LP6. Tehnici de izolare si purificare ADN i ARN.
Metode de evaluare a concentraiei, puritii i gradului de
fragmentare a acizilor nucleici anterior PCR
Multe dintre tehnicile de analiz a modalitilor de stocare, transmitere i
exprimare a informaiei genetice se bazeaz pe posibilitatea obinerii unor cantiti
relativ mari de ADN purificat. Izolarea materialului nuclear din celule este un
proces relativ simplu ce implic lizarea membranelor celulare, ns n prim faz
ADN-ul va fi contaminat att cu ARN ct i cu proteine. De aceea metodele
folosite trebuie s aib n vedere eliminarea acestor molecule i implicit creterea
fraciei de ADN purificat.
Izolarea ADN-ului genomic din snge
Principiul metodei
Acest protocol este destinat izolrii ADN din leucocite, cantitatea obinut
fiind de aproximativ 5-15g. Purificarea ADN are loc n patru etape: (1) liz
celular i nuclear - aceast etap implic iniial liza eritrocitelor n soluia de
liz celular urmat de liza leucocitelor i a nucleilor acestora n soluia de liz
nuclear; (1*) digestia opional a ARN-ului total cu ajutorul RN-azelor; (2)
nlturarea proteinelor dup o prealabil precipitare a acestora n soluie salin ce
las n soluie ADN-ul cu mas molecular mare (soluie de precipitare a
proteinelor); (3) concentrarea ADN-ului i eliminarea srurilor din soluie prin
precipitare n izopropanol; (4) splarea cu etanol, deshidratarea i rehidratarea
ADN-ului (fig.1);
Fig. 1 Schema general a izolrii ADN din snge
1
Materiale necesare
Microcentrifug capabil s dezvolte o for centrifugal relativ (RCF) de
13.000 - 16.000g;
Tuburi de 1.5ml pentru microcentrifug;
Vortex (agitator turbionar);
Bloc de incubare uscat a tuburilor de 1.5ml;
Micropipete;
Baie de ap termostatat - *opional;
Snge recoltat pe anticoagulant (EDTA);
Kit de extracie ADN:
soluie de liz celular;
soluie de liz nuclear;
soluie de precipitare a proteinelor;
soluie de rehidratare a ADN-ului;
Izopropanol 100%;
Etanol 70%;
Etapele izolrii ADN din 300l snge
1. ntr-un tub steril de microcentrifug (1,5ml) se transfer 900 l soluie de liz
celular.
2. Se rstoarn uor recipientul n care s-a recoltat sngele (omogenizare) i apoi se
transfer un volum de 300 l n tubul coninnd 900 l soluie de liz celular. Se
inverseaz de 5-6 ori.
3. Incubare 10 minute la temperatura camerei. Rezultat - liza hematiilor.
4. Se centrifugheaz proba la 13.000 - 16.000g timp de 1 minut. Rezultat - sediment
leucocitar.
5. Se ndeprteaz supernatantul fr a afecta sedimentul leucocitar. Cantitatea admis
de lichid rezidual deasupra sedimentului - 10-20 l.
6. Se vortexeaz intens tubul, pn ce leucocitele sunt resuspendate (10-15 secunde).
7. Peste celulele resuspendate se adaug 300 l soluie de liz nuclear. Amestecul se
pipetez de 5-6 ori pentru a produce att liza leucocitelor ct i a nucleilor leucocitari.
n timpul acestei etape soluia devine foarte vscoas. Rezultat - eliberarea acizilor
nucleici din compartimentul nuclear.
8. Opional: Se adaug 1,5 l soluie coninnd RN-aze peste lizatul nuclear i se
amestec proba prin inversare de 2-5 de ori. Se incubeaz 15 minute la 37oC i apoi se
rcete la temperatura camerei.
9. Se adaug 100 l de soluie de precipitare a proteinelor peste cei 300 l de lizat
nuclear i se vortexeaz timp de 10-20 secunde. La final pot fi vizibile mici
precipitate proteice.
10. Se centrifugheaz proba la 13.000 - 16.000g timp de 3 minute. Se obine un
sediment proteic brun-negricios.
11. Se transfer supernatantul coninnd ADN-ul aflat n stare solubil ntr-un nou tub
de 1,5 ml ce conine 300 l izopropanol.
12. Se amestec uor soluia prin inversie pn ce devin vizibile filamente albe de
ADN i pn ce acestea formeaz o mas compact. Rezultat - precipitarea ADN.
13. Se centrifugheaz proba la 13.000 - 16.000g timp de 3 minute. La sfritul acestei
etape ADN-ul trebuie s fie vizibil ca un mic sediment alb.
14. Se ndeprteaz supernatantul i se adaug un volum de 300 l de etanol 70% la
temperatura camerei. Se inverseaz uor tubul de cteva ori pentru a spla sedimentul
2
de ADN i pereii tubului. Se centrifugheaz din nou n aceleai condiii ca la punctul
13.
15. Se nltur etanolul evitndu-se aspirarea sedimentului. Se rstoarn tubul pe o
hrtie de filtru absorbant i se permite evaporarea etanolului restant timp de 10-15
minute la temperatura camerei.
16. Se adaug 100 l soluie de rehidratare a ADN-ului peste sediment i se
incubeaz proba peste noapte la temperatura camerei sau la 4oC. Alternativ, pentru
rehidratare se poate incuba tubul la 65oC timp de 1 or.
17. ADN-ul n stare rehidratat se pstreaz la 2-8oC.
Not
Probele de snge recoltate pe anticoagulant pot fi stocate la 2-8oC un interval de
maxim dou luni ns cantitatea de ADN obinut se va diminua pe msur ce crete
timpul de stocare.
Concentraia, puritatea ADN. Evaluarea va fi efectuat folosind spectrofotometrul
Eppendorf Biophotometer fiind posibil msurarea n volume de peste 50 l.
Cuantificare ADN:
a. Msurtorile se vor efectua n 50 l prob ADN;
b. nregistrarea absorbanelor: 230, 260 & 280 nm;
c. Calculul concentraiei:
A260 x 40 x Factorul de diluie = Concentraia g/ml;
d. Determinarea puritii prin calcularea fraciilor 260/280 i 260/230. Probele de
o puritate acceptat vor avea valori mai mari sau egale cu:
i. 260/280: 1.8;
(o valoare mai mic a raportului 260/280 indic o posibil contaminare cu
proteine);
ii. 260/230 = 1.7
(o valoare mai mic a raportului 260/230 indic o posibil contaminare cu
sruri, guanidin, carbohidrati, peptide, fenoli sau alti compusi aromatici).