capítulo 5 Genética Molecular
- DNA como material genético
- a estrutura dos ácidos nucleicos
- propriedades do material genético
- multiplicação semi-conservativa
DNA como material genético
O material genético deve preencher requisitos básicos:
deve ser capaz de replicação fiel – suas características estruturais
devem assegurar isso;
precisa ter um conteúdo informativo – isto é, ele deve ser capaz de
armazenar e transmitir a informação genética, geração após geração e,
também, de controlar o desenvolvimento do fenótipo do organismo (ele
deve expressar-se acuradamente);
tem de ser capaz de mudar em ocasiões raras; não obstante, sua
estrutura deve ser estável.
Como estavam os conhecimentos nessa época?
os genes – os fatores hereditários descritos por Mendel – sabidamente
estavam associados a traços específicos, mas sua natureza física não
era conhecida;
a hipótese um gene – um polipeptídio já era aceita;
os genes estavam localizados nos cromossomos;
os cromossomos são constituídos por proteínas e DNA.
Algumas evidências sugeriam que o DNA era o material genético:
a maior parte do DNA está localizada nos cromossomos, enquanto que
o RNA e as proteínas também são abundantes no citoplasma;
existe uma correlação precisa entre quantidade de DNA e o número de
cromossomos, numa célula; uma célula somática contém exatamente o
dobro da quantidade de DNA que um gameta;
a composição molecular do DNA, em todas as células de um organismo,
é a mesma, enquanto que a composição de RNA e proteínas varia
qualitativa e quantitativamente de um tipo de célula para outro.
Na primeira metade do século 20, resultados de diversos experimentos levaram
à conclusão que o DNA é o material genético.
a) transformação em pneumococos
O fenômeno da transformação foi descoberto por F. Griffith, em 1928. Ele
trabalhou com a bactéria Streptococcus pneumoniae, a qual causa pneumonia
em seres humanos e é letal em camundongos; no entanto, algumas linhagens
são menos virulentas. Griffith utilizou duas linhagens de pneumococos,
distinguíveis pela morfologia de suas colônias:
uma linhagem virulenta, com colônias de aspecto liso, por serem
envoltas por uma cápsula de polissacarídeo – ditas S;
outra linhagem não virulenta, sem a cápsula de polissacarídeo, o que
proporciona às colônias um aspecto rugoso ( ditas R).
Griffith matou algumas células virulentas por meio de fervura e injetou as
células mortas em camundongos – os camundongos sobreviveram.
Então, Griffith injetou camundongos com uma mistura de células virulentas
mortas e células não virulentas vivas; os camundongos morreram:
Além disso, células virulentas puderam ser recuperadas dos camundongos, as
quais formaram colônias lisas e eram virulentas numa injeção subsequente.
Esses resultados foram interpretados como se tivesse ocorrido a
“transformação” das linhagens não virulentas em linhagens virulentas.
Estes experimentos demonstraram a ocorrência da transformação (algum
componente da célula virulenta era capaz de modificar a linhagem receptora),
mas não trouxeram qualquer evidência sobre qual componente celular seria o
responsável por esse fenômeno.
A etapa seguinte seria determinar qual componente químico da célula doadora
morta havia causado essa transformação. Essa substância modificou o
genótipo da linhagem receptora, portanto, podia ser uma candidata para o
material genético.
b) experimento de Avery, MacLeod e McCarty
Em 1944, eles repetiram o experimento da transformação de Griffith, porém,
com componentes celulares altamente purificados, demonstrando, dessa
maneira, que o componente da célula, responsável pelo fenômeno da
transformação, era o DNA.
Eles destruíram quimicamente todas as principais categorias de substâncias
químicas em um extrato de células mortas, uma por vez, e observavam se o
extrato havia perdido a capacidade de transformação.
Como as células virulentas possuíam a cápsula de polissacarídeos, estes eram
os candidatos óbvios a serem o agente transformante. Entretanto, quando os
polissacarídeos foram destruídos, a mistura ainda podia ser transformada.
Proteínas, lipídios e RNA demonstraram todos, de modo semelhante, não
serem o agente transformante. A mistura perdeu a sua capacidade de
transformação apenas quando a mistura doadora foi tratada com a enzima
desoxirribonuclease (DNase), que fragmenta o DNA:
Esses resultados implicam fortemente o DNA como material genético.
O mecanismo celular pelo qual a transformação ocorria ainda estava longe de
ser elucidado, porém, estes experimentos estabeleceram nitidamente que a
informação genética estava presente no DNA.
c) o experimento de Hershey-Chase
Porém, ainda muitos cientistas estavam relutantes em aceitar o DNA (em vez
das proteínas) como material genético.
Evidência direta adicional de que o DNA é o material genético veio, em 1952,
com o experimento realizado por Hershey e Chase, o qual mostrou que a
informação genética de um certo vírus (bacteriófago T2) estava presente no
DNA.
O bacteriófago T2, que infecta a Escherichia coli, obrigatoriamente injeta na
bactéria as informações específicas que ditam a reprodução de novas
partículas virais.
A estrutura do T2 é bastante simples, sendo constituída de DNA contido dentro
de uma bainha proteica. Hershey e Chase decidiram marcar diferencialmente o
DNA e a proteína por meio da utilização de radioisótopos, de modo que eles
pudessem seguir essas duas substâncias durante a infecção.
O DNA contém fósforo (P), já a proteína, contém enxofre (S). Deste modo,
Hershey e Chase marcaram o DNA com o isótopo radioativo do fósforo – o P32
(no lugar do isótopo normal P31), e marcaram a proteína com o isótopo
radioativo do enxofre – S35 (no lugar do isótopo normal S32).
Quando eles misturavam partículas virais marcadas com S 35 e células de E.
coli, observaram que a radioatividade podia ser facilmente removida, pois o
material radioativo estava fora das células, indicando que a proteína não
entrava na célula bacteriana, sendo meros envoltórios estruturais. Porém,
quando eles misturavam vírus marcados com P32, a radioatividade passava
para dentro da célula, indicando que o DNA do fago entrava nas células:
RNA como material genético em pequenos vírus
À medida que outros vírus foram estudados, descobriu-se que muitos deles
continham RNA e proteínas, mas não DNA; nesses casos, a informação
genética está armazenada no RNA.
A estrutura dos ácidos nucleicos
A estrutura do DNA foi deduzida por Watson e Crick, em 1953, com base nas
seguintes evidências:
1) as estruturas básicas do DNA são 3 tipos de componentes químicos:
fosfato, o açúcar desoxirribose e 4 bases nitrogenadas – adenina,
timina, citosina e guanina:
2) quando a composição do DNA era analisada, observava-se que a
concentração de timina era sempre igual à de adenina, e a concentração
de citosina era sempre igual à de guanina. Isso era uma sugestão de
que tanto adenina e timina, quanto citosina e guanina tinham um inter-
relacionamento fixo.
a) A quantidade total de pirimidinas (T + C) sempre é igual à quantidade
total de purinas (A + G);
b) A quantidade de T = A e de C = G, mas a quantidade de A + T não
necessariamente é igual a G + C.
Essas duas evidências ficaram conhecidas como regras de Charfaff.
3) os padrões de difração de raios X aplicados em moléculas de DNA
indicavam que este era uma molécula altamente ordenada, helicoidal, de
fitas múltiplas, com unidades repetidas a cada 3,4 ângstroms (1 Å = 10-8
cm).
Então, com base nisso, Watson e Crick propuseram:
que o DNA existe como uma dupla-hélice, na qual duas cadeias
de nucleotídeos estão enoveladas uma na outra, formando uma
espiral;
as duas cadeias de nucleotídeos são mantidas ligadas entre si
através de pontes de hidrogênio entre bases específicas: adenina
sempre está pareada com timina e citosina sempre está pareada
com guanina. Isso se deve ao simples fato de pontes de
hidrogênio não serem possíveis entre outras combinações dessas
bases. Por isso, as duas fitas do DNA são ditas complementares.
Essa complementaridade é importante, pois é ela que torna o
DNA especialmente apropriado para armazenar e transmitir a
informação genética.
o arcabouço de cada filamento é formado por unidades de fosfato
e açúcar desoxirribose alternadas. Os dois filamentos têm
orientação oposta (ou antiparalela).
os pares de bases ficam empilhados uns sobre os outros no
centro da dupla-hélice – isso aumenta a estabilidade da molécula
de DNA:
Os ácidos nucléicos são macromoléculas compostas de subunidades repetidas
chamadas nucleotídeos. Cada nucleotídeo é composto de:
um grupamento fosfato;
uma pentose (açúcar com 5 carbonos)
uma base nitrogenada.
No DNA, o açúcar é a 2-desoxirribose – daí o nome de ácido
desoxirribonucleico; no RNA, o açúcar é a ribose – origem do nome ácido
ribonucleico.
No DNA encontramos 4 bases nitrogenadas: adenina, guanina, citosina e
timina; no RNA, também encontramos 4 bases: adenina, guanina, citosina e
uracila.
Adenina e guanina são bases de anel duplo, chamadas purinas; citosina, timina
e uracila são bases de anel único e são chamadas de pirimidinas.
O RNA geralmente existe como um polímero de fita simples, que é composto
por uma longa sequência de nucleotídeos. O DNA, entretanto, tem um nível
adicional de organização – normalmente é uma molécula em dupla-fita.
Multiplicação semiconservativa do DNA
As duas fitas complementares da dupla-hélice se separam, por quebra das
pontes de hidrogênio de cada par de bases e, então, cada fita paterna dirige a
síntese de uma nova fita complementar, com base na necessidade do
pareamento de bases. Ou seja, cada fita paterna serve de molde para uma
nova fita complementar:
Esse mecanismo de replicação do DNA é chamado semiconservativo, uma vez
que uma das fitas do DNA é paterna e a outra é nova.
Como resultado, temos duas duplas-hélices idênticas, o que é importante, na
divisão celular (seja ela mitose ou meiose), para que a transmissão da
informação genética seja um processo muito acurado.
o experimento de Meselson-Stahl
Publicado em 1958, veio comprovar o modelo semi-conservativo, proposto por
Watson e Crick. M.S. Meselson e F.W. Stahl cultivaram células de Escherichia
coli por muitas gerações em meio de cultura contendo N15, o isótopo pesado de
nitrogênio e, após, as transferiram para meio contendo o isótopo leve normal
N14.
Como as bases purínicas e pirimidínicas do DNA contêm nitrogênio, o DNA de
células crescidas em meio contendo N15 terá densidade maior do que o DNA
de células crescidas em meio contendo N14.
Uma vez que moléculas com densidades diferentes podem ser separadas por
centrifugação, Meselson e Stahl foram capazes de determinar o modo de
replicação do DNA seguindo as mudanças de densidade após a transferência
de meio de cultura (de meio com N15 para meio com N14).
Todo o DNA isolado de células, após uma geração de crescimento em meio
contendo N14, tinha uma densidade intermediária entre as densidades do DNA
“pesado” e do DNA “leve” – essa densidade intermediária pode ser referida
como densidade “híbrida”. Após duas gerações de crescimento em meio
contendo N14 , metade do DNA era de densidade “híbrida” e metade era “leve”: