1.
Introducere
HPLC metoda analitica utilizata in scopul separarii, identificarii si dozarii substantelor
organice si anorganice aflate in solutie.
ANALIZE:
farmaceutice
clinice
toxicologice
de mediu
industriale
Alimentare [1]
2. Prile component ale aparatului
[2]
1
HPLC este cea mai extins metod cromatografic utilizat pentru analiza analiilor
compui biologic activi, fiecare clas a acestora fiind testat separat. Spre deosebire de tehnica
LC-MS, nu ofer o certitudine 100% cu privire la identificarea analiilor. [1]
HPLC este prescurtarea de la High Performance Liquid Chromatography (Cromatografie
lichid de nalt performan), metod de analiz calitativ utilizat n biochimie i chimie
analitic pentru separarea, identificarea i cuantificarea compuilor. HPLC folosete o coloan
ncrcat cu diferite materiale (faza staionar), o pomp ce mpinge faza(ele) mobil(e) prin
coloana i un detector care arat timpurile de retenie ale moleculelor. Timpul de retenie depinde
de interaciunea dintre faza staionar, moleculele de analizat i solvenii utilizai.
3. Decrierea metodei
Proba de analizat este introdus n volum mic n fluxul fazei mobile. Trecerea
analituluprin coloan este ncetinit de prezena unor interacii de natur chimic sau fizic in
fazastaionar, acestea trecnd de a lungul coloanei. Totalul ncetinirilor depinde de fiecare analit
n parte, faza staionar i compoziia fazei mobile. Timpul la care un analit specific elueaz (iese
afar din coloan) este numit timp de retenie; timpul de retenie sub condiii particulare este
2
considerat o caracteristic unic de identificare a analitului dat. Folosirea unei coloane ncrcat
cu particule mici (care creeaz o presiune de mpingere mai mare) crete viteza linear, acordnd
compuilor timpul minim s difuzeze prin coloan, conducnd astfel la o mbuntire a
rezoluiei cromatogramei rezultate.
Solvenii comuni care se utilizeaz includ orice combinaie miscibil cu apa sau lichide
organice variate (de obicei metanol sau acetonitril). Apa poate conine soluii tampon sau sruri
care ajut la separarea componenilor de analizat sau componeni ca acid trifloroacetic care
acioneaz ca agent de mperechere ionic.
O rafinare mai bun a metodei HPLC a dus la posibilitatea de a varia compoziia fazei mobile n
timpul analizei; aceasta este cunoscut sub denumirea de gradient de eluie. Un gradient normal
pentru o faz cromatografic invers poate se nceap cu 5% metanol i s creasc pn la 50%
n 25 minute; gradientul ales depinde de ct de hidrofob este analitul. Gradientul separ
amestecul de analii n funcie de afinitatea analitului pentru curentul fazei mobile raportat la faza
staionar[4].
[3]
3
Fotografie a unui aparat HPLC. De la stnga la dreapta: Pompa de gradient, ce asigur
fluxul de solvent, coloana cromatografic, aparat de nregistrare a absorbanei.
3.1. Timp de retenie
Timpul necesar pentru un anumit compus de a cltori prin coloan la detector este
cunoscut sub numele de timp de retenie . Acest timp este msurat din momentul n care proba
este injectat la punctul n care pe ecran se afieaz o nlime maxim de vrf pentru acel
compus.
Pentru un anumit compus, timpul de retenie va varia n funcie de:
presiunea folosit (pentru c afecteaz rata de curgere a solventului);
natura fazei staionare (nu numai materialul din care este confecionat, dar, de asemenea,
dimensiunea particulelor);
compoziia exact a solventului;
temperatura coloanei;
Asta nseamn c, condiiile trebuie s fie atent controlate dac folosii timpi de retenie ca o
modalitate de identificare a unor compui.
[Link]
Exist mai multe metode de detectare atunci cnd o substan a trecut prin coloan. O
metod comun, care este uor de explicat foloseste absorbie ultra-violet.
Muli compui organici absorb lumina UV de diferite lungimi de und. Dac avei un
fascicul de lumina UV strlucete prin fluxul de lichid care iese din coloan, i un detector UV
de pe partea opus a fluxului, putei obine o lectur direct de ct de mult din lumina este
absorbit.
Cantitatea de lumin absorbit va depinde de cantitatea de un anumit compus care trece
prin raza la momentul respectiv.
Metanol, de exemplu, absoarbe la lungimi de und sub 205 nm, i ap sub 190 nm. Dac
ai folosind un amestec de metanol i ap ca solvent, prin urmare, ar trebui s utilizai o lungime
de und mai mare de 205 nm, pentru a evita citirile false de solvent.
4
Interpretarea de ieire de la detectorul
Ieirea va fi nregistrat ca o serie de varfuri - fiecare dintre ele reprezentnd un compus
n amestec trece prin detectorul i de a absorbi lumina UV. Atta timp ct ati fost atenti pentru a
controla conditiile de pe coloana, ai putea folosi timpii de retentie pentru a ajuta la identificarea
compuilor prezenti.
Cromatografia lichid de nalt performan ( HPLC, denumite anterior cromatografie
lichid de nalt presiune ), este o tehnic n chimie analitic utilizat pentru a separa
componentele ntr-un amestec, pentru identificarea fiecrei componente, i de a cuantificafiecare
component. Ea se bazeaz pe pompe pentru a trece un lichid presurizat solvent care conine
amestecul de prob printr-o coloan umplut cu un solid material adsorbant. Fiecare component
n eantion interacioneaz uor diferit cu materialul adsorbant, provocnd debite diferite pentru
diferite componente i care conduce la separarea componentelor, deoarece fluxul de coloana.
HPLC a fost utilizat n scopuri medicale (de exemplu, detectarea nivelurilor de vitamina
D in serul sanguin), juridice (de exemplu, detectarea drogurilor de mbuntire a performanei n
urin), cercetare (de exemplu, separarea componentelor unui eantion biologic complex, sau de
produse chimice sintetice similare de la unul de altul), i de fabricaie (de exemplu, n timpul
procesului de producie de produse farmaceutice si biologice) scopuri.
Cromatografia poate fi descris ca un transfer de mas proces care implic adsorbie .
HPLC se bazeaz pe pompe pentru a trece un lichid sub presiune i un amestec de prob
printr-o coloan umplut cu un adsorbant, care duce la separarea de componentele
[Link] activ a coloanei, adsorbant, este de obicei un material granular din particule
solide (de exemplu, silice , polimeri, etc), 2-50 microni n dimensiune.
Componentele amestecului prob sunt separate unul de altul, datorit diferitelor grade lor
de interaciune cu particulele absorbante. Lichidul sub presiune este de obicei un amestec de
solveni (de exemplu ap, acetonitril i / sau metanol) i este menionat ca o "faz mobil".
Compoziie i de temperatura joac un rol major n procesul de separare prin influenarea
interaciunilor care au loc ntre componente eantion i absorbant. Aceste interaciuni sunt
denatur fizic, cum ar fi hidrofob (dispersiv), dipol-dipol i ionic, cel mai adesea o combinaie
a acestora.
5
HPLC se distinge de tradiional ("presiune joas") cromatografia de lichide , deoarece
presiunile de exploatare sunt semnificativ mai mari (50-350 bar), n timp ce cromatografia
lichid obinuit se bazeaz de obicei pe fora de gravitaie pentru a trece faza mobil prin
coloan. Avnd n vedere cantitatea mic de prob separat la HPLC analitic, dimensiunile tipice
de coloan sunt cu diametrul de 2.1 - 4.6 mm, i 30 - 250 mmlungime. De asemenea coloane
HPLC sunt realizate cu sorbent mici (2-50 micrometri n dimensiune medie a particulei). Acest
lucru ofer HPLC superioar putere de rezoluie , atunci cnd separarea amestecurilor, care este
de ce este o tehnica cromatografic popular.
Schema unui instrument HPLC include de obicei un sampler, pompe, i un detector.
Prelevare aduce amestecul de prob n fluxul fazei mobile pe care o desfoar n coloan.
Pompele realizat debitul dorit i compoziia fazei mobile prin coloan. Detectorul genereaz un
semnal proporional cu cantitatea de component prob iese din coloan, permind astfel pentru
cantitativ analiza componentele probei. O digitale microprocesor i software-ul de utilizator de
control instrumentul HPLC i s ofere o analiz a datelor. Unele modele de pompe mecanice
ntr-un instrument HPLC poate amesteca multiple solveni mpreun n proporii schimbare n
timp, genernd o compoziie de gradient n faza mobil. Diferite detectoare sunt n uz comun,
cum ar fi UV/ Vis, fotodiod array (PDA) sau bazate pe spectrometrie de mas
3.3. Operaiune
Amestecul de prob s fie separate i analizate este introdus, ntr-un volum mic discret
(de obicei microlitri), n fluxul fazei mobile se scurge din coloan. Componentele probei deplasa
prin coloan cu viteze diferite, care sunt funcie de interaciuni fizice specifice cu adsorbantul
(numit i faz staionar). Viteza fiecrei componente depinde de natura sa chimic, de natura
fazei staionare (coloan) i de compoziia fazei mobile. n momentul n care o anumit eluat de
analizat (iese din coloana) este numit timpul de [Link] de retenie msurat n condiii
speciale este considerat o caracteristic de identificare a unui anumit analit.
Multe tipuri diferite de coloane sunt disponibile, umplute cu sorbeni variind ca mrime a
particulelor, i n natura suprafeei lor ("chimia de suprafa"). Utilizarea de materiale de
ambalare mai mici dimensiuni a particulelor necesit utilizarea presiunii de funcionare mai mare
("contrapresiune") i mbuntete n mod tipic rezoluia cromatografic (adicgradul de
6
separare ntre analii consecutive emergente din coloan). n ceea ce privete chimia de
suprafa, particulele absorbante poate fi hidrofob polar sau n natur. Faze mobile comune
utilizate includ orice combinaie miscibil cu apa cu diveri solveni organici (cele mai comune
sunt acetonitril i metanol ). Unele tehnici HPLC utiliza faze mobile lipsite de ap (a se vedea
cromatografie Normal faz de mai jos). Componenta apoas a fazei mobile poate conine acizi
(de exemplu, formic, fosforic sau acid trifluoracetic ) sau sruri pentru a ajuta la separarea de
componentele probei. Compoziia fazei mobile poate fi meninut constant ("mod izocratic
eluare") sau variate ("Mod gradient de eluare") n timpul analizei cromatografice. Eluare
izocratic este de obicei eficient n separarea componentelor eantion care nu sunt foarte diferite
n afinitatea lor pentru faza staionar. In gradient de eluie compoziia fazei mobile este variat
n mod tipic de la mic la mare putere de eluie. Concentraia eluare al fazei mobile este reflectat
de timpi de retenie analit cu rezisten ridicat eluie productoare de eluare rapid (= timpii de
retenie scurt). Un profil tipic de gradient n cromatografia n faz invers ar putea ncepe de la
5% acetonitril (n ap sau tampon apos) i progresul liniar la 95% acetonitril timp de 5-25
minute. Perioadele de compoziia fazei mobile constant poate fi parte din orice profil de
gradient. De exemplu, compoziia fazei mobile poate fi meninutconstant la 5% acetonitril
pentru 1-3 min, urmat de o schimbare liniar de pn la 95% acetonitril.
Compoziia ales al fazei mobile (de asemenea, numit eluant) depinde de intensitatea
interaciunilor dintre diferitele componente de prob ("substane de analizat") i faza staionar
(de exemplu, interaciunile hidrofobe din HPLC n faz invers).Acest proces de partiionare este
similar cu cel care apare n timpul unei extracia lichid-lichid , dar este continuu, nu n etape. n
acest exemplu, folosind un gradient de ap / acetonitril, componentele mai hidrofobi vor elua
(intre pe coloana) trziu, odat faza mobil devine mai concentrat n acetonitril (adic ntr-o faz
mobil de rezisten care elueaza mai sus) [4].
7
4. Bibliografie
1. [Link]
2. [Link]
a=X&ved=0ahUKEwiyjvrgirXRAhWF7xQKHbDnChcQ_AUIBigB#imgrc=82D6C4jEl
wEXrM%3A
3. [Link]
4. [Link]