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An Acad Bras Cienc (2024) 96(4): e20231370 DOI 10.1590/0001-3765202420231370

Anais da Academia Brasileira de Ciências | Anais da Academia Brasileira de Ciências
ISSN impresso 0001-3765 e ISSN online 1678-2690
[Link]/aabc | [Link]/aabcjournal

MICROBIOLOGIA

Abordagem da fase de vapor do óleo

essencial para avaliação
antimicrobiana usando Hesperozygis
myrtoides (A. St.-Hill. ex Benth.) Epling (Lamiaceae) como mode

MARCOS AURÉLIO A. PEREIRA, ADILSON SARTORATTO, CRISTINA MAIRA TS

MIGUEL, CÍNTHIA MURAKAMI, FABIANA L. SILVA, INÊS CORDEIRO, KAMILLA N.
MACHADO, MARIA CLÁUDIA M. YOUNG, TELMA MARIA KANEKO, PATRÍCIA S.
LOPES & PAULO ROBERTO H. MORENO

Resumo: A demanda por desinfetantes de superfície menos perigosos e ecologicamente corretos está
crescendo, e os óleos essenciais podem ser alternativas eficientes. O ensaio em fase de vapor é uma
técnica promissora que explora a volatilidade dos óleos essenciais para determinar a atividade
antimicrobiana. Neste estudo, modificamos as condições da técnica da placa de Petri invertida para avaliar
as concentrações inibitórias mínimas (CIM).
Como prova de conceito, a atividade antimicrobiana do óleo essencial (HM) de Hesperozygis myrtoides foi
estudada pela primeira vez na fase de vapor. De acordo com o protocolo estabelecido, a dinâmica de
volatilização do óleo foi usada para determinar os compostos majoritários na fase de vapor. Após 270 min,
a porcentagem relativa foi semelhante à observada na análise do óleo bruto. O HM também foi avaliado
quanto à segurança (IC50 = 921,2 µg ml-1), sendo considerado seguro em caso de exposição oral aguda.
Os vapores de óleo inibiram completamente o crescimento de Staphylococcus aureus (MIC = 0,39 mg l-1),
Candida albicans (MIC = 0,83 mg l-1), Aspergillus brasiliensis (MIC = 378 mg l-1) e Bacillus subtilis (MIC =
704,8 mg l-1).
Este protocolo oferece uma alternativa econômica e eficiente para determinação da atividade antimicrobiana
e segurança de óleos essenciais, podendo ser utilizado para avaliação de diversas aplicações de óleos
essenciais, como agente desinfetante em ambientes habitados.

Palavras-chave: atividade antimicrobiana, citotoxicidade para dispersão de óleo essencial, método da

placa de Petri invertida, dinâmica de vaporização.

INTRODUÇÃO bem como fungos, leveduras e vírus (Scott et al.

2020). Embora produtos convencionais, como água sanitária,
Nos últimos anos, tem havido um consenso crescente de
sejam amplamente utilizados como sanitizantes, a busca
que a limpeza e a desinfecção de superfícies em ambientes
por novos desinfetantes que sejam menos perigosos e
comuns são importantes para prevenir a propagação de
ecologicamente corretos está crescendo (Goodyear et al.
infecções. Infecções comunitárias têm um forte impacto nas
2015).
populações mais frágeis, como crianças, idosos e
Os óleos essenciais apresentam uma gama reconhecida
imunossuprimidos. Alguns patógenos potenciais incluem
de atividades antimicrobianas contra bactérias, Gram-
Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa e
negativas e Gram-positivas, e fungos patogênicos (Powers
coliformes fecais.
et al., 2019). Alguns estudos in vitro são realizados com
óleos essenciais em meio líquido.

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MARCOS AURÉLIO A. PEREIRA et al. ABORDAGEM DA FASE DE VAPOR DO ÓLEO ESSENCIAL

fase volátil, mas sua aplicação como sanitizante líquido acompanhado por volatilização dinâmica e ensaio de
requer grandes quantidades. Por outro lado, o uso do óleo citotoxicidade para dispersão de óleo essencial.
essencial em sua fase vapor, aplicado como fumigante, Em nossa investigação, verificamos a adequação do
oferece vantagens, como a possibilidade de atingir áreas nosso método para avaliar óleos essenciais na fase de
de difícil acesso pela limpeza manual, maior potência vapor utilizando o óleo essencial de Hesperozygis myrtoides
antimicrobiana, uma vez que os componentes volatilizados (St. Hill. Ex Benth.), uma espécie nativa brasileira. Este óleo
possuem livre ligação aos microrganismos, e menor essencial em particular foi escolhido devido à sua atividade
quantidade de óleo utilizado, reduzindo o custo de sua demonstrada contra um espectro de microrganismos,
utilização (Reyes-Jurado et al., 2020). incluindo leveduras e bactérias gram-negativas e gram-
positivas, como Candida albicans, Escherichia coli e
Muitos estudos exploraram a volatilidade dos óleos Staphylococcus aureus (Martini et al., 2011).
essenciais para desenvolver métodos de determinação da
atividade antimicrobiana, com base na criação de uma
atmosfera controlada. Alguns deles utilizam placa de Petri
invertida (Kloucek et al., 2012a), vapor de ágar (Inouye et
MATERIAIS E MÉTODOS
al., 2006), aparato de vidro ou plástico com atmosfera de
Produtos químicos
óleo essencial (Szczerbanik et al., 2007), microplaca com
óleo essencial dissolvido (Feyaerts et al., 2017), caixa Os solventes analíticos foram adquiridos da Synth (Brasil) e

hermética e suas variações (Amat et al., 2017, Inouye et al., da Merck (Alemanha). Outros reagentes como (3-(4,5-

2001), permitindo que os componentes voláteis do óleo dimetiltiazol-2-il)-5-(3-

sejam liberados e entrem em contato direto com a parede Os meios de cultura para microrganismos

dos microrganismos. (carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-sal interno de

tetrazólio)/fenazina metossulfato (MTS/PMS) foram obtidos

No entanto, a maioria desses ensaios determina o da Sigma-Aldrich (EUA). Os meios de cultura para

potencial antimicrobiano relativo; é impossível comparar os microrganismos foram adquiridos da Difco (EUA) e o Meio

resultados devido às variações dentro de cada técnica Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM), soro fetal bovino

aplicada; uso de diferentes unidades de medida de e glutamina para culturas celulares foram adquiridos da

concentrações inibitórias mínimas (CIM), quando o cálculo Sigma-Aldrich (EUA). Os antibióticos nistatina e cloranfenicol

é permitido, mostrando uma uniformidade limitada nos foram adquiridos da USP (EUA), amicacina e doxorrubicina

critérios metodológicos adotados para o estudo dessa da Sigma-Aldrich (EUA), ciprofloxacino e tetraciclina da

atividade (Amat et al. 2017, Reyes-Jurado et al. 2020) e, em Galena (Brasil).

muitos casos, o uso de dispositivos de difícil acesso. Por

isso, é necessário modificar a metodologia de teste, tornando-
Extração de material vegetal e óleo essencial
a reprodutível e viável.
Hesperozygis myrtoides foi coletada em novembro de 2013,
em Campos do Jordão, São Paulo, Brasil (22°42'52,8” S,
45°27'42,7” W) (SISBIO nº 2371522). A identificação
Desenvolver uma abordagem eficaz que possa ser
usada para avaliar óleos essenciais para desinfecção de botânica foi confirmada pela Dra. Inês Cordeiro e o voucher
foi depositado no herbário do Instituto de Botânica, São
ambientes habitados, projetamos um método baseado na
Paulo, Brasil com número de referência PEREIRA 02. Este
placa de Petri invertida para determinação simples, rápida
estudo está registrado no
e de baixo custo do potencial antimicrobiano de óleos
voláteis na fase de vapor

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Plataforma SisGen de acesso ao patrimônio genético (número prato (0,054 l). O balão foi mantido a 37 °C e os produtos de
de registro AF1FF34), em conformidade com a Lei da evaporação foram coletados (1,0 ml) com uma seringa Gastight
Biodiversidade Brasileira (13.123/2015). (Hamilton, EUA) em 30, 90, 150, 210 e 270 min e injetados no
O óleo essencial (LH) foi extraído das folhas por cromatógrafo. A temperatura da coluna foi inicialmente mantida
hidrodestilação durante 4 h, em aparelho tipo Clevenger, em a 60 °C e, em seguida, posteriormente aumentada para 240 °C
quadruplicata, e armazenado a -22 °C. O rendimento foi a 3 °C min-1; as temperaturas de injeção e detecção foram de
calculado com base no peso seco da planta. 220 °C e 209 °C, respectivamente; ionização de elétrons: 70
eV; o gás de arraste utilizado foi o hélio (vazão de 1 ml min-1).
A identificação dos compostos foi realizada comparando os
Análise por cromatografia gasosa/espectrometria
índices de retenção e espectros de massa com dados
de massa (GC/MS)
encontrados na literatura.
A composição química do HM (diluído em acetona 1:99, v/v) foi
determinada por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria
de massas realizada em GC Agilent série 6890 (Agilent, EUA)
interligado a um detector MS quadrupolo série 5973 (Agilent, Culturas de células BALB/3T3 clone A31 de fibroblastos
embrionários de camundongo
EUA), equipado com uma coluna DB-5 (30 x 0,25 mm id x 0,25
µm (Agilent, EUA). Volume de injeção de 1,0 µl. O tempo de A linhagem celular BALB/3T3 clone A31 (ATCC CCL-163) foi
varredura foi de 0,1 varredura/seg e a faixa de massa m/ z cultivada em meio DMEM suplementado com 10% de soro fetal
35-500. O hélio foi o gás de arraste (vazão de 1 ml min-1). A bovino (v/v), 4 mmol l-1
temperatura da coluna foi inicialmente mantida a 40°C por 1 glutamina e 100 U ml-1 penicilina, 100 mg ml-1
min e posteriormente aumentada para 240°C a 3°C min-1, estreptomicina e 0,025 mg ml-1 de anfotericina (codificada
mantendo-a nessa temperatura por 10 min; temperatura de como meio DM10). As células foram incubadas a 37 °C sob
injeção e detecção: 250 °C, ionização de elétrons: 70 eV. Os atmosfera de 5% de CO2 em atmosfera umidificada até atingir
componentes foram identificados pela comparação de índices a subconfluência (aproximadamente 80%). O descolamento
de retenção (calculados em relação aos n-alcanos C5 -C28 na celular foi realizado com tripsina 0,05% (p/v)/EDTA 0,02% (p/v)
coluna DB-5) e espectros de massa avaliados por análise com em tampão fosfato pH 7,2. A suspensão celular foi centrifugada,
aqueles relatados na literatura, busca em biblioteca baseada o sobrenadante descartado e o pellet suspenso em meio DM10.

em software e interpretação visual dos espectros de massa

(Adams 2007, NIST 2019).

Ensaio de citotoxicidade

O efeito citotóxico do HM foi medido utilizando o ensaio MTS

Análise GC-MS do Headspace (ICCVAM 2006). O HM diluído em DMSO-DM10 foi avaliado
Os compostos voláteis do espaço livre do HM foram obtidos em concentrações seriadas em poços (14,75 a 0,15 mg

utilizando um cromatógrafo gasoso Agilent 6890 Series GC ml-1, p/v).

(Agilent, EUA) interligado a um detector MS quadrupolo série Resumidamente, as células foram semeadas (2x104 células/
5973 (Agilent, EUA), equipado com uma coluna CP 8944 poço) em placas de 96 poços e incubadas por 24 h. Em
VF-5ms (30 m x 0,25 mm x 0,25 µm, Agilent). Neste método, 7 seguida, 50 µl da diluição de HM foram adicionados a cada
µl (6,3 µg) de HM foram adicionados a um balão selado de poço, mais 50 µl de DM10. Após 24 h de incubação, o meio
0,062 l, com volume de espaço livre semelhante ao de uma de cultura foi removido. As células foram lavadas com

placa de Petri. solução de NaCl (0,9%, p/v) e 100 µl de

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MTS/PMS foi adicionado e incubado durante 3 h. em caldo Sabouraud dextrose (SDB) por 48h e 96h,
Após esse período, o sobrenadante foi removido, as respectivamente. Todas as culturas bacterianas foram
células foram novamente lavadas com solução salina incubadas a 37°C por 24h em caldo tríptico de soja
e 150 µl de solução de dessorção (ácido acético-água- (TSB). Uma alíquota de cada cultura foi espalhada em
etanol, 1:49:50, v/v/v) foram adicionados. O DMSO na ágar nutriente (ágar Sabouraud dextrose, SDA, para
concentração máxima utilizada no poço (4,67 mg mL-1, fungos; ágar tríptico de soja, TSA, para bactérias).
p/v) não afetou a viabilidade celular. O controle positivo Uma única colônia de cada placa foi suspensa em
foi administrado com doxorrubicina. Todos os testes solução salina (0,85%, m/v). A densidade celular foi
foram realizados em triplicata. estimada comparando a turbidez com uma solução de
A absorbância foi lida a 490 nm sulfato de bário de acordo com a escala de McFarland
(Biotek Synergy HT, EUA). As curvas dose-resposta (Garzoli et al. 2021). A densidade óptica do tubo na
de viabilidade celular foram determinadas e o IC10 escala 0,5 McFarland foi comparada à densidade óptica
e os valores de IC50 foram calculados. Os valores de IC50 medida a 630 nm para a suspensão de microrganismos
foram usados para determinar a dose letal média (espectrofotômetro Micronal, EUA) e o valor foi
(LD50), de acordo com a seguinte equação 3 estimado em 1,5 x 108 unidades formadoras de
(ICCVAM 2001, 2006): colônias (UFC ml-1). Para A. brasiliensis, foram
utilizados três tubos inclinados lavados com solução
Equação 3: log LD50 (mg kg-1) = 0,372 x log IC50
salina estéril 0,85% (m/v) contendo 1% (m/v) de
(mg ml-1) + 2,2014
polissorbato 80, para evitar agregação dos esporos.
Com base na DL50, a toxicidade foi estimada Diluições seriadas foram feitas com todos os
utilizando a classificação por categorias estabelecida microrganismos para obter concentrações de 1,5 x 108
pelo Sistema Globalmente Harmonizado (GSH) das a 1,5 x 102 UFC ml-1. Ao final de cada padronização,

Nações Unidas para as quais as categorias 1 (DL50 < a diluição microbiana foi confirmada por UFC no
5 mg kg-1 ) e 2 (DL50 5 - 50 mg kg-1) são fatais se nutriente do ágar.
ingeridas; a categoria 3 (DL50 50 - 300 mg kg-1) é
Concentração inibitória mínima (CIM) no método
tóxica se ingerida; a categoria 4 (DL50 300 - 2000 mg
de microdiluição em caldo (fase líquida)
kg-1) é perigosa se ingerida; a categoria 5 (DL50 >
O ensaio antimicrobiano foi avaliado pelo método de
5000 mg kg-1) não é classificada (Bulgheroni et al.
microdiluição em caldo (Moreno et al. 2009).
2009).
O inóculo foi preparado ajustando-se a concentração
Culturas microbianas final para 1,5 × 103 UFC ml-1 em cada poço da placa

Os testes foram realizados com seis cepas de de 96 poços. O HM foi diluído em DMSO-metanol (1:1,
microrganismos recomendadas para testes de v/v) para obter uma concentração final no ensaio de
desinfecção de superfícies (USP 2014). As espécies 151.000-19 mg l-1. As microplacas foram incubadas a
fúngicas foram o fungo filamentoso Aspergillus 28 °C por 48 h para a levedura, a 28 °C por 96 h para
brasiliensis (ATCC 16404) e a levedura Candida o fungo e a 37 °C por 24 h para a bactéria. A inibição
albicans (ATCC 10231). As bactérias Gram-positivas do crescimento foi medida pela leitura da absorbância
incluíram S. aureus (ATCC 6538) e Bacillus subtillis em um comprimento de onda de 630 nm, usando um
(ATCC 6633). Pseudomonas aeruginosa espectrofotômetro de varredura multipoços (Biotek,
(ATCC 9027) e Escherichia coli (ATCC 8739) foram as Synergy HT Multi-Mode, EUA); exceto para A.
bactérias Gram-negativas testadas. C. albicans brasiliensis, onde o crescimento foi avaliado apenas
e culturas de A. brasiliensis foram cultivadas a 28°C visualmente.

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em todos os ensaios, nistatina, cloranfenicol, amicacina, perda (dados não mostrados). As placas foram fechadas
ciprofloxacino e tetraciclina foram usados como controles com os fundos inoculados e seladas com

positivos em concentrações de 50 µg ml-1 Parafilm® para evitar a perda de umidade. As placas foram
nos poços da microplaca. Todos os testes foram realizados colocadas dentro de um cilindro de aço inoxidável,
em triplicata. previamente desinfetado com etanol 70% (Fig.
A menor concentração de HM que 1). As placas foram incubadas seguindo o mesmo tempo e
não resultou em crescimento microbiano foi considerado temperatura utilizados no método de microdiluição em caldo.
como concentração inibitória mínima (CIM). A inibição do crescimento foi determinada pela contagem
Diluições de HM sem crescimento detectável na microplaca de UFC de cada placa. Os brancos foram preparados
foram transferidas para nutriente de ágar e incubadas para adicionando 500 µl de acetato de etila ao papel de filtro e a
determinar a menor concentração letal (concentração incubação foi realizada em uma incubadora exclusiva.
bactericida/fungicida mínima, MBC/MFC). A categoria de Todos os testes foram
atividade antimicrobiana de HM para superfícies foi realizado em triplicado.
determinada com base na classificação proposta por Djabou A concentração de HM (em mg l-1) no headspace da
et al. (2013), onde o valor de MIC entre 50.000 e 25.000 mg placa de Petri, responsável pela inibição do crescimento, foi
l-1 é considerado não ativo; moderadamente ativo para calculada em função do seu volume de expansão. Para
valores de MIC entre 12.500 e 3.000 mg l-1; ativo para tanto, determinou-se inicialmente o volume total da placa de
valores de MIC entre 2.000 e 400 mg l-1; e extremamente Petri (Vt , em cm3 ) (Equação 1), sendo este volume
ativo para valores de MIC ÿ 200 mg l-1 . descontado do meio de cultura (Vcm, em cm3 ) (Equação 2):

Concentração inibitória mínima (CIM) pelo método do Equação 1: Vt = hx ÿ x r2

prato invertido (fase de vapor)

O método da fase de vapor foi adaptado da literatura Equação 2: Ve = Vt - Vcm

(Kloucek et al. 2012a, b).
Onde Vt = volume total da placa de Petri (cm3 ), Ve =
O teste foi desenvolvido em placas de Petri (ø 85 mm)
volume da área de expansão (cm3 ou l), Vcm = volume do
contendo 20 ml de meio apropriado (SDA para fungos e
meio de cultura (20 cm3 ), r = diâmetro (8,5 cm), h = altura
TSA para bactérias) previamente inoculado com uma
(1,3 cm), ÿ = 3,14.
suspensão salina de microrganismos com densidade celular Os valores de MIC foram considerados HM
entre 2,5 - 3,5 ×102 UFC ml-1 .
concentrações nas quais não foi detectado crescimento
microbiano aparente nas placas (CLSI/NCCLS 2018). As
O HM foi diluído em acetato de etila em concentrações
placas sem colônias foram abertas em fluxo laminar por 5
seriadas. 500 µl de cada concentração de HM foram min (eliminação do vapor residual do óleo essencial) e
distribuídos na superfície de um papel de filtro branco estéril
incubadas novamente. A menor concentração sem
(diâmetro interno 80 mm) por micropipeta, colocado sobre a
crescimento de cada microrganismo foi considerada como
tampa de uma placa de Petri (método da placa invertida).
MBC/
Para a remoção total do acetato de etila, o solvente pôde
Valor de MFC. Solução aquosa de formaldeído, na
evaporar por 1 min (tempo padronizado). Usando este
concentração de 1 mg l-1, foi utilizada como controle positivo
procedimento, o acetato de etila não teve efeito sobre a
devido à sua reconhecida atividade fumigante.
viabilidade de nenhum dos microrganismos testados e não
houve alteração significativa do HM.

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Figura 1. Representação esquemática do ensaio antimicrobiano em fase de vapor. O experimento modelo consiste em 1.
Placa de Petri (ø 85 mm) contendo 20 ml de meio de cultura inoculado com o microrganismo desejado (método
da placa de pour); 2. Papel de filtro estéril (ø 80 mm) impregnado com óleo essencial; 3. Placa invertida, com
área livre para expansão do óleo de 0,054 l; 4. Cilindro de aço inoxidável contendo a triplicata das amostras
para cada microrganismo na concentração testada (tratamento) e o branco.

RESULTADOS E DISCUSSÃO Dinâmica de volatilização: A

A composição do óleo eficácia da técnica da fase de vapor é consequência da

essencial HM apresentou um rendimento médio nas extrações volatilidade dos compostos presentes no óleo essencial
de 1,99% (p/v). O cromatograma de íons totais (TIC) detectou testado, que têm contato direto com o microrganismo (Reyes-
pelo menos 15 compostos, dos quais 11 foram identificados Jurado et al., 2020). Como cada composto apresenta uma
(Tabela I). Os principais constituintes foram os monoterpenos razão de volatilização diferente, de acordo com seu peso
oxigenados pulegona (48,8%) e isomentona (16,2%). Outros molecular, a dinâmica de volatilização do LH foi realizada para
constituintes foram detectados em quantidades menores, determinar quais compostos são liberados pela vaporização e
como acetato de isomentila (11,1%), neoisomentol (8,3%), quais devem estar relacionados à atividade antimicrobiana.
limoneno (4,2%) e acetato de neoisopulegila (3,1%). Os
resultados obtidos neste estudo são consistentes com
trabalhos anteriores que descrevem o H. myrtoides. As composições químicas do headspace foram medidas
a 37°C a cada 60 minutos durante um experimento de 270
óleo de folhas (Castilho et al. 2017). minutos, utilizando uma coluna VF-5ms. A análise completa é
apresentada na Tabela II. Este teste foi realizado para simular
a evaporação do óleo nas condições de temperatura da
bactéria.

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Tabela I. Composição do óleo essencial das folhas de Hesperozygis myrtoides .

RILit RICAL
Compostos Quantidade relativa (%)

1 ÿ-pineno 932 933 0,6

2 ÿ-pineno 974 979 0,5

3 limoneno 1024 1029 4.2

4 1,8-cineol 1026 1033 1.2

5 isomentona 1158 1167 16.2

-
6 não identificado (M+ 152) 1177 0,7

-
7 não identificado (M+ 154) 1180 0,5

8 neoisomentol 1186 1190 8.3

9 pulegone 1237 1242 48,8

10 acetato de isomentila 1305 1305 11.1

11 acetato de acetato de neoiso-pulegila acetato de acetato 1319 1308 3.1

-
12 não identificado (M+ 152) 1343 0,59

-
13 não identificado (M+ 154) 1399 1.2

14 ÿ-cariofileno 1417 1417 1.8

15 óxido de cariofileno 1583 1581 0,8

Total 99,6

Hidrocarbonetos monoterpênicos 5.3

Monoterpenos oxigenados 88,7

Hidrocarbonetos sesquiterpênicos 1.8

Sesquiterpenos oxigenados 0,8

RILit - Índice de retenção linear encontrado na literatura (Adams 2007), RICal - Índice de retenção linear calculado.

incubação. Nas etapas iniciais de evaporação, o espaço o neoisomentol no espaço livre era semelhante às
livre era mais rico em hidrocarbonetos monoterpênicos (ÿ- porcentagens obtidas para o HM bruto.
pineno, ÿ-pineno e limoneno), sendo o limoneno a substância O monoterpeno oxigenado acetato de neoisopulegila
mais abundante. Após 90 min, os hidrocarbonetos e os dois sesquiterpenos (ÿ-cariofileno e seu derivado de
monoterpênicos diminuíram e os monoterpenos oxigenados óxido) detectados no HM bruto não foram detectados em
(isomentona, neoisomentol, pulegona e acetato de
isomentila) foram os principais constituintes do vapor, com o espaço livre talvez porque a temperatura de aquecimento
concentração crescente de pulegona e isomentona. utilizada seja menor do que a necessária para a volatilização
desses compostos durante o tempo experimental utilizado
(Hamm et al.
No último tempo de medição (270 min), a porcentagem 2003). Dentre os hidrocarbonetos monoterpênicos, o
relativa dos principais componentes pulegona, isomentona, sabineno foi caracterizado apenas na fase vapor. Além
acetato de isomentila e disso, sua quantidade relativa foi aproximadamente
constante (2,5 - 1,7%) ao longo de

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Tabela II. Alterações na composição do espaço livre durante o processo de volatilização de Hesperozygis myrtoides
óleo essencial.

% Quantidade relativa de espaço livre

Tempo (min)
RI Compostos
0* 30 90 150 210 270

932 ÿ-pineno 0,6 10.3 5.0 2.2 1.9 1.2

972 sabinena NF 2,5 2.2 1.9 2.0 1.7

978 ÿ-pineno 0,5 6.2 3.4 1.3 1.1 0,6

1029 limoneno 4.2 28,8 21,5 8.4 5.1 3.0

1032 1,8-cineol 1.2 5.2 5.6 3.1 2.0 1.2

1157 mentona NF 5.9 7.1 10.2 10.8 10.0

1166 isomentona 16.2 10.0 12,7 15.0 16.2 13,8

1190 neoisomentol 8.1 2.3 3.2 4.7 4.8 6.1

1239 pulegone 48,8 25,5 33,6 41,8 44,0 48.1

1305 acetato de isomentila 11.1 3.3 5.1 7.4 8.4 10.0

1319 acetato de neoisopulegila 3.1 NF NF NF NF NF

1422 ÿ-cariofileno óxido de 1.8 NF NF NF NF NF

1583 cariofileno 0,8 NF NF NF NF NF

Total 100,0 99,3 96,0 96,3 95,7

*Tempo 0 - Composição do óleo líquido total; NF - não encontrado.

a análise, que diferiu da tendência à redução processos de rearranjo/oxidação desses monoterpenos.

observada para os demais compostos do mesmo
grupo, sugere que este composto seja resultado de
Ensaio de citotoxicidade
um processo de degradação térmica, comum a alguns
hidrocarbonetos monoterpênicos, como o limoneno A maioria dos óleos essenciais já é utilizada há muito
(McGraw et al., 1999). tempo. Em geral, são seguros para uso por inalação,
via oral e cutânea, mas alguns deles e seus
Mentona, um monoterpeno oxigenado, também componentes isolados podem apresentar efeitos
foi encontrada apenas na fase vapor. Este composto, adversos (Tisserand & Young 2014).
presente desde o primeiro momento de análise, seguiu O conhecimento sobre sua toxicidade em aplicações
a tendência geral dos monoterpenos oxigenados, com como desinfetantes ambientais e/ou de superfície é
concentração crescente com o tempo de aquecimento extremamente importante para garantir a segurança
(5,9-10,0%). A rota biossintética dos monoterpenoides do usuário. Considerando que, no caso do H.
p-mentano em Lamiaceae mostra que os precursores myrtoides, não há dados de segurança para uso em
da mentona são o limoneno e a pulegona (Bergman humanos, o HM foi avaliado por meio de um ensaio in vitro validado.
& Phillips 2021). Assim, a presença de mentona Ensaio de citotoxicidade contra linhagem celular de fibroblastos

apenas na fase vapor sugere que mesmo baixas embrionários normais de camundongo (BALB/3T3 clone A31), utilizando

temperaturas, como 37 °C, podem influenciar a um protocolo específico para dispersão de óleos essenciais (Esteves-

Pedro et al. 2018). É um método alternativo reconhecido ao uso em

animais em pesquisas.

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atividades para estimar as doses iniciais para toxicidade custo e menor manipulação do meio de cultura, o que reduz o
sistêmica oral aguda (ICCVAM 2006). Sua aplicabilidade se risco de contaminação (Reyes-Jurado et al. 2020). Neste
justifica por não envolver o uso de animais e, ao mesmo tempo, estudo, desenvolvemos uma versão modificada deste ensaio
para fornecer medições qualitativas e quantitativas da atividade
gera a mesma qualidade de informação que os testes clássicos antimicrobiana na fase de vapor, com base em protocolos
in vivo (Esteves-Pedro et al. 2018). publicados anteriormente (Kloucek et al. 2012a, b).

A atividade citotóxica ( valor de IC50 de 921,2 µg ml-1)

permitiu estimar o valor de LD50 do HM para toxicidade oral
aguda em 2014,0 mg kg-1. Este valor coloca o HM na categoria Os microrganismos foram incubados utilizando a técnica
5, de acordo com o Sistema Globalmente Harmonizado das de pour plate, que proporcionou homogeneidade e distribuição,
Nações Unidas, o que representa segurança em caso de favorecendo a contagem de UFC e a observação do tamanho
exposição oral aguda (GHS 2011). e desenvolvimento das colônias. Para padronizar a concentração
do inóculo, testamos densidades entre 2,0 x 106 - 2,5 x 102
A Agência Europeia de Medicamentos/Comitê de Produtos UFC ml-1. A concentração do inóculo
Fitoterápicos (EMA/HMPC) revisou a toxicidade do óleo
essencial de espécies de Mentha , taxonomicamente que apresentou melhor visualização das colônias formadas foi

relacionadas a H. myrtoides, e pulegona, concluindo que elas 2,5 - 3,5 x 102 UFC ml-1. O meio

não são genotóxicas, mas podem ser hepatotóxicas e o volume adicionado à placa de Petri foi definido

cancerígenas com o uso prolongado (EMA 2016). como 20 ml, porque gerou uma área de expansão satisfatória.
A forma e a dimensão do papel de filtro embebido com óleo
Além disso, a pulegona demonstrou citotoxicidade urotelial in essencial também foram importantes para uma difusão de vapor
vitro contra linhagens de células uroteliais de rato (MYP3) e homogênea. No nosso caso, papéis de filtro com 80 mm de
humanas (1T1), com valores de LC50 de 0,27 mM e 0,57 mM, diâmetro (cobrindo completamente a parte superior da placa)
respectivamente. melhoraram a uniformidade da atmosfera interna da placa
Estudos in vivo demonstraram efeitos citotóxicos quando a quando comparados a 6 - 20 mm, usados em estudos anteriores
pulegona foi administrada em altas doses (75 mg kg-1 e 150 (Andrade et al. 2016, Garzoli et al. 2021). Usar 500 µl de
mg kg-1) em ratas. No entanto, os autores consideram solução de HM foi suficiente para cobrir toda a superfície do
improvável que humanos sejam expostos a concentrações tão papel. Neste estudo, a absorção de HM no meio de cultura e a
altas de pulegona, necessárias para induzir citotoxicidade hermeticidade do sistema não foram consideradas.
(Rocha et al., 2012).

No entanto, para aplicação segura como agente fumigante

em espaços ocupados, o HM ainda precisa de avaliações Visualizando as zonas de inibição formadas, decidimos
citotóxicas adicionais contra linhagens de células pulmonares e contar as UFCs por placa e compará-las com o controle de
cerebrais, bem como avaliar seu potencial genotóxico. crescimento, o que permitiu a determinação da CIM (Fig. 2).
Este procedimento também permite observar o desenvolvimento
individual das colônias com mais detalhes e determinar se o
Atividade antimicrobiana
HM tem efeito biostático ou biocida, após a aeração da placa
para remoção total.
Protocolo de fase de vapor modificado

A placa de Petri invertida é uma técnica amplamente utilizada vapor HM e subsequente reincubação. Em dosagens próximas
para ensaios de fase de vapor, principalmente devido à sua baixa à CIM, nas quais a inibição do crescimento

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Figura 2. Exemplo de um ensaio de fase de vapor representando os efeitos de diferentes concentrações de óleo
essencial de Hesperozygis myrtoides no crescimento de Aspergillus brasiliensis após 96 h de incubação. (ac)
concentrações de óleo de 258, 298 e 338 mg l-1, respectivamente, mostrando inibição do crescimento; (d)
concentração de óleo de 378 mg l-1 mostrando concentração inibitória mínima (CIM); (e) controle de crescimento mostrando crescimento tota

não estava completo, as colônias se desenvolveram lentamente Conforme relatado em estudo utilizando o método de
em relação ao controle do crescimento, indicando um atraso no difusão em ágar, o óleo essencial de H. myrtoides é ativo
desenvolvimento. contra S. aureus, E. coli, Lactobacillus casei, A. brasiliensis
e Candida spp. (Martini et al. 2011).
Comparação da atividade antimicrobiana do
Portanto, optamos por utilizá-lo em nossa avaliação da
óleo essencial de H. myrtoides nas fases líquida e
atividade antimicrobiana na fase de vapor.
vapor
A atividade antimicrobiana observada neste óleo pode
Após a caracterização do modificado ser atribuída às cetonas monoterpênicas pulegona e
condições para determinar o efeito antimicrobiano isomentona, seus principais componentes. De fato, sabe-se
atividade por fase de vapor, a atividade antimicrobiana do que muitos compostos desta classe apresentam propriedades
HM contra um painel de seis microrganismos recomendados antibacterianas e antifúngicas, dependendo da concentração
para testes de desinfetantes de superfície foi avaliada e utilizada (Badawy et al. 2019).
comparada expondo-os aos métodos de fase líquida e de
fase de vapor, confirmando a viabilidade do delineamento Anteriormente, a pulegona na fase líquida foi testada in vitro
experimental contra as bactérias e fungos avaliados. contra dezoito espécies de Candida , apresentando amplo
Antibióticos e formaldeído foram utilizados como controles espectro de atividade, com CIM entre 1.000 e 2.000 mg l-1
positivos dos ensaios de microdiluição e fase de vapor, (Boni et al., 2016). Staphylococcus aureus (CIM: 385 mg l-
respectivamente, e todos os microrganismos foram sensíveis 1) e Escherichia coli (CIM: 60 mg l-1) também foram
a eles. Uma vez desenvolvido o método de fase de vapor relatados como sensíveis à pulegona em um ensaio de
para quantificação de colônias, as CIMs e MBC/MFC do HM microdiluição (Badawy et al., 2019).
foram expressas em mg l-1. Esta também foi a unidade
padronizada para expressar os resultados da fase líquida, Considerando a eficácia do HM, seu efeito inibitório do
tornando possível comparar diretamente os testes crescimento na fase de vapor é relatado pela primeira vez
antimicrobianos realizados (Tabela III). neste estudo, sendo mais ativo cerca de 118 vezes (C.
albicans), 48 vezes (S. aureus), 4 vezes (A. niger), 3 vezes
(B. subtillis) e 1 vez (P. aeruginosa) do que o mesmo
essencial

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Tabela III. Atividade antimicrobiana do óleo essencial de Hesperozygis myrtoides determinada pelo ensaio de microdiluição e pelo ensaio de
placa invertida modificado.

Microdiluição (mg l-1) Fase de vapor (mg l-1)

Microrganismo (ATCC) MIC MBC/MFC MIC MBC/MFC

Aspergillus brasiliensis (16404) 1.447 1.740 378 594

Candida albicans (10231) 95 158 1 2

Bacillus subtillis (6633) 1.884 2.153 705 1.044

Escherichia coli (8739) >151.000 ND >30.000 ND

Pseudomonas aeruginosa (9027) 3.170 4.900 2.600 3.700

Staphylococcus aureus (6538) 19 55 1 1

MIC - concentração inibitória mínima, MBC - concentração bactericida mínima, MFC - concentração fungicida mínima, ND - não detectado.

óleo em solução, no teste de microdiluição. Apesar do 5,2 - 10,0%). Este monoterpeno oxigenado apresenta
aumento na atividade da fase vapor ter variado entre 1 e atividade anticandida moderada (Boni et al. 2016) e pode
118 vezes, a classificação da categoria para antimicrobianos ter contribuído para o aumento da HM
de superfície (Djabou et al., 2013) não mudou. Para os dois atividade contra C. albicans. Ainda sobre atividade
métodos de avaliação da atividade antimicrobiana, o HM foi antimicrobiana, é interessante notar que embora S. aureus
considerado extremamente ativo para S. aureus e C. e B. subtilis sejam as bactérias mais

albicans, ativo para B. subtilis e A. brasiliensis, suscetível ao HM, essa atividade não pode ser relacionada
moderadamente ativo para P. aeruginosa e inativo para E. apenas às características da parede celular Gram-positiva,
coli. que permite que moléculas hidrofóbicas penetrem na célula
(Laird & Phillips 2012).
Através da dinâmica de volatilização do HM , observou- Estudos sugerem que os vapores de óleos essenciais
se que pulegona e alguns hidrocarbonetos monoterpênicos podem atuar por mecanismos de ação diferentes daqueles
com amplo espectro antimicrobiano foram liberados em relatados para os óleos adicionados diretamente ao meio de
concentrações mais elevadas no início do processo, o que cultura (microdiluição), o que também pode explicar sua
pode ter contribuído para a inibição do crescimento maior potência (Wu et al. 2019).
observada dos microrganismos avaliados. Entre estes, A técnica da fase de vapor é descrita como uma
pulegona (variando de 48,8 a 48,1%) e limoneno (variando ferramenta interessante para avaliar a atividade
de 28,8 a 3,0%) (Tabela II) são conhecidos por suas antimicrobiana de óleos essenciais como desinfetantes de
atividades bacteriostáticas e antifúngicas contra vários superfície (Matusiak et al. 2018), conservantes naturais
microrganismos (Kim et al. 2013, Badawy et al. 2019). O ÿ- (Oliveira Filho et al. 2021) ou ainda para o tratamento de
pineno (variando de 10,3 a 1,2%) também é ativo contra infecções do trato respiratório (Ács et al. 2018), sendo criado
uma variedade de microrganismos, atuando no aumento da o termo “vaporoterapia”
permeabilidade da membrana ou destruindo a integridade (Inouye et al. 2001). Sua aplicação tem sido realizada
celular (Dai et al. 2013). utilizando diversos aparelhos, desde os mais simples, como
uma placa de Petri invertida, até outros especialmente
projetados para esse fim (Reyes-Jurado et al. 2020).
Além disso, durante a volatilização do HM houve a formação
de mentona (variou de

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O método da placa de Petri invertida é bastante popular patógenos do trato respiratório. BMC Complement Altern Med 18: 1-9.
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e apresenta as vantagens de utilizar placas disponíveis
comercialmente a baixo custo, a possibilidade de ser utilizado ADAMS RP. 2007. Identificação de componentes de óleos essenciais
por cromatografia gasosa/espectrometria de massa, 4ª ed., Allured
para a avaliação de bactérias, leveduras e bolores, o número
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reduzido de etapas e o menor risco de contaminação
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cruzada, por não haver transferência de inóculo. Estudos
vapor para avaliar as atividades antimicrobianas de óleos essenciais
descrevem sua
contra patógenos bacterianos respiratórios bovinos. Lett Appl Microbiol
uso com diversos óleos comerciais, aplicados a um disco de 65: 489-495. [Link]

papel de tamanhos variados (geralmente 6 a 20 mm), onde org/10.1111/lam.12804.

as zonas de inibição formadas são avaliadas (Andrade et al. ANDRADE BFMT, BARBOSA LN, ALVES FCB, ALBANO M, RALL
VLM, SFORCIN JM, FERNANDES AAH & FERNANDES A. 2016.
2016, Garzoli et al. 2021). No entanto, observa-se que o
Os efeitos antibacterianos de Melaleuca alternifolia, Pelargonium
tamanho do papel é importante para a homogeneidade da
graveolens e Cymbopogon martinii
atmosfera (Kloucek et al. 2012b). Óleos essenciais e principais compostos em fase líquida e vapor. J
Os resultados do nosso método, utilizando um disco de papel Essent. Oil Res 28: 227-233. [Link]
0/10412905.2015.1099571.
que cobre toda a tampa do recipiente, permitem a distribuição
do óleo essencial por toda a superfície do ágar e a BADAWY MEI, MAREI GIK, RABEA EI e TAKTAK NEM. 2019.
Atividades antimicrobianas e antioxidantes de hidrocarbonetos e
consequente uniformidade na inibição do microrganismo
monoterpenos oxigenados contra alguns patógenos de origem
para determinar a CIM e o modo de ação do óleo essencial, alimentar por meio de estudos in vitro e in silico . Pestic Biochem
estático ou tóxico, sem a necessidade de reinoculação. Physiol 158: 185-200. [Link]
Portanto, o teste baseado na fase de vapor de óleos pestbp.2019.05.008.

essenciais aqui apresentado oferece uma alternativa BERGMAN ME & PHILLIPS MA. 2021. Diversidade estrutural e

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para a determinação da atividade antimicrobiana e pode ser
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utilizado para o desenvolvimento de diversas aplicações de
RAMOS MM, BARBOSA JP, DE OLIVEIRA TR & HÖFLING JF. 2016. Atividade
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Agradecimentos BULGHERONI A, KINSNER-OVASKAINEN A, HOFFMAN S, HARTUNG

Este estudo foi financiado em parte pela Coordenação de T & PRIETO P. 2009. Estimativa da toxicidade oral aguda usando o
Nível de Efeito Adverso Não Observado (NOAEL) em estudos de
Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – Brasil (CAPES) –
Código Financeiro 001 e pelo Conselho Nacional de Desenvolvimento toxicidade de dose repetida de 28 dias em ratos. Regul Toxicol

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Mecanismos de ação antibacteriana em fase de vapor do óleo Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas, Av.
Alexandre Cazellato, 999, 13148-218 Paulínia, SP, Brasil
essencial de Cinnamomum camphora var. linaloofera Fujita contra

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MARCOS AURÉLIO A. PEREIRA et al. ABORDAGEM DA FASE DE VAPOR DO ÓLEO ESSENCIAL

5
Instituto de Botânica, Av. Miguel Estefano,
3687, 04301-002 São Paulo, SP, Brasil
6
Universidade Paulista, Instituto de Ciências da Saúde, Av.
Yojiro Takaoka, 3500, 06542-001 Santana de Parnaíba, SP, Brasil
7
Universidade Federal de São Paulo, Departamento
de Ciências Exatas e da Terra, Av. Conceição,
123, 09920-000 Diadema, SP, Brasil

Correspondência para: Paulo Roberto Hrihorowitsch Moreno

E-mail: prmoreno@[Link]

Contribuições dos autores

MAAP: Conceitualização, Metodologia, Investigação, Redação –
Rascunho Original. PRHM: Conceitualização, Recursos, Supervisão,
Redação – Revisão e Edição. TMK: Investigação, Recursos.
MCMY, IC e CM: Investigação, Recursos. AS: Metodologia,
Investigação, Recursos. PSL: Metodologia, Recursos, Análise
formal. KNM e CMTSM: Redação – Rascunho original. FLS:
Redação – Rascunho original, Redação – Revisão e edição.

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