Hipótese: A concentração de oxigénio na amostra de água de uma poça intertidal
determina a abundância relativa de microrganismos aeróbios versus anaeróbios: amostras
com maior exposição ao ar apresentarão maiores contagens em PCA por spread plating
(aeróbios), enquanto amostras com menor troca gasosa (sedimentos anóxicos) revelarão
maior recuperação de anaeróbios quando processadas com verter meio fundido e
incubação em condições de anaerobiose.
Material
• 11 tubos inoculados com 9 ml de ASW (artificial seawater) (10 + controlo de
esterilidade)
• Suportes para tubos de ensaio
• 22 placas de Petri de meio PCA em camada fina solidificado no interior
• 11 placas de Petri meio MA em camada fina solidificado no interior
• 500 ml meio PCA fundido
• 35 espalhadores estéreis
• Estufa a 18ºC
• Agitador (vortex)
• Bico de gás
• Micropipeta de volume variável para pipetar 1000 µl
• Micropipeta de volume variável para pipetar 100 µl
• Pontas estéreis para as micropipetas
• Jarra de anaerobiose
• Saquetas anaerocult auri Merk
• Frasco falcon estéril
1) Recolha de amostra:
Feita em condições de assepsia com um falcon estéril, deve ficar refrigerada até ao
momento de análise. O frasco é aberto dentro da água.
Durante a maré baixa recolher água de uma poça intertidal com o uso de um frasco falcon
esteril, enchendo-o quase completamente (para preservar o estado de O2).
Etiquetar com local, data, hora e replicado.
2) Diluições em Série
1. Acender o bico de gás.
2. Marcar 11 tubos de ensaio com o fator de diluição respetiva, no 11º tubo escrever
CE (controlo de esterilidade).
3. Agitar vigorosamente a solução-mãe antes de retirar o inócuo.
4. Transferir 1 mL da solução-mãe para o primeiro tubo (diluição 10⁻¹) e agitar
novamente vigorosamente o tubo 1.
5. Proceder de igual forma até à diluição 10−10, no tubo CE não adicionar amostra.
6. Marcar placas de Petri com respetivas diluições, método, meio e estado de
anaerobiose/aerobiose.
3) Plaqueamento à Superfície (Aeróbios)
1. Identificar 11 placas de Petri com meio PCA no interior, 11 placas com meio MA no
interior, 9 provenientes das diluições em série, 1 do controlo de esterilidade (CE) e 1
da suspensão-mãe (fator de diluição -1), para ambos os meios.
2. Agitar o tubo 10 (fator de diluição 10-10) no agitador.
3. Pipetar 0,1 ml do tubo 10 para o centro de uma placa (esta placa será relativa ao
fator de diluição 10-10).
4. Proceder da mesma forma para os restantes tubos, de 10 a 1 (por esta ordem).
Utilizar a mesma ponta para os restantes tubos, se usar a ordem do tubo 10 para o
1, e se a ponta desta não tocar nenhum objeto.
5. Agitar a suspensão-mãe. Pipetar 0,1 ml da mesma para o centro da placa
assinalada com a diluição -1.
6. Agitar o controlo de esterilidade. Pipetar 0,1 ml do tubo para o centro da placa
assinalada com CE.
7. Segurar a placa firmemente. Com um espalhador estéril espalhar (em movimentos
circulares) o inoculo sobre o meio sem tocar na placa de Petri.
8. Incubar em estufa a 18ºC durante uma semana, em posição invertida.
9. Repetir o procedimento para as placas com meio MA no interior.
10. Observar as placas e contar o número de ufc de cada placa. Deve-se contar apenas
as placas que apresentem entre 15 a 300 ufc.
4) Plaqueamento à Superfície (Anaeróbios)
1. Identificar 11 placas de Petri com meio PCA no interior, 9 provenientes das
diluições em série, 1 do controlo de esterilidade (CE) e 1 da suspensão-mãe (fator
de diluição -1).
2. Agitar o tubo 10 (fator de diluição 10-10) no agitador.
3. Pipetar 0,1 ml do tubo 10 para o centro de uma placa (esta placa será relativa ao
fator de diluição 10-10).
4. Proceder da mesma forma para os restantes tubos, de 10 a 1 (por esta ordem).
Utilizar a mesma ponta para os restantes tubos, se usar a ordem do tubo 10 para o
1, e se a ponta desta não tocar nenhum objeto.
5. Agitar a suspensão-mãe. Pipetar 0,1 ml da mesma para o centro da placa
assinalada com a diluição -1.
6. Agitar o controlo de esterilidade. Pipetar 0,1 ml do tubo para o centro da placa
assinalada com CE.
7. Segurar a placa firmemente. Com um espalhador estéril espalhar (em movimentos
circulares) o inoculo sobre o meio sem tocar na placa de Petri.
8. Verter PCA fundido para a placa de Petri de modo a minimizar o headspace
(minimiza as trocas gasosas).
9. Colocar as placas de Petri, invertidas, na jarra de anaerobiose, com as saquetas
(anaerocult auri Merk).
10. Colocar a jarra de anaerobiose, com as placas, na estufa a 18ºC durante uma
semana.
11. Observar as placas e contar o número de ufc de cada placa. Deve-se contar apenas
as placas que apresentem entre 15 a 300 ufc.