EXTRAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE UREASE
ISADORA COSTA; JOÃO VÍTOR NEUMANN; KELLEN PEREIRA; MÔNICA BERCHET;
PETERSON DA SILVA; RÓGER LUCAS LEMES; TIMÓTEO CASARIN
1 INTRODUÇÃO
As enzimas são macromoléculas, em sua maioria proteínas globulares, que
exercem função de catalisadores ao aumentar a velocidade das reações químicas
sem serem consumidas durante o processo. Sua ação baseia-se na formação de um
complexo enzima-substrato no sítio ativo, promovendo a diminuição da energia de
ativação necessária para a conversão dos reagentes em produtos. Cada enzima
apresenta elevada especificidade quanto ao substrato e depende de condições físico-
químicas adequadas, como pH e temperatura, para manter sua conformação e
atividade catalítica. Essas características tornam as enzimas componentes muito
relevantes nos sistemas biológicos e em aplicações industriais e biotecnológicas
(LEHNINGER, 1970).
A atividade enzimática pode ser diretamente afetada por meio de inibidores e
promotores de reação, substâncias que interferem na atividade catalítica das enzimas.
Os inibidores são compostos que reduzem ou bloqueiam a ação enzimática ao se
ligarem ao sítio ativo ou a outras regiões da enzima, modificando sua conformação e
dificultando a interação com o substrato; podem atuar de modo reversível, por
competição com o substrato ou por ligação alostérica, e irreversível, formando
ligações covalentes com resíduos catalíticos do sítio ativo. Os promotores, por sua
vez, são substâncias que aumentam a eficiência da reação, facilitando a ligação entre
enzima e substrato ou estabilizando a estrutura enzimática
(VOET; VOET; PRATT, 2016).
Pode-se provocar, também, a desnaturação enzimática, processo em que a
estrutura tridimensional terciária e quaternária de uma enzima é alterada,
comprometendo a disposição espacial de seus aminoácidos e, consequentemente, a
configuração do sítio ativo responsável pela catálise. Esta modificação estrutural,
geralmente irreversível, ocorre devido à ruptura de interações químicas que mantêm
a conformação nativa da proteína. Fatores como temperatura elevada, variações de
pH ou exposição a agentes químicos podem provocar esse processo, levando à perda
total ou parcial da atividade da enzima (CREIGHTON, 1993).
A soja, uma leguminosa de grande valor nutricional, contém a enzima urease,
que catalisa a reação de decomposição da ureia em amônia e gás carbônico, o que
gera um sabor desagradável no produto alimentício quando não é inativada
corretamente (TORALLES; KUHN, 2013). A urease apresenta resistência térmica
semelhante à dos principais fatores antinutricionais presentes nos grãos, como
inibidores de tripsina, inibidores de quimotripsina, glicinina e conglicinina não
digeríveis. Estes compostos podem interferir na digestibilidade das proteínas e na
absorção de aminoácidos essenciais (LIENER, 1980).
A similaridade de resistência à temperatura da urease com os compostos em
questão permite utilizá-la como um indicador indireto da inativação das substâncias
antinutricionais presentes no grão de soja. Níveis elevados de atividade ureásica
indicam processamento inadequado e, consequentemente, baixo valor nutritivo da
farinha de soja, enquanto valores reduzidos refletem a desnaturação enzimática
adequada e maior aproveitamento nutricional do produto. Portanto, a determinação
da atividade ureásica da soja é um método simples e eficiente para avaliar a qualidade
do processamento dessa leguminosa (TORALLES; KUHN, 2013).
A atividade ureásica é modulada por fatores físico-químicos que influenciam
a conformação molecular e a eficiência catalítica da enzima. O pH desempenha papel
fundamental, pois determina a ionização adequada dos grupos funcionais do sítio
ativo, a urease apresenta atividade enzimática máxima em faixas próximas à
neutralidade, segundo Blakeley e Zerner (1984) e Krajewska (2009) o intervalo de pH
ideal para a atividade ureásica encontra-se entre 7,0 e 7,5, de acordo com Qin e
Cabral (1994) o pH ótimo é definido em 7,2. A temperatura também exerce efeito direto
sobre a cinética enzimática, promovendo o aumento da taxa de reação até um valor
ótimo, acima do qual ocorre desnaturação proteica e perda de atividade, Tabatabai e
Bremmer (1972) e Kandeler e Gerber (1988) determinam a temperatura ótima para a
atividade ureásica em 37 ºC, pois garante uma atividade mensurável e estável,
minimizando a desnaturação térmica. (KARPLUS; PEARSON; HAUSINGER, 1997).
A escolha do indicador adequado para a determinação da atividade ureásica
deve considerar a variação de pH resultante da liberação de amônia durante a
hidrólise da ureia. Como a reação gera aumento da alcalinidade do meio, são
utilizados indicadores com faixas de viragem em torno da neutralidade, destacando a
mudança de pH do meio de ácido ou neutro para alcalino (LENNETE, 1985). Entre os
mais empregados destaca-se o vermelho de fenol, por possuir um pK a de 7,9 e faixa
de viragem entre pH 6,8 e 8,4, apresentando coloração amarela em meio ácido,
alaranjada em meio neutro, tonalidade rosada a vermelho-claro em meio levemente
básico e completamente vermelha em meio alcalino. Esta sensibilidade permite
correlacionar a mudança de cor à intensidade da atividade enzimática, fornecendo
uma estimativa visual e qualitativa da eficiência catalítica da urease
(MACFADDIN, 2000).
O objetivo desta prática foi constatar o caráter proteico de uma enzima,
determinar a atividade enzimática da urease e sua especificidade qualitativamente, e
também demonstrar a inibição e desnaturação da mesma.
2 MATERIAIS E MÉTODOS
Os materiais e reagentes utilizados foram: ácido nítrico; água destilada; cloreto
de mercúrio; extrato enzimático de soja em água, glicerol e tampão; indicador
vermelho de fenol; solução tamponada de tioureia; solução tamponada de ureia;
banho-maria; bico de Meker; capela de exaustão; micropipeta monocanal; pera de
sucção; pipeta graduada; pipeta Pasteur; ponteira para micropipeta; suporte de tubo
de ensaio; tela de amianto; tripé; tubo de ensaio.
No preparo do extrato enzimático, para cada solução, foram utilizados,
respectivamente, 5 g de soja e 50 mL de água, glicerol a 50% e solução tampão.
Realizou-se um total de cinco testes qualitativos da enzima urease:
Para a realização do teste qualitativo de determinação de proteínas: teste de
Heller, em cada tubo de ensaio foram adicionados 0,5 mL de extrato enzimático de
soja em água, glicerol e tampão, 1,5 mL de água destilada e 1,0 mL de HNO₃ P.A..
Os tubos foram deixados em repouso por 10 minutos.
Para a realização do teste qualitativo de atividade enzimática, em cada tubo de
ensaio foram adicionados 0,2 mL de extrato enzimático (água, glicerol e tampão), 0,8
mL de água destilada, 3,0 mL de solução tamponada de ureia e 2 gotas de indicador
vermelho de fenol. A mistura foi homogeneizada e colocada em banho-maria a 37 °C
por 10 minutos.
Para a realização do teste qualitativo de especificidade da urease, em cada tubo
de ensaio foram adicionados 0,2 mL de extrato enzimático (água, glicerol e tampão),
0,8 mL de água destilada, 3,0 mL de solução tamponada de tioureia e 2 gotas de
indicador de indicador vermelho de fenol. A mistura foi homogeneizada e colocada em
banho-maria a 37 °C por 10 minutos.
Para a realização do teste qualitativo de inibição da urease, em cada tubo de
ensaio foram adicionados 0,2 mL de extrato enzimático (água, glicerol e tampão), 0,8
mL de água destilada, uma alíquota de cloreto de mercúrio (HgCl₃), 3,0 mL de solução
tamponada de ureia e 2 gotas do indicador vermelho de fenol. A mistura foi
homogeneizada e colocada em banho-maria a 37 °C por 10 minutos.
Para a realização do teste qualitativo de desnaturação pelo calor, em cada tubo
de ensaio foram adicionados 0,2 mL de extrato enzimático (água, glicerol e tampão) e
0,8 mL de água destilada. Os tubos foram colocados em banho-maria fervente por 10
minutos. Em seguida, adicionaram-se 3,0 mL de solução tamponada de ureia e 2
gotas de indicador vermelho de fenol. A mistura foi homogeneizada e colocada
novamente em banho-maria a 37 °C por 10 minutos.
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Para demonstrar a natureza proteica da enzima aplicou-se o teste de Heller, que
determina a presença de proteína na amostra por meio de sua desnaturação utilizando
um ácido forte, para os três extratos enzimáticos previamente obtidos, como pode ser
visualizado na Figura 1.
A B C
Figura 1. Tubos de ensaio após o
emprego do teste Heller: A – extração
com água destilada; B – extração
com tampão fosfato pH 7; C –
extração com glicerol 50%. Utilizando
uma relação soluto/solvente de 1/10.
Fonte: Autoria própria
Desta forma, foi possível observar uma precipitação nos tubos de extrato
enzimático extraídos com água destilada e tampão fosfato de pH 7, o que caracteriza
eles como positivos para a presença de proteínas. Já o tubo de extrato enzimático
extraído com glicerol 50 % não apresentou precipitação, sendo negativo para a
presença de proteínas.
A precipitação das proteínas nos tubos de extrato enzimático, extraídos com
água destilada e tampão fosfato de pH 7, ocorre pois o ácido altera bruscamente o pH
rompendo as interações intermoleculares que são responsáveis pelas estruturas
terciária e quaternária da enzima.
A divergência entre os resultados pode ser justificada pela forma com que os
meios de extração facilitam ou dificultam a reação do HNO3 com a enzima, enquanto
a água permite que o pH seja alterado facilmente, o tampão fosfato de pH 7 apesar
de permitir a alteração a torna mais difícil, e o glicerol 50 % que não apresenta
desnaturação, de acordo Vagenende et al. (2009) previne a agregação de proteínas
inibindo sua desnaturação e estabilizando intermediários propensos à agregação, por
meio de interações com regiões de superfície hidrofóbicas, protegendo a estrutura da
enzima que apesar de presente, não é desnaturada
Para determinar a atividade da urease de forma qualitativa realizou-se a reação
de hidrólise da ureia, demonstrada na Equação 1.
(Eq. 1)
Nesta reação a urease catalisa e hidrólise da ureia, que libera amônia no meio,
aumentando o pH da solução (MOBLEY; ISLAND; HAUSINGER, 1995).
Desta forma adicionou-se aos três extratos, ureia e o indicador de pH vermelho
de fenol, que permite verificar o aumento de pH pela mudança de cor de uma faixa
entre o amarelo e o laranja (em meios ácidos e neutros, respectivamente) para o rosa
(em meios básicos), confirmando que a reação ocorreu, amônia foi liberada e
consequentemente há atividade enzimática da urease.
Também foi realizado um ensaio do branco no qual não foi adicionada a ureia,
como representado na Figura 2.
b A B C
0
0
0
0
Figura 2. Tubos de ensaio do teste
de atividade enzimática. b – ensaio
do branco; A – extração com água
destilada; B – extração
com tampão fosfato pH 7;
C – extração com glicerol 50%.
Utilizando uma relação
soluto/solvente de 1/10.
Fonte: Autoria própria.
Foi possível observar que os tubos de extrato enzimático extraídos com água
destilada e com tampão fosfato de pH 7 apresentaram um aumento de pH, enquanto
no extrato enzimático extraído com glicerol 50 % e no ensaio do branco não houve
aumento no pH da solução.
O aumento de pH nos tubos de extrato enzimático extraídos com água destilada
e com tampão fosfato de pH 7 indicam que a urease foi capaz de realizar sua função
catalisadora da ureia liberando amônia e aumentando o pH do meio, confirmando,
portanto, atividade enzimática.
Já a inalteração dos tubos do ensaio do branco e o extrato com glicerol 50 %
indica que não houve liberação de amônia no meio decorrente da atividade
enzimática, entretanto por motivos diferentes pois enquanto no ensaio do branco não
havia o substrato para permitir a atividade enzimática, no extrato com glicerol 50 % a
atividade enzimática da ureia foi inibida e a viscosidade do meio aumentada
diminuindo drasticamente a efetividade da hidrólise da ureia (CAVALCANTE, 2020).
Para determinar a especificidade da enzima, foi replicado o teste anterior,
contudo ao invés de adicionar-se ureia adicionou-se tioureia, um substrato
estruturalmente semelhante à ureia, mas com um átomo de enxofre ao invés de um
de oxigênio, caso a enzima apresente especificidade a tioureia não deverá ser
hidrolisada, mantendo o pH do meio e a cor do indicador permanecerá entre o amarelo
e o laranja.
Desta forma adicionou-se tioureia e o indicador vermelho de fenol aos extratos
obtendo os resultados que podem ser visualizados na Figura 3.
A B C
Figura 3. Tubos de ensaio do teste
de especificidade: A – extração com
água destilada; B – extração com
tampão fosfato pH 7;
C – extração com glicerol 50%.
Utilizando uma relação
soluto/solvente de 1/10.
Fonte: Autoria própria.
A coloração entre o amarelo e o laranja apresentada pelos três tubos indica que
o pH do meio se manteve, portanto, a hidrólise não ocorreu, destacando a alta
especificidade da urease pelo substrato ureia, o que explica a enzima não reagir com
a tioureia, que é muito semelhante estruturalmente, devido a diferenças na formação
de interações não covalentes, como ligações de hidrogênio e complexos com íons de
níquel no sítio ativo, além de possíveis barreiras estéricas que impedem uma ligação
eficaz, dessa forma, como pode ser visto na equação 2 e a enzima é específica
(CIURLI et al., 1999; LI et al., 2002).
(Eq. 2)
Para determinar a inativação por metais adicionou-se HgCl2 e urease,
verificando se após a adição de um metal a enzima mantém sua capacidade de
hidrolisar a ureia aumentando o pH da solução ou se a enzima é desativada, o teste
foi aplicado para os três extratos como apresentado na Figura 4.
A B C
Figura 4. Tubos de ensaio do teste
de inativação por metais: A – extração
com água destilada; B – extração
com tampão fosfato pH 7;
C – extração com glicerol 50%.
Utilizando uma relação
soluto/solvente de 1/10.
Fonte: Autoria própria.
A coloração obtida pelos três tubos indica um pH ácido, ou seja, não só a reação
de hidrólise da ureia não ocorreu, devido à interferência do HgCl 2 no sítio ativo da
urease alterando a funcionalidade dos íons de níquel presentes, como o pH da solução
foi alterado pela presença do HgCl 2 que tem caráter ácido, dessa forma é determinada
a inativação da urease (SVANE et al., 2020).
Para determinar se a enzima pode ser desnaturada pelo calor, adicionou-se
aos três extratos ureia e o indicador de pH permitindo verificar a ocorrência da reação,
os tubos também foram submetidos à um banho-maria. Os resultados obtidos podem
ser visualizados na Figura 5.
A B C
Figura 5. Tubos de ensaio do teste
de desnaturação pelo calor: A –
extração com água destilada; B –
extração com tampão fosfato pH 7;
C – extração com glicerol 50%.
Utilizando uma relação
soluto/solvente de 1/10.
Fonte: Autoria própria.
Como o pH das soluções se manteve inalterado, indicando alterações nas
ligações que mantêm sua estrutura tridimensional, como o rompimento das ligações
de hidrogênio (que são termolábeis e sensíveis a fatores como calor ou inibidores)
que desencadeiam uma cascata de mudanças na conformação enzimática, resultando
em uma nova estrutura ou em um estado conformacional instável e indefinido, dessa
forma pode-se dizer que a enzima sofreu desnaturação pelo calor, resultados
corroborados pelos encontrados por Almeida et al. (2008).
4 CONCLUSÃO
Conclui-se a partir da prática realizada que a metodologia empregada foi eficaz
para a extração da urease e sua caracterização quanto à natureza proteica, pelo teste
de Heller; atividade enzimática, determinada qualitativamente pela reação de hidrólise
da ureia; determinação da especificidade da enzima, por meio também da reação de
hidrólise, porém utilizando tioureia; determinação da inativação da enzima por metais,
repetindo o teste de atividade enzimática com a adição de cloreto de mercúrio no meio
e a determinação da desnaturação da enzima pelo calor, realizando o teste de
atividade enzimática após a enzima ser submetida à um banho-maria fervente.
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