Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
1. Conceito Geral
O processo se baseia em três elementos
essenciais:
A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR –
Polymerase Chain Reaction) é uma técnica 1. DNA molde – o segmento que se
in vitro que imita o processo natural de deseja amplificar.
replicação do DNA, permitindo a
amplificação de fragmentos específicos de 2. Primers (oligonucleotídeos) –
DNA em laboratório. pequenos fragmentos de DNA que
delimitam a região a ser replicada.
● Criada em 1982.
3. DNA polimerase – enzima que
● Em 1985, Saiki - foi introduzida a Taq
adiciona nucleotídeos para formar a
DNA polimerase (extraída da bactéria
nova fita de DNA.
Thermus aquaticus, resistentes à
temperaturas altas).
● Em 1993, Kary Mullis recebeu o Prêmio
Nobel de Química por desenvolver a
PCR.
2. Princípio da Técnica
A PCR depende de uma DNA polimerase
3. Composição da Reação
capaz de sintetizar uma nova fita de DNA a
partir de um molde. (MIX)
O “mix” da PCR contém todos os
componentes necessários para que a
reação ocorra:
Milene - monitoria
● Volume final – 25-100µL
● dNTPS (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
● Oligonucleotídeos (primers) 4. Equipamento
● Quantidade apropriada de tampão
A reação ocorre em um Termociclador,
(Mg) • Enzima – Taq polimerase
aparelho que controla automaticamente as
● DNA genômico (DNA alvo)
variações de temperatura em ciclos
repetidos.
○ Inclui íons de Magnésio (Mg²⁺)
○ Concentração ótima: 0,5 – 3,0
mM
○ [Mg²⁺] baixa → baixa eficiência
○ [Mg²⁺] alta → baixa
especificidade
5. Etapas da PCR
A PCR é formada por três fases principais,
que se repetem em vários ciclos:
1. Desnaturação (94°C)
○ O DNA molde é aquecido,
● DNA polimerase: geralmente Taq
quebrando as pontes de
polimerase
hidrogênio entre as fitas.
● DNA alvo (genômico)
⚠ Cuidados importantes: pipetagem
○ Resultado: duas fitas simples de
precisa, controle de temperatura e
DNA.
ambiente estéril para evitar
contaminação.
2. Anelamento (54–56°C) ● Após múltiplos ciclos, a quantidade de
○ Os primers se ligam às DNA alvo aumenta exponencialmente.
extremidades complementares
da região alvo.
○ A temperatura depende do tipo
de primer utilizado.
3. Extensão (72°C)
○ A Taq polimerase adiciona
nucleotídeos, alongando a fita
de DNA a partir dos primers.
7. Aspectos Experimentais
🔁 Esse ciclo se repete 35–40 vezes, A eficiência da PCR depende de:
resultando em bilhões de cópias da
● Qualidade do DNA molde.
sequência alvo.
● Correta concentração de reagentes.
⏱ ️Tempo total: aproximadamente 2 horas.
● Condições de reação bem ajustadas.
● Prevenção de contaminações.
6. Resultados após os Ciclos
● Ao final do 1º ciclo, apenas um
⚠️ Contaminação pode ser minimizada com:
fragmento alvo está totalmente
copiado.
● Áreas de trabalho distintas. ● Identificação de organismos
transgênicos.
● Uso de hipoclorito. ● Medicina forense (investigações
criminais).
● Radiação UV para descontaminação. ● Engenharia genética.
● Sequenciamento de DNA.
8. Variações da PCR
RT-PCR (Reverse Transcriptase PCR)
PCR Multiplex: permite amplificar vários
alvos ao mesmo tempo.
● Utilizada quando o molde é
RNA/mRNA.
● Envolve duas etapas:
1. Transcrição reversa → RNA é
10. Considerações Finais
convertido em cDNA pela
A PCR revolucionou a biologia molecular e as
enzima Transcriptase Reversa.
ciências médicas por permitir análises
2. PCR → o cDNA é amplificado
rápidas, específicas e sensíveis de ácidos
normalmente.
nucleicos.
Apesar disso, exige cuidados rigorosos para
evitar resultados falsos devido a inibidores
9. Aplicações da PCR
ou contaminações.
A técnica é extremamente versátil, sendo
aplicada em várias áreas:
📖 Referência principal:
● Identificação de paternidade. Princípios e aplicações da reação em cadeia
● Diagnóstico de doenças infecciosas da polimerase em campos de diagnóstico
(ex: SARS-CoV-2). médico: uma revisão.
● Detecção de mutações gênicas. Disponível em: NCBI – PMC3768498
● Diagnóstico de doenças genéticas.