CURS – ANALIZA MEDICAMENTULUI

CROMATOGRAFIA
METODE CROMATOGRAFICE APLICATE IN CONTROLUL MEDICAMENTELOR
CROMATOGRAFIA = este una din ramurile vaste ale analizei (instrumentale) medicamentului, cu aplicatii
largi in separarea, detectia si determinarea substantelor chimice in general si in analiza si controlul
medicamentelor in particular.

Conform FR X, cromatografia este o metoda fizico-chimica de separare a unor substante dintr-un

amestec, intr-un sistem constituit dintr-o faza stationara si o faza mobila care se deplaseaza intr-o
directie data.

Metoda cromatografica se bazeaza pe un proces de migrare dinamica diferentiata a substantelor din

amestecul respectiv, ca urmare a unor diferente de adsorbtie, repartitie, solubilitate, presiune de vapori,
marimea moleculelor, etc.

Metoda cromatografică a fost descoperită de botanistul rus Mihail Tsvet, în 1906 şi a fost folosită întâi
pentru separarea unor pigmenti vegetali.

• Tehnicile cromatografice de analiza sunt in primul rand tehnici de separare, dintre cele mai
selective si eficiente, inclusiv pentru urme de substante si asociate cu metode de detectie, sunt
capabile sa sesizeze cantitati infime de substante, ceea ce le confera o mare sensibilitate,
selectivitate si eficienta.

• Separarea diferitelor substanţe dintr-un amestec constituie una dintre cele mai importante
probleme ale chimiei analitice.

Se poate spune ca toate tehnicile cromatografice au ca elemente comune o faza stationara si o faza
mobila iar componentii unui amestec de analizat sunt antrenati in lungul coloanei de un flux de faza
mobila, gazoasa sau lichida, cu viteze diferite, ceea ce constituie procesul fundamental al separarii.

La baza tuturor metodelor cromatografice de separare, stau PATRU procese fundamentale:

• Adsorbtia pe suporturi solide

 • Repartitia intre faza stationara si cea mobila

• Schimbul ionic

• Excluderea, difuzia.

Principiul separarii poate fi diferit, dar etapele analizei cromatografice sunt aceleasi:

• Pregatirea fazei stationare;

• Fixarea initiala a analitilor, in capul coloanei, pe faza stationara, dupa introducerea solutiei de
proba;

• Deplasarea selectiva, caracteristica a analitilor, antrenati de faza mobila, in cadrul procesului de

elutie, developare;

• Identificarea analitilor separati, pe masura ce acestia ies din coloana separatoare si trec in
detector;

• Inregistrarea cromatogramelor, calcularea ariilor pic-urilor si a altor parametri si dozarea

analitilor corespunzatori, concomitent cu evaluarea statistica a rezultatelor.

Este dificil de a realiza o clasificare atotcuprinzatoare a tehnicilor cromatografice, dar tinand cont de
natura fazelor stationare si a celor mobile se poate realiza o clasificare acceptabila si rezonabila a
metodelor cromatografice:

• Cromatografia in faza gazoasa

• Cromatografia in faza lichida

► Planara

- Pe hartie

- Pe strat subtire (css)

► Pe coloana

- De adsorbtie solid-lichid

- De repartitie lichid-lichid

- De schimb ionic

- De excludere-difuzie

fiecare din acestea cu subclasificari.

Alegerea fazelor stationare se face in functie de masa moleculara a analitilor, de solubilitatea lor in
solventi organici si in apa, de caracterul lor (nepolar, polar sau ionic).

• In cromatografia de absorbtie, faza stationara este un suport solid (ex. Al2O3; SiO2), care are
proprietati absorbante.
 • In cromatografia de repartitie, faza stationara este o pelicula de lichid fixata pe un suport solid,
cele doua faze nefiind miscibile.

• In cromatografia de schimb ionic, faza stationara este un compus macromolecular, care

contine un nr. mare de grupari functionale, acide sau bazice, capabile sa schimbe cationi bi- si
trivalenti ( grupari acide) sau anioni (Cl¯; OH¯; grupari bazice), cu cationi si anioni mai grei si cu
sarcina mai mare. Aceste macromolecule schimbatoare de ioni, se mai numesc si rasini cationice
sau cationitzi si anionice sau anionitzi.

• In cromatografia de excludere sterica sau de excludere-difuzie, faza stationara este de regula un

gel, care se comporta ca o sita moleculara, fixand anumite molecule si eliminand altele, in
functie de marimea si masa lor.

In afara de aceste tipuri fundamentale de metode cromatografice, exista si unele procedee

cromatografice specifice, caracteristice unor specii chimice:

• Cromatografia chirala, de absorbtie sau de repartitie; se caracterizeaza prin structura chirala a

fazei stationare sau a fazei mobile, ceea ce permite separarea selectiva a analitzilor chirali
(respectiv a enantiomerilor).

• Cromatografia cu lichide supercritice, care exploateaza solubilitatea analitzilor intr-un fluid

supercritic (ex: CO2), ca atare sau modificat (+ metanol); metoda asigura extragerea analitilor
din matrice si ulterior separarea cromatografica.

• Electro-cromatografia capilara micelara, o tehnica hibrida, care imbina cromatografia cu

electroforeza;

In functie de procedeul practic utilizat:

• Cromatografie pe coloana, in care faza stationara este plasata intr- o coloana (tub de metal,
sticla, silicesilice topita).

• Cromatografie planara/de suprafata, pe hartie sau pe strat subtire.

In functie de migrarea fazei mobile, se disting:

• Cromatografie prin developare, in care analitzii raman pe faza stationara sau sunt localizati pe
aceasta; in functie de directia de migrare, ascendenta sau descendenta.

• Cromatografie de elutzie, in care analitzii sunt eluatzi (spalatzi) pana la iesirea lor completa din
coloana, deci din faza stationara, fiind posibila culegerea succesiva a fractiunilor de analitzi si in
acest caz detectia se face in efluentzi.

Pentru intelegerea si pentru utilizarea corecta a proceselor cromatografice, trebuie precizati parametrii
sau marimile care definesc si explica procesele cromatografice de separatie.

Ex: o proba cu 2 analiti. Pe coloana pregatita in prealabil se introduce un volum din proba, se adauga
faza mobila, putin cate putin, incepe developarea, adica migrarea analitzilor cu viteze diferite;
continuand a adauga faza mobila, se produce elutzia, adica extragerea din coloana a fiecarui analit, pana
la iesirea din coloana.
La aparatele moderne de cromatografie, efluentul se conduce direct la detector, in care se face
detectia analitilor separati.

Pentru un amestec de analitzi, este posibil sa se utilizeze un detector plasat cat mai aproape de iesirea
efluentului din coloana si care inregistreaza continuu semnalul analitic, semnal proportional cu variatiile
concentratiilor analitzilor separati si eluatzi, care traverseaza coloana, obtinandu-se cromatograma
corespunzatoare, inregistrata de un inregistrator/recorder, care face parte din ansamblul
instrumentului de analiza cromatografica.

Fiecarui analit ii corespunde un “pic” pe cromatograma care se inregistreaza intr-un sistem de

coordonate. Se observa ca procesul de separare se produce treptat intre faza stationara si faza mobila
existand un echilibru – determinat de concentratiile fiecarui analit in cele 2 faze si a caror raport
reprezenta coeficientul de repartitie sau de distributie (k).
Parametrii/marimile de retentie cromatografica sunt:

• timpul

• volumul

• distanta

• factorul/raportul de retentie,

acestia fiind legati de coeficientul de distributie (k) intre faza stationara si cea mobila.

• Timpul de retentie – tR = timpul scurs de la introducerea probei de analit in coloana si

momentul in care apare maximul pic-ului din coloana (CONCENTRATIA MAXIMA).

• t0 sau tm = timpul mort = timpul necesar ca faza mobila sa ajunga la detector si se datoreaza
parcursului obligatoriu al fazei mobile prin spatiile fazei stationare.

• De regula, eluentul iesit din coloana este detectat printr-un semnal sau pic al detectorului, si din
acest moment, se masoara timpul de retentie al analitului, numit timp de retentie corectat.
(tR’=tR-t0)

• Volumul de retentie – VR = reprezinta volumul de faza mobila necesar pentru a aduce analitul
cu concentratia sa maxima in detector.

• Similar timpului de retentie, volumul de retentie corectat. (VR’=VR-V0)

• Raportul de retentie (RR)

• se exprima prin raportul dintre viteza medie de deplasare a analitului si viteza medie de
deplasare a fazei mobile.

Factorul de retentie se exprima prin raportul dintre cantitatea de analit care se gaseste in faza
stationara (Qs) si cantitatea de analit care se gaseste in faza mobila(Qm). K= QS/QM

• Componenţii amestecului analizat, având coeficienţi de distribuţie diferiţi se vor deplasa în

procesul eluţiei cu diferite viteze şi vor avea un timp de reţinere diferit, în condiţiile date.

• Constanta de distribuţie este factorul principal, care determină separarea substanţelor pe

coloana cromatografică. Cu cât mai mare va fi diferenţa dintre valorile constantelor de
distribuţie, cu atât mai efectivă va fi separarea cromatografică în condiţiile date.

Cromatografia poate fi definită ca un proces dinamic bazat pe realizarea multiplă a actelor de

echilibru la distribuţia componenţilor amestecului în cele două faze nemescibile ce vin în contact.

CROMATOGRAFIA PE HARTIE (C.H.)

• Realizeaza separarea sau distribuirea componentelor dintr-un amestec intre:

• o faza stationara, constituita din hartia cromatografica (de regula celuloza 95-99%)
impregnata cu un solvent polar (apa, solutii tampon);

• si o faza mobila, constituita dintr-un sistem de solventi de polaritate opusa (nepolari).

 • Procesul de separare are la baza in general un mecanism de repartitie, dar se pot intalni si
mecanisme de absorbtie, schimb ionic, reactii chimice.

Aparatura este dependenta de procedeul ales pentru developare.

• In general se utilizeaza camere sau bac-uri cromatografice din sticla sau metal (de regula inox),
cu posibilitatea de inchidere etansa (cu vizoare), de forma cilindrica sau paralelipipedica,
prevazute cu un dispozitiv de fixare a hartiilor cromatografice si cu o cuva care in cazul tehnicii
ascendente se fixeaza pe fundul vasului cromatografic, iar in cazul tehnicii descendente se
fixeaza la partea superioara a vasului.

• Benzile de hartie cromatografica sunt specificate in monografia respectiva; toate sorturile de

hartie cromatografica utilizate (Whatman, Munktel, Schleicher-Schűll, Toyo, etc) sunt
caracterizate prin:

• viteza de migrare a solventului

• porozitate

• aspectul suprafetei (mata, lucioasa)

• grosime

si eventual, utilizarea ei, care deriva din pretratare (ex: hartia hidrofobizata, in scopul separarii
substantelor hidrofobe)

Tehnica de lucru

• Daca nu se prevede altfel, cu 24 h inainte de determinarea cromatografica, vasul cromatografic

se satureaza cu toate componentele fazei mobile (adica a developantului), introduse in
cristalizoare la o temperatura de 20-25 ºC.

• Tehnica cromatografica (ascendenta, descendenta), pregatirea benzilor de hartie

cromatografica, developantul, modul de preparare al solutiilor de aplicat (proba si etalonul),
volumele aplicate si distanta parcursa de developant sunt prevazute in monografia respectiva.

• Linia pe care se aplica solutiile - linia de start – trebuie sa fie situata la o distanta de 5-6 cm de
marginea benzii de hartie pt tehnica ascendenta si de 10-12 cm pt tehnica descendenta.

• Distanta dintre punctele marginale si latura hartiei trebuie sa fie de cel putin 2,5 cm.

• Solutiile se aplica pe hartia cromatografica, daca nu se prevede altfel, cu micropipete,

microseringi, in puncte circulare cu diametru de cel mult 6 mm. Daca este cazul, solutia se aplica
in mod repetat asteptand de fiecare data evaporarea solventului.

• Dupa ce developantul a parcurs distanta prevazuta, hartia cromatografica se scoate, se usuca si

se pun in evidenta petele conform prevederilor din monografie.

• Se trece la identificare, evaluare semi-cantitativa si dozare.

• Dozarea se mai poate efectua si dupa decuparea petei si eluarea acesteia cu un solvent potrivit
conform prevederilor.
Aplicatii ale cromatografiei pe hartie:

• metoda oficiala pt determinarea puritatii radiochimice a substantelor radioactive;

• identificarea si dozarea fenobarbitalului din comprimate;

• identificarea si puritatea maleatului de ergometrina;

CROMATOGRAFIA PE STRAT SUBTIRE (C.S.S.)

• Este o metoda ce permite separarea componentelor unui amestec pe baza diferentei lor de
deplasare de-a lungul unui strat absorbant care acopera o placa de sticla, metal sau polimer sub
actiunea unui sistem de solventi.

• Stratul absorbant constituie faza stationara si poate avea o grosime de 0,2-0,3 mm pentru scop
calitativ si 1-2 mm pentru scop cantitativ.

• Separarea evidentiaza un mecanism de adsorbtie, repartitie, schimb ionic, s.a.

• Cei mai uzuali adsorbanti ce alcatuiesc faza stationara, utilizati in C.S.S. sunt:

• silicagelul

• celuloza

• oxidul de Al

• kieselgur-ul

• Tehnica de lucru: asemanatoare C.H., iar particularitatile sunt prevazute in monografia

respectiva.

• In C.H. sau C.S.S. zona de migrare este definita prin Rf , care reprezinta raportul dintre
distantele de migrare ale componentelor si frontul fazei mobile.

• Pentru indentificarea substantelor se compara pe aceiasi cromatograma valoarea Rf, culoarea si

fluorescenta petei obtinute cu solutia probei, cu valoarea Rf, si culoarea si fluorescenta petei
obtinute cu solutia etalon.
 • a = distanta parcursa de substanta de la punctul de aplicate al solutiei pana la centrul petei (in
cm);

• b = distanta parcursa de developant de la punctul de aplicare al solutiei pana la frontul

developantului, trecand prin centrul petei (in cm).

• De obicei, punerea in evidenta a punctelor de pe cromatograma, se efectueaza prin examinarea

acestora ca atare, sau dupa tratarea cu reactivi potriviti, in lumina vizibila sau UV.

• Dozarea substantelor separate pe cromatograma se efectueaza dupa razuirea petelor respective

si eluarea substantelor de pe absorbant cu un solvent potrivit prin spectrometrie.

• Compararea vizuala a dimensiunii petelor si a intensitatii coloratiei sau fluorescentei se foloseste

pt evaluarea semi-cantitativa a impuritatilor.

Aplicatii:

• identificarea teofilinei si papaverinei din supozitoare;

• identificarea fenacetinei, cofeinei, aspirinei din comprimate;

• determinarea puritatii palmitatului de cloramfenicol, care admite cel mult 2% cloramfenicol

neesterificat;

• determinarea impuritatilor din tetraciclina (epitetraciclina, anhidrotetraciclina,

epianhidrotetraciclina).

CROMATOGRAFIA DE GAZE (C.G.)

• Este o metoda fizico-chimica de separare cromatografica, in care faza mobila este un gaz (gaz
purtator), iar faza stationara este un solid (CGS) sau un lichid (CGL) cu care este impregnat un
suport solid, inert, sau un lichid uniform repartizat pe peretii unei coloane capilare. Faza
stationare se afla intr-o coloana (inchisa) cromatografica, confectionata de obicei din sticla sau
din otel inoxidabil. Faza mobila se deplaseaza continuu prin coloana, iar la iesire, gazul purtator
trece prin detector.

• C.G. se utilizeaza atat in determinari calitative cat si cantitative.

• Cromatografia de gaze / GAZ-CROMATOGRAFIA, este o varianta a cromatografiei pe coloana si

permite atat separarea substantelor volatile, cat si a celor care in urma unor reactii chimice pot
fi transformate in derivati volatili si stabili.

Cromatograful de gaze este compus din urmatoarele parti principale:

• sursa de gaz

• camera de evaporare

• coloana cromatografica
 • termostatul

• detectorul

• sistemul de inregistrare.

Schema de functionare a unui gaz-cromatograf

• Este cea mai utilizata tehnica cromatografica, deoarece prezinta o serie de avantaje care îi
confera o adaptabilitate deosebita la problemele care pot apare în timpul analizei amestecurilor
complexe de componente.

• Faza mobila este un gaz inert (He, neon, argon, H), numit si gaz vector sau purtatoar, care
antreneaza substantele de determinat; dupa separare componentele pot fi usor detectate
deoarece faza mobila nu interfera la detectie.

• Daca este cazul, componentele separate pot fi analizate suplimentar prin metode
spectroscopice cum ar fi spectrometria de masa sau spectrofotometria în IR.

Singurele limitari ale cromatografiei de gaze sunt determinate de volatilitatea prea scazuta sau
instabilitatea termica a componentelor analizate si aceste dezavantaje pot fi însa limitate, de exemplu,
prin transformarea compusilor respectivi în derivati care sa aiba volatilitate mai mare. Tehnica se
numeste derivatizare si este larg utilizata în cromatografia de gaze.

• Gazul purtator se deplaseaza cu o viteza constanta prin camera de evaporare, preia proba de
analizat si o introduce in coloana cromatografica, unde se realizeaza separarea componentelor.

• Viteza de deplasare a componentelor de-a lungul coloanei este diferita, fapt ce duce la
separarea si la eluarea lor din coloana intr-o anumita ordine.

• Deoarece probele de analizat dizolvate intr-un solvent trebuie sa fie aduse in stare de vapori,
camera de evaporare este incalzita la o temperatura suficient de ridicata pt a asigura o
evaporare rapida si fara a produce o degradare termica a probelor.
 • Cu ajutorul termostatului in timpul determinarii, temperatura coloanei cromatografice este
mentinuta constanta.

• La iesirea din coloana cromatografica, gazul purtator trece impreuna cu componentele separate
prin detector (care deosebeste proprietatile componentelor de cele ale gazului vector) si care
emite un semnal electric proportional cu concentratia componentei din faza gazoasa, semnal
care se inregistreaza.

● Se traseaza o curba in clopot analog unei curbe de distributie Gauss.

● Varful cromatografic sau pic-ul corespunde componentei separate, iar inaltimea lui este proportionala
cu concentratia componentului in faza gazoasa.
● Detectorul este conectat la sistemul de inregistrare, iar rezultatele se prezinta sub forma unui grafic
semnal/timp.

Sensibilitatea detectoruluI
= reprezinta variatia marimii semnalului emis de detector în functie de cantitatea de solut si se exprima
prin valoarea pantei raspunsului detectorului pentru componenta respectiva.
= O sensibilitate mare a detectorului va duce la un raspuns mai mare pentru aceeasi cantitate de solut
analizata si deci va permite analiza unor cantitati mici de proba, reprezintând o calitate importanta
pentru un detector performant.
Limita de sensibilitate

= este un criteriu strâns legat de cel precedent, definindu-se prin cantitatea minima din componenta
respectiva pentru care se obtine un semnal de raspuns al detectorului de doua ori mai mare decât
valoarea medie a zgomotului (semnalului) de fond; cantitatea respectiva se numeste cantitate minima
detectabila.

= Semnalul de fond reprezinta semnalul dat de detector în absenta vreunei componente injectate si
depinde de caracteristicile sale constructive.

Domeniul de raspuns liniar

= reprezinta intervalul în care semnalul de raspuns al detectorului este direct proportional cu cantitatea
de solut care ajunge în detector.

• Stabilirea acestei liniaritati se face prin etalonare, cu ajutorul unor etaloane pure ale compusilor
analizati. Asemenea etaloane pentru cromatografia de gaze sunt accesibile comercial, la o
puritate foarte avansata (în general peste 99,9%).

Stabilirea domeniului de raspuns liniar este importanta mai ales pentru analiza cantitativa. În situatiile în
care raspunsul nu este liniar, caz întîlnit mai ales la detectoarele folosite în cromatografia de lichide dar
si la unele detectoare folosite în cromatografie de gaze, este necesara trasarea unor curbe de etalonare,
pentru a se putea efectua analiza cantitativa

Cuplarea cromatografului de gaze cu spectrometrul de masa (CG-MS)

• Atât cromatografia de gaze cât si spectrometria de masa (SM) sunt tehnici analitice de mare
utilitate pentru analiza compusilor organici.

• Combinarea lor într-un singur sistem duce însa la obtinerea unor rezultate care depasesc mult
ceea ce s-ar realiza prin simpla însumare a datelor oferite de cele doua tehnici.

• Sistemul ofera posibilitatea detectarii unui mare numar de compusi dintr-un amestec complex,
fiecare compus fiind identificat prin spectrul sau de masa, obtinut prin introducerea eluantului
direct in camera de ionizare a SM.

• Pentru a putea gestiona imensa cantitate de date oferita de un sistem GC-MS este neaparat
necesara utilizarea unui calculator echipat cu un program adecvat.

• Cuplarea cromatografiei de gaze cu spectrometria de masa ofera în primul rând posibilitatea

identificarii calitative a componentelor analizate, cu o probabilitate de eroare foarte mica.

Trecerea între cromatograf si spectrometru se realizeaza folosind niste dispozitive numite interfete.
Aplicatii ale cromatografiei de gaze

• [Link] poate utiliza in analiza calitativa (identificare, decelare impuritati) si in analiza cantitativa
(cuantificarea impuritatilor si a principiilor active).

Determinari calitative

• Prin examinare vizuala, se compara gaz-cromatograma substantei de analizat cu gaz-

cromatograma substantei etalon.

• Prin compararea timpului de retentie (tR) sau a volumului de retentie (VR) a probei de analizat
cu cele ale etalonului.

• Cuplarea (CG-MS), ofera posibilitatea detectarii unui numar mare de compusi dintr-un amestec
complex, fiecare compus fiind identificat prin spectrul sau de masa obtinut, dupa introducerea
eluatului direct in camera de ionizare a spectrofotometrului de masa.

Determinari cantitative

La baza determinarilor cantitative sta relatia de proportionalitate intre aria de sub picul cromatografic si
cantitatea componentului eluat.

Se masoara aria si se coreleaza aria cu concentratia.

Masurarea ariei picului

• Prin metode manuale sau cu ajutorul unui integrator.

• In cazul picurilor simetrice, aria se masoara prin inmultirea inaltimii picului (h) cu latimea picului
determinata la jumatatea inaltimii picului (w½)

h x w½

b) Cand se considera picul un triunghi, (aria) A = (h x w)/2

c) Masurarea ariilor picurilor, este inlocuita uneori cu masurarea integrala a inaltimii picului (h) sau a
jumatatii ei (h/2)
CROMATOGRAFIA DE LICHIDE DE INALTA PERFORMANTA (HPLC)
Cromatografia de lichide clasica (pe coloana, pe strat subtire, pe hartie) necesita o aparatura simpla, dar
este destul de lenta si cu o capacitate de separare relativ mica; detectia componetelor este dificila,
costisitoare si necesita cantitati mari de solvent si pregatiri tehnice laborioase.

• Cromatografia de gaze s-a impus ca o metoda rapida, sensibila si a cunoscut o mare extindere prin
cuplarea gaz-cromatografului cu spectrometrul de masa, limitele metodei, insa, fiind impuse de
conditia volatilizarii produsilor sau a transformarii lor in derivati volatili si stabili termic, aspecte ce
fac posibile determinari ale unui numar scazut de substante organice (aprox 15%).

• Cunostintele dobandite in gaz-cromatografie, transpuse in practica cromatografiei de lichide au

condus la o tehnica de inalta performanta, moderna, care se realizeaza cu o viteza mare, si elimina
dezavantajele cromatografiei de gaze: HPLC.

• Utilizand absorbanti cu o structura fina, se mareste rezistenta la curgere a fazei mobile si o data cu
scaderea vitezei de curgere, cresc timpii de retinere a componentelor pe coloana.

• In aceste conditii pentru realizarea unei separari eficiente, in timpi scurti de analiza, trebuie
realizate presiuni mari, care, desi impun dificultati tehnice legate de o aparatura adecvata, permit
separari analitice, imposibil de realizat prin alte metode.
• Aceasta noua tehnica se numeste cromatografie de lichide la inalta performanta, sau la inalta
presiune, sau la inalta viteza, HPLC (HIGH PERFORMANCE-PRESSURE-LIQUID
CHROMATOGRAPHY); denumirea la inalta performanta se refera la viteza analizei, capacitatea de
separare, sensibilitatea metodei.

• In HPLC sunt necesare presiuni mari (de cateva sute de atmosfere) pentru a asigura debite
corespunzatoare ale fazei mobile; avand in vedere ca granulatia fazei stationare in HPLC moderne
este foarte mica, (diametrul particulelor = 3 –10μm) aparatura utilizata este mai complicata si
foarte scumpa.

• HPLC este o metoda rapida, eficienta, selectiva.

Avantaje HPLC:

• substantele de analizat nu trebuie sa fie volatile;

• majoritatea separarilor se pot efectua la temperatura obisnuita;
• timpi scurti de analiza;
• conditii de lucru simple pentru pregatirea probelor, efectuarea analizei si prelucrarea datelor;
• polaritatea fazei mobile si a fazei stationare poate fi variata.

In HPLC, separarea componentelor dintr-un amestec se bazeaza pe distribuirea lor intre 2 faze, iar
mecanismele care stau la baza separarii definesc si tipurile de HPLC:
• HPLC de absorbtie
• HPLC cu faze inverse
• HPLC de repartitie
• HPLC prin schimb ionic
• HPLC prin excluziune moleculara

Schema de principiu a unui cromatograf de lichide de înalta performanta

Tehnica de lucru: in fiecare monografie care utilizeaza tehnica HPLC sunt prevazute caracteristicile
coloanei cromatografice (tipuri, lungimea, diametrul interior, natura fazei stationare, dimensiunea
particulelor, etc) si conditiile de cromatografiere (concentratia solutiei de analizat, concentratia
solutiei standard, volumele de injectat din fiecare solutie, compozitia si debitul fazei mobile,
temperatura, modul de lucru, sistemul de detectare).

• Cu ajutorul solutiilor sandard se regleaza aparatul si se determina volumul solutiilor de injectat

pentru a obtine un raspuns convenabil al detectorului.

• Se determina suprafata si inaltimea pic-urilor componentelor, iar din valorile obtinute se

calculeaza concentratia componentei/componentelor de determinat.

• Gradul de separare a doua substante intr-o cromatograma se defineste prin notiunea de rezolutie.
(Rs).
• Rezolutia (Rs) = reprezinta masura capacitatii efective de separare a doi compusi pe o coloana
specifica (avand o anumita lungime, raza, natura a fazei stationare, grosime, s.a.), in conditii
bine determinate (tº; natura si viteza fazei mobile, s.a. )

Aplicatii ale HPLC in controlul medicamentelor

Metoda ofera importante posibilitati de separare, detectie si cuantificare a speciilor chimice analizate
= largi aplicatii in analiza calitativa si cantitativa.

• Decelarea impuritatilor si produsilor de degradare ale unor substante farmaceutice sau ale unor
produse farmaceutice.
• Studii de stabilitate ale unor produse farmaceutice.
• Izolarea si cuantificarea principiilor active din produse vegetale.
• In biofarmacie, pentru dozarea substantelor medicamentoase din lichide biologice.
• Analiza cantitativa si calitativa a preparatelor farmaceutice.

Identificare.
O metoda uzuala de identificare a componentilor de analizat, bazata pe compararea parametrilor de
retentie a standardului cu cei ai componentului de identificat.

Determinarea cantitativa
Se poate face realizand o serie de probe etalon de concentratii diferite, sau folosind metoda standardului
intern.

• Metoda etalonarii externe

CX = AX/AE . CE

Formula se aplica cand domeniul de concentratie al analitului de interes in proba este cunoscut si
etalonul este o solutie a analitului de interes in stare pura la nivel de concentratie asemanator cu
cel al probei.
Cand nu se cunoaste domeniul de concentratie este necesara trasarea unei curbe de etalonare si prin
extrapolare se determina CX.
AX = aria picului corespunzator solutului de interes in cromatograma probei
AE = aria picului corespunzator solutului de interes in cromatograma etalonului
CE = concentratia solutului de interes din etalon
 • Metoda etalonarii interne
Consta in adaugarea unui compus numit standard intern (de concentratie si puritate cunoscute) la proba
de analizat.
Standardul intern trebuie sa indeplineasca o serie de conditii:
• sa nu fie prezent in proba;
• sa fie separat de compusii de interes;
• sa fie stabil si sa nu reactioneze cu proba sau cu faza mobila;
• sa aiba puritate inalta ;
• sa aiba un raspuns similar la detectie cu proba, pentru concentratiile utilizate;
• sa aiba un factor de retentie k similar cu al compusilor de separat.

Relatia prin care se determina concentratia procentuala % a analitului:

C% = AX/ASI . KX/KSI . mSI/m . 100

mSI = cantitatea de standard intern din proba injectata

m = cantitatea de proba injectata
KX, KSI = factor de raspuns pentru analitul de interes, respectiv pentru standardul intern
AX, ASI = aria picului solutului de interes, respectiv a standardului intern

SPECTROMETRIA DE MASA (M.S.)

• Metoda de analiza care se bazeaza pe fragmentarea moleculelor substantelor organice la

energii mari de pana la 100 V, iar numarul, sarcina si masa fragmentelor rezultate dau informatii
asupra structurii si identitatii substantelor cercetate.

• De regula, detectia compusilor organici, inclusiv medicamentosi, nu se face prin spectrometrie de

masa decat daca ei se afla in stare pura.

• Din aceste considerente, spectrometria de masa se utilizeaza in cuplaj cu H.P.L.C. si/sau C.G.,
legand capatul de iesire al coloanei cromatografice la camera de ionizare a unui spectrometru de
masa. In acest fel se poate analiza fiecare fractiune (pic) care iese din coloana cromatografica, pe
masura ce avanseaza elutzia, inclusiv in cazul urmelor de substante existente in proba.
• Fragmentarea moleculelor este determinata de acumularea de energie care produce ruperea unor
legaturi interatomice, proces din care rezulta mai ales ioni pozitivi, rar negativi, radicali si molecule
neutre.

• Deoarece fragmentarea produce mai ales ioni pozitivi, fragmentele sunt purtatoare de sarcina, au
o masa determinata si se pot caracteriza prin raportul dintre masa si sarcina. m/z

• Pentru a putea produce fragmentarea moleculelor, substanta care trebuie analizata se aduce in
stare gazoasa, se introduce intr-o camera de ionizare, in care se produce fragmentarea, iar
fragmentele sunt accelerate de un camp electric si supuse unui proces de separare, in functie de
valoarea raportului m/z si concentrate pe un colector, inregistrandu-se abundenta lor relativa.

• Toate operatiunile se efectueaza in vid inaintat.

Spectrometria de masă este utilizată ca tehnică de detecţie în cromatografie.