Oncologia 2003; 26 (suplemento 6): 52–55 Versão 01

Aprovação: 15 de novembro de 2002

Implementação: 15 de novembro de 2002

SOP 12: Validação de Métodos Bioanalíticos

Contexto e Objetivos – Mudança na metodologia analítica, e

– Mudança nos procedimentos de processamento de amostras.
Um método bioanalítico é um conjunto de procedimentos envolvidos em
a coleta, processamento, armazenamento e análise de um biolo- Validação Cruzada
matriz lógica para um composto químico. A disponibilidade de Em uma validação cruzada de dois métodos bioanalíticos para o
métodos bioanalíticos seletivos e sensíveis são um pré-requisito mesmos analitos são comparados. Validações cruzadas são necessárias
site para a geração de dados confiáveis sobre farmacocinética sary quando dois ou mais métodos bioanalíticos são utilizados para
netica, biodisponibilidade e bioequivalência de medicamentos. Estes gerar dados dentro do mesmo estudo. Eles devem ser con-
os métodos devem permitir a quantificação de drogas e seus ductado com padrões de matriz espinhosa e amostras de sujeito.
metabólitos em matrizes biológicas, por exemplo, plasma, urina, e Uma validação cruzada também deve ser considerada quando
líquido cefalorraquidiano, e deve ser validado com respeito a Análises de amostras dentro de um único estudo são conduzidas em
sua confiabilidade para o uso pretendido. Método bioanalítico mais de um laboratório ou
a validação compreende todos os critérios que determinam a qualidade dos dados,
– Dados gerados usando diferentes técnicas analíticas em
como seletividade, precisão, exatidão, recuperação, sensibilidade diferentes estudos estão incluídos em uma submissão regulatória
e estabilidade. Este SOP é aplicável para a análise de pré- sion.
amostras clínicas, bem como amostras clínicas.
Uma entidade química específica e única que seria encontrada em
uma matriz biológica é chamada de analito. Parâmetros de Validação

Nesta seção, os parâmetros fundamentais para a validação

Tipos de Validação de Método a realização de um ensaio químico, por exemplo, cromatografia gasosa (CG),
cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) ou capil-
Validação Completa A eletroforese capilar (CE) é descrita. Para imunoadsorção -
Uma validação completa é necessária diz que considerações especiais devem ser levadas em conta
– Se o método for desenvolvido e implementado para (veja
o abaixo 'Considerações Especiais para Imunoensaios').
primeira vez
- Se uma nova entidade farmacêutica for analisada, ou Seletividade
– Se metabolitos forem adicionados a um ensaio existente para quantificação - A seletividade é a capacidade de um método analítico de diferenciar
ficção. identificar e quantificar em uma amostra o analito no pré-
sensibilidade de outros componentes. Para seletividade, análises de
Validação Parcial amostras em branco da respectiva matriz biológica devem ser
Uma validação parcial pode ser realizada se a bioanálise validada obtido a partir de pelo menos 6 fontes. Cada amostra em branco
métodos analíticos foram modificados. Podem variar de deve ser testado para interferência que pode originar
determinação de uma precisão e exatidão intra-dia para um a partir de componentes da matriz endógena, metabólitos, decom-
validação quase completa. Situações típicas para uma validação parcial posicionar produtos e medicamentos concomitantes.
ção são
– Transferências de métodos entre laboratórios e analistas, Precisão
– Mudanças de instrumentos e/ou plataformas de software, A precisão de um método analítico descreve a proximidade-
– Mudanças nas espécies dentro da mesma matriz, nness dos resultados médios de testes obtidos pelo método para o
– Mudanças na matriz dentro da mesma espécie, valor nominal (concentração) do analito. A precisão é

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determinado por análise replicada de amostras contendo amostra (amostra matriz com padrão interno), e 5–8
quantidades conhecidas de analito. A precisão deve ser medida em amostras não zero que cobrem a faixa esperada, incluindo
usando um mínimo de 3 concentrações e 5 determinações o LLOQ.
por concentração. O valor médio deve estar dentro de 15%. O ajuste da curva de calibração deve ser realizado aplicando
do valor nominal, exceto no limite inferior de quantificação, o modelo mais simples que descreve adequadamente a concentração
(LLOQ, veja abaixo), onde não deve haver desvio por mais relação dose-resposta usando ponderação apropriada
do que 20%. A desvio da média em relação ao nominal e testes estatísticos para bom ajuste. As seguintes condições-
o valor (erro relativo) serve como a medida de precisão. As condições devem ser atendidas ao desenvolver uma curva de calibração:
– Desvio de 15% dos padrões que não são LLOQ de
Precisão concentração nominal e
A precisão de um método analítico descreve a proximidade de... - 20% de desvio do LLOQ em relação à concentração nominal
da eficácia das medidas individuais de um analito quando o proce- tions.
dure é aplicado repetidamente a múltiplos aliquots de um único Pelo menos 4 de 6 padrões não nulos devem atender a
volume homogêneo de matriz biológica. Precisão os critérios acima, incluindo o LLOQ e a calibração
deve ser medido usando um mínimo de 3 concentrações padrão na mais alta concentração.
e 5 determinações por concentração. A imprecisão
determinado como coeficiente de variação (CV) em cada concentração - Limite Inferior de Quantificação
O nível de tração não deve exceder 15%, exceto para o LLOQ. O LLOQ é a menor concentração de um analito que...
(veja abaixo), onde não deve exceder 20%. pode ser medido com precisão e exatidão aceitáveis.
A precisão é ainda subdividida em O padrão mais baixo na curva de calibração deve ser
– Precisão dentro do dia, que avalia a precisão durante um limite inferior de quantificação (LLOQ) aceito se as seguintes condições forem atendidas:

execução analítica única, e A resposta do analito deve ser pelo menos 5 vezes a re-
– Precisão entre dias, que mede a precisão com resposta em comparação com resposta em branco.
tempo, e pode envolver diferentes analistas, equipamentos, re- A resposta do analito deve ser reprodutível com um im-
agentes e laboratórios. precisão de no máximo 20% e uma precisão de 80–120%.

Recuperação Estabilidade
A recuperação de um analito é a resposta do detector ob- A estabilidade do analito na matriz biológica em
obtido a partir de uma quantidade do analito adicionada e ex- As temperaturas de armazenamento recomendadas devem ser estabelecidas. Mais-

extraído da matriz biológica, comparado ao detec- a estabilidade deve ser investigada em temperatura ambiente
resposta do tor obtida para a concentração nominal do temperatura ao longo de um período de tempo que abrange a duração
pure authentic standard. Recovery experiments should be de preparação típica de amostras, manipulação de amostras e análise
realizado ao comparar os resultados analíticos para ex- tempo de execução tático. O procedimento também deve incluir um eva-
amostras extraídas em três concentrações com não extraído avaliação da estabilidade do analito na solução estoque por pelo menos 6 horas.
padrões que representam 100% de recuperação. Recuperação do A influência dos ciclos de congelamento/descongelamento deve ser estudada - em

o analito não precisa ser 100%, mas a extensão da recuperação de um pelo menos 3 ciclos em 2 concentrações em triplicado.
o analito e um padrão interno devem ser consistentes, pré- Todas as determinações de estabilidade devem usar um conjunto de amostras pré-

preciso e reproduzível. preparado a partir de uma solução estoque recém-fabricada do analito em

a matriz biológica apropriada, livre de interferências.
Curva de Calibração
A relação entre o valor da resposta experimental
Validation Report
e concentrações conhecidas do analito é referido como
curva de calibração. Uma curva de calibração deve ser preparada
Uma descrição específica e detalhada do método bioanalítico
na mesma matriz biológica que as amostras no
od, os experimentos de validação e os resultados da validação
estudo tendido ao picar a matriz com concentrações conhecidas
será escrito na forma de um relatório pelo laboratório re-
ações do analito. Caso não haja blank suficiente responsável pela análise de drogas. O relatório de validação abrange tudo
exemplo disponível, por exemplo, do líquido cefalorraquidiano, um apro-
parâmetros de validação descritos em 'Parâmetros de Validação'.
a matriz de calibração privada deve ser selecionada, por exemplo, 0,9%
NaCl, e a resposta obtida de ambas as matrizes
deve ser comparado. Análise de Drogas de Rotina
A concentração dos padrões deve ser escolhida com base
da faixa de concentração esperada em um estudo particular. Esta seção descreve os parâmetros de validação que
Uma curva de calibração deve consistir em uma amostra em branco (ma- deve ser avaliada durante a aplicação rotineira de um va-
amostra de trix processada sem padrão interno), um método bioanalítico datado de zero para um estudo específico.

SOP 12: Validação de Métodos Bioanalíticos Oncologia 2003; 26 (suplemento 6): 52–55 53
Após uma validação bem-sucedida, análise da Seletividade biológica
amostras podem ser feitas por determinação única. A necessidade Quanto aos ensaios químicos, os imunoensaios devem ser demonstrados para
A análise de duplicatas pode surgir em casos especiais, por exemplo, para ser seletivo para o analito. Dois tipos de seletividade têm
analitos lábeis, quando as tolerâncias de precisão e exatidão devem ser consideradas:
difícil de alcançar. Nesse caso, uma justificativa para duplicidade –‘Especificidade’ não seletiva (interferência de compostos
a análise deve ser desenvolvida a priori. que são fisicoquimicamente semelhantes ao analito), por exemplo.
cross-reatividade de metabólitos, medicação concomitante
Adequação do Sistema ou compostos endógenos:
Com base no analito e na técnica, um sistema específico se adequa. Se possível, o imunoensaio deve ser comparado com
o teste de habilidade ou amostra deve ser identificado para assegurar a um método de referência validado, por exemplo, HPLC, usando estudo
operação óptima do sistema empregado. amostras.
Não seletividade 'não específica' (interferência da matriz
Calibração components):
Uma curva de calibração baseada em matriz deve ser gerada para As curvas de calibração em fluidos biológicos devem ser com-
cada corrida e deve ser usado para calcular o analito comparado com aqueles no buffer para detectar matriz
concentração nas amostras desconhecidas analisadas com isso efeitos.
corra.
É importante usar uma curva de calibração que cubra o Precisão e Exatidão
toda a gama de concentrações nas amostras desconhecidas. Critérios para precisão e exatidão de imunodosagens
Estimativa de incógnitas por extrapolações abaixo do deve corresponder aos de ensaios químicos. Tanto o limite superior de
LLOQ ou acima do limite superior não é aceitável. Em- a quantificação, bem como o LLOQ, deve ser definido por aceitação
em vez disso, a curva de calibração deve ser redeterminada ou precisão e exatidão da tabela.
as amostras devem ser reanalisadas após a diluição com o ma-
trix.
Recuperação
Amostras de Controle de Qualidade Se a separação for empregada antes da análise de amostras de estudo
Amostras de controle de qualidade (QC) duplicadas, no mínimo, 3 mas não para padrões, é necessário avaliar a eficiência
concentrações (uma dentro de 3 Â do LLOQ, uma em e a reprodutibilidade da recuperação e o uso da recuperação em deter-
média, e uma se aproximando da extremidade alta da faixa) resultados de mineração.

deve ser incorporado em cada corrida. Deve haver um

mínimo de 5% de QCs em relação ao número de amostras em Curva de Calibração
uma corrida ou 6 amostras de QC totais, o que for maior. As curvas de calibração de imunoensaios são essencialmente não-
linear e, em geral, requerem mais pontos de concentração para
Critérios de Aceitação define the fit than do chemical assays. A minimum of 6 non-
Os resultados das amostras de QC fornecem a base para ac- Concentrações do calibrador zero, executadas em duplicata, são necessárias.
aceitando ou rejeitando uma corrida. Pelo menos 67% (4 em 6) do
As amostras de QC devem estar dentro de 15% de suas respectivas nom- Análise de Drogas de Rotina
valores finais. 33% das amostras de QC (mas não todas as réplicas Devido à maior imprecisão inerente aos imunoadsorventes.
Critérios de aceitação de amostras de QC na implementação de ensaios de rotina
na mesma concentração) pode estar fora dos 15%
faixa do valor nominal. A precisão é de 25%. Assim, pelo menos 67% do QC
as amostras devem estar dentro de ±25% de seus valores nominais,
Análise de Repetição com não mais que 2 no mesmo nível de concentração ex-
Uma diretriz para análise repetida deve ser estabelecida cedendo 25% dos valores nominais.
Prioritário. Razões antecipadas para repetir a análise devem ser
definidos, por exemplo, erros de processamento de amostras, falha de equipamento,

cromatografia pobre. A justificativa para a análise repetida Documentação e Arquivamento de Dados Analíticos
deve ser claramente documentado.
Os dados gerados para o estabelecimento de métodos bioanalíticos
e os QCs devem ser documentados e disponíveis para dados
Considerações Especiais para Imunoensaios auditoria e inspeção. Em particular, a documentação deve
comprise
A maioria dos parâmetros e princípios de validação bioanalítica – Uma descrição operacional do método analítico,
as menções acima também se aplicam a imunoas- – Evidência de pureza e identidade dos padrões de drogas, eu-
diz. No entanto, existem algumas diferenças específicas que padrões de tabolite e padrões internos usados na vali-
são descritos nesta seção. dation experiments and routine analysis,

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EnsaiosdoCESARnaEuropaCentral
Sociedade para Pesquisa de Drogas Anticancerígenas – EWIV
 – Motivos para amostras ausentes,
– Todos os relatórios de validação completos, parciais e cruzados disponíveis
(veja 'Relatório de Validação') – Documentação para análises repetidas, incluindo a inicial
–Cromatogramas, eletroferogramas ou espectrometria de massa típicos e repetir os resultados da análise, o resultado relatado, e o
espectrogramas, se aplicável, razão para a análise repetida,
– Tabelas resumo contendo informações sobre amostras pro- – Documentação para dados reintegrados, incluindo o inicial
processamento e armazenamento, incluindo identificação de amostras, col- e repetir os resultados da integração, o método usado para re-
datas de eleição, armazenamento antes do envio, informações sobre
integração, o resultado reportado e a razão para o
lote de remessa e armazenamento antes da análise reintegração.
– Tabelas resumo de execuções analíticas clínicas e pré-clínicas. Os documentos devem ser arquivados por no mínimo
amostras nicais, incluindo identificação de execução do ensaio, data 10 anos.
e tempo de análise, método de ensaio, analistas, início e
paradas, duração, equipamentos e materiais significativos
mudanças, e qualquer problema ou desvio potencial de References
método estabelecido Kromidas S: Manual de Validação na Análise. Weinheim, VCH, 2000.
– Tabelas resumo dos dados da curva de calibração, Departamento de Saúde e Serviços Humanos dos EUA, FDA, CDER e CVM:
– Informações resumidas sobre os dados de QC utilizados para aceitação Orientações para a Indústria: Validação de Métodos Bioanalíticos, 2001.
Shah VP, Midha KK, Dighe S, et al: Validação de métodos analíticos: Bioa-
a execução analítica, disponibilidade, bioequivalência e estudos farmacocinéticos. Pharm Res 1992;9:
- Tabelas de dados de execuções analíticas de ensaios clínicos e pré-clínicos 588–592.
amostras de calibragem, incluindo identificação de execução de ensaio, amostra Shah VP, Midha KK, Findlay JWA, et al: Validação de método bioanalítico –
uma reavaliação com uma década de progresso. Pharm Res 2000;17:1551–1557.
identificação e dados brutos
– Cromatogramas seriados completos de 5–20% de sub-
objetos com calibração e amostras de QC daqueles ana-
execuções lyticais,

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