PCR

A reação em cadeia da polimerase, ou PCR , é uma técnica análoga, ou seja, que

possui os mesmos princípios da replicação do DNA, que é um processo natural in vivo, já a técnica de
PCR nada mais é do que a reprodução do processo de replicação da molécula de DNA in vitro, no
laboratório.

Ou seja, nada mais é do que uma adaptação do que acontece in vivo.

In vitro, o processo de replicação se repete inúmeras vezes, para que sejam feitas várias cópias de
um fragmento, uma amplificação seletiva de uma região com sequencia especifica do DNA em que
se tem o interesse de estudar, como um ciclo, uma cadeia. Portanto, por isso este nome da técnica.

E porque devem ser feitas essas cópias? Porque se utiliza essa técnica? Um exemplo, seria pequenas
amostras de DNA deixadas em cenas de crimes, como um fio de cabelo, mas é difícil de identificar
qualquer informação em apenas um fragmento de um gene de DNA, então uma solução seria fazer
copias para amplificar esta molécula.

A técnica é tão importante, e essencial para inúmeras áreas, que ganhou o prêmio Nobel de química
em 1993.

Passo a passo da técnica convencional de PCR.

Componentes usados na técnica

 A amostra de DNA (podendo ser sangue, biopsia de qualquer tecido, cabelo, unha, líquidos
corpóreos, entre outros.)
 Primers específicos (que são os oligonucleotideos iniciadores, uma
sequência curta
de nucleotídeos que fornece um ponto de partida para a síntese de
DNA) estes primers iniciadores são comprados e devem ser correspondentes com a região
que se quer amplificar, pois assim delimitam a região especifica do DNA que deseja ser
analisada.
 Nucleotidios (dNTP’s desoxirribonucleotídeos fosfatados)
 TAQ Polimerase - DNA Polimerase bacteriana (Assim como a replicação de DNA em um
organismo, a PCR requer uma enzima DNA polimerase que faça novas fitas de DNA usando
as existentes como moldes. Porém a DNA polimerase humana não é resistente ao calor, e o
PCR passa por processos de alta temperatura, então se é usada uma DNA Polimerase
termoestável da qual foi isolada de uma bactéria resistente ao calor chamada de Thermus
aquaticus, que vive em fontes termais e de água quente. Sua DNA polimerase é bastante
estável ao calor e é mais ativa à 70°C (temperatura em que as DNA polimerases humanas ou
de E. coli seriam disfuncionais). Essa estabilidade ao calor torna a Taq polimerase ideal para
PCRs).

Juntar tudo em um tubo que já contém uma solução tampão e coloca o tubo num aparelho que é
chamado de termociclador, um aparelho que permite variações de temperatura principalmente
aquecimento, porque aquecer ? Porque in vitro não se tem as mesmas enzimas que se tem in vivo,
como a helicase responsável pelo processo de separação da dupla fita. Então com o processo de
aquecimento e resfriamento in vitro se obtém os mesmos resultados que as enzimas proporcionam
naturalmente em condições fisiológicas (in vivo).
A PCR consiste na repetição de ciclos de temperatura, e esses ciclos são divididos em três etapas
1- Desnaturação

2 -Anelamento

3- Extenção

1- Desnaturação

Primeiramente, nesta fase o termociclador estará agindo numa temperatura média de 95ºc por 30
segundos, e nesta temperatura vai ocorrer o rearranjo dessa molécula de DNA que irá deixar de ser
helicoidal, ou seja, vai desenrolar a molécula e ocorrer também a separação da dupla fita, com o
rompimento das pontes de hidrogênio formadas pelas bases nitrogenadas devido à alta
temperatura. Isso proporciona um molde de fita simples para a próxima
etapa.

2- Anelamento do primer

Após as fitas estarem separadas, o termociclador diminui sua temperatura para média de 57ºc por 1
min, para que então os primers se liguem com especificidade às suas seqüências
complementares da colecula de DNA no local a ser amplificado (este primer é formado de
DNA, enquanto o primer da replicação em vivo é formado de RNA)

Com o molde já identificado, a enzima DNA-polimerase adiciona as bases

complementares, formando uma nova fita e então tem-se novamente a
duplicação da fita de DNA
Após a separação das fitas, um par de primers

vai determinar a região a ser copiada, na qual

complementa a fita oposta da sequência de DNA.

Ou seja: a função de um deles é complementar a

sequência em uma fita de dupla-hélice, e o outro

é complementar a sequência na outra fita.

O molde é determinado pela posição dos

indicadores que se anelam a fita. Essa etapa ocorre a uma temperatura de 60ºc

Os primers se ligam na fita de DNA por pareamento de bases

complementares, bem nas extremidades da região a ser copiada
no próximo passo, a temperatura de reação é reduzida para 50-65 °C durante 20-40 segundos,

555555 - 656565°C): Resfria a reação para que os primers possam se

permitindo o anelamento dos iniciadores para cada um dos modelos de DNA de cadeia simples.

ligar às suas sequências complementares no DNA molde de fita simples.

O anelamento esta relacionado com a ligação dos primes na região
específica que se deseja Amostra Primes dNTP’s Tubo Tampão MgCl2 Taq
Polimerase Componentes Etapas Termociclador Desnaturação
Anelamento Extensão amplificar e é caracterizada pelo abaixamento da
temperatura (55 a 62°C). Esta temperatura esta diretamente relacionada
com a composição dos primers
Os primers trabalham em pares, um que se chama primer direito pois
corresponde ao que se acoplara no sentido 5’3’ em que a taq polimerase
vai replicar da esquerda para a direita e o primer esquerdo que
corresponde ao que se acoplara no sentido 5’3’ em que a taq polimerase
vai replicar da direita para a esquerda.

3- extenção

Na ultima etapa do processo se faz um Aquecimento a 72ºc por aproximadamente 1 min, para
funcionamento da taq polimerase que auxilia na introdução dos nucleotidios que vão complementar
a cadeia que esta sendo sintetizada

(72°C): Eleva a temperatura da reação para que a Taqpolimerase estenda

os primers, sintetizando novas fitas de DNA.
Neste passo, a DNA polimerase sintetiza uma nova cadeia de DNA complementar à cadeia de matriz de
DNA por adição de dNTPs livres a partir da mistura de reação que são complementares ao modelo na
direção 5' a 3',

Em condições ideais (isto é, se não houver limitações devido a substratos ou reagentes limitantes), em
cada etapa de extensão / alongamento, o número de sequências alvo de DNA é duplicado. Com cada ciclo
sucessivo, os fios originais do modelo mais todas as vertentes recém-geradas tornam-se fios de modelo
para a próxima rodada de alongamento, levando a amplificação exponencial (geométrica) da região
específica do alvo de DNA.

Ocorre então um processo exponencial quanto mais tempo se deixa ocorrendo a reação no
termociclador em média ate ,35 ciclos, isso vai depender com o resultado que se quer obter com o
que o profissional esta trabalhando, resultado total é 2 elevado a 35 ou seja bilhoes de moleculas de
dna. O processo leva em media de 2 a 3 horas

O procedimento pode ser repetido muitas vezes, até que o nivel desejado dre amplificação seja
obtido

A terceira etapa, a extensão, envolve a ativação da Taq Polimerase (72°C) e subsequentemente a

síntese das novas cadeias

Em seguida, um novo ciclo é iniciado, sendo que normalmente são realizados de 25 a 40

ciclos para cada reação, apresentado taxa de replicação exponencial.
Os resultados de dna da pcr são denominados amplicons

Em seguida, um novo ciclo é iniciado, sendo que normalmente são realizados de 25 a 40

ciclos para cada reação, apresentado taxa de replicação exponencial.
Os processos de desnaturação, anelamento e alongamento constituem um único ciclo. São necessários
vários ciclos para amplificar o alvo de DNA para milhões de cópias.

. Estas alterações de temperatura ocorrem em torno de 30 a 40 vezes e são chamadas de ciclo

ciclo se repete 252525 - 353535

vezes em uma reação típica de PCR, que geralmente ocorre em 222 - 444
Cada ciclo irá passar por essas três fases, Este

horas, dependendo do comprimento da região de DNA a ser copiada.

Na PCR, a reação é repetida ciclicamente através de uma série de
alterações de temperatura, o que possibilita a produção de muitas cópias
da região de interesse.
Com o molde já identificado, a enzima DNA-polimerase adiciona as bases
complementares, formando uma nova fita e então tem-se novamente a
duplicação da fita de DNA. O procedimento é repetido muitas vezes até que o
nível desejado de amplificação seja obtido. Na prática, a amplificação efetiva do
DNA requer de 20 a 30 ciclos de reação, com os produtos de cada ciclo servindo
como DNA-molde para o próximo – dando origem ao termo “reação em cadeia”
da polimerase.

Técnicas de PCR - Transcrição Reversa, Quantitativa,

O que é qPCR ou PCR em Tempo Real?

A PCR em Tempo Real (Real Time Quantitative PCR) é uma variação da técnica de PCR, a qual

permite que a amplificação e detecção ocorram simultaneamente. O resultado é visualizado em

Tempo Real durante a amplificação da sequência de interesse, com capacidade ainda de gerar

resultados quantitativos com maior precisão.

Durante a amplificação, a quantificação é determinada pela quantidade de produto amplificado

durante cada ciclo, através da fluorescência emitida. Esta metodologia utiliza um equipamento com

sistema de monitoramento da emissão da fluorescência.

PRC em Tempo real O PCR em tempo real possibilita monitorar, em tempo real, o processo de
amplificação e permite a quantificação dos ácidos nucléicos por meio da emissão e capitação de
fluorescência que ocorre durante todo o processo. A emissão da fluorescência gera um sinal que
aumenta na proporção direta da quantidade de produto da PCR. O PCR em tempo real requer um
termociclador com sistema ótico para a excitação da fluorescência e captação da emissão, além de
um computador com um software para aquisição de dados e análise final da reação(NOVAIS; PIRES-
ALVES, 2004). Existem dois tipos de sistemas principais de fluorescências, o SYBR Green e o Taq Man.
O SYBR Green se liga a qualquer molécula de dupla fitae TaqMan consiste em uma sonda ligada a um
fluoróforo em uma das extremidades, e na outra uma molécula quencher. Durante a amplificação as
moléculas de fluorescência são excitadas e a luz é captada pelo aparelho. Conforme ocorre a reação
é gerado uma curva de amplificação (AGNE et al., 2009; ARYA et al., 2005)

Eletroforese A eletroforese trata-se de um processo de migração de uma partícula carregada sob

influência de um campo elétrico. Por apresentarem grupos funcionais ionizáveis, várias moléculas
adquirem carga positiva ou negativa em um determinado pH. Portanto, quando são submetidas a
um campo elétrico, essas moléculas carregadas migram para o cátodo ou ânodo, dependendo de
sua carga(WILSON; WALKER, 2010). Para a realização desta metodologia é necessário uma fonte de
tensão e uma unidade de eletroforese que estão disponíveis na forma vertical e horizontal. Além
destes itens, também é necessário de um gel, que pode ser de poliacrilamida ou de agarose
(WILSON; WALKER, 2010). O gel de agarose é o tipo de matriz mais rotineiramente utilizado no
laboratório de Biologia Molecular, que por sua constituição química e o tamanho dos poros pode
mudar a velocidade de migração dos ácidos nucléicos (PETECOF et al., 2015). Na figura 3 está
esquematizado o processo envolvido na eletroforese.

Uso da eletroforese em gel para

visualizar os resultados da PCR
Os resultados de uma reação PCR são geralmente visualizados (tornam-se
visíveis) através do uso da eletroforese em gel. Eletroforese em gel é uma
técnica na qual fragmentos de DNA são puxados por uma corrente
elétrica através de uma matriz de gel, e que separa os fragmentos de DNA
de acordo com o tamanho. Um padrão, ou escada de DNA, é tipicamente
incluído para que o tamanho dos fragmentos nas amostras da PCR possa
ser determinado.

Fragmentos de DNA de mesmo comprimento formam uma "banda" no

gel, que pode ser vista a olho nu se o gel for pigmentado com um corante

fragmento de 400400400pares de bases (pb) apareceria desta maneira

que se liga ao DNA. Por exemplo, uma reação de PCR produzindo um

no gel:

Uma banda de DNA contém muitas e muitas cópias da região de interesse

do DNA, não apenas uma ou algumas cópias. Como o DNA é
microscópico, muitas cópias têm de estar presentes antes que possamos
vê-las a olho nu. Isso é uma grande parte do porquê de a PCR ser uma
ferramenta importante: ela produz cópias suficientes de uma sequência
de DNA de modo que possamos ver ou manipular aquela região de DNA.

Outros xemplos de uso para o PCR

Ou em casos em que se procura defeitos genéticos, como doenças, como o câncer, se tira uma
amostra do paciente, mas se olhasse apenas para essa molécula retirada de uma célula, encontrar
um fragmento especifico de interesse seria como procurar uma agulha num palheiro.

 Casos de pequena amostra de DNA deixada em cenas de crime, então vai se pegar essa
pequena amostra, e reproduzi-la, replicar, multiplicar a quantidade da amostra, e porque
deve ser feito isso ? Porque só com uma pequena amostra de DNA não é suficiente, possivel
fazer tecnica de identificação como a eletroforese.
 ou um marcador genético usado pelos cientistas forenses para
correlacionar o DNA da cena do crime com os suspeitos.
 Essa tecnica foi denominada de dna fingerprint
 Ciencia forence diagnoticos medicos, genetica e microbiologia
 Aplicações

 Diagnóstico de doenças infecciosas e genéticas

 ' Determinação de variabilidade genética

 Sexagem de embriões

 Estudo da expressão gênica

 "Investigação forense

 ' Determinação de Linhagens Animais

 Identificação de Patógenos

 Paternidade
 Ela é rotineiramente usada em clonagens de DNA, diagnósticos
médicos e análises forenses de DNA.
 A PCR encontra sua principal aplicação em situações onde a quantidade de DNA disponível é
reduzida. Em teoria, é possível amplificar qualquer DNA. Uma das principais aplicações da PCR é
na medicina forense, onde pequenas amostras de DNA retiradas da cena de um crime (pedaços
de cabelo que contenham bulbo, gotas de sangue ou saliva, pedaços de pelo ou até mesmo a
minúscula quantidade de DNA deixada em uma impressão digital) são amplificadas para serem
analisadas pelo método de impressão digital genética. A PCR também é rotineiramente utilizada
em procedimentos científicos de biologia molecular como amplificação para gerar mutagênese,
detecção de mutações ou preparação de fragmentos de DNA para clonagem (inserção em
plasmídeo, por exemplo) como também pode ser utilizada para identificação de patógenos que
estão presentes em amostras, como por exemplo a identificação de agentes como Candida sp,
Chlamydia trachomatis, HPV (Vírus do papiloma humano) e seus genótipos, HIV, Vírus da
 Hepatite B, etc. A PCR também é utilizada na paleontologia para o sequenciamento gênico de
animais pré-históricos. Também é muito utilizada na identificação de micro-organismos, tendo
em vista que apenas 1% dos micro-organismos são cultiváveis e podendo ser isolados. A PCR é o
primeiro passo para o posterior sequenciamento. Após obter as sequências geradas pelos
equipamentos, pode-se consultar bases de dados na internet para tentar localizar suas possíveis
origens, sendo bactérias, archeas ou etc
 identificação de doenças hereditárias, a construção de árvores filogenéticas, a
clonagem de genes, teste de paternidade, detecção de organismos causadores de
infecções, concepção de organismos transgênicos, entre outras.
 A Reação em Cadeia da Polimerase no exame de cariótipo
 A Reação em Cadeia da Polimerase na sexagem fetal
 A Reação em Cadeia da Polimerase em doenças ligadas aos genes
 A Reação em Cadeia da Polimerase na pesquisa de polimorfismo e aconselhamento
nutricional

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