevenind împerecherea intracatenară. In prezenţa ATP,
RecA acoperă regiunea monocatenară şi determină polimerizare formând un filament care
înveleşte (acoperă) întreaga lungime a capătului recombinogenic. Deoarece polimerizarea
realizată de Rec A apare în direcţia 5’-3’ de- a lungul ADN, acoperirea realizându-se
discontinuu, o parte din duplex nefiind acoperită. Analizele de cristalografie cu raze X sugerează
că fiecare moleculă de RecA posedă două situsuri de legare la ADN, ambele putându-se lega la
nivelul miezului filamentului.
Migrarea catenei şi rezolvarea structurilor Holliday depinde de proteinele Ruv Figura :
Demonstraţie experimentală a migrării segmentelor (ramurilor) sun acţiunea proteinelor RuvA şi
RuvB de la E. Coli.
Catenele complementare sunt indicate prin culori mai închise şi mai deschise şi prin prezenţa
sau absenţa asterixului (A, A’, B, B’); segmentele care conţin segvenţe diferite sunt indicate prin
culori diferite.
a) Se obţine o structură Holliday sintetică prin an elarea a patru oligonucleotide sintetice
monocatenare la nivelul cărora numai regiunea centralaă de cross- over (verde) posedă omologie
cu capetele opuse ale fiecărei catene, respectiv complementară cu două catene diferite. b) , c)
tratarea structurilor Holliday cu proteinedle RuvA şi RuvB în prezenţă de ATP conduce la
migrarea ramurilor (fragmentelor de catene) urmată de desfăşurarea (descolăcirea) conducând la
formarea de structuri cruciforme obţinute cu capete monocatenare ne-omologe. Migrarea
ramurilor în alte direcţii conduce la obţinerea unor structuri cruciforme similare.
Acţiunea proteinelor E. coli asupra migării catenelor şi rezolvării structurilor Acţiunea
proteinelor RuvA şi RuvB de la E. Coli asupra migrării fragmentelor şi rezolvarea joncţiunilor
Holliday.
a) Modelul de asociere a RuvA şi RuvB cu joncţiunile Holliday aşa cum s-a putut evidenţia prin
tehnici electronomicroscopice. Pentru claritate proteinele sunt desenate în spatele ADN; în
realitate ADN trece prin orfificiul central al fiecărui hexamer RuvB. Cu consum de energie
furnizată de ATP, moleculele RuvB rotesc elicea ADN în interiorul lor (aşa cum roteşti un şubub
într-un diblu) Cele două proteine RuvB exercită forţe egale opuse asupra ADN aşa cum se poate
observa de pe figură. Săgeţile drepte indică direcţia de înaintare a ADN către complexul
RuvA/RuvB. b) Diagramă care ilustrează migrarea şi rezolvarea joncţiunilor Holliday.
Deplasarea joncţiunii prin complexul RuvA/RuvB generează regiuni heteroduplex, aşa cum se
poate observa în figura anterioară. După migrarea ramurilor (etapa 1), două molecule de
endonuclează RuvC se leagă la RuvA (etapa 2) şi taie intermediarul în douză puncte situate la
1800 de o parte şi de alta (etapa 3). Ligarea capetelor tăiate completează rezolvarea (etapa 4). În
acest exemplu, se formează două molecule recombinante, dar dacă RuvC scindează in alte două
puncte se obţin molecule de ADN nerecombinate.
260
 Formarea structurilor Holliday depinde de RecA dar menţinerea lor nu. Îndepărtarea RecA
lasă structurile Holliday stabile. Acestea au fost utilizate ca substrate în studii de migrare a braţelor
şi de rezolvare. Migrarea punctului de crossover, care poate fi detectat pe structuri sintetice este
eficient catalizată de proteinele RuvA şi ruvB. Analize mai amănunţite arată că ruvA recunoaşte
specific joncţiunile Holiday, în timp ce RuvB posedă activitatea helicazică necesară promovării
migrării ramurilor.
Studii recente au clarificat acţiunea acestor două proteine. Forma tetrameră activă a RuvA
se lează la regiunea centrală a structurilor Holliday desfăcând joncţiunea (unfolding jonction) într-
o configuraţie plană şi ţine cele 4 segmente monocatenare separate. Aceasta induce legarea a două
proteine hexamere sub formă de inel, care înconjoară ADN dublu-catenar ieşind din partea opusă
a complexului RuvA. Folosind energia ATP inelul RuvB acţionează ca o pompă împingând ADN
dublu-catenar în complexul RuvA. Urmînd migrarea ramurilor, două propteine RuvC cu activitate
endonucleazică se leagă la complexul RuvA/RuvB şi apoi scindează intermediarul ADN în două
situri poziţionate la 1800; legarea ulterioară generează molecule recombinate (sau nerecombinate)
conţinând un segment de heteroduplex ADN.
Proteina Cre şi alte recombinaze catalizează recombinarea “situs” specifică Figura: Proteina Cre
codificată de fagul P1, catalizează o reacţie specifică de recombinare între situsurile loxP situate
pe cercurile multimere ale ADN al P1, generând on ADN monomeric circular.
Repetarea acestui proces poate conduce la transformarea întregului ADN multimer în
monomeri circulari P1.
Proteina Cre este codificată de genomul bacteriofagului P1. În timpul replicării ADN a P1
se produc molecule multimere lungi de ADN; acestea sunt rezolvate în molecule monomere P1
prin procesul de recombinare la nivelul situsurilor loxP, care sepşară mpnomerii ADN P1 ce
compun molecula multimeră de ADN.
Proteina Cre care catalizează această reacţie acţionează similar cu integraza fagului λ. De
asemenea, chiar mecanismul de excizarea unei structuri ADN P1 monomere din cercul multimeric
este similar cu cel de integrare în cromozomul bacterian (catalizată de către integrază).
Recombinarea omologă apare aleator între două segmente omologe de ADN existând
relativ slabă specificitate pentru situsurile la care apare crossover. În cazul recombinării situs
specifică, care este un tip diferit de proces de scurtă durată, sunt recunoscute secvenţe unice de
nucleotide de către enzime numite recombinaze, care apoi catalizează unirea celor două molecule.
Mai multe exemple de recombinare situs-specifică au fost descoperite atât la procariote cât şi la
eucariote. Un exemplu foarte cunoscut îl reprezintă integrarea bacteriofagului λ la nivelul unui
situs particular din cromozomul E. coli, care este catalizată de o enzimă virală numită integrază.
Genomul fagului λ conţine un situs de ataşare de 15 pbşi a cărui structură centrală de 7 pb este
identică cu situsul de integrare (sau de ataşare) din structura ADN al celulei gazdă. Integrarea poate
fi realizată într-un sistem acelular cu numai două proteine purificate, λ integrază şi factorul de
integrare al celulei gazdă care este o proteină celulară. Integraza şi ea catalizează reacţia inversă,
excizia fagului λ circular din cromozomul bacterian.
 Reacţia de recombinare situs-specifică care este cel mai bine înţeleasă la nivel molecular
este catalizată de către proteina Cre, proteină codificată de către genomul
261
bacteriofagului P1. În timpul replicării fagului P1, sre produc structuri lungi multimere de ADN;
acestea sunt rezolvate în fome monomere P1 ADN prin recombinarea la nivelul situsurilor loxP,
care separă monomerii P1 ADN din structura ADN multimeră.
Proteina Cre care catalizează această reacţie este similară ca structură şi funcţie cu
integraza λ. Mai mult, excizia moleculelor monomere de P1 ADN din cercul multimeric de către
proteina Cre este similară mecanic cu excizia ADN λ din cromozuomul bacterian de către
integrază.
Mecanismul recombinării “situs” specifice realizată de Cre-loxP Figura : Modelul
mecanismului de recombinare
Acest mecanism implică formarea secvenţială a a doi intermediari tranzitorii în care Cre şi
ADN sunt legaţi covalent prin legături fosfo-tirozină, similare celor dintre ADN şi topoizomeraza
II. Reacţia primului intermediar Cre-ADN generează o structură de tip Holliday; reacţia celui de
al doilea conduce la formarea de produşi de recombinare dublu-catenari. Dacă se folosesc
molecule de ADN cu mutaţii la nivelul regiunii scurte loxP de recunoaştere, se poaste opri reacţia
la diferite stadii şi se pot colecta intermediarii.
Sistemul recombinazei P1 este un instrument important în genetica şoarecilor transgenici.
Adeseori este necesar ca o serie de gene să fie studiate în mai multe stadii ale dezvoltării lor. De
forte multe ori producerea de gene “knock-out” clasice conduce la moartea timpurie a embrionilor.
Totuşi, folosirea sistemului de recombinare P1 loxP-Cre permite generarea de animale în care
genele de interes primordial sunt deletate numai în anumite ţesuturi. Astfel de mecanisme de
“knock-out” ţesiut specifice pot permite cercetătorilor să analizeze orice genă la nivelul unui singur
ţesut al organismului adult.
Recombinarea “situs” specifică-modelul intermediarului II Cre-DNA Figura anterioară
Două proteine Cre se ledagă de o parte şi de alta a două situri loxP, şi asociate împreună,
formează o sinapsă compusă din două molecule de ADN şi 4 proteine Cre (etapa 1).
Un rest de tirozină de pe o moleculă Cre opusă scindează catena de ADN la care este legată
proteina, formând o două legături covalente 3’-fosfotirozină şi două capete libere 5’ (etapa 2).
Capetele 5’-OH libere din acest intermediar Cre-ADN reacţionează apoi cu legăturile fosfo-
tirozină opuse, generînd structuri intermediare tip Holliday şi proteine Cre native (etapa 3).
În continuare, clikvarea catenelor de ADN la care acestea s-au legat formează din nou
legături covalente 3’ fosfotirozină şi capere 5’-OH libere pentru a da naştere celui de al doilea
intermediar (etapa 4). În final, capetele 5’-OH libere ale acestui intermediar atacă legăturile
fosforibozină opuse conducând la produşi de recombinare ADN şi proteină Cre nativă.
Figura : Modelare pe calculator a modelului mecanismului de acţiune al proteinei Cre.
Intermediarul II Cre-ADN de la nivelul situsului specific de recombinare. Fiecare dintre
subunităţile de clivare este legată covalent la ADN printr-o legătură fosfotirozină.
262
• Apoptoza (moartea celulara programată) Este o manieră particulară de cenzurare a
anormalitatilor de desfaşurare a ciclului celular. Pentru producerea apoptozei se consumă energie
sub formă de ATP. În celulele supuse apoptozei, cromatina nucleară se condensează, nucleul se
fragmentează, iar membrana celulara se menţine integră până în stadiul final, când celulele
apoptotice se rup, formează corpii apoptotici ce sunt fagocitati de macrofage. În inducerea
apoptozei sunt implicaţi produşi care controlează ciclul celular: p53, Rb, etc. Există mai multe
situaţii care pot induce declanşarea apoptozei. S-a presupus că acest fenomen survine fie când
celula receptionează semnale contradictorii, fie când celula nu primeşte semnale de supravietuire
(factori de crestere, hormoni) din mediul extracelular, fie ca răspuns la modificarile marcante
aparute la nivelul ADN.
S-au descris proteine anti-apoptotice care inhibă proteina bax (inductoare a apoptozei).
Este vorba de proteina bcl-2 (localizată în mitocondrii, membrana nucleară şi reticulul
endoplasmatic) şi de proteina bcl-X1. Se presupune că aceste proteine induc intrarea celulei într-o
stare puţin activă din punct de vedere metabolic, protejand-o astfel de apoptoza, proces consumator
de ATP.
ÎMPACHETAREA ADN : HISTONELE CHAPERONE ŞI CĂILE DE ASAMBLARE
NUCLEOSOMALĂ
Cuprins 1. Introducere 2. Etapa de elongare a replicării ADN prin bariera nucleosomală 3. Cele
două feţe ale histonelor chaperone: asamblarea / dezasamblarea
nucleosomală 4. Ciclul genomic deschis al acetilarii / deacetilarii histonelor 5. Asamblarea
nucleosomală-independentă de replicare 6. Asamblarea nuclesomală şi senescenţa celulară 7. Un
caz extrem al asamblării nucleosomilor de novo: împachetarea
genomului paternal 8. Concluzii
La eucariote, împachetarea ADN în cromatină este esenţială pentru viabilitatea celulară.
Diversele evenimente importante din punct de vedere metabolic ale ADN necesită dezmembrarea
structurii cromatinei, celulele dezvoltând multe metode ce operează de-a lungul ciclului celular,
pentru a preveni efectele vătămatoare ale eroziunii cromatinei. Sunt descrise astfel diferite căi de
asamblare a nucleosomilor care funcţionează de-a lungul replicării, transcripţiei, senescenţei
celulare şi embriogenezei timpurii; de asemenea şi consecinţele fiziologice asociate defectelor în
căile de asamblare nucleosomală.
1. Introducere
În celulele mamaliene, aproape 2 m ADN sunt împachetaţi în interiorul unui nucleu aflat
în interfază, care are în diametru cam 10-20μm. Acestă trăsătură arhitecturală este obţinută prin
întinderea ADN incolacit1.
Primul nivel al împachetării ADN este reprezentat de înfăşurarea a 147 pb de ADN într-un
superhelix de 1,65 ori în jurul unui octamer format din proteine histonice, pentru a crea particula
core nucleosomală. Acest octamer este el însuşi o structură tripartită alcatuită dintr-un tetramer
central (H
3

-H
4

)
2

flancat de 2 dimeri
263
 -H H
2A
2B

. La eucariotele superioare, particular core nucleosomală este unită prin nişte legături
variabile de un ADN linker (de legatura) de 18-65pb. Histonele asociate apără de excesul de
încărcătură negativă a ADN linker, pentru a permite plierea cromatinei într-o structură înalt
ordonată cunoscută sub numele de fibră de 30 nm.
În celulele proliferative, duplicarea cromatinei de-a lungul etapei de replicare este realizată
prin intermediul a două reacţii concertate. Astfel, şuviţa ADN este desfăcută de o helicază (un
complex de şaşe proteine minicromozomiale), iar sinteza ADN de către polimeraza, necesită
dezmembrarea tranzitorie a contactelor ADN- histone, şi transferul histonelor parentale în urma
furcii de replicare. Apoi are loc o rapidă depozitare de histone chaperone lângă histonele recent
sintetizate în interiorul ADN nascent printr-o cale de asamblare nucleosomală care este strâns
legată de sinteza ADN. Histonele chaperone promovează asamblarea nucleosomală de novo, prin
îndepărtarea excesului de încărcătură pozitivă a proteinelor histonice. Prin această rezistenţă ionică
fiziologică, încărcătura histonică protectoare este necesară prevenirii formării agragatelor ADN -
histone.
2. Etapa de elongare a replicării ADN prin bariera nucleosomală
Particula core nucleosomală reprezintă o barieră pentru enzimele care mediază procesarea
ADN sau sinteza ARN. O serie de experimente genetice în înmugurirea drojdiei Saccharomyces
cerevisiae au dus la identificarea a două subunităţi a unui complex proteic conservat în evoluţie
(Spt 16 şi Pob3 la drojdii; SPT16 şi SSRP1 la om). Acest complex numit şi FACT (facilitează
transcripţia cromatinei) a fost purificat biochimic dintr-un extract celular uman bazat pe abilitatea
de a spori transcripţia unei matrite de către ARN polimeraza II. FACT cooperează cu ARN
polimeraza II şi este puternic implicat în depăşirea barierei nucleosomale şi trecerea la etapa de
elongare a transcripţiei. În plus, FACT este direct legat de replicarea DNA. Cele două subunităţi
ale FACT sunt necesare celulei pentru viabilitate, la [Link], dar surprinzator, doar
subunitatea Spt16 este esenţială în procesul de fisiune a drojdiei Schizosaccharomyces pombe.
FACT a fost purificat ca parte a unui complex de progresie a furcii de replicare. FACT se leagă
slab la o singură suviţă a proteinei RPA legata de ADN, dar leagă direct complexul primază-α
ADN polimeraza, care creează primeri pentru iniţierea replicării catenei leading a ADN şi sinteza
fragmentelor Okazaki. Câteva mutaţii hipomorfice la drojdii, SPT16 şi POB3, incluzând şi
mutaţiile care slăbesc legatura FACT cu α ADN polimeraza conduc la o susceptibilitate la
hidroxiuree (HU), un inhibitor al ribonucleozid reductazei care interferă cu replicarea ADN prin
depleţia deoxiribonucleotid trifosfatilor(dNTP). FACT uman leagă de asemenea în mod direct
helicaza oligomerică a minicromozomilor şi facilitează desfacerea ADN nucleosomal in vitro. De-
a lungul transcripţiei in vitro a matritelor nucleosomale de către ARN polimeraza II, FACT
dislocuie unul din cei doi dimeri H2A-H2B. Acesta părăseşte tetramerul (H2A-H2B)
2
 care e un obstacol ce trebuie depăşit de către polimeraza, singură sau în asociere cu
alte proteine. Astfel, in vivo, alte proteine, cu funcţie asemănătoare sunt asociate cu FACT şi /sau
modificarile post-translationale (PTM) pentru a facilita desfacerea rapida (1-3kb/minut) şi
procesivă a ADN şi sinteza prin aranjarea nucleosomala.
3. Cele două feţe ale histonelor chaperone: asamblarea / dezasamblarea
nucleosomală
264
 ASF-1(anti-silencing function) este o histonă chaperone implicată atât în replicarea
cuplată cât şi în replicarea independentă de asamblarea nucleosomală.
Printr-o strategie de purificare, ASF 1 a fost recent co-purificat din cromatina celulelor
umane din complexul stabil cu minicromozomi şi histonele H3-H4. Multe histone purificate din
acest complex sunt histone parentale pentru că ele conţin
265
modificări post-translaţionale (PTM) adică H3K9 trimetilare şi H4K16 acetilare, care sunt atipice.
Celulele umane lipsite de ASF 1 exprimă un defect în generarea unei singure catene ADN atunci
când furca de replicare încetineşte din cauza depletiei dNTP cu HU. Acest lucru este specific, în
condiţii normale. Se produc lungi catene single- ADN, care prin activarea protein-kinazei ATR şi
a punctului de oprire din faza S, anunţă celula asupra prezenţei leziunilor în ADN, şi blochează
replicarea. Acestă lipsă a producţiei catenelor singulare ADN şi activarea punctului de verificare
în celulele lipsite de ASF 1 demonstrează un rol esenţial al ASF 1 în etapa de elongare a replicării
prin legarea histonelor parentale H3-H4, promovând transferul lor în urma furcii de replicare.
La om, pui DT40 şi celule de Drosophila, absenţa ASF1 cauzează o acumulare celulară în
faza S, asociată cu generarea unei cromatine imature sensibilă la nuclează, o descreştere a
incorporarii BrdU (bromodeoxyuridina) în ADN nascent şi leziuni spontane în ADN. Apar astfel
aberaţii severe în segregarea cromozomilor şi letalitate celulară. Acest fenotip se observă la
celulele umane şi pui DT40, când CAF- 1 (factorul de asamblare a cromatinei) este inactivat. CAF-
1 are 3 subunităţi conservate, p150, p60 şi RbAp48, în celulele umane, fiind implicate în
depozitarea noilor histone H3-H4 sintetizate în urma furcii de replicare, prin interacţia cu antigenul
nuclear al celulelor proliferative (PCNA).
PCNA este o proteină homo-trimerică care înconjoară ADN dublu catenar şi actionează
drept factor de procesivitate pentru ADN polimeraze, dar poate servi şi ca platformă mobilă pentru
depozitarea de novo a histonelor şi a multor chei ale evenimentelor ADN. Defecte similare ale
fazei S conferite de depleţia ASF 1 şi CAF- 1 la eucariotele superioare sugerează faptul că fenotipul
celulelor lipsite de ASF 1 duce la diverse probleme în replicarea cuplată cu asamblarea de novo a
nucleosomului.
Au fost propuse două modele exclusiv nereciproce: i) prezenţa în urma furcii de replicare
a nucleosomilor parţial asamblati şi întinderea ADN liber, poate cauza mari leziuni în ADN şi
/sau defecte în segragarea cromozomală; ii) existenţa mecanismului de asamblare a cromatinei
(de supravieţuire) în celulele de tip sălbatic, previne generarea nucleosomilor imaturi lungi,
întinşi, prin încetinirea sau întreruperea furcii de replicare.
În absenţa ASF 1 sau CAF-1, acest mecanism de asamblare a cromatinei poate întrerupe
furca de replicare foarte frecvent, posibil fără activarea punctului de control, ducând la replicarea
incompletă a ADN, leziuni în molecula ADN sau alte trăsături ale segregarii cromozomilor. La S.
cerevisiae, absenţa kinazei Rad53 cheie a punctului de control produce leziuni ireversibile şi
structuri aberante ale ADN când furca de replicare este întârziată de depleţia dNTP mediată-HU.
Asocierea ASF-1 uman cu minicromozomi poate servi ca senzor molecular ideal care opreşte
desfacerea ADN ori de câte ori suplimentul de noi histone este insuficient. Experimentele clasice
au arătat că în celulele de [Link] unde expresia indusă de promotorul GAL a noilor molecule
histonice H4, este represată în faza G1, poate completa replicarea ADN cu o cinetică normală
bazată pe citometrie de flux. Aceste celule pierd viaabilitatea de-a lungul progresiei prin fazei S şi
se termină în G2 cu cromatina care pierde aproape 50% din conţinutul nucleosomal normal. Astfel
s-au emis argumente împotriva existentei acestui mecanism de supravieţuire a cromatinei la drojdii
care monitorizează eficienţa sau asamblarea nucleosomală cu replicarea.
266
 Oricum, pentru că noi molecule histonice H3 sunt exprimate de la promotorii lor naturali în
aceste experimente, este posibil ca prezenţa noilor histone H3 sintetizate să fie suficientă trecerii
acestui mecanism de supravieţuire. În mod alternativ, mecanismul asamblării nucleosomilor la
[Link] poate în alt caz să fie insuficient. În contrast cu situaţia celulelor umane, moleculele
ASF 1 şi CAF-1 nu sunt esenţiale pentru viabilitate la [Link], probabil datorită existenţei altor
molecule chaperone pentru histonele H3-H4, cum ar fi cea recent descoperită Rtt106, Hif1, sau
Spt6.
Mutanţii asf1 şi caf-1 exprimă leziuni spontane în ADN, niveluri ridicate ale rearanjărilor
cromozomiale, şi sunt sensibili la unii agenti genotoxici care lezează ADN în timpul replicării. Nu
este cunoscută sursa instabilităţii genomice şi a sensibilităţii la agenţi genotoxici a mutanţilor asf
1 şi caf-1. Multe forme de reparare a ADN necesita dezmembrarea tranzitorie a structurii
cromatinei si anumite trepte ale ADN sintetizat, de exemplu pentru repararea unui spectru larg de
leziuni în ADN, leziuni ale bazelor ADN, rupturi ale unei singure catene ADN (SSB), rupturi dublu
catenare (DSB), leziuni distorsionale ale helixului ADN prin reparare prin excizia nucleotidelor.
Expresia CAF-1 este scăzută în celulele pasive, dar este indusă în răspunsul la radiaţii
ionizante sau agenţi radiomimetici, ca bleomicina, care generează atât SSB, cât şi DSB.
CAF-1 este recutat la situsurile de leziune ADN, cauzate de UV şi depozitează histonele la
aceste sitisuri pentru a permite restaurarea cromatinei. De aici, o posibilă sursă a sensibilităţii la
agenţi genotoxici a mutanţilor caf-1 poate fi insuccesul în reasamblarea nucleosomilor urmând
repararea ADN sintetizat.
[Link] genomic deschis al acetilării / deacetilării histonelor Cele patru histone core sunt
compuse din două domenii. Cozile amino- terminale nu sunt critice modificărilor post-
translaţionale (PTM) localizate în interiorul reziduurilor histonice care ies în afară, departe de
suprafaţa particulei core nucleosomală. Domeniile globulare a particulei core adoptă o structură
similară cunoscută ca histone-fold şi sunt responsabile de interacţia histonă-histonă şi histonă-
ADN. Studiile au aratat ca noile histone sintetizate sunt acetilate la cateva reziduuri de lizină din
interiorul domeniilor amino-terminale a H3 şi H4.
A existat o dogmă care demonstra că acetilarea noilor histone are loc în citoplasmă şi, prin
extensie, poate juca rol în importul nuclear a noilor histone sintetizate. Dogma a fost schimbată, o
dată cu descoperirea HAT tipB-histon acetil transferaza, enzimă care acetilează histonele în special
la încorporarea lor în cromatină. Are două subunităţi: HAT1 (în celulele umane) şi Rb Ap46,
ambele conservate la multe specii, de la drojdii la om. HAT 1 catalizează acetilarea moleculelor
de H4 la lizina 5 şi 12, un model al modificării care constituie un diagnostic pentru noile H4
sintetizate. În celulele DT40 de la pui, şi la drojdiile S. pombe în fisiune, absenţa HAT1 nu este
letală, dar apare o sensibilitate la agenţi genotoxic.
La S. cerevisae, plante și celule umane, o parte importantă a HAT1 este localizată în nucleu
de-a lungul fazei S, dar multe enzime sunt prezente în citoplasmă. În plus, HAT1 la S. cerevisiae
este o parte a a complexului cu Asf 1, H3-H4 și o karioferina (factor de import nuclear) cunoscut
drept Kap123 la drojdii. Histonele chaperone cum ar fi Asf 1 sunt predominant nucleare, dar este
posibil ca ele să se deplaseze rapid din citoplasmă în nucleu.
În mod alternativ, HAT 1 sau /și Asf 1 se poate/pot conjuga cu karioferina de legare a
H3-H4, în timp ce complexul a intrat în nucleul celulei. Semnale de
267
localizare nucleare (NLS) pentru H3-H4 sunt localizate la nivelul cozilor amino- terminale.
Activitatea NLS a cozilor histonice este optimă când sunt încărcate pozitiv iar reziduurile de lizina
sunt protonate. Acetilarea conservată a reziduurilor de lizină poate facilita disocierea karioferinei
de la H3-H4 și /sau de la alte evenimente ale căii de asambalre nucleosomala.
Toate reziduurile acetilate ale noilor histone sintetizate aparțin domeniilor amino-terminale
ale acestor histone. S-au identificat recent noi situsuri de acetilare care sunt localizate în interiorul
domeniilor globulare ale H3 și H4 nou sintetizate. Primul situs reprezintă acetilarea lizinei 91 din
H4(K91), descoperite într-un complex proteic care a fost purificat din extracte nucleare de
[Link] și conține chaperone Hif1, H3-H4 și enzime tip B Hat1-Hat-2 (ortolog al HAT1 –
RbAp46 uman), dar este prezent și în celulele umane. In vitro, mutația H4K91 slăbește legarea
dimerilor H
2A

-H
2B

la tetramerii (H3-H4)
2

. Acetilarea H4K91 poate regla maturarea octamerilor histonici asamblați în

urma furcii de replicare. Deacetilarea regulată a H4K91 poate determina sincronizarea maturării
cromatinei nascente. Altă modificare a noilor histone sintetizate, recent descoperită prin
spectrometria de masa la S. cerevisiae, este acetilarea lizinei 56 a H3(K56). Acestă modificare
are loc în noile histone sintetizate și poate fi detectată în complexele histonelor H3-H4 cu CAF-
1.
Majoritatea histonelor sintetizate în urma furcii de replicare sunt K56 acetilate. Atunci când
H3K56 deacetilazele (Hst3 și Hst 4) sunt inactivate printr-o singură runda a fazei S, aproape 50%
din totalul histonic este K56 acetilat în faza G2. În plus, acetilarea este nedectabilă în timpul trecerii
prin faza S, în absența sintezei de novo. Histonele parentale nu sunt K56 acetilate de-alungul
replicării sale sau, acetilarea lor are loc ci o stoichiometrie mai scăzuta decat a noilor molecule H3.
Acetilarea H3K56 este catalizată de HAT tipB, cunoscut ca Rtt109 care nu are motivele situsului
catalitic corect pentru alte HAT și pare a fi restricționat fungilor.
În celulele în care nu are loc acetilarea H3K56 studiile de imunoprecipitare a cromatinei
(ChIP) dovedesc faptul că furca de replicare face o pauză prin depleția dNTP HU-mediata
rezultând o pierdere în componentele replisomului (PCNA, RFC, ADN polimeraza ε).
Studii recente au arătat că mutanții defectivi în acetilarea H3K56 sunt parțial defectivi în
coeziunea cromatidelor surori în câțiva loci diferiti. Datorită faptului că această coeziune a
cromatidelor surori promovează repararea dublu-catenară, defectul coeziv al celulelor fără
acetilarea H3K56 poate explica sensibilitatea la agenți genotoxici care pot cauza leziuni dublu-
catenare. În absența leziunilor în ADN, H3K56 este probabil deacetilată, sau la o anumită distanță,
în urma furcii de replicare, în interiorul fazei S sau urmând replicarea completă a ADN în timpul
tranziției din G2 în M.
268
Fig.2:
Această deacetilare a H3K56 a genomului este mediată de enzimele nicotinamida adenine
dinucleotid (NAD+)-dependente. Sir2 este implicată în deacetilarea regiunilor subtelomerice. În
celulele hst3 și hst4 mutante, prin spectrometrie de masă, cam 98% din totalul histonelor H3 este
K56-acetilat, pe durata întregului ciclu celular. Deacetilarea H3K56 este importantă datorită
faptului că mutanții hst3 și hst4 expun câteva fenotipuri, cum ar fi termosensibilitatea, pierderea
cromozomilor mitotici, leziuni spontane în ADN și o extremă sensibilitate la agenți genotoxici
care este mai pronunțată la mutanții fără acetilare H3K56.
Deși baza moleculară nu este bine cunoscută, fenotipurile severe ale mutanților deacetilati
sunt cauzate de un exces sau o acetilare constitutivă, pentru că ele pot fi supresate prin mutația
H3K56 într-un reziduu de arginină neacetilată. În celulele tip-sălbatic, moleculele histonice H3
K56-acetilate sunt depozitate în spatele furcii de replicare a ADN cuplată cu asamblarea
nucleosomală.
Leziunile spontane în ADN și alte fenotipuri posibile ale celulelor mutante hst3 și hst4 par
a fi cauzate prin prezența aberantă a acetilarii H3K56 în fața furcii de replicare. Acest lucru explică
de ce celulele necesită mutarea acetilarii H3K56 înaintea unei noi runde a fazei S în celulele fiice.
Hst3 și Hst4 sunt reglate de enzime ale ciclului celular. Hst începe să se acumuleze în faza S în
paralel cu o descreștere globală în acetilarea H3K56, în timp ce Hst4 atinge maximul la un anumit
stadiu al ciclului celular și joaca un rol minor în deacetilare în comparațive cu Hst3.
Hst3 este de asemenea negativ reglat pentru a menține niveluri înalte ale acetilării H3K56
în răspunsul la agenți genotoxici. Urmărind leziunile ADN de-a
269
lungul replicării, kinaza Mecl de verificare, țintește atât represia genei Hst3 cât și degradarea
mediată de ubiquitinină a moleculelor de Hst3 care sunt prezente în special în celulele cu leziuni
ADN. Aceasta este o nouă funcție a punctului de verificare a ADN care previne acetilarea
histonelor și promovează supraviețuirea celulară în răspunsul la o largă gamă de agenți genotoxici,
mulți dintre ei fiind folosiți în chemoterapia cancerului. Acetilarea H3K56 a fost de asemenea
raportată și la Drosophila și la celulele umane HeLa.
5. Asamblarea nucleosomală-independentă de replicare
Pentru mulți ani, o tehnică puternică de localizare a elementelor Cys- reglatoare
importante, cum ar fi enhancerii și promotorii, a fost cartarea situsurilor deoxiribonucleazei I-
hipersensibila(DH) în cromatină. Prin studii bazate pe topologia și sedimentarea ADN, combinate
cu studiile genomului folosind anticorpi împotriva histonelor prin imunoprecipitare (ChIP)
analizate cu micro-arrays (ChIP chip), s-a stabilit faptul că promotorii multor gene active transcrise
conțin scurte regiuni libere nucleosomale (NFR) care coincid cu situsurile de legare a factorilor de
transcripție.
Depozitarea de novo a histonelor țintită de promotor în NFR este mediată cel puțin în
parte prin histonele chaperone Asf1 și Spt6.
Chiar în absența unui proces de transcripție activ, un numar de promotori de la drojdii sunt
subiectul ciclurilor de îndepărtare a histonelor și a asamblării nucleosomale, care a condus la
sugestia că această fluiditate dinamică a nucleosomilor localizați în regiunile promotoare poate
juca roluri importante în reglarea inițierii transcriptionale. Ca și în cazul replicărei ADN,
nucleosomii parentali sunt tranzitoriu dezmembrați înaintea mașinariei de transcripție și
reasamblați după aceasta.
Distantă dintre ARN polimeraze este suficient de mare, cromatina să poată condesa într-o
structură înalt ordonată. Acest lucru nu se poate întampla dacă există goluri numeroase în probele
nucleosomale. Dezagregarea nucleosomilor parentali dinaintea ARN polimerazei II este cel putin
în parte, cauzată de complexul proteic FACT. FACT este de asemenea implicat în reasamblarea
histonelor parentale după mașinăria transcipțională.
La S. cerevisiae, mutațiile în FACT și alte câteva proteine reduce densitatea histonică în
genele active trascriptibile, rezultând transcripți aberanți derivați din situsurile criptice de inițiere
localizate în interiorul regiunilor codante ale genelor. Acest defect transcripțional cauzat de
pierderea nucleosomilor de-a lungul elongării poate interfera cu programele normale ale expresiei
genice, în special dacă situsurile criptice de inițiere conduc transcripția antisens.
În al doilea rând pierderea nucleosomală de-a lungul elongării poate uza histonele
modificate post-translațional și/sau substratul natural nucleosomal care este în mod normal întâlnit
de aparatul transcripțional. Această deteriorare a substratului de cromatina poate împiedica
cinetica elongării sau preveni ciclurile repetate ale transcripției pentru multe gene.
În al III-lea rând, prezența catenelor ADN lungi în urma ARN polimerazelor poate
promova formarea buclelor-R. Aceste structuri, unde un transcript ARN nascent este hibridizat
după o matriță ADN, constituie o sursă importantă de instabilitate genomică. Deși FACT pare a fi
eficient în transferul histonelor în spatele ARN polimerazei, celulele desfăsoară un plan de rezervă
pentru prevenirea eroziunii cromatinei de-a lungul transcripției. La formele histonei H3
dependente de replicare, cunoscute ca H3.1 și H3.2 în celulele umane, se mai adaugă și varianta
H3.3 exprimată la multe microorganisme.
270
 Spre deosebire de H3.1/H3.2, sinteza noilor molecule H3.3 nu este restricționată fazei S și
are loc de-a lungul ciclului celular. În tipurile celulare non- proliferative care rămân active pentru
o perioadă prelungită de timp, cum ar fi neuronii, varianta H3.3 poate reprezenta o mare fracție
din totalul histonelor H3.
Deși H3.3 este similară structural cu H3.1/H3.2 la nivelul secvenței de aminoacizi, două
tipuri de histone sunt asociate cu diferite proteine chaperone în celulele proliferative. H3.1/H3.2
sunt predominant asociate cu CAF-1, în timp ce H3.3 este în special legat la HIRA. Mutația unor
aminoacizi(3) ai H3.1 cruciali în replicare permit acesteia să fie depozitată prin calea independentă
de replicare. ASF1 formează complexe cu dimerii H3.1-H4 și H3.3-H4, dovedind rolul dual al
ASF1 atât în replicarea cuplată sau nu cu asamblarea nucleosomală.
Histona H3.3 este predominant încorporată in genele active transcripțional. ASF1 pare a
merge odată cu mașinăria transcripțională și / sau întregind rapid golurile lăsate în probele
nucleosomale urmând trecerea ARN polimerazei. La [Link] mutațiile hipomorfice în FACT
exacerbează fenotipurile mutantilor asf1 și sunt letale în combinație cu mutațiile nule în genele
codificate de patru subunități ale complexului proteic HIR: HIR1, HIR2, HIR3 și HPC2. În plus,
mutațiile hipomorfice în subunitățile FACT nu sunt letale în combinație cu mutațiile caf-1. O
posibilă interpretare a acestor rezultate este faptul că FACT și proteinele căilor de asamblare
nucleosomală HIR-mediate sunt compromise. În ciliatul Tetrahymena thermophila, gena H3.3 nu
este esențială pentru viabilitate, dar absența sa dă naștere la defecte în
271
linia germinală și reproducerea sexuală. Histona H3 este astfel rar îndepărtată din cromatină de-
alungul elongării transcripționale.
6. Asamblarea nuclesomală și senescența celulară Senescența celulară este definită ca o retragere
ireversibilă din progresia ciclului celular, care depinde de supresorii tumorali bine stabiliți ca Rb
și p53. De aceea senescența este văzută ca un mecanism important de aparare împotriva
tumorigenezei. Sunt câtiva factori care induc senescența. În plus la deteriorarea ADN telomeric,
multe tipuri de stres celular (leziuni ADN și stres oxidativ) și remarcabil, oncogenele activate,
pot ținti senescența.
Deși pot exista și alte mecanisme, oncogenele activate pot provoca senescența
determinând intrarea prematură în faza S ducând la leziuni în ADN. Senescența ireversibilă în
celulele umane este asociată cu o condensare globala a cromatinei, unde fiecare cromozom este
împachetat într-o structură foarte compactă cunoscută drept SAHF- foci heterocromatici asociați
– senescenței.
SAHF este importantă pentru a impune oprirea ciclului celular caracteristic senescenței
celulare. Genele care promovează proliferarea celulară (de exemplu gena reglatoare E2F ca și
ciclina A), sunt oprite transcripțional prin împachetarea stabilă în SAHF. O treaptă importantă în
biogeneza SAHF este acțiunea concertată a două histone chaperone: ASF1 și HIRA, care
depozitează multe histone H3-H4 în ADN pentru condensarea cromozomilor și formarea SAHF.
Este foarte importantă de asemenea sursa de histone H3-H4. În celulele normal proliferative,
ARNm histonelor dependent de replicare, cunoscute ca H3.1 și H3.2, sunt fin represate atât în
afara fazei S cât și în răspunsul la agenți genotoxici care interferă cu replicarea ADN. La vertebrate,
această represie este obținută prin represia transcripției HIRA-dependentă și printr-un mecanism
sofisticat post-transcripțional reglator care previne expresia excesului de ARN histonic dependent
de replicare și proteine în absența replicării ADN.
Această reglare translațională este posibilă prin structura stemloop la capătul 3,-terminal,
care este unică la replicarea-dependentă a ARN histonic. ARNm care codifică H3.3 este terminat
prin poliadenilare, și proteina H3.3 poate fi exprimată în toate stadiile ciclului celular. Histona
chaperone HIRA este în special asociată cu H3.3 în celule umane proliferative. De aceea, este
posibil ca sursa de H3 pentru formarea HIRA-mediata a SAHF să fie H3.3. O parte din moleculele
H3.3 conțin modificări post-translaționale caracteristice cromatinei active.
O altă parte a moleculelor H3.3 conțin modificări post-translaționale tipice cromatinei
latentă transcripțional. În organismele model, sunt câteva exemple unde proteinele Asf1 și Hir,
provoacă încetarea transcripției și/sau formarea heterocromatinei.
O funcție bine stabilită și conservată a omologilor HIRA este represia genelor histonelor
dependente de replicare în fazele celulare G0/G1 și G2/M. Rolurile aparente ale ASF1 și HIRA în
promovarea încorporării histonelor de-a lungul fiecărui proces de transcripție a genei sau represie,
pot fi capătate simplu prin invocarea că, în răspunsul la semnale, aceste chaperone acționează în
general într-o manieră independentă de replicarea ADN, inserându-se în golurile din probele
nucleosomale.
 Faptul că senescența țintită de oncogenele activate este inițiată prin replicarea
neprogramatăa ADN sugerează de asemenea alta posibilă sursa de histone pentru generarea SAHF.
Este posibil ca noile histone să fie deja prezente în celule când oncogenele activate induc intrarea
în faza S și formarea SAHF. Acest lucru nu este deloc plauzibil deoarece, în ciuda faptului că
substratul preferat al HIRA în celulele
272
umane este H3.3, această variantă poate fi încorporată în cromatină, deși ineficientă, printr-un
mecanism cuplat cu replicarea. La S. cerevisiae există o singură formă a histonei H3 cu o secvența
mai puțin indicată decât H3.3 umană, iar complexul proteic HIR contribuie la oprirea epigenetică
a expresiei genice.
O parte din contribuția proteinelor HIR la oprirea transcripției în S. cerevisiae este mediată
printr-o cale de asamblare nucleosomală dependentă de PNCA cuplată cu replicarea. Alte câteva
schimbări în structura cromatinei sunt asociate cu biogeneză SAHF, cum ar fi metilarea lizinei 9
din histona H3 și legarea sa de proteina heterocromatinei 1 (HP1), pierderea histonei H1, și
încorporarea grupului proteic înalt mobil H2A din familia I/Y ca și variantă extremă a histonei
H2A, cunoscută ca macro-H2A. Este posibil ca schimbările dramatice din structura cromatinei
care au loc în SAHF sa fie conduse de o creștere în densitatea nucleosomală.
Pierderea histonei H1 poate fi explicată printr-o creștere a densității octamerului histonic
și o descreștere compensatorie în lungimea lantului ADN linker. Histona H1 se leagă la ADN
linker și la cromatina neuronală, care are un ADN linker foarte scurt.
7. Un caz extrem al asamblării nucleosomilor de novo: împachetarea genomului
paternal
De-a lungul spermatogenezei, majoritatea histonelor sunt înlocuite mai întâi prin tranziția
proteinelor și în final prin proteine bogate în arginină numite protamine. Protaminele sunt necesare
împachetării strânse a genomului paternal în capul spermatozoidului (aproape 4μm în diametru la
om). Oricum, după fertilizare, protaminele sunt desprinse din ADN și o mare undă de asamblare
nucleosomală are loc pe întregul genom paternal.
Întregul genom îndepărtat de protamine și substituția lor de nucleosomi are loc înaintea
fuziunii pronucleilor maternali și paternali și este necesară decondensarea cromozomilor paternali
ca o condiție esentială pentru prima rundă a replicării ADN. Printr-un screen genetic, sesame (ssm)
a fost identificat ca o mutație care dezmembrează reînlocuirea protaminelor de nucleosomi în
genomul paternal. Proteina Sesame este ortologul de la Drosophila al HIRA uman și atât sesame
cât și suplimentarea necesară a histonelor este îmbogățită de ou.
Bazându-se pe faptul că replicarea genomului parental nu poate avea loc anterior mutării
protaminelor, forma histonei H3 care este stocată în ou este varianta histonică H3.3 care susține
asamblarea nucleosomală dependentă de replicare. Printr- un mod neprevăzut, HIRA nu este
necesară mutării protaminelor, iar funcția sa în asambalarea nucleosomală pentru întregul genom
parental nu necesită ASF1.
În plus, singura funcție esențială a HIRA în Drosophila este de a asambla cromatina în
genomul parental. Acest lucru nu implică faptul ca asamblarea nucleosomală care reprimă inițierea
transcripției sau previne eroziunea cromatinei de- a lungul fazei de elongare a transcripției este
indispensabilă viabilității celulare. Este în totalitate posibil ca aceste funcții să fie îmbunătățite de
ASF1, acționând singur sau împreună cu alte histone chaperone cum ar fi FACT sau Spt6. Acest
argument este puternic susținut de faptul că încorporarea histonei H3 în cromatina embrionului și
adultului nu este deteriorată în absența HIRA.
8. Concluzii Sinteza ADN cuplată cu asamblarea nucleosomală este esențială pentru viabilitatea
celulară contribuind la refacerea cromatinei urmată de repararea multor leziuni ale ADN. În plus,
câteva situsuri de acetilare în noile histone sintetizate pot
273
juca roluri majore pentru menținerea stabilității genomice și rezistenței celulare la agenți
genotoxici care produc daune furcii de replicare. Mecanismele moleculare care susțin funcțiile lor
biologice sunt slab reprezentate și înțelese. Căile de asamblare nucleosomală independente de
replicare sunt exploatate de celule pentru a represa inițierea transcripțională și de asemenea pentru
a preveni pierderea nucleosomilor care are loc în timpul elongării transcripției genelor înalt active.
Asamblarea de novo a nucleosomilor de asemenea inițiează senescența celulară și calea
independentă de replicare poate acționa în împachetarea genomului parental din interiorul
pronucleilor masculini ai unei celule embrionare.
O situație dificilă este modul în care celulele controlează echilibrul care trebuie să fie atins
între diferitele căi de asamblare nucleosomală funcționale. Segregarea corectă a cromatidelor
surori în celulele fiice depinde de încorporarea situs-specifică a variantei histonice H3
centromerice cunoscută ca CENP-A la vertebrate. Aceasta este prezentă într-o cantitate mai mica
decât H3.1/H3.2 și H3.3, principalele forme ale histonei H3. Mai mult, RbAp48, și ortologul său
la S. pombe Mis16, leagă CENP-A și sunt critice pentru localizarea lor la centromeri. Multe
polipeptide RbAp48 sunt de asemenea subunități ale CAF-1, un factor major de asamblare care
depozitează histonele H3-H4 în întregul genom de-a lungul replicării ADN. De aceea,
determinarea mecanismului prin care variantele histonice specifice sunt țintite la locul cromozomal
alocat rămâne o problemă majoră în câmpul asamblării nucleosomale.
274