23TUTORIAL 1

[Link] o ciclo celular normal (interfase- mitose)

A função básica do ciclo celular é duplicar a imensa quantidade de DNA nos cromossomos e, então, segregar as cópias
em duas células-filhas geneticamente idênticas. A duplicação do cromossomo ocorre durante a fase S, que requer de 10
a 12 horas e ocupa cerca da metade do tempo do ciclo celular. Após a fase S, a segregação dos cromossomos e a divisão
celular ocorrem na fase M, que requer muito menos tempo (menos de uma hora). A fase M compreende 2 eventos
principais: a divisão nuclear, ou mitose, durante a qual os cromossomos copiados são distribuídos em um par de núcleos-
filhos; e a divisão citoplasmática, ou citocinese, quando a própria célula se divide em duas.
O ciclo celular eucariótico geralmente é composto por quatro fases. A maioria das células requer muito mais tempo para
crescer e duplicar sua massa de proteínas e organelas do que o necessário para duplicar seus cromossomos e se dividir.
Durante a fase G1 ocorre aumento do tamanho celular, intensa síntese de proteínas, produção de enzimas e duplicação
progressiva de organelas necessárias para sustentar a futura divisão celular. A fim de reservar, em parte, tempo para o
crescimento, a maioria dos ciclos celulares possui fases de intervalo – a fase G1 entre a fase M e a fase S, e a fase G2
entre a fase S e a mitose. Assim, o ciclo celular eucariótico é tradicionalmente dividido em quatro fases sequenciais: G1,
S, G2 e M. As fases G1, S e G2 são, em conjunto, chamadas de interfase. Em uma célula humana típica se proliferando
em cultura, a interfase pode ocupar 23 horas de um ciclo celular de 24 horas, com 1 hora de fase M. O crescimento
celular ocorre ao longo do ciclo celular, exceto durante a mitose. As duas fases de intervalo são mais do que um simples
retardo de tempo que garante o crescimento celular. Elas também dão tempo para que a célula monitore o ambiente
interno e externo a fim de se assegurar de que as condições são adequadas e os preparativos estejam completos, antes
que a célula se comprometa com as principais transformações da fase S e da mitose.
Nesse sentido, a fase G1 é especialmente importante. Sua duração pode variar imensamente, dependendo das condições
externas e de sinais extracelulares de outras células. Se as condições extracelulares forem desfavoráveis, por exemplo,
as células retardam a progressão a G1 e podem entrar em um estado de repouso especializado conhecido como G0 (G
zero), no qual podem permanecer por dias, semanas ou mesmo anos antes que a proliferação seja retomada. Na verdade,
muitas células ficam permanentemente em G0 até que elas ou o organismo morram. Se as condições extracelulares são
favoráveis e os sinais para crescer e se dividir estão presentes, as células no início de G1 ou G0 avançam até um ponto
de comprometimento próximo ao fim de G1 conhecido como ponto de restrição (em células de mamíferos). Uma vez
passado esse ponto, as células se comprometem com a replicação do DNA, mesmo que os sinais extracelulares que
estimulam o crescimento e a divisão celular sejam removidos.
Durante a fase S, além da duplicação do DNA, ocorre também a duplicação dos centríolos, que organizarão os polos do
fuso mitótico. Os mecanismos de correção de erros atuam continuamente garantindo a fidelidade da replicação do DNA,
detectando pareamentos incorretos e reparando danos antes que estes sejam fixados na nova molécula sintetizada.
Na fase G2, a célula realiza uma checagem final do DNA replicado, corrigindo danos remanescentes, aumenta a síntese
de proteínas estruturais e enzimáticas necessárias para a mitose, reorganiza elementos do citoesqueleto e ativa
complexos ciclina-CDK que permitem a transição para a fase M. Esta fase funciona como o último controle antes da
entrada definitiva na mitose.
Ao longo do ciclo celular, atuam ainda os pontos de checagem. O checkpoint G1/S avalia o tamanho celular, a
disponibilidade de nutrientes e possíveis danos no DNA antes da replicação. O checkpoint G2/M confirma se toda a
replicação do DNA foi concluída adequadamente e se não há quebras ou erros que impeçam a entrada na mitose. O
checkpoint do fuso, localizado na transição metáfase-anáfase, garante que todos os cromossomos estejam corretamente
ligados aos mitcrotúbulos do fuso mitótico antes que as cromátides-irmãs sejam separadas.
No começo da mitose, em um estágio chamado prófase, as duas moléculas de DNA são gradativamente desembaraçadas
e condensadas em pares de bastonetes rígidos e compactos chamados cromátides-irmãs, as quais permanecem ligadas
por meio da coesão de cromátides-irmãs. Quando posteriormente o envelope nuclear se desfaz na mitose, os pares de
cromátides-irmãs ficam ligados ao fuso mitótico, um gigantesco arranjo bipolar de microtúbulos. As cromátides-irmãs
são fixadas a polos opostos do fuso e, por fim, alinham-se na placa equatorial do fuso em um estágio chamado metáfase.
A destruição da coesão de cromátides-irmãs, no início da anáfase, separa as cromátides-irmãs, que são puxadas para
polos opostos do fuso. Em seguida, o fuso se desfaz e os cromossomos segregados são empacotados em núcleos
separados na telófase. Então, a citocinese cliva a célula em duas, de forma que cada célula-filha herde um dos dois
núcleos.
2. ⁠Papel das ciclinas, quinases e P53(reguladoras do ciclo)
O sistema de controle do ciclo celular opera de forma muito semelhante a um cronômetro que aciona os eventos do ciclo
celular em uma sequência determinada. Esse sistema de controle é rigidamente programado para fornecer uma
quantidade fixa de tempo para a realização de cada evento do ciclo celular. Se algum mau funcionamento impede a
conclusão bem-sucedida da síntese de DNA, por exemplo, sinais são enviados ao sistema de controle para retardar a
progressão da fase M. Tais atrasos fornecem tempo para a maquinaria ser reparada e também previnem o desastre que
poderia resultar se o ciclo seguisse prematuramente ao próximo estágio.
O sistema de controle do ciclo celular tem como base uma série conectada de interruptores bioquímicos, cada um dos
quais inicia um evento específico do ciclo celular. Esse sistema de interruptores possui muitas características
importantes, as quais aumentam tanto a precisão como a confiabilidade da progressão do ciclo celular. Em primeiro
lugar, os interruptores geralmente são binários (ativo/inativo) e desencadeiam eventos de maneira completa e
irreversível. Seria claramente desastroso, por exemplo, se eventos como a condensação dos cromossomos ou a
desintegração do envelope nuclear fossem iniciados apenas parcialmente ou começados e não completados. Em segundo
lugar, o sistema de controle do ciclo celular é notavelmente intenso e confiável, em parte devido a mecanismos de
reserva e outras características que permitem que o sistema opere de maneira eficiente sob várias condições, mesmo que
alguns componentes falhem. Por fim, o sistema de controle é altamente adaptável e pode ser modificado para se adequar
a tipos celulares específicos e para responder a sinais intracelulares ou extracelulares específicos.
Na maioria das células eucarióticas, o sistema de controle do ciclo celular controla a progressão do ciclo celular em três
principais pontos de transição reguladora. O primeiro é o Início (ou ponto de restrição) no final de G1, onde a célula se
compromete à entrada no ciclo celular e à duplicação dos cromossomos. Este ponto é controlado principalmente pelos
complexos ciclina D–Cdk4/6 (em humanos), que fosforilam a proteína Rb, liberando o fator de transcrição E2F,
responsável por ativar genes necessários para a entrada na fase S. O segundo ponto é a transição de G2/M, onde o
sistema de controle dispara um evento mitótico precoce que leva ao alinhamento de cromossomos no eixo mitótico na
metáfase; este ponto depende da ativação do complexo ciclina B–Cdk1. O terceiro ponto é a transição entre metáfase e
anáfase, onde o sistema de controle estimula a separação das cromátides-irmãs, levando à conclusão da mitose e da
citocinese. Se detecta problemas dentro ou fora da célula, o sistema de controle impede a progressão através de cada
uma dessas transições. Se o sistema de controle identifica problemas na realização da replicação de DNA, por exemplo,
isso manterá a célula na transição G2/M até que esses problemas sejam resolvidos. Similarmente, se as condições
extracelulares não são apropriadas à proliferação celular, o sistema de controle bloqueia a progressão ao Início,
impedindo dessa forma a divisão celular até que as condições se tornem favoráveis.
As ciclinas foram originalmente denominadas desse modo porque sofrem um ciclo de síntese e degradação a cada ciclo
celular. Os níveis de proteínas Cdk, ao contrário, são constantes. As modificações cíclicas nos níveis das proteínas
ciclinas resultam no agrupamento e ativação cíclicos dos complexos ciclina-Cdk nos estágios específicos do ciclo
celular. Em seres humanos, as ciclinas clássicas correspondem às seguintes classes funcionais: a ciclina D atua na fase
G1; a ciclina E atua no ponto G1/S; a ciclina A atua na fase S e também no início da fase G2; e a ciclina B atua na
transição G2/M e durante a mitose. Essas correspondem, respectivamente, às categorias G1-ciclina, G1/S-ciclina, S-
ciclina e M-ciclina descritas neste capítulo.
Existem quatro classes de ciclinas, cada uma definida pelo estágio do ciclo celular no qual se ligam às Cdks e em que
atuam. Todas as células eucarióticas necessitam de três dessas classes: as G1/S-ciclinas ativam Cdks no final de G1 e,
com isso, ajudam a desencadear a progressão ao Início, resultando no comprometimento à entrada no ciclo celular. Seus
níveis diminuem na fase S. As S-ciclinas se ligam a Cdks logo após a progressão ao Início e ajudam a estimular a
duplicação dos cromossomos. Os níveis das S-ciclinas permanecem elevados até a mitose, e essas ciclinas também
contribuem ao controle de alguns eventos mitóticos iniciais. As M-ciclinas ativam Cdks que estimulam a entrada na
mitose na transição G2/M. Os níveis de M-ciclinas diminuem na metade da mitose. Na maioria das células, uma quarta
classe de ciclinas, as G1-ciclinas, ajuda a regular as atividades das G1/S-ciclinas, as quais controlam, no final de G1, a
progressão ao Início.
Em células de leveduras, uma única proteína Cdk se liga a todas as classes de ciclinas e desencadeia diferentes eventos
do ciclo celular, mudando de ciclina associada em diferentes estágios do ciclo. Por outro lado, em células de vertebrados,
existem quatro Cdks principais envolvidas no ciclo celular. Duas interagem com ciclinas G1 (Cdk4 e Cdk6), uma
interage com ciclinas G1/S e S (Cdk2), e uma interage com ciclinas S e M (Cdk1). Neste capítulo, referir-nos-emos
simplesmente aos diferentes complexos de ciclina-Cdk como G1-Cdk, G1/S-Cdk, S-Cdk e M-Cdk, mas suas
equivalências humanas são: ciclina D–Cdk4/6, ciclina E–Cdk2, ciclina A–Cdk2 e ciclina B–Cdk1.
A ativação total de um complexo ciclina-Cdk ocorre quando a cinase ativadora de Cdk (CAK) fosforila um aminoácido
próximo à entrada do sítio ativo da Cdk, o que promove uma mudança conformacional que aumenta sua atividade. A
atividade de Cdk pode ser suprimida pela fosforilação inibitória, realizada pela cinase Wee1, e pode ser reativada pela
fosfatase Cdc25.
A ligação de proteínas inibidoras de Cdk (CKIs) inativa complexos ciclina-Cdk. Entre as CKIs mais importantes em
vertebrados estão p21, p27 e p57 (família Cip/Kip), que atuam principalmente sobre Cdk2. Já a família INK4, composta
por p15, p16, p18 e p19, atua inibindo especificamente Cdk4 e Cdk6, impedindo a fosforilação de Rb e bloqueando a
progressão da fase G1.
Tanto o APC/C como a SCF são grandes complexos de multissubunidades que possuem componentes em comum, mas
que são diferencialmente regulados. As modificações na atividade de APC/C durante o ciclo celular resultam das trocas
nas suas associações com subunidades ativadoras, como Cdc20 na metade da mitose e Cdh1 a partir do final da mitose
através de G1 precoce. A atividade de SCF depende de subunidades de reconhecimento chamadas proteínas F-box, e
sua atividade é constante ao longo do ciclo, sendo a ubiquitinação controlada pela fosforilação dos alvos.
O controle transcricional também contribui para o ciclo celular, regulando a expressão de ciclinas e de outros
componentes importantes. Mudanças na transcrição dos genes de ciclinas são cruciais para regular sua abundância e,
consequentemente, a atividade das Cdks, garantindo que os eventos do ciclo celular ocorram no momento correto.
A proteína p53 é um fator de transcrição que impede a transformação neoplásica celular por meio de três mecanismos
interconectados: ativação da parada temporária do ciclo celular (denominada quiescência), indução da parada
permanente do ciclo celular (denominada senescência) ou desencadeando a morte celular programada (denominada
apoptose). Se RB for um "sensor" dos sinais externos, a p53 poderá ser vista como um monitor central do estresse
interno, direcionando as células estressadas para uma das três vias descritas. Vários tipos de estresses disparam as vias
de resposta de p53, incluindo anóxia, estímulos pró-crescimento inadequados (por exemplo, atividade de MYC ou RAS
descontrolada) e dano à integridade do DNA. Pelo controle da resposta ao dano do DNA, a p53 exerce papel central na
manutenção da integridade do genoma, descrita a seguir.
Em células saudáveis, não estressadas, a p53 apresenta uma meia-vida curta (20 minutos) devido à sua associação com
MDM2, uma proteína que visa a destruição da p53. Quando a célula está estressada, por exemplo, por um insulto ao seu
DNA, “sensores” que incluem proteínas cinases, como ATM (ataxia-telangiectasia mutada), são ativados. Esses
complexos ativados catalisam modificações pós-translacionais em p53, que se dissocia da MDM2, aumentando sua
meia-vida e sua capacidade de impulsionar a transcrição dos genes-alvo. Foram encontrados centenas de genes cuja
transcrição é desencadeada por p53. Esses genes suprimem a transformação neoplásica por três mecanismos:
A parada do ciclo celular mediada por p53 pode ser considerada a resposta primordial ao dano ao DNA. Ocorre
tardiamente na fase G1 e é causada principalmente pela transcrição dependente de p53 do gene de CDKI, CDKN1A
(p21). A proteína p21, como descrito anteriormente, inibe os complexos ciclina-CDK e evita a fosforilação da proteína
RB, interrompendo assim as células na fase G1. Além disso, quando o dano ao DNA ocorre após a replicação, a p53
também pode bloquear a transição G2/M por meio da inibição da fosfatase Cdc25, impedindo a ativação do complexo
ciclina B–Cdk1 e garantindo que células com DNA lesado não entrem em mitose. Essa pausa no ciclo celular é essencial
por dar às células tempo para reparar o DNA danificado.
A proteína p53 também induz a expressão dos genes de reparo do dano ao DNA. Se o reparo ao dano do DNA for bem-
sucedido, a p53 regula a transcrição de MDM2, levando à destruição de p53 e liberando o bloqueio do ciclo celular. Se
não for possível reparar o dano, a célula pode entrar em senescência induzida por p53 ou sofrer apoptose direcionada
por p53.
Senescência induzida por p53 é a forma de interrupção permanente do ciclo celular caracterizada por alterações
específicas de morfologia e expressão genética que a diferenciam da interrupção reversível do ciclo celular ou da
quiescência. A senescência requer a ativação de p53 e/ou de RB ou da expressão de seus mediadores, como as CDKIs.
Os mecanismos de senescência não são claros, mas parecem envolver alterações globais da cromatina, que modificam
de forma drástica e permanente a expressão gênica.
Apoptose induzida por p53 de células com dano irreversível ao DNA é o mecanismo protetor final contra a
transformação neoplásica. É mediada pela regulação de vários genes pró-apoptóticos, como BAX, PUMA e NOXA,
todos pertencentes à família de proteínas BH3-only, que promovem permeabilização mitocondrial e ativação da via
intrínseca do apoptose.
Para resumir, a p53 é ativada por estresses, como o dano ao DNA, e auxilia no reparo do DNA causando a interrupção
de G1 e induzindo a expressão de genes de reparo do DNA. Uma célula com DNA danificado sem possibilidade de ser
reparado é direcionada por p53 a entrar em senescência ou sofrer apoptose. Em face dessas atividades, chama-se p53
corretamente de “guardião do genoma”. Com a perda da função normal de p53, o dano ao DNA não é reparado, as
mutações se tornam fixas nas células em divisão e a célula entra em uma via de mão única que leva à transformação
maligna. Importante notar que a proteína p53 funcional atua como um tetrâmero, e muitas mutações no gene TP53
afetam essa capacidade de oligomerização; assim, mesmo um único alelo mutado pode exercer efeito dominante
negativo sobre as subunidades restantes, inativando a função protetora da p53.
Confirmando a importância de TP53 no controle da carcinogênese, mais de 70% dos cânceres humanos apresentam um
defeito nesse gene, e as demais neoplasias malignas apresentam defeitos em genes a montante ou a jusante de TP53. As
perdas bialélicas do gene TP53 são encontradas em praticamente todos os tipos de câncer, incluindo carcinomas de
pulmão, cólon e mama – as três principais causas de morte por câncer. Na maioria dos casos, as mutações que afetam
ambos os alelos TP53 são adquiridas nas células somáticas. Em outros tumores, como certos sarcomas, o gene TP53
está intacto, mas a função de p53 está perdida por causa da amplificação e superexpressão do gene MDM2, que codifica
um potente inibidor de p53. Menos comumente, alguns pacientes herdam um alelo TP53 mutante; a doença resultante é
chamada síndrome de Li-Fraumeni. Como ocorre no caso do retinoblastoma familiar, a herança de um alelo TP53
mutante predispõe os indivíduos afetados a desenvolverem tumores malignos porque é necessária somente uma mutação
adicional para inativar o segundo alelo normal. Os pacientes com síndrome de Li-Fraumeni apresentam uma chance 25
vezes maior de desenvolver tumores malignos por volta dos 50 anos de idade, quando comparados à população em geral.
Ao contrário dos tumores que se desenvolvem em pacientes que herdaram um alelo RB mutante, o espectro de tumores
que se desenvolvem em pacientes com síndrome de Li-Fraumeni é muito mais variado; os tipos mais comuns são
sarcomas, câncer de mama, leucemia, tumores cerebrais e carcinomas do córtex da suprarrenal. Comparados às pessoas
diagnosticadas com tumores esporádicos, os pacientes com síndrome de Li-Fraumeni desenvolvem tumores em idade
mais jovem e podem desenvolver múltiplos tumores primários. Como ocorre com a proteína RB, a p53 normal também
pode se tornar não funcional por ação de certos vírus de DNA. As proteínas codificadas por HPVs oncogênicos, certos
poliomavírus e vírus da hepatite B se ligam à p53 normal e anulam sua função protetora. Assim, os vírus de DNA podem
subverter dois dos supressores tumorais mais conhecidos, RB e p53.
3. ⁠Estudar o controle da proliferação celular (Proto-oncogênese, genes supressores tumorais, genes reguladores
de apoptose e genes reparadores de DNA)
O controle da proliferação celular depende de um conjunto integrado de mecanismos moleculares que regulam o
crescimento, a divisão, a sobrevivência e a integridade do material genético. Em organismos normais, genes
estimuladores e inibidores do ciclo celular funcionam de forma coordenada para garantir que a célula apenas se divida
quando as condições internas e externas forem adequadas. Quando esses mecanismos são alterados, favorecem o
crescimento descontrolado característico das neoplasias. De maneira geral, quatro grandes grupos de genes participam
desse controle: os proto-oncogenes, os genes supressores tumorais, os genes reguladores de apoptose e os genes
reparadores de DNA.
Os proto-oncogenes são genes normais cuja função é estimular a proliferação celular em situações fisiológicas. Seus
produtos incluem fatores de crescimento, receptores de membrana dotados de atividade tirosina-quinase, proteínas
citoplasmáticas de transdução de sinal e fatores de transcrição nuclear que ativam a expressão de genes envolvidos na
entrada e progressão pelo ciclo celular. Exemplos notáveis são os fatores de crescimento EGF e PDGF; receptores como
HER2 e EGFR; proteínas de sinalização como RAS; fatores de transcrição como MYC; e reguladores diretos do ciclo,
como ciclinas e CDKs. Esses genes tornam-se oncogenes quando sofrem alterações que levam à sua ativação
constitutiva, independentemente de estímulos fisiológicos. As principais formas de ativação incluem mutações pontuais
(como ocorre com RAS), amplificação gênica (como em HER2 no câncer de mama), translocações cromossômicas que
resultam em ativação anômala de genes de proliferação (como MYC no linfoma de Burkitt) e ativação por vírus
oncogênicos. Uma vez ativados, os oncogenes funcionam como aceleradores permanentes, conduzindo a célula à
proliferação contínua.
O segundo grande grupo é composto pelos genes supressores tumorais, cuja função principal é frear a proliferação
celular, garantindo que o ciclo celular não avance diante de danos genéticos ou condições inadequadas. Entre os mais
importantes está o gene RB, responsável por controlar o ponto de restrição na fase G1. Em seu estado hipofosforilado,
a proteína RB mantém reprimidos fatores de transcrição essenciais para a entrada na fase S, impedindo a duplicação do
DNA. Outro supressor fundamental é TP53, que atua como principal sensor do estresse celular, ativando mecanismos
de reparo, quiescência, senescência ou apoptose. APC, componente central da via Wnt/β-catenina, e PTEN, regulador
negativo da via PI3K/AKT, também são supressores essenciais para o equilíbrio entre proliferação e sobrevivência
celular. BRCA1 e BRCA2 participam do reparo por recombinação homóloga e preservam a estabilidade do genoma. A
inativação dos genes supressores geralmente exige a perda das duas cópias do gene, fenômeno explicado pelo modelo
do “dois golpes” (two-hit hypothesis) de Knudson. Além de mutações, esses genes podem ser silenciados por metilação
de promotores ou perda de heterozigosidade, reduzindo sua expressão e favorecendo o crescimento tumoral.
Outro grupo essencial na regulação do destino celular é o dos genes envolvidos na apoptose, que controlam a decisão
entre sobrevivência e morte programada. A apoptose pode ser ativada por vias externas, mediadas por receptores de
morte como Fas e TNF, ou por vias internas, dependentes da integridade mitocondrial. A família de proteínas BCL-2 é
central nesse processo. Proteínas anti-apoptóticas, como BCL-2 e BCL-XL, preservam a integridade mitocondrial,
enquanto proteínas pró-apoptóticas como BAX e BAK promovem a liberação de citocromo c e ativação da cascata de
caspases. As proteínas BH3-only, como PUMA, NOXA e BIM, funcionam como sensores de estresse celular e modulam
o equilíbrio entre fatores pró- e anti-apoptóticos. Alterações nessa família têm forte relação com a carcinogênese: a
superexpressão de BCL-2 é típica de linfomas, onde impede a morte de células geneticamente alteradas, enquanto a
perda de BAX e BAK confere resistência a apoptose e favorece a sobrevivência de células transformadas.
Os genes responsáveis pelo reparo de DNA constituem o quarto pilar do controle proliferativo. Eles corrigem erros que
surgem durante a replicação ou após danos induzidos por agentes químicos, físicos ou biológicos. O sistema de reparo
de pareamento incorreto (mismatch repair – MMR), composto por MLH1, MSH2, MSH6 e PMS2, corrige erros de
replicação e sua perda leva à instabilidade de microssatélites, observada em tumores do tipo HNPCC (síndrome de
Lynch). O sistema de reparo por excisão de nucleotídeos (NER), defeituoso no xeroderma pigmentosum, remove
dímeros de timina induzidos pela radiação ultravioleta. BRCA1 e BRCA2 coordenam o reparo de quebras de dupla fita
por recombinação homóloga, mecanismo de alta fidelidade. Quando esses sistemas falham, mutações se acumulam
progressivamente, favorecendo instabilidade genômica e transformação maligna.
A carcinogênese ocorre pela integração de todos esses processos alterados. Quando um proto-oncogene é ativado, os
sinais pró-proliferativos são aumentados. Quando genes supressores são inativados, o freio do ciclo celular é removido.
Defeitos em genes de apoptose permitem que células com dano genético escapem da morte e continuem a proliferar.
Por fim, a falha nos sistemas de reparo de DNA favorece o acúmulo contínuo de mutações, promovendo instabilidade
genômica progressiva. A interação desses mecanismos conduz a uma expansão clonal de células cada vez mais
agressivas, culminando no desenvolvimento de tumores invasivos e metastáticos.