NOM-110-SSA1-1994

BENS E SERVIÇOS. PREPARAÇÃO E

DILUIÇÃO DE AMOSTRAS DE ALIMENTOS
PARA SU ANÁLISE MICROBIOLÓGICA.
 INTRODUCCIÓN
ESTA NORMA ESTÁ ORIENTADA A
PROPORCIONAR LAS GUIAS GENERALES
PARA A PREPARAÇÃO DE DILUIÇÕES
PARA EL EXAMEN MICROBIOLOGICO
DE ALIMENTOS.
 OBJETIVO Y CAMPO
DE APLICAÇÃO
ESTA NORMA OFICIAL MEXICANA ESTABELECE
EL PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACIÓN
DE DILUCIONES PARA EL ANÁLISIS
MICROBIOLÓGICO DE PRODUTOS
ALIMENTICIOS.
 SE BASEIA NA
PREPARAÇÃO DE
DILUIÇÕES PRIMÁRIAS,
FUNDAMENTO PARA OBTER UMA
DISTRIBUIÇÃO O MAIS
UNIFORME POSSÍVEL DE
OS MICROORGANISMOS
PRESENTES NA
MUESTRA PORÇÃO DE
AMOSTRA.
 REFERENCIA
ESTA NORMA SE COMPLEMENTA COM
O SEGUINTE: NOM-109-SSA1-1994
PROCEDIMENTOS PARA A COLETA,
MANEJO E TRANSPORTE DE AMOSTRAS
DE ALIMENTOS PARA SUA ANÁLISE
MICROBIOLÓGICO.
 DENTRO DE ESTAS
DILUIÇÕES EXISTEM
DOS VARIANTES:
DILUIÇÃO PRIMÁRIA

DILUIÇÕES DECIMAIS ADICIONAIS

 ·DILUCIÓN PRIMARIA:

OBTIDA DEPOIS DE PESAR OU MEDIR

UMA QUANTIDADE DO PRODUTO BAIXA
EXAME E MISTURÁ-LO COM UMA QUANTIDADE
DE NOVE VEZES EM PROPORÇÃO DE
DILUYENTE
 DILUIÇÕES DECIMAIS ADICIONAIS:

AS SUSPENSÕES OU SOLUÇÕES
OBTIDAS AO MISTURAR UM DETERMINADO
VOLUME DA DILUIÇÃO PRIMÁRIA COM UM
VOLUME DE NOVE VEZES UM DILUENTE E
QUE POR REPETIÇÃO DESTA OPERAÇÃO
COM CADA DILUIÇÃO ASSIM PREPARADA, SE
OBTENHA A SÉRIE DE DILUIÇÕES DECIMAIS
ADEQUADAS PARA A INOCULAÇÃO DE
MEIOS DE CULTIVO.
 CM CENTÍMETRO
MM MILÍMETRO
G GRAMAS
SÍMBOLOS E ML MILILITRO
ABREVIATURAS L LITRO
POTENCIAL DE PH
Quando nesta norma HIDROGÊNIO
faça referência aos
N NORMAL
siguientes símbolos e
abreviaturas se °C GRAU CELSIUS
entende por: % POR CENTO
H HORA
PREPARAÇÃO DE
REACTIVOS
 1 SOLUÇÃO DE HIDRÓXIDO DE
SÓDIO 1,0 N
FÓRMULA
INGREDIENTES CANTIDADES
HIDRÓXIDO DE SÓDIO 4,0 G
ÁGUA 100,0 ML
PREPARACIÓN:
DISSOLVER O HIDRÓXIDO DE SÓDIO E COMPLETAR PARA 100 ML COM ÁGUA.
 SOLUÇÕES DILUÍDAS
SOLUÇÃO REGULADORA DE FOSFATOS (SOLUÇÃO
CONCENTRADA).
FÓRMULA
INGREDIENTES CANTIDADES
FOSFATO DE SÓDIO MONOBÁSICO 34,0 G
ÁGUA 1,0 L
PREPARACIÓN:
DISSOLVER O FOSFATO EM 500 ML DE ÁGUA E AJUSTAR O pH PARA 7,2 COM
SOLUCIÓN DE HIDRÓXIDO DE SODIO 1,0 N.
LEVAR A UM LITRO COM ÁGUA
ESTERILIZAR DURANTE 15 MINUTOS A 121° ± 1,0°C
CONSERVAR EM REFRIGERAÇÃO (SOLUÇÃO CONCENTRADA)
TOMAR 1,25 ML DA SOLUÇÃO CONCENTRADA E COMPLETAR ATÉ UM LITRO COM
AGUA (SOLUCIÓN DE TRABAJO).
DISTRIBUIR EM PORÇÕES DE 99, 90 E 9 ML CONFORME NECESSÁRIO.
ESTERILIZAR A 121° ± 1,0°C DURANTE 15 MINUTOS.
DESPUÉS DE LA ESTERILIZACIÓN, EL PH Y LOS VOLÚMENES FINALES DE LA
SOLUÇÃO DE TRABALHO DEVERÁ SER IGUAL AOS INICIAIS.
PREPARAÇÃO DA ÁGUA PEPTONADA
DISSOLVER A PEPTONA E O NACL EM UM
LITRO DE ÁGUA. AJUSTAR SEU PH A 7
DISTRIBUIR EM PORÇÕES DE 9 ML.
*.LEVAR A ESTERILIZAR
*OBSERVAR QUE SEU PH E VOLUME
DEVEM COINCIDIR COM AS INICIAIS
 APARATOS E INSTRUMENTOS
*HORNO PARA ESTERILIZAR QUE ALCANCE UNA TEMPERATURA MÍNIMA
DE 170°C.
*AUTOCLAVE COM TERMÔMETRO E MANÔMETRO, CALIBRADA COM
TERMÔMETRO DE MÁXIMAS E MÍNIMAS.
BANHO DE ÁGUA COM CONTROLE DE TEMPERATURA E CIRCULAÇÃO
MECÂNICA, PROVISTA COM TERMÔMETRO CALIBRADO COM
DIVISIONES DE 0,1°C Y QUE MANTENGA LA TEMPERATURA A 45 ± 0,5°C.
LICUADORA DE UMA OU DUAS VELOCIDADES CONTROLADAS POR UM
REÓSTATO OU BEM UM HOMOGENEIZADOR PERISTÁTICO
MALHADOR
VASOS PARA LIQUIDIFICADOR COM TAMPA ESTERILIZÁVEIS OU BOLSAS
ESTÉRIL PARA HOMOGENEIZADOR PERISTÁLTICO.
*BALANÇA GRANATÁRIA COM SENSIBILIDADE DE 0,1 G.
 PROCEDIMENTO
PREPARACIÓN DE LA DILUCIÓN PRIMARIA
A PARTIR DE AMOSTRAS LÍQUIDAS:
*PARA AMOSTRAS LÍQUIDAS NÃO VISCOSAS (ÁGUA, LEITE, REFRIGERANTES, ETC.) NAS
CUALES LA DISTRIBUCIÓN DE MICROORGANISMOS ES HOMOGÉNEA O FÁCILMENTE
HOMOGENEIZÁVEL POR MEIOS MECÂNICOS (AGITAÇÃO, ETC.).
*PARA AMOSTRAS CONGELADAS DE UM ALIMENTO ORIGINALMENTE LÍQUIDO O
LICUÁVEL, FUNDIR COMPLETAMENTE EM BANHO DE ÁGUA DE 40 A 45°C POR UM TEMPO
MÁXIMO DE 15 MINUTOS E HOMOGENEIZAR AGITANDO VIGOROSAMENTE.
PARA A PARTE LÍQUIDA DE UMA AMOSTRA HETEROGÊNEA QUE SEJA
CONSIDERADA SUFICIENTEMENTE REPRESENTATIVA DA AMOSTRA TOTAL (POR
EJEMPLO LA FASE ACUOSA DE GRASAS ANIMALES Y VEGETALES).
1. AGITE A AMOSTRA MANUALMENTE COM 25 MOVIMENTOS DE CIMA PARA BAIXO EM
UM ARCO DE 30 CM EFETUADO EM UM TEMPO DE 7 SEGUNDOS. TOMAR 1 ML DA
MUESTRA E DILUA COM 9 ML DO DILUENTE QUE DEVE ESTAR A UMA
TEMPERATURA SEMELHANTE A ESTA, EVITANDO O CONTATO ENTRE A PIPETA E O
DILUENTE.
 2. SEMPRE QUE A QUANTIDADE DE AMOSTRA PERMITIR, TOMAR
ALÍQUOTAS MAIORES, POR EXEMPLO VOLUMES DE 10 OU 11 ML, DILUÍDOS
COM 90 OU 99 ML, DA MESMA FORMA QUE FOI DESCRITO ANTERIORMENTE
.*A PARTIR DE AMOSTRAS SÓLIDAS OU SEMISÓLIDAS.
*AS AMOSTRAS SÓLIDAS E SEMISÓLIDAS CONGELADAS DEVEM
DESCONGELAR NA REFRIGERAÇÃO DE 4 A 8ºC DURANTE 18 HORAS E NÃO
MÁS DE 24 HORAS ANTES DE PROCEDER A SU ANÁLISIS.
2.1 PESAR UNA CANTIDAD DE 10 U 11 G DE LA MUESTRA POR ANALIZAR EN UN
RECIPIENTE OU SACO PLÁSTICO ESTÉRIL DE TAMANHO ADEQUADO.
2.2 ADICIONAR UM VOLUME DE 90 A 99 ML DO DILUENTE LEVADO A
UMA TEMPERATURA SEMELHANTE À DA AMOSTRA.
2.3 OPERAR LA LICUADORA O EL HOMOGENEIZADOR PERISTÁLTICO DE 1
A 2 MINUTOS ATÉ OBTENHA UMA SUSPENSÃO COMPLETA E
HOMOGÊNEA SEGUNDO SE INDICAR NA TÉCNICA CORRESPONDENTE PARA
CADA ALIMENTO. AÚN EN LOS EQUIPOS MÁS LENTOS, ESTE TIEMPO NO
DEVE EXCEDER 2,5 MINUTOS.
2.4 PERMITIR QUE AS PARTÍCULAS GRANDES SE SEDIMENTEM, E TRANSFERIR
A QUANTIDADE DESEJADA TIRANDO DAS CAMADAS SUPERIORES DE
SUSPENSÃO. QUANDO A DILUIÇÃO PRIMÁRIA É MUITO VISCOSA OU PEGAJOSA,
ADICIONAR MAIS DILUENTE, O QUE DEVE SER LEVADO EM CONTA PARA AS
OPERAÇÕES SUBSEQUENTES OU EXPRESSÃO DE RESULTADOS. O
HOMOGENEIZADOR PERISTÁLTICO (STOMACHER) PODE NÃO SER ADEQUADO
PARA ALGUNOS PRODUCTOS (POR EJEMPLO, AQUELLOS CON PARTÍCULAS
AGUDAS OU CONSTITUINTES QUE NÃO SE DISSIPAM FÁCILMENTE). DEVE SER
UTILIZADO SOMENTE QUANDO HOUVER EVIDÊNCIA (PUBLICADA OU POR ENSAIOS)
COMPARATIVOS) DE QUE OS RESULTADOS OBTIDOS NÃO DIFEREM
SIGNIFICATIVAMENTE COM AQUELLOS OBTENIDOS COM LICUADORA.
[Link]ÇÃO DAS DILUIÇÕES DECIMAIS ADICIONAIS.
3.1. TRANSFERIR 1 ML OU UM MÚLTIPLO, POR EXEMPLO, 10 OU 11 ML DA DILUIÇÃO
PRIMÁRIA 1 + 9 (10-1), EM OUTRO RECIPIENTE CONTENDO NOVE VEZES O
VOLUME DO DILUENTE ESTERIL À TEMPERATURA APROPRIADA,
EVITANDO O CONTATO ENTRE A PIPETA E O DILUENTE.
 [Link] CUIDADOSAMENTE CADA BOTELLA DE DILUYENTE SIEMPRE DE
LA MISMA MANERA QUE SE DESCRIBE EN [Link].
3.3 A SELEÇÃO DAS DILUIÇÕES QUE SERÃO PREPARADAS E DE
AQUELAS QUE SE VÃO INOCULAR, DEPENDEM DO NÚMERO ESPERADO DE
MICROORGANISMOS EN LA MUESTRA, CON BASE A LOS RESULTADOS DE
ANÁLISE PRÉVIA E DAS INFORMAÇÕES QUE SE OBTERÃO DO PESSOAL DE
INSPEÇÃO QUE A TENHA COLETADO. NA TOTAL AUSÊNCIA DE
INFORMACIÓN, TRABAJAR CON LAS DILUCIONES DE LA PRIMERA A LA SEXTA.
3.4 UTILIZAR PIPETAS DIFERENTES PARA CADA DILUIÇÃO INOCULANDO
SIMULTANEAMENTE AS CAIXAS QUE FOREM SELECIONADAS. O VOLUME
QUE SE TRANSFIRA NUNCA DEVE SER MENOR QUE 10% DA CAPACIDADE
TOTAL DA PIPETA
3.5 SI LA PIPETA ES TERMINAL Y SE TRANSFIERE UN VOLUMEN DE LÍQUIDO
EQUIVALENTE À SUA CAPACIDADE TOTAL, ESCORRER APLICANDO A PONTA DE
A PIPETA UMA ÚNICA VEZ EM UMA ÁREA DA CAIXA DE PETRI SEM LÍQUIDO.
 3.6 ENQUANTO O LÍQUIDO DA PIPETA É EXPULSO, A PONTA DESSA DEVE
APOIAR-SE NO INTERIOR DO PESCOÇO DO FRASCO E MANTÊ-LO EM
POSIÇÃO VERTICAL, PARA A QUAL ESTE ÚLTIMO DEVE INCLINAR-SE
NECESSÁRIO.
*EM ESTUDOS ONDE SE BUSCA A PRESENÇA OU AUSÊNCIA DE UMA
DETERMINADA ESPÉCIE DE MICROORGANISMOS EM 0,1 ML OU 0,1 G, NÃO É
NECESSÁRIO PREPARAR DILUIÇÕES MAIORES. O CRITÉRIO PARA SELECIONAR
AS DILUIÇÕES A SEREM PREPARADAS DE ACORDO COM O NÚMERO DE
MICROORGANISMOS ESPERADO ES:
PARA A TÉCNICA DO NÚMERO MAIS PROVÁVEL UTILIZAR TRÊS TUBOS: ONDE
É POSSÍVEL DEMONSTRAR O MICROORGANISMO EM 10 ML DA DILUIÇÃO MAIS
ALTA.
PARA A TÉCNICA DE CONTAGEM EM PLACA, CONSIDERAR AQUELAS EM QUE
SE PUDEREM CONTAR DE 25 A 250 COLÔNIAS EM UM MÍNIMO DE UMA EM TRÊS
DILUIÇÕES NO MÉTODO DE CONTAGEM DE BACTÉRIAS AERÓBIAS EM PLACA. NO
O CASO DE OUTROS GRUPOS MICROBIANOS, CONSIDERAR O NÚMERO
ESPECIFICADO DE COLÔNIAS NA NORMA OFICIAL MEXICANA
CORRESPONDENTE.
 [Link]ÓN DEL PROCEDIMIENTO.
EM GERAL, AS DILUIÇÕES DA AMOSTRA DEVEM SER
PREPARADAS IMEDIATAMENTE ANTES DA ANÁLISE E ESTAS
DEVEM SER USADAS PARA INOCULAR O MEIO DE CULTIVO
DENTRO DOS 20 MINUTOS APÓS A SUA PREPARAÇÃO.
 DÚVIDAS E
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