UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA

“JÚLIO DE MESQUITA FILHO”

unesp INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS – RIO CLARO

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

(MICROBIOLOGIA APLICADA)

PRODUÇÃO DE POLIGALACTURONASES POR FUNGOS TERMOFÍLICOS E

MESOFÍLICOS EM FERMENTAÇÃO EM ESTADO SÓLIDO E COMPARAÇÃO
DAS ISOFORMAS DA ENZIMA PRODUZIDAS POR CADA GRUPO.

ALEXANDRE COSTA MONTEIRO

Dissertação apresentada ao
Instituto de Biociências do Câmpus
de Rio Claro, Universidade
Estadual Paulista, como parte dos
requisitos para obtenção do título
de Mestre em Ciências Biológicas
(Microbiologia Aplicada).

Abril - 2008
 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
“JÚLIO DE MESQUITA FILHO”
unesp INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS – RIO CLARO

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

(MICROBIOLOGIA APLICADA)

PRODUÇÃO DE POLIGALACTURONASES POR FUNGOS TERMOFÍLICOS E

MESOFÍLICOS EM FERMENTAÇÃO EM ESTADO SÓLIDO E COMPARAÇÃO
DAS ISOFORMAS DA ENZIMA PRODUZIDAS POR CADA GRUPO.

ALEXANDRE COSTA MONTEIRO

Orientadora: Profa Dra Eleni Gomes

Dissertação apresentada ao
Instituto de Biociências do Câmpus
de Rio Claro, Universidade
Estadual Paulista, como parte dos
requisitos para obtenção do título
de Mestre em Ciências Biológicas
(Microbiologia Aplicada).

Abril - 2008
 i

Dedico:

Às pessoas que me são mais queridas:

Meus pais, Luiz Carlos e Nunce,
Meus irmãos Marcos e Paula.
 ii

AGRADECIMENTOS

A Deus, pela vida e oportunidades que me concedeu.

À profa. Dra. Eleni Gomes, pela orientação e aprendizado que me proporcionou e

pela imensa paciência.

Ao prof. Dr. Roberto da Silva.

Aos meus pais, pelo inefável apoio, pelas orações e pelo muito que sacrificaram
pelos meus estudos.

Aos meus irmãos pela amizade e incentivo.

Aos amigos Eduardo, que muito me ajudou nos primeiros passos, e Rodrigo, pelo
companheirismo e pelos muitos esclarecimentos e ajuda em todos os momentos em que
precisei.

À Paula, pela amizade verdadeira e pelo muito que me ajudou, especialmente nos
momentos finais.

A todos os amigos e colegas do laboratório pela agradável convivência e

colaboração, especialmente à Natália e à Aline.

À Heloiza, que com sua admirável dedicação ao laboratório e com sua generosa
colaboração contribuiu, direta e indiretamente, para que este trabalho fosse executado.

Ao César e ao Alex pela generosa hospitalidade.

Aos irmãos da Peniel.

Ao CNPq, pela concessão de bolsa.

À FAPESP, pelo importante suporte financeiro.

 iii

“O que guarda a sua boca e a sua língua guarda a

sua alma das angústias.”
Provérbios 21:23
 iv

ÍNDICE
Página
LISTA DE FIGURAS vi

LISTA DE TABELAS viii

LISTA DE ABREVIATURAS ix

RESUMO x
ABSTRACT xi

1. INTRODUÇÃO 1

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ...................................................................................... 3

2.1 Pectinas .............................................................................................................. 3

2.2 Protopectinases .................................................................................................. 6
2.3 Esterases ............................................................................................................ 6
2.4 Poligalacturonases .............................................................................................. 7
2.5 Liases .................................................................................................................. 8
2.5.1 Pectato-liase .............................................................................................. 8
2.5.2 Pectina-liase ............................................................................................... 9
2.6 Produção de pectinases em fermentação em estado sólido ............................... 10
2.7 Múltiplas formas de pectinases ............................................................................. 13

2.8 Aplicações de pectinases ...................................................................................... 18

3. OBJETIVOS 24

3.1 Geral ..................................................................................................................... 24

3.2 Específicos ........................................................................................................... 24

4. MATERIAL E MÉTODOS .......................................................................................... 26

4.1 Microrganismos ..................................................................................................... 26

4.2 Meios de manutenção ........................................................................................... 26

4.3 Fermentação em Estado Sólido ............................................................................ 26

4.4 Medida da atividade de poligalacturonase ........................................................... 27
4.5 Determinação de proteínas totais ......................................................................... 28
4.6 Fracionamento e isolamento das frações de PGs ............................................... 28
4.7 Zimograma ............................................................................................................ 29
4.8 Determinação do pH e temperatura ótimos para a atividade das enzimas ......... 30
4.9 Determinação da estabilidade das enzimas frente a variações
de temperatura e pH ............................................................................................ 30
4.10 Avaliação da especificidade pelo substrato ........................................................ 31
 v

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO................................................................................... 32

5.1 Produção de PGs em FES em farelo de trigo ....................................................... 32

5.2 Caracterização físico-química das PGs nas soluções enzimáticas brutas ........... 35
5.2.1 Efeito do pH sobre a atividade e estabilidade das PGs................................ 35
5.2.2 Efeito da temperatura sobre a atividade e estabilidade das PGs ................ 41
5.3 Determinação das atividades de Endo-PGs nas soluções enzimáticas brutas .... 47
5.4 Fracionamento das PGs por filtração em gel e zimogramas ................................ 48
5.5 Caracterização físico-química das PGs dos fungos termofílicos
obtidas por filtração em gel.................................................................................... 55
5.5.1 Efeitos do pH e temperatura sobre a atividade das PGs
e termoestabilidade das PGs ...................................................................... 55

5.6 Determinação da especificidade pelo substrato das PGs dos fungos termofílicos 60
5.7 Produção de PG em FES por A. fumigatus em diferentes substratos .................. 62

6. CONCLUSÕES ........................................................................................................... 64

7. LITERATURA CITADA .............................................................................................. 66

 vi

LISTA DE FIGURAS

Figura 01: Molécula de Homogalacturona, Molécula de Ramnogalacturona,

Neutralização das cargas negativas de moléculas de homogalacturona por
2+
íons Ca ........................................................................................................................ 4

Figura 02: Representação das atividades de pectinases sobre uma

molécula de galacturona com regiões metiladas e não metiladas.................................. 10

Figura 03: Produção de PG pelos fungos mesofílicos A. niger e P. itallicum ................ 33

Figura 04: Produção de PG pelos fungos termofílicos R. pusillus e T. lanuginosus e

termodúrico A. fumigatus ................................................................................................ 33

Figura 05: Efeito do pH sobre a atividade e estabilidade de PG de solução enzimática

bruta obtida no 11º dia de cultivo de A. niger em farelo de trigo..................................... 36

Figura 06: Efeito do pH sobre a atividade e estabilidade de PG de solução enzimática

bruta obtida no 4º dia de cultivo de P. itallicum em farelo de trigo.................................. 37

Figura 07: Efeito do pH sobre a atividade e estabilidade de PG de solução enzimática

bruta obtida no 12º dia de cultivo de A. fumigatus em farelo de trigo.............................. 38

Figura 08: Efeito do pH sobre a atividade e estabilidade de PG de solução enzimática

bruta obtida no 6º dia de cultivo de R. pusillus em farelo de trigo .................................. 39

Figura 06: Efeito do pH sobre a atividade e estabilidade de PG de solução enzimática

bruta obtida no 2º dia de cultivo de T. lanuginosus em farelo de trigo............................ 40

Figura 10: Efeito da temperatura sobre a atividade e estabilidade de PG em solução

enzimática bruta obtida no 11º dia de cultivo de A. niger em farelo de trigo................... 41

Figura 11: Efeito da temperatura sobre a atividade e estabilidade de PG em solução

enzimática bruta obtida no 4º dia de cultivo de P. itallicum em farelo de trigo................ 42

Figura 12: Efeito da temperatura sobre a atividade e estabilidade de PG em solução

enzimática bruta obtida no 12º dia de cultivo de A. fumigatus em farelo de trigo........... 43

Figura 13: Efeito da temperatura sobre a atividade e estabilidade de PG em solução

enzimática bruta obtida no 6º dia de cultivo de R. pusillus em farelo de trigo................. 44

Figura 14: Efeito da temperatura sobre a atividade e estabilidade de PG em solução

enzimática bruta obtida no 2º dia de cultivo de T. lanuginosus em farelo de trigo.......... 45

Figura 15: Atividades de Exo-PG e Endo-PG obtidas pelo cultivo dos mesofílicos e
termofílicos em farelo de trigo......................................................................................... 47

Figura 16: (A) Perfil de eluição de PGs produzidas por A. niger em coluna de filtração
em gel Sephadex G-100. (B) Zimograma em PAGE....................................................... 49
 vii

Figura 17: (A) Perfil de eluição de PGs produzidas por P. itallicum em coluna de
filtração em gel Sephadex G-100. (B) Zimograma em PAGE......................................... 50

Figura 18: (A) Perfil de eluição de PGs produzidas por A. fumigatus em coluna de
filtração em gel Sephadex G-100. (B) Zimograma em PAGE.......................................... 51

Figura 19: (A) Perfil de eluição de PGs produzidas por R. pusillus em coluna de
filtração em gel Sephadex G-100. (B) Zimograma em PAGE.......................................... 53

Figura 20: (A) Perfil de eluição de PGs produzidas por T. lanuginosus em coluna de
filtraçãoem gel Sephadex G-100. (B) Zimograma em PAGE........................................... 54

Figura 21: Efeito do pH sobre a atividade de PG do fungo A. fumigatus obtida por

filtração em gel Sephadex G-100.................................................................................... 55

Figura 22: Efeito da temperatura sobre a atividade e estabilidade de PG do fungo

A. fumigatus obtida por filtração em gel Sephadex G-100............................................... 56

Figura 23: Efeito do pH sobre a atividade de PG do fungo R. pusillus obtida por

filtração em gel Sephadex G-100 .................................................................................... 57

Figura 24: Efeito da temperatura sobre a atividade e estabilidade de PG do fungo

R. pusillus obtida por filtração em gel Sephadex G-100 ................................................. 58

Figura 25: Efeito do pH sobre a atividade de PG do fungo T. lanuginosus obtida por

filtração em gel Sephadex G-100 .................................................................................... 59

Figura 26: Efeito da temperatura sobre a atividade e estabilidade de PG do fungo

T. lanuginosus obtida por filtração em gel Sephadex G-100........................................... 60

Figura 27: Especificidade ao substrato das PGs brutas e eluídas ................................. 61

Figura 28: Produção de PG pelo fungo A. fumigatus em diferentes substratos.............. 63

 viii

LISTA DE TABELAS

Tabela 01: Propriedades das enzimas brutas caracterizadas ............................................ 46

Tabela 02: Razão entre os valores de atividade de Endo-PG e Exo-PG .......................... 48

Tabela 03: Fracionamento de PGs produzidas por [Link] em coluna

Sephadex G-100 a partir da solução enzimática bruta obtida em 11 dias de fermentação. 49

Tabela 04: Fracionamento de PGs produzidas por P. itallicum em coluna

Sephadex G-100 a partir de solução enzimática bruta obtida em 4 dias de fermentação... 50

Tabela 05: Fracionamento de PGs produzidas por A. fumigatus em coluna

Sephadex G-100 a partir da solução enzimática bruta obtida em 12 dias de fermentação. 52

Tabela 06: Fracionamento de PGs produzidas por R. pusillus em coluna

Sephadex G-100 a partir da solução enzimática bruta obtida em 6 dias de fermentação... 53

Tabela 07: Fracionamento de PGs produzidas por T. lanuginosus em coluna

Sephadex G-100 a partir da solução enzimática bruta obtida em 2 dias de fermentação... 54
 ix

LISTA DE ABREVIATURAS

Endo-PG(s) ....................... Endo-Poligalacturonase(s)

Exo-PG(s) ......................... Exo-Poligalacturonase(s)
FES ................................... Fermentação em estado sólido
FSm .................................. Fermentação submersa

GA .................................... Ácido galacturônico

IL ....................................... Interleucina
OGA(s) ............................. Oligogalacturonídeo(s)
PeL ................................... Pectato-liase
PG(s) ................................ Poligalacturonase(s)
PGIP(s) ............................. Proteína(s) inibidora(s) de poligalacturonase(s)
PME .................................. Pectina-esterase

PnL ................................... Pectina-liase

 x

RESUMO

As pectinases são enzimas com importantes aplicações econômicas,

especialmente na indústria alimentícia. Pectinases termoestáveis, produzidas
por microrganismos termofílicos, apresentam uma série de características que
favorecem sua aplicação em processos industriais, como, por exemplo,
estabilidade em ampla faixa de pH e temperatura e maior tolerância a agentes
químicos desnaturantes de proteínas. Contudo, os principais microrganismos
empregados na produção de poligalacturonases (PGs) são fungos mesofílicos.
O presente trabalho teve por objetivo realizar um estudo comparativo de
produção de PGs em fermentação em estado sólido (FES) por fungos
mesofílicos e termofílicos. Foram utilizados os fungos mesofílicos Aspergillus
niger NRRL 3112 e Penicillium itallicum IZ 1584, reconhecidos como bons
produtores de PGs, os termofílicos Thermomyces lanuginosus ROB e
Rhizomucor pusillus A13.36 e o termodúrico Aspergillus fumigatus N31. Os
microrganismos foram cultivados em FES em farelo de trigo, os mesofílicos a
27ºC e os demais a 45ºC, por períodos de 10 a 15 dias. Os maiores produtores
de PG foram P. itallicum IZ 1584 (51U/g) e A. fumigatus N31 (59,40 U/g). As
PGs dos fungos termofílicos apresentaram maiores valores de temperatura
ótima e maior termoestabilidade que as dos mesofílicos. T. lanuginosus
produziu PG com maior valor de temperatura ótima (70ºC). A. fumigatus
produziu a PG mais termoestável, que conservou 100% da atividade original
após 1 h de incubação a 50ºC em ausência de substrato. Cromatografias em
filtração em gel e zimogramas revelaram a expressão de 7 isoformas de PG em
A. niger NRRL 3112, 3 isoformas em P. itallicum IZ 1584, T. lanuginosus ROB
e R. pusillus, e 2 isoformas em A. fumigatus N31.

Palavras chave: poligalacturonase, termofílicos, mesofílicos, isoformas.

 xi

ABSTRACT

Pectinases are enzymes with important economic applications, especially

in food industry. Termostable pectinases, produced by termophilic
microorganisms, display an array of characteristics that support their application
in industrial processes, such as stability through a wide pH and temperature
range, as well as higher tolerance to protein denaturating chemical agents.
However, the major microoganisms employed in polygalacturonases (PGs)
prodution are mesophilic fungi. The present work aimed to make a comparative
study of PG production by mesophilic and thermophilc fungi in Solid-State
Fermentation (SSF). The fungi employed were the mesophilic Aspergillus niger
NRRL 3112 and Penicillium itallicum IZ 1584, both known as good PGs
producers, the thermophilic Thermomyces lanuginosus ROB and Rhizomucor
pusillus A13.36 and the termoduric Aspergillus fumigatus N31. The fungi were
bred in wheat bran in SSF, the mesophilic at 27ºC and the others at 45ºC,
during periods of 10 to 15 days. The higher PGs producers where P. itallicum IZ
1584 (51U/g) and A. fumigatus N31 (59,40 U/g). PGs of thermophilc fungi have
shown higher values of optimum temperature and termostability than mesophilic
PGs.
T. lanuginosus produced PG with the higher value of optimum temperature for
activity (70ºC). A. fumigatus have shown the most thermostable PG, which
mantained 100% of its original activity after 1 h of incubation at 50ºC in absence
of substrate. Gel filtration chromatography and zymograms revealed the
expression of 7 PG isoforms for A. niger, 3 isoforms for P. itallicum IZ 1584,
T. lanuginosus ROB and R. Pusillus, and 2 isoforms for A. fumigatus N31.

Key words: polygalacturonase, thermophilic, mesophilic, isoforms.

 1

1. INTRODUÇÃO

Substâncias pécticas são polissacarídeos estruturais

encontrados principalmente na lamela média e parede celular primária das
células dos vegetais superiores (DOESBURG, 1965; KAWABATA, 1977), Ainda
que correspondendo a uma faixa de apenas 0,5 a 4 % da massa fresca dos
vegetais, segundo KASHYAP e colaboradores (2001), elas são grandes
responsáveis pela integridade e aderência de seus tecidos (ROMBOUTS e
PILNIK, 1980).

As pectinases constituem um grupo de enzimas que catalisam

a degradação das substâncias pécticas presentes no material vegetal e são
produzidas por plantas superiores, fungos filamentosos, leveduras e bactérias
(ROMBOUTS e PILNIK, 1980). A classificação destas enzimas é baseada no
modo de ataque à cadeia de ácido poligalacturônico dos polímeros pécticos,
sendo descritos três tipos de enzimas: as desesterificantes (pectina-esterases),
as despolimerizantes (hidrolases e liases) e as protopectinases. A classificação
ainda pode ser baseada na preferência pelo substrato (pectina ou pectato) e na
região em que atuam na molécula, podendo, neste caso, atuar de forma
randômica (atividade endo) ou a partir da extremidade não redutora da
molécula (atividade exo) (FOGARTY e WARD, 1972; ROMBOUTS e PILNIK,
1980; KASHYAP et al., 2001). A produção de múltiplas formas de pectinases
por vários microrganismos foi relatada em vários trabalhos. O sentido da
expressão de diversas enzimas pectinolíticas por uma única espécie
 2

parece estar relacionado a mecanismos de fitopatogenia (NAESSENS e

VANDAMME, 2003).

Há um significante interesse no uso de técnicas de

fermentação em estado sólido (FES) para produzir uma ampla variedade de
enzimas, especialmente por fungos. Isso ocorre porque o uso da FES acarreta
diversas vantagens sobre a fermentação submersa (FSm), destacando-se a da
obtenção de maiores volumes de enzimas (GONZÁLEZ-VINIEGRA et al.,
2001). É crescente o interesse na utilização de resíduos vegetais como fonte
de energia e carbono para a produção de enzimas microbianas, dentre elas as
pectinases, em FES (KAUR et al, 2004).

Apesar da predominância do emprego de microrganismos

mesofílicos em estudos de FES, o interesse na aplicação de espécies
termofílicas em processos fermentativos é crescente (FREITAS et al. 2006).
Enzimas de termofílicos são, de modo geral, mais estáveis a temperatura, ao
pH e a agentes químicos do que enzimas de mesofílicos (BRUINS et al. 2001;
HAKI e RAKSHIT, 2003).
 3

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 Pectinas

As pectinas são uma família de polissacarídeos complexos que

promovem a aderência das paredes celulares entre células vegetais adjacentes
formando uma estrutura rígida pela interação com a celulose, a hemicelulose e
a lignina (FRY, 1986; MC NEILL et al, 1984; FOGARTY e WARD, 1972).
Polissacarídeos pécticos são formados por duas regiões interligadas: a
homogalacturonana e a ramnogalacturonana (Figura 01). A primeira é um
homopolímero formado por uma cadeia linear de resíduos de ácido
D-galactopiranosilurônico unidos por ligações Į-1,4-D-glicosídicas. Esses
resíduos de ácido D-galacturônico podem ter alguns de seus grupos carboxila
metil-esterificados ou O-acetilados nos carbonos 3 ou 2 (Figura 01). A
ramnogalacturonana é um heteropolímero que tem a estrutura principal
formada por repetidas unidades de ácido galactopiranosilurônico ligado à
ramnose por ligações ȕ–(1ĺ2) e ȕ–(1ĺ4) e cadeias laterais consistindo de
arabinose e galactose (RIDLEY et al, 2001; PÉREZ et al, 2000).
 4

(A)

(B)

(C)

Figura 01: A) Molécula de Homogalacturona. B) Molécula de Ramnogalacturona.

C) Neutralização das cargas negativas de moléculas de homogalacturona por íons Ca2+.
(figuras originais: [Link]
 5

“Substâncias pécticas” é uma expressão genericamente

empregada para os compostos que sofrem a ação das enzimas pectinolíticas.
Elas são macromoléculas glicosídicas complexas de alta massa molecular. São
polissacarídeos acídicos, negativamente carregados devido à ionização de
grupos metoxil. Estas cargas são neutralizadas por íons, principalmente Ca2+
(JAYANI et al, 2005) (Figura 01C). A Sociedade Americana de Química
(American Chemical Society) classificou as substâncias pécticas em quatro
tipos principais (ALKORTA et al, 1998; JAYANI et al, 2005):

(1) Protopectina: É a substância péctica insolúvel em água

presente no tecido intacto. A hidrólise restrita da protopectina
produz pectina ou ácidos pécticos.

(2) Ácido péctico: É o polímero solúvel das galacturonanas que

contem uma quantia negligível de grupos metoxil. Sais ácidos
ou normais de ácidos pécticos são chamados pectatos.

(3) Ácidos pectínicos: É a cadeia de poligalacturonana que

contem unidades de galacturonato metilado >0 e <75%. Sais
ácidos ou normais de ácido pectínico são considerados
pectinatos.

(4) Pectina (galacturonato polimetil): É o material polimérico no

qual, pelo menos, 75% de grupos carboxil das unidades de
galacturonato estão esterificados com metanol. Isto confere
rigidez na parede celular quando está ligado à celulose.

A degradação desses polissacarídeos requer um sistema

enzimático complexo. Os fungos Aspergillus sp (FREITAS et al, 2006; DEBING
et al, 2006; PANDA et al, 2004; DE VRIES & VISSER, 2001), Penicillium sp
(SILVA et al, 2002; VIDAL et al, 1999), Saccharomyces cerevisiae (BLANCO et
al, 1997), Thermomyces lanuginosus (SINGH et al, 2003) e Thermoascus
aurantiacus (PALMA-FERNANDES et al, 2002; MARTINS et al, 2002) são
alguns exemplos de microrganismos produtores de enzimas pectinolíticas.
 6

Existem três tipos de pectinases: Protopectinases, Esterases e

Despolimerizantes.

2.2 Protopectinases

São enzimas que solubilizam protopectinas. Liberam pectinas

solúveis e altamente polimerizadas a partir da protopectina (ALKORTA et al,
1998; KASHYAP et al, 2001).

São classificadas em dois tipos: Um reage com a região do

ácido poligalacturônico da protopectina (tipo A) e outro com cadeias de
polissacarídeo que podem conectar o ácido poligalacturônico com os
constituintes da parede celular (tipo B) (SAKAI et al, 1993).

A atividade enzimática é determinada pela medição do total de

substâncias pécticas liberadas a partir da protopectina pelo método do
carbazole-ácido sulfúrico (SEIBERT e ANTO 1946; JAYANI et al, 2005 ).

2.3 Esterases

Pectina-esterases (EC [Link]) são conhecidas também como

pectina-metil-esterases, pectase, pectina metoxilase ou pectina-metil-
hidrolases (KYRIAKIDIS, 1999).

Pectina-esterases catalisam a desesterificação do grupo

metoxila da pectina formando ácido péctico (KASHYAP et al, 2001). Este
processo libera metanol e grupos carboxílicos livres na cadeia de pectina
(KORNER, ZIMMERMANN e BERK, 1980; VERSTEEG, 1979; WICKER,
VASSALO E ECHERVERRIA, 1988).

As pectina-esterases são as primeiras enzimas a atuar na

degradação da pectina (SAKAI et al, 1993), permitindo que poligalacturonases
 7

(HUBER, 1983) e liases atuem no produto (SAKAI et al, 1993). Biologicamente,

são de grande importância, pois permitem a ação posterior de pectinases que
só atuam sobre compostos pécticos com menor grau de esterificação. São
produzidas por fungos filamentosos, leveduras, bactérias e vegetais superiores
(SAKAI et al, 1993), no quais ocorrem em diversos tecidos, especialmente nos
frutos (BARON E THIBAULT, 1985).

A atividade enzimática pode ser determinada pelo método de

Kertez (1937) em que se faz a titulação dos grupos carboxílicos liberados dos
ácidos galacturônicos da pectina, ou pelo método de difusão em gel, em que a
ação da enzima é detectada pela formação de uma zona manchada em gel de
agarose com pectina de alta esterifição (DOWNIE et al, 1998).

A reação genérica pode ser apresentada da seguinte forma:

pectina + n H2O = n metanol + pectato

2.4 Poligalacturonases

As poligalacturonases (PGs) são enzimas despolimerizantes

que catalisam a hidrólise da cadeia de ácido poligalacturônico (JAYANI et al,
2005).

As PGs podem ser classificadas como Endo-

poligalacturonases (Endo-PGs) ou Exo-poligalacturonases (Exo-PGs), de
acordo com o seu modo de ataque ao substrato.

Endo-PGs (E.C. [Link]) hidrolisam, de forma randômica, as

ligações glicosídicas internas entre os resíduos de ácidos galacturônicos,
causando a despolimerização da molécula, liberando oligogalacturonatos como
produtos.

Exo-PGs são subdivididas em Exo-PG-1 (E.C. [Link]), que

hidrolisa as ligações sucessivas do ácido poligalacturônico a partir da
 8

extremidade não redutora, liberando ácidos galacturônicos livres e Exo-PG-2

(E.C. [Link]), que hidrolisa as ligações alternadas do ácido poligalacturônico
a partir da extremidade não redutora, liberando ácidos digalacturônicos livres
(JAYANI et al, 2005;. DA SILVA et al, 1997; PILNIK E ROMBOUTS, 1981).

A atividade da PG é determinada medindo-se, durante o curso

da reação, a taxa de aumento no número de grupos redutores e/ou a
diminuição da viscosidade da solução com substrato em um aparelho
denominado viscosimetro. No primeiro caso, a quantidade de açúcares
redutores pode ser medida pelo método colorimétrico usando o reagente 3,5-
dinitrosalicílico (MILLER, 1959) ou pelo método de Somogyi-Nelson (1944).

2.5 Liases

São enzimas despolimerizantes que clivam as ligações Į-1-4

de pectatos ou pectinatos por transeliminação de hidrogênio, o que resulta em
galacturonídeos com ligação insaturada entre C4 e C5, na terminação não
redutora do ácido galacturônico formado (SAKAI et al, 1993 ; KASHYAP et al,
2001).

2.5.1 Pectato-liase

Pectato-liase (EC [Link]) é a enzima mais bem estudada entre

as pectinases. Pectato-liases atacam, randomicamente, pectatos e pectinas
com baixo grau de esterificação. São dependentes de Ca2+ para atividade e
possuem pH ótimo na categoria neutro-alcalino, entre 8-10, o que limita o seu
uso na indústria alimentícia. São produzidas por várias espécies de bactérias,
incluindo Bacillus sp, Erwinia sp. (SEMENOVA et al, 2006; WHITACKER, 1989;
SINGH et al, 1999) e Amycolata sp (BRUHLMANN et al, 1994).
 9

Podem ser classificadas em dois tipos de acordo com o modo

de ataque ao substrato:

Endo-poligalacturonato liase: ataca o ácido péctico

aleatoriamente, liberando oligogalacturonatos insaturados (JAYANI et al, 2005).

Exo-poligalacturonato liase: ataca o ácido péctico a partir da

terminação redutora, liberando 4-5 digalacturonatos (JAYANI et al, 2005) e 4-5
trigalacturonatos insaturados (SATO e KAJI, 1977).

2.5.2 Pectina-liase

Pectina-liase (EC [Link]) tem recebido crescente atenção

porque é a única enzima capaz de despolimerizar pectinas diretamente,
quebrando as ligações Į-1-4 de pectinas de alta esterificação, sem a ação
prévia de outras enzimas. De fato, a pectina-liase é uma enzima que degrada
diretamente pectinas de alta esterificação através da quebra ȕ eliminativa de
ligações glicosídicas (BUSTO, et al, 2006; ALAFIA et al, 1991; SPAGNA et al,
1995).

Ocorrem pricipalmente em bactérias, como Pseudomonas,

Bacillus, Erwinia e Clostridium (SINGH et al, 1999). Pouco é conhecido sobre
pectina-liases de fungos (SEMENOVA et al, 2006).

Podem ser classificadas em dois tipos de acordo com o modo

de ataque ao substrato:

Endo-Polimetilgalacturonato liases: atacam polimetil-

galacturonatos randomicamente, liberando metiloligogalacturonatos
insaturados.

Exo-Polimetilgalacturonato liases: atacam polimetil-

galacturonatos a partir da terminação redutora liberando
metilmonogalacturonatos insaturados.
 10

O método mais apropriado para determinar a atividade

enzimática é a medida do aumento de absorbância a 235nm devido à formação
de ligações ǻ-4:5 na terminação não redutora dos produtos insaturados,
conforme descrito por Albersheim (1966).

A Figura 02 representa os modos de ação dos diferentes tipos

de pectinases (TEN HAVE, 2000).

Figura 02: Representação das atividades de pectinases sobre uma molécula de galacturona com
regiões metiladas e não metiladas. Poligalacturonases (exoPG e endoPG) hidrolisam o ácido
poligalacturônico (PGA) na ligação glicosídica Į ,1-4 resultando em ácido monogalacturônico (GA) e
ácido oligogalacturônico (OGA), respectivamente. Pectato-liase e Pectina-liase (PeL e PnL) executam
a ȕ-eliminação. PnL atua sobre a galacturona metilada, resultando em OGA com uma ligação
insaturada ǻ4,5 na extremidade não redutora. A Pectinametilesterase (PME) promove a
desmetoxilação da pectina resultando em PGA (TEN HAVE, 2000).

2.6 Produção de pectinases em fermentação em estado sólido

Fermentação em estado sólido (FES) é definida como a

fermentação envolvendo sólidos em ausência ou quase ausência de água entre
as partículas de substrato. Contudo, o substrato deve reter umidade suficiente
para sustentar o crescimento e o metabolismo do microrganismo
(PANDEY 2000).
 11

A literatura relata uma série de vantagens decorrentes da

aplicação deste processo, tais como: baixo custo, alta produtividade e
concentração dos produtos, menor requerimento de espaço e energia, dentre
outras (LONSANE et al., 1992; TREJO-HERNÁNDEZ et al., 1991;
HESSELTINE, 1972).

A alta produtividade é um aspecto especialmente interessante

em processos de fermentação sólida. É freqüentemente citado que em FES as
taxas de produção de enzimas são maiores que em fermentação submersa
(FSm) para uma mesma linhagem e substrato. Por essa razão, há um interesse
significativo em utilizar técnicas de FES para produzir uma ampla variedade de
enzimas (PANDEY, 1999). Para González-Viniegra e colaboradores (2002), as
razões dessa maior produtividade em FES relacionam-se ao fato de que em
FES ocorre maior produção de biomassa, menor atividade de proteases, menor
suscetibilidade à repressão catabólica e mais eficiente transferência de
oxigênio do que em FSm. Acredita-se que FES é uma condição mais próxima
ao habitat, logo os microrganismos estão aptos a produzir enzimas nestas
condições (PANDEY, 2002).

Além disso, FES oferece numerosas oportunidades no

processamento de resíduos agro-industriais. Isso porque, de certo modo, FES
têm menor requerimento energético, produzem menos resíduos líquidos e são
ecologicamente amigáveis, uma vez que resolvem, em parte, o problema de
descarte dos resíduos sólidos disponíveis (PANDEY, 2000). Este processo é,
portanto, de especial interesse em países que possuem abundância de
biomassa e de resíduos agro-industriais (PANDEY et al., 2000; HESSELTINE,
1972), como o Brasil.

O processo fermentativo em estado sólido tem sido aplicado

com sucesso, quer para produção de pectinases bacterianas (SOARES et al.,
1999) quer para pectinases fúngicas (ACUÑA-ARGÜLLES et al., 1994).
Microrganismos pectinolíticos podem ser cultivados em vários tipos de meio de
cultura de baixo custo para a obtenção do metabólito desejado. A capacidade
 12

destes microrganismos de crescerem em materiais ligno-hemi-celulósicos pode

ser utilizada como uma forma de aproveitamento de resíduos vegetais.

A produção de vários tipos de pectinases já foi descrita em

pectinas purificadas de citrus, maçã e beterraba de açúcar, em ácido
poligalacturônico e em ramnose e ácido galacturônico. A literatura relata
também a produção de pectinases em diversos substratos vegetais como polpa
de maçã, farinha de soja, polpa da beterraba de açúcar, casca de arroz, palha
de milho, sabugo de milho, cascas e sementes de frutas, farelo de trigo,
bagaço ou casca de laranja, bagaço de cana-de-açúcar, polpa de café e polpa
de cacau (CASTILHO et al., 1999; SOARES et al., 1999; FREITAS et al, 2006;
PANDA et al, 2004; MARTINS et al, 2002; SILVA et al, 2002; DA SILVA et al,
1997; BOCCAS et al., 1994; SCHWAN et al., 1997; HANG e WOODAMS,
1994, SIDI et al., 1984; FONSECA e SAID, 1994; MARTIN et al., 2004;
ACUÑA-ARGÜELLES et al., 1994).

Na grande maioria dos estudos com FES, são utilizados

microrganismos mesofílicos, os quais não toleram temperaturas acima de 40°C, o
que dificulta o processo, pois as principais dificuldades na execução de FES são
justamente os efeitos da transferência de calor e de massa. Durante a FES uma
grande quantidade de calor, que é diretamente proporcional às atividades
metabólicas do microrganismo, é gerada. Os materiais sólidos usados em FES
possuem baixa condutividade térmica, por esta razão a remoção do calor do
processo pode ser muito lenta e algumas vezes o acúmulo de calor é elevado a
ponto de desnaturar os produtos formados e acumulados (PANDEY, 2002). O
uso de microrganismos termofílicos tem demonstrado boa adaptação dos
mesmos a esse processo (MARTINS et al., 2002; FREITAS et al., 2006).

Microrganismos termofílicos são definidos como aqueles que

apresentam temperatura ótima de crescimento entre 40ºC e 80ºC (VIEILLE e
ZEIKUS, 2001). Dentre as propriedades que as enzimas produzidas por esses
organismos termofílicos apresentam, sob o ponto de vista de aplicação
industrial, as mais importantes são a resistência a altas temperaturas, a
enzimas proteolíticas e a agentes detergentes (BRUINS et al., 2001; LEA et al.,
 13

1998). O desenvolvimento de FES em temperaturas acima de 40ºC traz outras

vantagens, como a redução do risco de contaminação por mesofílicos.

A grande maioria das pesquisas de produção de pectinases

tem focado a produção destas enzimas por linhagens fúngicas mesofílicas,
principalmente pertencentes aos gêneros Aspergillus e Penicillium, dos quais
são obtidos os principais preparados comerciais de pectinases (SEMENOVA et
al., 2006; PANDEY et al., 2000; SAID et al., 1991). Por outro lado, são poucos
os relatos na literatura sobre a produção de pectinases por linhagens
termofílicas (MAHESHWARI et al., 2000; MARTINS et al., 2002; SATHISH-
KUMAR e PALANIVELU, 1999; PUCHART et al., 1999; SATHISH-KUMAR e
PALANIVELU, 1998).

2.7 Múltiplas formas de pectinases

Estudos de produção de poligalacturonases microbianas têm

revelado múltiplas formas destas enzimas, as quais diferem em massa molar,
propriedades cinéticas e outras como glicosilação (DEVI e RAO, 1996;
MINJARES-CARRANCO et al., 1997). A IUPAC recomendou que o termo
“múltiplas formas de enzimas” fosse considerado um termo genérico que
compreende todas as proteínas catalisadoras de uma mesma reação em uma
mesma espécie. O termo “isoenzimas” ou “isozimas” deve ser aplicado
somente para aquelas múltiplas formas de enzimas que são originadas a partir
de diferenciações, geneticamente determinadas, na estrutura primária e não
para aquelas derivadas de modificações de uma mesma seqüência primária de
aminoácidos (MOSS, 1992). Enzimas que catalisam uma mesma reação e
possuem uma mesma estrutura primária, ao diferirem por alguma propriedade
mensurável são chamadas pseudo-isozimas (PURICH e ALLISON, 2000).

Múltiplas formas de uma enzima ocorrem em uma ampla

variedade de microrganismos. A síntese destas formas é freqüentemente
dependente de características do cultivo como composição do meio,
 14

parâmetros físico-químicos, tempo de cultivo e presença de agentes indutores

ou inibidores. Múltiplas formas de enzimas aumentam a capacidade do
organismo produtor de se adaptar e lidar com uma ampla variação de
mudanças ambientais. As vantagens fisiológicas compensam o aparente
desperdício da hiper-produção de múltiplas formas de uma enzima
(NAESSENS e VANDAMME, 2003).

O significado da existência dessas múltiplas formas ainda não

é claro, porém, algumas teorias são levantadas com relação a organismos
patogênicos de plantas, para os quais, a produção de pectinases extracelulares
é fator fundamental para o sucesso da infecção das plantas hospedeiras (RHA
et al, 2001; OESER. et al., 2002; ISSHIKI et al., 2000).

A parede celular vegetal é a primeira linha de defesa das

plantas. Ela atua como uma barreira fisiológica desempenhando um papel
crítico no controle de invasões patogênicas. Os principais constituintes da
parede celular vegetal são membros de duas redes de polissacarídeos, uma
consistindo de celulose e hemicelulose, outra de compostos pécticos.
Entretanto essa composição pode variar de acordo com a idade e as condições
fisiológicas da planta, fazendo com que o patógeno precise de um amplo pool
enzimático para o sucesso na infecção do tecido vegetal (DE LORENZO et al,
2001; JUGE, 2006).

A maioria dos microrganismos fitopatogênicos secreta uma

série de enzimas de degradação de parede capazes de despolimerizar
polissacarídeos da parede celular do hospedeiro. PGs são as primeiras
enzimas a serem secretadas pelos patógenos quando eles encontram a parede
celular vegetal, e sua contribuição à patogenicidade de alguns fungos e
bactérias tem sido demonstrada pelo uso de ferramentas genéticas. Por
exemplo, Kars e colaboradores (1999), demonstraram que a deleção do gene
Bcpg2, codificante de uma isoforma de PG, em Botrytis cinerea resulta em uma
forte redução de sua virulência em tomate e fava. PGs são um importante fator
de patogenicidade em outros fungos como Aspergillus flavus, Alternaria citri e
Claviceps purpurea e por bactérias como Agrobacteruim tumefaciens e
 15

Ralstonia solanacearum (JUGE, 2006; DI MATTEO et al, 2006; FREDERICI et

al, 2006).

As substâncias pécticas são compostas por repetidas unidades

de acido galacturônico negativamente carregado, cujo grupo carboxila é
freqüentemente esterificado com grupo metil, neutralizando as cargas
negativas. A porcentagem de ácido galacturônico metilado, assim como a
seqüência e posição das unidades metiladas variam com o ciclo de vida da
planta e de um tipo de planta para outra. Portanto, o patógeno capaz de
secretar uma bateria de pectinases com semelhante mecanismo de ação,
porém, que reconheçam diferentes seqüências de unidades metiladas e não
metiladas proporcionaria maior eficiência na quebra da pectina da parede
celular e, conseqüentemente, maior sucesso no processo de infecção
(HERRON et al., 2000).

Múltiplas formas de poligalacturonases podem ser expressas a

partir de um único gene ou de genes distintos. Caprari e colaboradores (1993)
relatam a expressão de quatro endo-poligalacturonases pelo fungo patogênico
Fusarium moniliforme derivadas da glicosilação diferencial de um único
polipeptídeo, produto de um só gene. Por outro lado, A. niger possui uma
família completa de genes codificantes de Endo-PG, e produz diversas
isozimas que demonstram diferenças consideráveis com respeito à
especificidade pelo substrato, velocidade de quebra e pH ótimo de atividade
(BUSSINK et al, 1992; PARENICOVA et al, 1998). A atividade de
poligalacturonase do fungo fitopatogênico Botrytis cinerea é resultado da ação
de várias isozimas que têm sido separadas ou purificadas após o crescimento
deste fungo patogênico sob diferentes condições de cultivo (RHA et al., 2001;
CRUICKSHANK e WADE 1980; MAGRO et al., 1980; DI LENNA e FIELDING
1983; JOHNSTON e WILLIAMSON 1992; TOBIAS et al., 1993; TOBIAS et al.
1995; LEE et al., 1997).

A maioria das enzimas degradadoras de parede ocorre em

grandes famílias multigênicas exibindo diversos padrões de expressão,
sugerindo especialização funcional (COUTINHO et al, 2003). Estas famílias
 16

gênicas surgiram a partir de processos de duplicação de genes. Genes

duplicados, que freqüentemente são ligados em tandem (seqüência de genes),
podem surgir de erros despercebidos durante a replicação do DNA ou erros no
reparo de quebras da dupla fita de DNA. Podem ocorrer eventos de duplicação
de tandem. A duplicação de um gene seguida de diferenciação pode dar
origem a um novo gene funcional. Cada duplicação de genes em tandem cria
uma oportunidade única para promover a expansão de uma família gênica
(CARROLL et al, 2006). Os modos pelos quais as duplicações gênicas deram
origem a novos genes funcionais ao longo do curso da evolução permanecem
pobremente compreendidos (HUGHES e FRIEDMAN, 2003).

Todos os genes em uma dada família gênica compartilham

seqüências similares e por isso são chamados homólogos. Estes genes
compartilham um ancestral comum. Temos dois tipos de genes homólogos:

• Ortólogos: encontrados em espécies diferentes.

Derivados de um único gene de um ancestral comum. São fruto de um
processo de divergência.

• Parálogos: encontrados no genoma de uma mesma

espécie e são derivados de eventos de duplicação em um único
genoma. São fruto de eventos de duplicação seguidos de um processo
de divergência intra-específica.

Devido à complexidade da parede celular vegetal e,

correspondentemente, dos sistemas enzimáticos envolvidos na sua
degradação, na maioria dos casos, a inativação de um único gene que
expressa enzimas que degradam a parede celular vegetal não tem influência
na virulência ou patogenicidade dos fungos (TUDZYNSKI e TUDZYNSKI, 1998;
TUDZYNSKI e TUDZYNSKI, 2000). Somente poucos casos são relatados em
que a perda de um gene específico de enzimas que degradam a parede celular
tem impacto significativo na patogenia do fungo. Shieh e colaboradores (1997)
demonstraram que uma endo-poligalacturonase de um patogênico oportunista,
Aspergillus flavus, está envolvida na infecção de algodão. Ten Have (1998)
 17

relata que a deleção de um dos seis genes de endo-poligalacuronases (Bcpg 1)

do fungo Botrytis cinerea leva a redução da virulência do fungo no tomate e na
maçã (OESER et al., 2002).

Em contrapartida ao fato de que a maioria dos microrganismos

fitopatogênicos secreta uma série de enzimas capazes de despolimerizar
polissacarídeos da parede celular do hospedeiro, as plantas desenvolveram
uma bateria diversificada de respostas defensivas, incluindo proteínas
inibidoras dessas enzimas. Elas incluem proteínas inibidoras de pectinases,
como poligalacturonases, pectina-metil-esterases, e pectina-liases (JUGE,
2006). Proteínas inibidoras de poligalacturonases (PGIPs) são proteínas
extracelulares vegetais ricas em leucina que se ligam especificamente e inibem
poligalacturonases de fungos. A interação com as PGIPs limitam o potencial
destrutivo das poligalacturonases, e podem engatilhar as respostas de defesa
das plantas induzidas pelos oligogalacturonídeos resultantes da ação dessas
PGs. Um elevado grau de polimorfismo é encontrado tanto em PGs quanto em
PGIPs (DI MATTEO et al, 2006).

Muitas plantas produzem PGIPs que reconhecem e inibem

PGs de fungos e insetos especificamente (DE LORENZO e FERRARI, 2002;
D’OVIDIO et al, 2004). A interação entre PGs e PGIPs limita o potencial
destrutivo das PGs e leva ao acúmulo de oligogalacturonídeos eliciadores da
síntese de fitoalexinas, etileno e lignina (RIDLEY et al, 2001). Fitoalexinas são
compostos antimicrobianos de baixa massa molecular que são sintetizados e
acumulados em vegetais após a exposição a microrganismos ou agentes
abióticos (MERT-TURK, 2002; PAXTON, 1980; VAN ETTEN et al, 1994).

PGIPs interagem com PGs formando complexos

biomoleculares. Patógenos desenvolveram diferentes PGs para maximizar seu
potencial ofensivo, em contrapartida os vegetais desenvolveram várias PGIPs
com diferentes especificidades para neutralizar a maioria das formas de PGs
existentes na natureza (FREDERICI et al, 2006). Parece razoável aceitar que
se trata, portanto, de uma coevolução.
 18

A eletroforese é o método mais comumente usado para

distinção de múltiplas formas de enzimas (NAGAO et alI, 1992; FERNADEZ-
LOPEZ et al, 1994; HICKS, 1995, MITCHELL et al; 1995, ABE et al, 1997), e
oferece vantagens como rapidez, ampla aplicabilidade, alto grau de resolução e
evita as conseqüências artificiais do manuseio ou purificação das enzimas
(PUGSLEY e SCHWARTZ, 1985). Zimogramas (eletroforese não desnaturante)
têm sido usados com sucesso para quantificação de pectinases produzidas por
fungos (SWEETINGHAM et al 1986; BALALI e KOWSARI, 2004, GANTOTTI e
DAVIS, 1993). Entretanto, isozimas que apresentam idênticas mobilidades
eletroforéticas não podem ser separadas, aparecendo como uma só banda no
gel (SHAW, 1969). A cromatografia é um outro meio de identificação de
isozimas, e também tem sido aplicada com sucesso (CAMPERI et al, 1996;
SILVA et al, 2002, VACIK e TOREN, 1982, McMILLAN et al, 1992).

A produção de diferentes isoformas de poligalacturonases

também tem sido descrita para fungos mesofílicos saprófitas como, Penicillium
frequentans (SAID et al., 1991), P. viridicatum rfc3 (SILVA et al., 2002), P.
italicum (RIZZATTO, 1999), Aspergillus carbonarius (DEVI e RAO, 1996), A.
niger (SINGH e RAO, 2002), Polyporus squamosus (PERICIN et al., 1992).
Entretanto, fungos termofílicos têm mostrado uma, ou no máximo três
isoformas para PG (Martins et al, 2007 Martin et al, 2007 – dados não
publicados). Desse modo, torna-se importante um estudo comparativo entre
espécies fúngicas mesofílicas e termofílicas.

2.8 Aplicações de pectinases

A produção de pectinases ocupa em torno de 10% de toda a

produção de preparados enzimáticos comerciais. Estas enzimas são
amplamente usadas na indústria alimentícia na produção de sucos, bebidas de
frutas e vinhos. (SEMENOVA et al, 2006).
 19

Endo-PGs têm sido especialmente aplicadas para maceração e

separação de células intactas, por hidrólise da lamela média, na preparação de
sucos e purês vegetais. O preparo de batatas chips instantâneas e de suco de
cenoura para alimentos de bebê requer a maceração e a separação de células
íntegras. Este tratamento mantém as células intactas, vitaminas, cor e aroma
são preservados e os conteúdos celulares são protegidos do oxigênio (LANG e
DORNENBURG, 2000).

Os preparados enzimáticos comerciais usados no

processamento de alimentos são tradicionalmente misturas de pectina-liases,
polimetil esterases e poligalacturonases, que correspondem à maior fração do
complexo pectinolítico nestes produtos. Estes preparados são
predominantemente derivados de fungos. A maioria destes preparados é obtida
de espécies do gênero Aspergillus (LANG e DORNENBURG, 2000;
SEMENOVA et al, 2006).

Os aspergillus negros são particularmente aplicáveis para a

produção de enzimas por várias razões: são capazes de secretar elevados
níveis de proteínas, possuem boas propriedades fermentativas, permitindo
produção de enzimas em larga escala e produzem uma ampla gama de
enzimas, tanto com atividade Endo quanto Exo, que degradam polissacarídeos
de parede celular vegetal. Diversos produtos destes fungos são classificados
como seguros, permitindo que sejam utilizados em alimentos (DE VRIES,
2003). Como exemplo de aspergilus negros, pode-se citar A. niger, A.
carbonarius, A. japonicus e A. aculeatus.

Aspergillus niger é o fungo mais comumente utilizado para

produção industrial de enzimas pectinolíticas possui o status GRAS (Generally
Regarded as Safe), seus metabólitos podem ser usados seguramente
(GUMMADI e PANDA, 2003). Estudos demonstraram que A. niger, quanto à
sua patogenicidade, hipersensibilidade e produção de toxinas, é um organismo
seguro para a produção de enzimas na indústria (SCHUSTER et al, 2002).
 20

A maior aplicação industrial de pectinases é na extração e

clarificação de sucos (JAYANI et al, 2005), aumentando a produção dos
mesmos, facilitando a prensagem e a filtração (LANG e DORNENBURG,
2000). Pectinases de Sporotrichium thermophile aumentaram o rendimento na
produção de sucos a partir da polpa de banana, uvas, maçã (KAUR et al,
2004). Pectinases aumentam também o rendimento na extração de polpa de
frutas como, por exemplo, o cupuaçu (Theobroma grandifolium) (BASTOS et al,
2002).

Enzimas pectinolíticas são amplamente usadas em indústrias

de processamento de frutas para hidrolisar substâncias pécticas (BUSTO et al,
2005), responsáveis pela turbidez, viscosidade e suspensão indesejáveis em
determinados sucos.

O uso de enzimas pectinolíticas em vinificação está

amplamente difundido por trazer uma série de benefícios à indústria vinícola
(GRANELLA et al, 2005), Os mostos e vinhos tratados com estas enzimas
assumem um melhor aspecto visual, com mais brilho (JAYANI et al, 2005;
LANG e DORNENBURG, 2000).

As pectinases são também utilizadas para a modificação de

pectinas purificadas para diferentes aplicações. Pectinas são amplamente
utilizadas na preparação de geléias, compotas e outros alimentos gelatinosos
(BARFOD, 1990). Na preparação destes alimentos o uso de pectinas de baixa
metoxilação é preferível por várias razões: elas produzem um gel de baixa
caloria, com ou sem açúcar, na presença de cátions bivalentes como Ca+2.
Pectinas de alta metoxilação requerem grandes quantidades de açúcar e pH
baixo para formar gel. Além disso, pectinas de baixa metoxilação são
quimicamente mais estáveis a umidade e ao calor do que as de alta
metoxilação (HOEFER, 1991). Géis obtidos por pectinas de baixa metoxilação
são mais macios e mais espalháveis do que os obtidos com pectinas de alta
metoxilação (PILGRIM et al, 1991).
 21

Há quatro modos de promover a desmetoxilação de pectinas:

ácidos, álcalis, amônia em álcool e pectina-esterases. Nighojar e colaboradores
(1995) relatam sucesso no uso de pectina-esterase imobilizada para diminuir o
grau de metoxilação de pectinas.

Pectina e polissacarídeos pécticos estão emergindo como

alimentos bioativos. A pectina de toronja (grape-fruit), usada industrialmente
como um estabilizante de alimentos possui um importante papel na saúde
(CERDA, 1987). Yamada (1995) encontrou dois diferentes polissacarídeos
pécticos bioativos: bupleran 2IIb e 2IIc. Bupleuran 2IIc, que consiste
principalmente de uma região de galacturona parcialmente ramificada, mostrou
potente atividade antiúlcera (YAMADA et al, 1991). A digestão de bupleuran
2IIc com Endo-PG produz principalmente galacturono-oligossacarídeos e
pequenas porções de regiões resistentes à enzima. A porção de carboidrato
resistente à enzima resultante mostrou potente atividade estimuladora da
secreção de interleucina 6 (IL-6) em células de ratos. IL-6 é uma citosina
estimuladora da resposta imunológica. (GUO et al, 2000), o que pode indicar
um papel para Endo-PG na produção de polissacarídeos e oligossacarídeos
como fármacos (LANG e DORNENBURG, 2000).

Novas aplicações para oligogalacturonídeos (OGAs) foram

demonstradas na última década. A degradação dos OGAs por PGs produz
oligossacarídeos não digestivos, que não são hidrolisados ou absorvidos na
porção superior do trato gastrintestinal. Estas substâncias afetam
beneficamente o hospedeiro pela estimulação seletiva de espécies de bactérias
naturalmente residentes no cólon. O favorecimento da microbiota residente do
hospedeiro induz efeitos sistêmicos benéficos à saúde e reprime a colonização,
o crescimento ou virulência de patogênicos (VORAGEM, 1998; CRTTENDEN e
PLAINE, 1996).

Pectinases podem ser empregadas para produzir OGAs.

Iwasaki e colaboradores (1998) reportaram uma eficiente degradação da
pectina em produção contínua utilizando Endo-PG de A. pulverulentus.
 22

O suco natural de laranja possui materiais em suspensão que

lhe conferem um aspecto opaco. Esta opacidade é um indicador de
autenticidade do suco. A pectina é o principal responsável pela estabilidade
desta suspensão correspondendo a cerca de 32% dos materiais suspensos.
Em sucos adulterados ou em imitações de suco de laranja, por motivos
técnicos, a estabilidade da suspensão é proporcionada por hidrocolóides
sintéticos ou diferentes do natural.

Um preparado com pectinases foi utilizado para detectar a

substituição da pectina natural em sucos de laranja por outros hidrocolóides.
Quando tratados com pectinases por 24 h a 50ºC, sucos naturais apresentaram
maior redução na sua absorbância a 650 nm do que misturas de suco natural
com imitações. Enquanto o suco natural sofreu redução de 78% na
absorbância, a imitação sofreu redução de apenas 5% e uma mistura com 80%
de suco natural e 20% de imitação sofreu redução de 37% (KYRIAKIDIS,
1999).

Enzimas pectinolíticas estão envolvidas na remoção de

material gomoso (degomagem) presente em fibras de juta, cânhamo, linho,
ramie e casca de coco para aplicação têxtil (CHESSON, 1980; BRUHLMANN
et al, 1994). A degomagem pode ser feita tanto pela aplicação de preparados
pectinolíticos quanto por um processo de fermentação das fibras (retting), no
qual microrganismos decompõem a pectina liberando a fibra da casca
(SHARMA e ROBINSON, 1983, MOLINA et al, 2001).

Para a remoção deste material gomoso, composto

principalmente de pectina e hemicelulose, Kapoor e colaboradores (2001)
testaram três tratamentos em fibras de ramie e cânhamo (sunn hemp):
enzimático, químico e químico-enzimático, sendo que o terceiro foi mais
eficiente, ficando demonstrada a remoção total do material gomoso não
celulolítico das fibras.
 23

Enzimas que degradam a parede celular vegetal podem ser

usadas para extração de óleos vegetais. Óleos de canola, coco, semente de
girassol e oliva são tradicionalmente extraídos com solventes orgânicos, como
o potencialmente cancerígeno hexano (KASHYAP et al, 2001). Ao degradar
componentes de parede, como a pectina, estas enzimas facilitam a liberação
do óleo.
 24

3. OBJETIVOS

3.1 Geral

Avaliar a presença de isoformas de PG, com base em separação por

tamanho das moléculas, são produzidas pelos fungos Thermomyces
lanuginosus ROB, Aspergillus fumigatus N31, Rhizomucor pusillus A13.36,
Penicillium italicum IZ 1584 e Aspergillus niger NRRL 3112, em fermentação
em estado sólido em farelo de trigo, assim como produzir PG em FES
utilizando diferentes substratos por pelo menos uma das cepas termofílicas e
caracterizar essa enzima.

3.2 Específicos

- Produzir poligalacturonase por Thermomyces lanuginosus ROB,

Aspergillus fumigatus N31, Rhizomucor pusillus A13.36, Penicillium
italicum IZ 1584 e Aspergillus niger NRRL 3112 em fermentação em
estado sólido usando farelo de trigo como substrato.

- Separar as PG produzidas pela diferença de massa molecular

utilizando filtração em gel SEPHADEX.

-Determinar a termoestabilidade das principais frações de pectinases

obtidas.
 25

- Estudar a produção da PG pela cepa termofílica escolhida como a

produtora da PG mais termoestável, em outros substratos como bagaço
de laranja, farelo de algodão e misturas de farelo de trigo e bagaço de
cana de açúcar.

- Caracterizar PG mais termoestável quanto a:

a) pH e temperatura ótimos de atividade;

b) Estabilidade da enzima, quando em ausência de substrato, a

variações de pH e temperatura;

c) Especificidade pelo substrato (pectinas de alta e baixa

esterificação);
 26

4. MATERIAL E MÉTODOS

4.1 Microrganismos

Os fungos utilizados foram os microrganismos mesofílicos

Aspergillus niger NRRL 3112 e Penicillium italicum IZ 1584, o termodúrico
Aspergillus fumigatus N31 e os termofílicos Rhizomucor pusillus A13.36 e
Thermomyces lanuginosus ROB.

4.2. Meio de manutenção

Os microrganismos foram mantidos em meio Sabouraud, os

mesofílicos a 7ºC (em geladeira) e os termofílicos a temperatura ambiente
(±25°C), sob água estéril coberta com camada de óle o mineral.

4.3 Fermentação em Estado Sólido

A fermentação em estado sólido (FES) foi realizada em frascos

Erlenmeyer de 250 mL, contendo 5 g de farelo de trigo esterilizado. Os
microrganismos mesofílicos e termofílicos foram cultivados a 27ºC e 45ºC,
respectivamente, em incubadoras B.O.D.

Nas FES realizadas com os fungos Rhizomucor pusillus A13.36

e Thermomyces lanuginosus ROB, o material foi inoculado com 5 mL de
 27

suspensão micelial em água estéril (aproximadamente 5 mg de massa micelial

seca/g substrato). Nas FES realizadas com Aspergillus niger NRRL 3112,
Aspergillus fumigatus N31, Penicillium italicum IZ 1584 o material foi inoculado
com 5 mL de suspensão de esporos (aproximadamente 107 esporos/g de
substrato). Os inóculos utilizados foram obtidos a partir de culturas de 7 dias
em meio Sabouraud para os fungos A. niger, [Link] e T. lanuginosus, e
culturas de 4 dias para R. pusillus e A. fumigatus.
Após a inoculação, 7 mL de solução nutriente foram
adicionados em cada frasco, obtendo-se umidade de 70%, considerando-se o
volume de solução nutriente e de água do inóculo. A solução nutriente
empregada foi preparada com a seguinte composição: 0,2% (NH4)H2PO4, 0,1%
MgSO4 x 7H2O, 0,05% de solução micronutriente (0,02% ZnSO4 x 7H2O, 0,1%
FeSO4 x 7H2O, 0,02% CuSO4 x 4H2O, 0,005% MgSO4 x H2O, 0,005% CaCl2).
O pH foi ajustado para 5,0 com (NH4) 2HPO4.

Os cultivos foram realizados, a princípio, por períodos de 10 a

15 dias. As fermentações foram realizadas em duplicatas.

Dois frascos Erlenmeyer foram retirados a cada 24 h e, ao

material fermentado de cada frasco, foram adicionados 40 mL de água
destilada. Em seguida, o material foi homogeneizado com auxílio de um bastão
de plástico, agitado por 30 min em shaker a 100 rpm, filtrado em gaze e
centrifugado por 20 min a 4ºC. O sobrenadante foi utilizado como solução
enzimática bruta.

4.4 Medida da atividade de poligalacturonase

A atividade das Exo-poligalacturonases foi avaliada numa

mistura contendo 0,9 mL de tampão acetato de sódio 0,2 mol/L, pH 5,0,
contendo 1% de pectina (KELCO, 64-72% de esterificação) e 0,1 mL de
solução enzimática bruta. O açúcar redutor liberado (ácido D-galacturônico),
após a incubação da mistura de reação a 50ºC por 10 min, foi quantificado pelo
método do DNS (ácido 3,5-dinitrosalicílico) proposto por Miller (1959). Neste
 28

trabalho, uma unidade de PG foi definida como a quantidade de enzima capaz

de liberar 1 µmol de ácido galacturônico por minuto, nas condições de reação.

A determinação da atividade endo das poligalacturonases foi

obtida pela incubação de uma mistura de 6 mL de tampão acetato de sódio, 0,2
mol/L, pH 5,0, contendo 3% de pectina (Kelco) e 2 mL de solução enzimática
por 10 min na temperatura de 50ºC. Considerou-se como uma unidade de
enzima a quantidade de enzima capaz de reduzir em 50% a viscosidade da
mistura de reação nas condições de ensaio. As leituras de viscosidade foram
realizadas em viscosímetro (FREITAS et al, 2006).

4.5 Determinação de proteínas totais

A determinação dos teores de proteínas totais da solução

enzimática bruta e das frações isoladas foi feita através do método de Lowry,
adaptado por Hartree (HARTREE, 1972), usando soro albumina bovina como
padrão.

4.6 Fracionamento e isolamento das frações de PGs

As soluções enzimáticas brutas foram dialisadas contra 4 L de

tampão acetato de sódio 10 mmol/L pH 5,0 a 4ºC, por 24 h, com 3 trocas
sucessivas após, respectivamente, 12, 18 e 24 h de diálise. O material dialisado
foi congelado em nitrogênio líquido e posteriormente liofilizado. O preparo da
amostra se deu pela ressuspensão do material liofilizado em tampão acetato de
sódio 50 mmol/L, pH 5,0.

As enzimas brutas, dialisadas e concentradas, foram

submetidas à cromatografia de filtração em gel em coluna contendo gel
Sephadex G-100 (Pharmacia). Para a eluição utilizou-se tampão acetato de
sódio 50 mmol/L, pH 5,0. O fluxo na coluna foi ajustado em 18 mL/h, sendo
 29

coletados 3 mL por tubo. A atividade de poligalacturonase foi determinada nas

frações eluídas.

4.7 Zimograma

Para a eletroforese, foi empregado um sistema constituído por

gel de separação a 10% e gel de empilhamento a 4%, em placa de 10 x 15cm.

O gel de separação foi composto por 10 mL de água

desionizada, 0,01g de pectina de citrus Kelco com 64-72% de esterificação, 6,6
mL de solução contendo 30% de acrilamida e 0,8% de NN-metileno-
bisacrilamida, 5mL de tampão TRIS-HCl 1,5 M, pH 8,8, 0,3 mL de solução de
persulfato de amônio a 0,2% e 20µL de temed. A mistura foi vertida na placa e,
após a sua polimerização, adicionou-se a mistura para o gel de empilhamento
constituída por 6 mL de água desionizada, 1,35 mL de solução contendo 30%
de acrilamida e 1,6 % de NN-metileno-bisacrilamida, 2,5 mL de tampão TRIS-
HCL 0,5 M, pH 6,8, 0,15 mL de solução de persulfato de amônio a 0,2% e
10 µL de temed.

Tampão tris-glicina (pH 8,7) foi usado nas cubas com eletrodos
para a corrida. Antes da aplicação das amostras, fez-se uma pré-eletroforese
do gel por 30 min.

As amostras foram preparadas misturando-se 10 ȝL das

soluções enzimáticas e 3 ȝL de azul de bromofenol 0,05% em tampão de
corrida do gel. As amostras foram aplicadas para migrarem no sentido do
cátodo. A eletroforese foi feita a 4ºC, em câmara fria, a uma força constante de
25 W. Após a eletroforese, cada gel foi lavado com água destilada e incubado
por 30 min em cubas com 300 mL tampão acetado de sódio 200 mmol/L a
50ºC. Decorrido o período de incubação, os géis foram lavados com água
destilada e incubados, sob fraca agitação em shaker, em solução 0,01% de
vermelho de rutênio por tempo suficiente para a revelação das bandas. Após a
 30

revelação, os géis foram lavados com água destilada e secados em papel

celofane.

4.8 Determinação do pH e temperatura ótimos para a atividade das

enzimas

O comportamento da atividade das enzimas em função do pH foi

estudado incubando-se a solução enzimática e substrato em solução de acetato
de sódio 0,2 mol/L (pH 3,0), tampões acetato de sódio 0,2 mol/L (pH 3,5 a 5,5),
McIlvaine (pH 5,5 a 7,5) e glicina (pH 8,5 a 10,5). Para pHs 8,0 e 11,0 foram
empregadas soluções obtidas a partir de tampões glicina, cujos valores de pH
foram ajustados, respectivamente, com glicina e NaOH. A atividade foi dosada a
50ºC.

O efeito da temperatura sobre a atividade enzimática foi

avaliado incubando-se a mistura de reação em temperaturas de 40ºC a 80ºC. A
atividade foi medida no pH determinado como ótimo.

4.9 Determinação da estabilidade das enzimas frente a variações de

temperatura e pH

As enzimas foram mantidas por 1 h, em ausência de substrato,

em temperaturas de 0ºC a 80ºC. Após esse período, foram tomadas amostras
para ensaiar a atividade enzimática, nas condições de pH e temperatura
ótimos.

A estabilidade das enzimas em diferentes valores de pH foi

avaliada incubando-as em tampões (0,2 mol/L) com pH variando de 3,0 a 11,0,
em ausência de substrato, a 25ºC, por 24 h. Após esse período, foram tomadas
amostras para ensaiar a atividade enzimática nas condições de pH e
temperatura determinados como ótimos para a atividade das enzimas.
 31

4.10 Avaliação da especificidade pelo substrato

A atividade de PG das amostras enzimáticas foi determinada em

pectina de citrus de baixa e alta esterificação (SIGMA, com respectivamente 10%
e 92% de esterificação), pectina de maçã (SIGMA) e pectina com 64-72% de
esterificação (KELCO), seguindo-se o procedimento descrito no item 4.4.
 32

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 Produção de PGs em FES em farelo de trigo

Os fungos mesofílicos A. niger e [Link] foram cultivados em

temperatura de 27ºC e os termofílicos em temperatura de 45ºC.

A atividade de PG foi detectada no meio de cultivo de [Link] a

partir do 2º dia de cultivo, sendo a máxima atividade observada entre o 9º e o
13º dia (24-25 U/g) (Figura 03).

Castilho e colaboradores (2000) obtiveram, em FES, um pico

de produção de PG por [Link] em 70 h em cultivo a 35ºC em meio contendo
uma mistura de farinha de trigo e farelo de soja.
 33

60

50
Atividade PG (U/mL)

40

30

20

10

0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Tempo (dias)

Figura 03: Produção de PG pelos fungos mesofílicos A. niger e P. italicum.

Cultivo a 27ºC em farelo de trigo.
-Ŷ- A. niger, -Ɣ- P. italicum

60

50
Atividade PG (U/mL)

40

30

20

10

0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Tempo (dias)

Figura 04: Produção de PG pelos fungos termofílicos R. pussilus e T. lanuginosus.e

termodúrico A. fumigatus. Cultivo a 45ºC em farelo de trigo.
-Ŷ- R. pusillus, -Ɣ- T. lanuginosus, -Ÿ- A. fumigatus
 34

O fungo P. italicum apresentou atividade a partir do 2º dia de

fermentação. A atividade cresceu linearmente até o 4º dia, quando foi obtido o
pico de produção de 51 U/g. Após atingir o valor máximo, a atividade decaiu
progressivamente extinguindo-se no 9º dia (Figura 03).

O tempo para obtenção do pico de atividade foi semelhante ao

observado para outras espécies de Penicillium, e a produção de PG foi alta em
comparação com o reportado para outras linhagens. Pode-se citar, por
exemplo, Penicillium sp ECG5 que produziu 26 U/g em 4 dias de fermentação a
30ºC em bagaços de cana, laranja e farelo de trigo (MARTIN et al, 2004),
P. viridicatum RFC3 com produção de 30 U/g em 4 dias em farelo de trigo a
30ºC (SILVA et al, 2002),

A Figura 04 mostra que, para o fungo termodúrico A. fumigatus,

detectou-se atividade enzimática a partir do primeiro dia, sendo obtidos dois
picos de produção, um no 6º dia (53,3 U/g) e outro do 12º ao 13º dia (59,4 U/g).
A. fumigatus foi considerado o melhor produtor de PG dentre todos os fungos
empregados no presente trabalho.

Segundo Freitas e colaboradores (2006), A. fumigatus produziu

boas quantidades de PG em FES empregando como fontes de carbono o farelo
de trigo, bagaço de cana-de-açúcar e bagaço de laranja. O fungo chegou a
produzir 80 U/g após 3 dias de incubação a 45ºC em meio de cultivo composto
por farelo de trigo e bagaço de laranja.

O fungo R. pusillus apresentou produção expressiva a partir do

3º dia, atingindo um pico de produção de 16,3 U/g no 6º dia de fermentação
(Figura 04).

Há poucos relatos na literatura de produção de PG por fungos

do gênero Rhizomucor. Martin (2006), estudou a produção de PG pelo fungo
Rhizomucor sp N 31 em farelo de trigo a 45ºC. A máxima produção (98 U/g) foi
obtida no 2º dia de fermentação, mantendo-se constante até o 8º dia.

O fungo T. lanuginosus apresentou produção a partir do

primeiro dia, atingindo um pico de produção de 20,7 U/g no 2º dia de
fermentação (Figura 04). Este resultado é semelhante ao observado por
 35

Sathish-Kumar e Palanivelu (1999) que obtiveram pico de produção de

poligalacturonase em 40 h de fermentação com esta espécie em meio mínimo
com 1% de pectina e 1% de sacarose. Em um outro estudo, realizado com 17
linhagens de T. lanuginosus, Puchart e colaboradores (1999) observaram
produção de pectinases por 14 linhagens durante o crescimento em polpa de
beterraba, com picos de produção após o 3º ou 4º dia de fermentação.

Diferentemente dos demais fungos, para os quais se observou

atividade enzimática durante vários dias de cultivo, para T. lanuginosus só se
observou atividade do 1º ao 3º dia de fermentação.

5.2 Caracterização físico-química das PGs nas soluções enzimáticas

brutas

As amostras enzimáticas utilizadas para a caracterização

físico-química das PGs foram aquelas obtidas no tempo de cultivo em que se
deu o pico de atividade enzimática para cada fungo. Assim, foram usadas
amostras do 11º dia de fermentação para A. niger, 4º dia para P. italicum,
12º dia para A. fumigatus, 6º dia para R. pusillus e 2º dia para T. lanuginosus.

5.2.1 Efeito do pH sobre a atividade e estabilidade das PGs

O pH é um importante fator de influência sobre a atividade de

enzimas. O pH do meio afeta o grau de ionização dos resíduos de aminoácidos
das proteínas (DIXON, 1952), causando variações de carga total, variações
conformacionais ou alterações no sítio ativo das enzimas. Podem ocorrer
também alterações no substrato (GOMES et al, 2006). As alterações podem
ser irreversíveis, podendo causar inativação definitiva da enzima.

A solução enzimática de Aspergillus niger apresentou atividade

de PG em uma ampla faixa de pH (3,0-7,0), com maior atividade em pH 4,5. A
solução enzimática mostrou-se estável em faixa de pH 3,0-8,5, chegando a
manter mais de 90% da atividade original em pH 3,0-7,0 (Figura 05).
 36

100

Atividade Relativa (%)

80
Atividade PG (U/g)
3
60

2
40

1 20

0 0
3 4 5 6 7 8 9 10 11

pH

Figura 05: Efeito do pH sobre a atividade e estabilidade de PG de solução enzimática bruta

obtida no 11º dia de cultivo de [Link] em farelo de trigo.
Tampões: acetato 3,5 – 5,5, Mcllvaine 6,0 – 7,5, glicina 8,0 – 11.
̛ Ŷ ̛ Atividade de PG nas condições de reação descritas ̛Ÿ̛ Estabilidade de PG frente às
variações de pH, quando em ausência de substrato. Reação realizada em pH ótimo (4,5).

Alguns autores, em experimentos com PGs de A. niger, relatam

valores de pH ótimo para atividade PG iguais ou semelhantes ao aqui
apresentado, como por exemplo Labavitch e Rae (1978) e Acuña-Argülles e
colaboradores (1994) que relatam pH ótimo 4,5 e 4,5-5,0, respectivamente. Há
também relatos de valores de pH ótimo diferentes, Benkova (1967), por
exemplo, detectou atividade máxima de PG em pH 6,5-7,0, enquanto que
Heinrichova e Dzurova (1981) obtiveram melhor atividade em pH 4,0. Como já
foi exposto no item 2.7, sabe-se que [Link] expressa simultaneamente
diversas pectinases (BUSSINK et al, 1992; MARKOVIC e JANECEK, 2001) que
podem diferir quanto ao pH ótimo de atividade. Assim, podemos considerar que
para espécies como [Link] que expressam diferentes PGs, o pH ótimo do
complexo pectinolítico pode variar dependendo das proporções em que estas
enzimas são expressas.
 37

A PG produzida por Penicillium italicum apresentou atividade

em uma ampla faixa de pH (4,0 a 8,5) (Figura 06). P. italicum também expressa
diferentes PGs simultaneamente, que podem diferir quanto ao pH ótimo
(RIZZATTO, 2004), sendo esta a possível razão para ocorrência do pH ótimo
na faixa de pH 5,0-6,5.

A literatura relata que outras espécies do mesmo gênero como,

por exemplo, Penicilium sp (MARTIN et al, 2004), P. viridicatum (SILVA et al,
2002) e P. oxalicum (T. IKOTUN, 1984) também apresentaram atividade ótima
em pH 5,0, ou próximo a este valor, como P. capsulatum com pH ótimo 4,7
(GILLESPIE et al, 1990).

As PGs apresentaram boa estabilidade ao pH. A atividade

relativa manteve-se sempre superior a 80% da atividade original em pH entre
3,5 e 11,0. Na faixa de pH entre 3,5 e 7,0 conservou-se mais de 90% da
atividade original (Figura 06). Esta estabilidade demonstrada pela enzima
associada ao fato de que ela apresentou-se bastante ativa em uma ampla faixa
de pH (4,5-7,0) é interessante sob o ponto de vista da sua aplicação em
processos industriais. Isso porque uma enzima pode ser estável, porém inativa,
em uma determinada faixa de pH, o que limita a sua aplicação.

10

100

8
Atividade Realativa (%)

80
Atividade PG (U/mL)

6
60

4
40

2 20

0 0
3 4 5 6 7 8 9 10 11
pH

Figura 06: Efeito do pH sobre a atividade e estabilidade de PG de solução enzimática bruta

obtida no 4º dia de cultivo de P. italicum em farelo de trigo.
Tampões: acetato 3,5 – 5,5, Mcllvaine 6,0 – 7,5, glicina- 8,0 – 11.
̛ Ŷ ̛ Atividade de PG nas condições de reação descritas ̛Ÿ̛ Estabilidade de PG frente
às variações de pH, quando em ausência de substrato. Reação realizada em pH ótimo (5,0).
 38

Para Aspergillus fumigatus, considerado fungo termodúrico,

detectou-se atividade de PG em faixa de pH de 4,0 a 6,0. A atividade, porém,
foi ótima em pH 5,0-5,5 (Figura 07). A enzima teve mais de 80% de sua
atividade original preservada na faixa de pH 4,0-11,0. O mesmo valor de pH
ótimo e um semelhante comportamento frente às variações de pH para PG de
A. fumigatus foi obtido por Freitas e colaboradores (2006) e por Phutela e
colaboradores (2005).

5,0

4,5 100
4,0

Atiividade Relativa (%)

Atividade PG (U/mL)

3,5
80
3,0

2,5

2,0 60

1,5

1,0
40
0,5

0,0
3 4 5 6 7 8 9 10 11

pH
Figura 07: Efeito do pH sobre a atividade e estabilidade de PG de solução enzimática bruta obtida
no 12º dia de cultivo de A. fumigatus em farelo de trigo.
Tampões: acetato 3,5 – 5,5, Mcllvaine 6,0 – 7,5, glicina 8,0 – 11.
̛ Ŷ ̛ Atividade de PG nas condições de reação descritas ̛Ÿ̛ Estabilidade de PG frente às
variações de pH, quando em ausência de substrato. Reação realizada em pH ótimo (5,5).
 39

A PG do fungo Rhizomucor pusillus apresentou atividade

máxima em pH 5,0 (Figura 08). Apesar de R. pusillus ter sido isolado pela
primeira vez há mais de um século, sendo o primeiro fungo termofílico a ser
descrito (MAHESHWARI et al., 2000), há poucos relatos na literatura de
estudos de PGs desta espécie. Foda e colaboradores (1984) relatam maior
atividade de PG produzida por esta espécie em pH 4,5. Henricson e
colaboradores (1999) relataram pH ótimo 6,0 para pectinases produzidas por
R. pusillus.

A estabilidade de PG foi superior a 80% em pH 3,0 a 8,5. A

enzima perdeu drasticamente sua atividade em pHs superiores a 8,5
(Figura 08).

3,0

100
2,5

80
Atividade Relativa (%)
Atividade PG (U/mL)

2,0

60
1,5

40
1,0

0,5 20

0,0 0
3 4 5 6 7 8 9 10 11

pH

Figura 08: Efeito do pH sobre a atividade e estabilidade de PG de solução enzimática bruta

obtida no 6º dia de cultivo de R. pusillus em farelo de trigo.
Tampões: acetato 3,5 – 5,5, Mcllvaine 6,0 – 7,5, glicina 8,0 – 11.
̛ Ŷ ̛ Atividade de PG nas condições de reação descritas ̛Ÿ̛ Estabilidade de PG frente às
variações de pH, quando em ausência de substrato. Reação realizada em pH ótimo (5,0).
 40

Para a PG de T. lanuginosus (Figura 09), observou-se um pico

de atividade em pH 5,0 e outro em pH 7,5, indicando a ocorrência de enzimas
com diferentes valores de pH ótimo. Sathish-Kumar e Palanivelu (1999)
reportaram pH ótimo de 5,5 para uma PG purificada produzida por esta
espécie.

A atividade de PG foi estável em uma ampla faixa de pH. A

atividade residual só foi inferior a 85% da atividade original na faixa de pH de
7,0 a 8,0 (Figura 09).

10

100

Atividade Relativa (%)

80
Atividade PG (U/mL)

6
60

4
40

2
20

0
3 4 5 6 7 8 9 10 11
pH

Figura 09: Efeito do pH sobre a atividade e estabilidade de PG de solução enzimática bruta

obtida no 2º dia de cultivo de T. lanuginosus em farelo de trigo.
Tampões: acetato 3,5 – 5,5, Mcllvaine 6,0 – 7,5, glicina 8,0 – 11.
̛ Ŷ ̛ Atividade de PG nas condições de reação descritas ̛Ÿ̛ Estabilidade de PG frente às
variações de pH, quando em ausência de substrato. Reação realizada em pH ótimo (5,0).
 41

5.2.2 Efeito da temperatura sobre a atividade e estabilidade das PGs

A Figura 10 mostra que, para A. niger, a temperatura ótima

para atividade das PGs foi 50ºC. Acima de 70ºC não se detectou atividade
enzimática. O aumento da temperatura de incubação causou progressiva
redução da estabilidade do complexo enzimático, quando este foi mantido por
1 h em ausência de substrato. A 50ºC, foi mantido aproximadamente 70% da
atividade original. A 60ºC, apenas 16,20% da atividade original foi preservada.

100

Atividade Relativa (%)

80
Atividade PG (U/mL)

60
2

40

1
20

0 0
0 10 20 30 40 50 60 70 80

Temperatura (Cº)

Figura 10: Efeito da temperatura sobre a atividade e estabilidade de PG em solução

enzimática bruta obtida no 11º dia de cultivo de A. niger em farelo de trigo.
Tampão: acetato de sódio pH 4,5.
̛ Ŷ ̛ atividade de PG nas condições de reação descritas ̛Ÿ̛ estabilidade de PG após 1 h
nas temperaturas indicadas, em ausência de substrato.
 42

A PG produzida por P. italicum apresentou atividade máxima

em temperatura de 45ºC. Dentre todos os fungos estudados no presente
trabalho, P. italicum foi o que produziu PG menos termoestável. A 0ºC, 100%
da atividade original foi mantida, porém após incubação por 1 h a 27ºC, em
ausência de substrato, a atividade foi reduzida para 63,80%. A incubação a
60ºC inativou totalmente a PG (Figura 11).

10

9 100

Atividade Relativa (%)

80
Atividade PG (U/mL)

6
60
5

4
40
3

2 20
1

0 0
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Temperatura (ºC)

Figura 11: Efeito da temperatura sobre a atividade e estabilidade de PG em solução enzimática

bruta obtida no 4º dia cultivo de P. italicum em farelo de trigo.
Tampão: acetato de sódio pH 5,0.
̛ Ŷ ̛ atividade de PG nas condições de reação descritas ̛Ÿ̛ estabilidade de PG após 1 h nas
temperaturas indicadas, em ausência de substrato.
 43

A Figura 12 mostra que, para as PGs de A. fumigatus, a

temperatura ótima de atividade foi na faixa de 50-60ºC. A partir de 60ºC a
atividade caiu bruscamente tornando-se desprezível a 80ºC. Com relação a
termoestabilidade em ausência de substrato, houve manutenção de
praticamente 100% da atividade original até 50ºC, com drástica perda de
atividade em temperaturas superiores a esta. A 60ºC a estabilidade foi inferior
a 10%.

A comparação dessa termostabilidade com aquelas

observadas para as PGs das soluções enzimáticas obtidas pelos cultivos de
A. niger e P. italicum, fungos tipicamente mesofílicos, sugere que a propriedade
termodúrica de A. fumigatus leve à produção de PGs mais termoestáveis.

10 120

100
8

Atividade Relativa (%)

Atividade (U/mL)

80
6

60

4
40

2
20

0 0
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Temperatura (ºC)

Figura 12: Efeito da temperatura sobre a atividade e estabilidade de PG em solução

enzimática bruta obtida no 12º dia de cultivo de A. fumigatus em farelo de trigo.
Tampão: acetato de sódio pH 5,5.
̛ Ŷ ̛ atividade de PG nas condições de reação descritas ̛Ÿ̛ estabilidade de PG após 1 h nas
temperaturas indicadas, em ausência de substrato.
 44

A Temperatura ótima para atividade de PGs de R. pusillus,

fungo tipicamente termofílico, foi de 50ºC a 60ºC, com atividade ligeiramente
maior a 60ºC, similar ao observado para as PGs de A. fumigatus. (Figura 13).
Este resultado corrobora o obtido por Foda e colaboradores (1984) que, em
estudos realizados com R. pusillus, obtiveram máxima atividade de PG a 60ºC.
Com relação a termoestabilidade em ausência de substrato, as PGs foram
estáveis até 40ºC, preservando 80% da atividade original. Entretanto, as PGs
perderam completamente a atividade quando incubadas a 50ºC. Apesar deste
fungo ser termofílico, a termoestabilidade foi baixa, sendo menor do que a
estabilidade das enzimas de [Link] (Figura 10), que é mesofílico.

20

18 100

16

Atividade Relativa (%)

80
Atividade PG (U/mL)

14

12
60
10

8
40
6

4 20
2

0 0
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Temperatutra (ºC)

Figura 13: Efeito da temperatura sobre a atividade e estabilidade de PG em solução enzimática

bruta obtida no 6º dia de cultivo de R. pusillus em farelo de trigo.
Tampão: acetato de sódio pH 5,0.
̛ Ŷ ̛ atividade de PG nas condições de reação descritas ̛Ÿ̛ estabilidade de PG após por 1 h
nas temperaturas indicadas, em ausência de substrato.
 45

A máxima atividade de PG produzida por T. lanuginosus foi

detectada a 70ºC. Dentre todos os fungos, T. lanuginosus foi o que apresentou
o mais elevado valor de temperatura ótima. A PG foi estável a 50ºC em
ausência de substrato, conservando nesta temperatura 89% da atividade
original, porém, foi totalmente inativada a 60ºC (Figura 14).

100

Atividade Relativa (%)

80
Atividade PG (U/mL)

3
60

2
40

1 20

0 0
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Temperatura (Cº)

Figura 14: Efeito da temperatura sobre a atividade e estabilidade de PG em solução

enzimática bruta obtida no 2º dia de cultivo de T. lanuginosus em farelo de trigo.
Tampão: acetato de sódio pH 5,0.
̛ Ŷ ̛ atividade de PG nas condições de reação descritas ̛Ÿ̛ estabilidade de PG após 1 h
nas temperaturas indicadas, em ausência de substrato.

Os dados de temperatura ótima para atividade e de

termoestabilidade das PGs brutas permitem concluir que existem diferenças de
comportamento das enzimas dentro desses parâmetros, mesmo quando
produzidas por espécies do mesmo gênero. A comparação entre estes
parâmetros, tendo como fonte das enzimas fungos mesofílicos, termodúrico e
termofílicos, leva-nos a inferir que a temperatura de crescimento do fungo tem
correlação positiva com a temperatura ótima, porém, não é um fator que
garante a termoestabilidade da enzima, pois, como se observou, o fungo
termofílico T. lanuginosus, que cresceu a 45ºC, apresentou PG menos
termostável do que o mesofílico [Link], que cresceu a 27ºC.
 46

Admitindo-se que enzimas mais termostáveis e com maiores

valores de temperatura ótima conferem melhor adaptação às condições
termofílicas, é possível inferir que a pressão seletiva sobre os microrganismos
que se adaptaram à termofilia tenha sido no sentido de selecionar enzimas com
tais características. Assim, a correlação positiva entre a temperatura de
crescimento e a temperatura ótima de atividade enzimática pode estar
relacionada a um processo de seleção natural. De fato, observou-se que os
microrganismos termofílicos T. lanuginosus e R. pusillus e o termodúrico
A. fumigatus, que cresceram a 45ºC, apresentaram PGs com temperaturas
ótimas mais elevadas do que os mesofílicos [Link] e P. italicum, que
cresceram a 27ºC.

Tabela 01: Propriedades das enzimas brutas caracterizadas

Temperatura em
pH em que se que se preservou
preservou pelo pelo menos 70%
menos 70% da Temperatura da atividade
pH ótimo atividade original ótima original

A. niger 4,5 3,0-8,5 e 10,5-11,0 50ºC 50ºC

P. italicum 5,0 e 6,5 3,0-11,0 45ºC 10ºC

A. fumigatus 5,0-5,5 3,0-11,0 50-60º 50ºC

R. pusillus 5,0 3,0-8,5 60ºC 40ºC

T. lanuginosus 5,0 3,0-11,0 70ºC 50ºC

 47

5.3 Determinação das atividades de Endo-PGs nas soluções enzimáticas

brutas

A Figura 15 mostra as atividades de Endo-PG das soluções

enzimáticas obtidas pelo cultivo dos 5 fungos em farelo de trigo. Os dados
indicaram que A. niger e T. lanuginosus produziram as maiores quantidades de
Endo-PG (17 U/mL e 18 U/mL, respectivamente), sendo, também, os fungos
que, proporcionalmente, produziram a menor atividade de Exo-PG (Tabela 02),
enquanto que A. fumigatus produziu enzimas com maior proporção de
atividade de Exo-PG.

20
A E

15
Atividade (U/mL)

C
10 B

D
5

EXO ENDO

Figura 15: Atividades de Exo-PG e Endo-PG obtidas pelo cultivo dos mesofílicos e
termofílicos em farelo de trigo:A - A. niger ; B - P. italicum; C - A. fumigatus; D - R. pusillus;
E - T. lanuginosus.

A Tabela 02 mostra que a atividade de Endo-PG em A. niger foi

12 vezes maior que a de Exo-PG. A existência de uma família gênica de endo-
poligalacturonases em A. niger justifica este resultado (PARENICOVA et al,
1998).
 48

Tabela 02: Razão entre os valores de atividade de Endo-PG e Exo-PG

Fungo Razão entre atividades Endo/Exo

A. niger 12

P. italicum 2,9

A. fumigatus 1,8

R. pusillus 3,5

T. lanuginosus 6,5

5.4 Fracionamento das PGs por filtração em gel e zimogramas

Para avaliar as múltiplas formas de PGs produzidas por cada

fungo, as amostras de solução enzimática bruta foram dialisadas, congeladas,
liofilizadas e ressuspendidas para serem aplicadas em coluna de gel Sephadex
G-100, conforme descrito no item 4.6. Os géis foram preparados de acordo
com o descrito no item 4.7. Foi utilizada pectina de citrus KELCO com 64-72%.

Para Aspergillus niger, foram aplicados 4mL de amostra da

enzima obtida em 11 dias de cultivo do fungo, concentrada com 128,4 U de
enzima. Detectou-se atividade enzimática a partir de 228mL até 552 mL de
eluição. Pode-se observar 7 picos de atividade de PG eluída no cromatograma,
indicando a presença de pelo menos 7 de PGs (Figura 16A). Este resultado é
coerente com a literatura que relata a produção de diversas isozimas por A.
niger (BUSSINK et al, 1992; PARENICOVA et al, 1998). Entretanto, essas
frações não aparecem no zimograma (Figura 16B), no qual apenas uma banda
foi detectada. É possível que o procedimento e as condições do experimento
tenham levado à perda da atividade da enzima, pois como ficou demonstrado
no item 5.2.1, as PGs de [Link] não foram estáveis no pH de corrida da
eletroforese ( pH 8,7).
 49

A B
3,0

2,5
Atividade PG (U/mL)

2,0

1,5 PG II
PG III
1,0
PG I
PG VII
PG IV PG V PG VI
0,5

0,0
200 250 300 350 400 450 500 550 600

Volume de eluição (mL)

Figura 16: (A) Perfil de eluição de PGs produzidas por A. niger em coluna de filtração em gel
Sephadex G-100. (B) Zimograma em PAGE.

Não se observaram grandes ganhos nos valores de atividade

específica em relação à solução enzimática bruta. Nas frações eluídas II e III
houve os maiores aumentos de atividade especifica (Tabela 03).

Tabela 03: Fracionamento de PGs produzidas por [Link] em coluna Sephadex G-100
a partir da solução enzimática bruta obtida obtido em 11 dias de fermentação.

Atividade Proteínas totais Atividade

(U/mL) (mg/mL) Específica (U/mg)
Solução enzimática bruta 3,4 1,90 1,78
Concentrado 32,1 18,60 1,72
Pico da fração eluída I (240-264 mL) 0,40 0,10 4,00
Pico da fração eluída II (318-342 mL) 0,9 0,15 6,00
Pico da fração eluída II (360-384 mL) 0,7 0,30 2,33
Pico da fração eluída IV (426-444 mL) 0,3 0,28 1,07
* As frações eluídas V, VI e VII não constam na tabela devido à baixa recuperação de suas
atividades enzimáticas.
 50

A solução enzimática bruta obtida pelo cultivo de Penicillium

italicum, por 4 dias, em farelo de trigo, foi processada conforme o descrito para
enzima de A. niger. Foram aplicadas 194,6 U de enzima (3,8 mL) na coluna.
Foi detectada atividade em 207 mL a 447 mL de volume de eluição. Foram
obtidos 3 picos de atividade enzimática, indicando a presença de no mínimo 3
PGs distintas (Figura 17A). No zimograma (Figura 17B), foram observadas três
bandas, corroborando o resultado obtido na filtração em gel.

A B
3,5

3,0 PG III

2,5
Atividade (U/mL)

2,0 PG II

PG I
1,5

1,0

0,5

0,0
150 200 250 300 350 400 450 500
Volume de eluição (mL)

Figura 17: (A) Perfil de eluição de PGs produzidas por P. italicum em coluna de filtração em gel
Sephadex -100. (B) Zimograma em PAGE.

Em todas as frações eluídas, houve aumento de atividade

específica em relação à solução enzimática bruta, especialmente na fração I
(70,0 U/mg) (Tabela 04).

Tabela 04: Fracionamento de PGs produzidas por P. italicum em coluna Sephadex

G-100 a partir da solução enzimática bruta obtida em 4 dias de fermentação
Atividade Proteínas totais Atividade
(U/mL) (mg/mL) Específica (U/mg)
Solução enzimática bruta 3,2 1,12 2,86
Concentrado 51,2 21,00 2,44
Pico da fração eluída I (216-231 mL) 0,7 0,01 70,00
Pico da fração eluída II (309-333 mL) 1,0 0,05 20,00
Pico da fração eluída III (387-417 mL) 1,3 0,12 10,83
 51

Foram aplicados 180,5 U (2,5 mL) de PG produzida em 12 dias

de cultivo por A. fumigatus, sendo detectada atividade de 188 mL a 290 mL de
eluição. Apenas um pico de atividade foi obtido. Entretanto, considerando-se a
base larga e o perfil do pico, pode-se deduzir que o método usado não permite
a separação das isoformas (Figura 18A). No zimograma, porém, observou-se
uma grande faixa de degradação, não sendo possível distinguir bandas, porém
pode-se considerar a presença de no mínimo duas PGs, uma de maior massa
molar na zona clara mais abaulada do zimograma, e outra de menor massa
molecular na extremidade da zona de degradação (Figura 18B), assim, a
obtenção de um só pico não permite concluir que apenas uma PG está
presente neste pico. Este resultado é bem diferente do que se observou em
[Link] para o qual vários picos ficaram bem evidentes (Figura 16A); apesar
destas duas espécies pertencerem ao mesmo gênero apresentaram perfis de
eluição totalmente distintos. Considerando que este fungo é termodúrico, é
possível uma correlação entre temperatura de crescimento e expressão de
formas de PG.

3,0 A B
2,5
Atividade PG (U/mL)

2,0

1,5

1,0

0,5

0,0
100 150 200 250 300 350 400 450 500
Volume de eluição (mL)

Figura 18: (A) Perfil de eluição de PGs produzidas por A. fumigatus em coluna de filtração em gel
Sephadex G-100. (B) Zimograma em PAGE.
 52

A Tabela 05 mostra que houve grande redução no valor de

proteínas totais no pico de eluição, em relação a enzima bruta. A atividade
específica do pico (52,5 U/mg) foi aproximadamente 9 vezes maior que da
solução enzimática bruta (5,9 U/mg).

Tabela 05: Fracionamento de PGs produzidas por A. fumigatus em coluna Sephadex

G-100 a partir da solução enzimática bruta obtida em 12 dias de fermentação
Atividade Proteínas totais Atividade
(U/mL) (mg/mL) Específica (U/mg)
Solução enzimática bruta 6,6 1,12 5,9
Concentrado 72,2 14,16 5,10
Pico da fração eluída (233-242 mL) 2,1 0,04 52,5

Na cromatografia realizada com o preparado enzimático de

Rhizomucor pusillus foram aplicados 135,0 U de PG (2,6 mL) produzida em 6
dias de fermentação. Detectou-se atividade enzimática entre 318 mL e 414 mL
de eluição (Figura 19A).
A Figura 19A mostra um único pico, porém este não apresenta
um ápice definido. O zimograma (Figura 19B) revelou claramente 3 bandas
obtidas a partir da solução enzimática bruta deste fungo. Assim, o que parece
ser um pico é, de fato, a sobreposição de três picos que, em decorrência da
limitação de resolução da coluna usada, não foram separados.

Dentre todos os fungos empregados no presente trabalho,

R. pusillus foi o que apresentou a solução enzimática bruta com o menor teor
de proteínas totais (0,60 mg/mL). O pico de eluição apresentou aumento na
atividade específica de aproximadamente 6 vezes e redução de 90% no valor
de proteínas totais em relação à amostra enzimática bruta (Tabela 06).
 53

A B
3,0
PG I
2,5
Atividade (U/mL)

2,0 PG II

1,5

1,0

PG III
0,5

0,0
300 350 400 450 500
Volume de eluição (mL)

Figura 19: (A) Perfil de eluição de PGs produzidas por R. pusillus em coluna de filtração em gel
Sephadex G-100. (B) Zimograma em PAGE.

Tabela 06: Fracionamento de PGs produzidas por R. pusillus em coluna Sephadex

G-100 a partir da solução enzimática bruta obtida em 6 dias de fermentação
Atividade Proteínas totais Atividade
(U/mL) (mg/mL) Específica (U/mg)
Solução enzimática bruta 2,3 0,60 3,83
Concentrado 45 17,90 2,51
Pico da fração eluída (342-354 mL) 1,3 0,06 22,16
 54

Na análise cromatográfica de PGs produzidas por

Thermomyces lanuginosus foram aplicadas 94,5 U de enzima em 4,5 mL. Foi
possível detectar atividade enzimática entre 276 ml e 366 mL de eluição e três
picos de atividade bem distintos (Figura 20A). Este resultado está de acordo
com o observado no zimograma (Figura 20B), que também revelou três frações
para este fungo.

A B
2,0
PG I
PG II
1,6
Atividade (U/mL)

1,2

0,8
PG III

0,4

0,0
260 280 300 320 340 360 380 400 420
Volume de eluição (mL)

Figura 20: (A) Perfil de eluição de PGs produzidas por T. lanuginosus em coluna de filtração em gel
Sephadex G-100. (B) Zimograma em PAGE.

O pico da primeira fração eluída apresentou atividade

específica superior àquela apresentada pela amostra enzimática bruta, o pico
da segunda fração eluída, porém, apresentou atividade específica menor
(Tabela 07).

Tabela 07: Fracionamento de PGs produzidas por T. lanuginosus em coluna Sephadex

G-100 a partir da solução enzimática bruta obtida em 2 dias de fermentação
Atividade Proteínas Atividade
(U/mL) totais (mg/mL) Específica (U/mg)
Solução enzimática bruta 2,8 3,60 0,78
Concentrado 21 14,72 1,42
Pico da fração eluída 1 (282-294 mL) 0,3 0,04 7,5
Pico da fração eluída 2 (324-354 mL) 0,2 0,36 0,55
* A fração eluída III não consta na tabela devido à baixa recuperação de sua atividade
enzimática.
 55

5.5 Caracterização físico-química das PGs dos fungos termofílicos

obtidas por filtração em gel

Frações de PGs, obtidas nas cromatografias em gel Sephadex

G-100, foram caracterizadas para aferir se houve alterações em suas
características em relação àquelas observadas nas soluções enzimáticas
brutas.

5.5.1 Efeitos do pH e temperatura sobre a atividade das PGs e

termoestabilidade das PGs

A Figura 21 mostra que a PG do pico de atividade obtido na

cromatografia de Aspergillus fumigatus (233 mL a 242 mL de eluição)
apresentou o mesmo perfil de atividade frente a variações de pH que o
observado para a enzima da solução enzimática bruta (Figura 07), com pH
ótimo 5,5.

4
Atividade PG (U/mL)

0
3 4 5 6 7 8 9 10 11
pH

Figura 21: Efeito do pH sobre a atividade de PG do fungo A. fumigatus obtida por filtração em gel
SEPHADEX G-100. Tampões utilizados: acetato de sódio 3,5 – 5,5, Mcllvaine 6,0 – 7,5,
glicina 8,0 – 11.
 56

Com relação à influência da temperatura sobre a atividade da

enzima, nota-se um pico de atividade bem definido a 60ºC (Figura 22). Este
resultado é diferente do que foi observado na solução enzimática bruta, em que
o pico de atividade ficou estabelecido na faixa de 50ºC a 60ºC, com
temperatura ótima de 55ºC (Figura 12).

A enzima foi estável a 50ºC, perdendo atividade

acentuadamente em temperaturas superiores, semelhantemente ao observado
na solução enzimática bruta.

5 120

100
4

Atividade Relativa (%)

Atividade PG (U/mL)

80
3

60

2
40

1
20

0 0
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Temperatura (ºC)

Figura 22: Efeito da temperatura sobre a atividade e estabilidade de PG do fungo A. fumigatus

obtida por filtração em gel Sephadex G-100.
̛ Ŷ ̛ atividade de PG nas condições de reação descritas ̛Ÿ̛ estabilidade de PG após 1 h nas
temperaturas indicadas, em ausência de substrato.
 57

A caracterização da PG obtida no pico de atividade da

cromatografia de Rhizomucor pusillus (342 mL a 354 mL de eluição) revelou
atividade enzimática na faixa de pH 4,0-6,5 com maior atividade em pH 5,0
(Figura 23). Na solução enzimática bruta se observou atividade em uma faixa
de pH mais ampla (pH3,0-6,5) (Figura 08).

3
Atividade PG (U/mL)

0
3 4 5 6 7 8 9 10 11
pH

Figura 23: Efeito do pH sobre a atividade de PG do fungo R. pusillus obtida por filtração em gel
Sephadex G-100. Tampões utilizados: acetato de sódio 3,5 – 5,5, Mcllvaine 6,0 – 7,5,
glicina 8,0 – 11.
 58

Diante da variação de temperatura, a enzima eluída de

R. pusillus teve pico de atividade em 60ºC (Figura 24). Na solução enzimática
bruta o pico de atividade não foi bem definido, estendendo-se pela faixa de
50ºC a 60ºC (Figura 13).

A enzima eluída manteve 92% da atividade original a 50ºC,

sendo plenamente estável na zona de 27ºC a 40ºC (Figura 24). Nota-se que a
estabilidade aumentou após o processo de filtração em gel, pois, na forma
bruta, a enzima foi estável até 40ºC (Figura 13), com perda acentuada de
atividade em temperaturas superiores. É possível que fatores responsáveis
pelo decaimento de atividade enzimática, como proteases, presentes na
solução enzimática bruta, tenham sido excluídos na cromatografia.

2,0

1,8 100

1,6

Atividade Relativa (%)

80
Atividade PG (U/mL)

1,4

1,2
60
1,0

0,8
40
0,6

0,4 20
0,2

0,0 0
0 10 20 30 40 50 60 70 80

Temperatura (Cº)

Figura 24: Efeito da temperatura sobre a atividade e estabilidade de PG do fungo R. pusillus

obtida por filtração em gel Sephadex G-100.
̛ Ŷ ̛ atividade de PG nas condições de reação descritas ̛Ÿ̛ estabilidade de PG após 1 h
nas temperaturas indicadas, em ausência de substrato.
 59

A PG I produzida pelo fungo Thermomyces lanuginosus obtida

na cromatografia (282ml a 294mL de eluição) apresentou atividade na faixa de
pH 4,5-6,0, com atividade máxima em pH 5,0-5,5 (Figura 25). Na solução
enzimática bruta, a ação associada das diferentes PGs proporcionou dois
picos, o maior deles se deu em pH 5,0 (Figura 09).

Quanto ao efeito da temperatura (Figura 26), foi observado o

mesmo perfil mostrado pela solução enzimática bruta (Figura 14). A enzima foi
plenamente estável a 40ºC e manteve 89% da atividade original a 50ºC. A
temperatura ótima para a atividade enzimática foi de 70ºC.

1,00

0,75
Atividade PG (U/mL)

0,50

0,25

0,00
3 4 5 6 7 8 9 10 11
pH

Figura 25: Efeito do pH sobre a atividade da 1ª fração de PG do fungo

T. lanuginosus obtida por filtração em gel Sephadex G-100. Tampões utilizados: acetato de sódio 3,5
– 5,5, Mcllvaine 6,0 – 7,5, glicina 8,0 – 11.
 60

1,0

100

0,8

Atividade Relativa (%)

80
Atividade PG (U/mL)

0,6
60

0,4
40

0,2 20

0,0 0
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Temperatura (º)

Figura 26: Efeito da temperatura sobre a atividade e estabilidade da 1ª fração de PG do fungo

T. lanuginosus obtida por filtração em gel Sephadex G-100.
̛ Ŷ ̛ atividade de PG nas condições de reação descritas ̛Ÿ̛ estabilidade de PG após 1 h nas
temperaturas indicadas, em ausência de substrato.

5.6 Determinação da especificidade pelo substrato das PGs dos fungos

termofílicos

As enzimas brutas e eluídas dos fungos termofílicos foram

incubadas em pectinas de citrus com diferentes graus de esterificação, e
pectina de maçã. As reações foram feitas em temperatura e pH ótimo para
cada amostra enzimática.

Para A. fumigatus, observou-se que tanto a amostra enzimática

bruta quanto a eluída, obtida na cromatografia (233 mL a 242 mL de eluição –
Figura 18A), apresentaram alta atividade sobre a pectina com esterificação de
64%-72%. As atividades enzimáticas detectadas para os demais tipos de
pectina foram muito baixas, não sendo observada atividade da enzima eluída
sobre pectinas de citrus de alta e baixa esterificação (Figura 27).
 61

5
A B C

0
Solução Bruta Solução Eluída Solução Bruta Solução Eluída Solução Bruta Solução Eluída I

Pectina de citrus com 92% de esterificação, Pectina de citrus com 64-72% de esterificação,
Pectina de citrus com 10% de esterificação, Pectina de maçã.

Figura 27: Especificidade ao substrato das PGs brutas e eluídas. A: A. fumigatus, B: R. pusillus,
C: T. lanuginosus

As PGs de R. pusillus apresentaram maior atividade quando o

substrato foi pectina de baixa esterificação, com gradativa diminuição da
atividade frente ao aumento do grau de esterificação. A amostra bruta e a
eluída obtida na cromatografia (342 mL a 354 mL de eluição – Figura 19A)
apresentaram o mesmo padrão de atividade sobre as diferentes pectinas de
citrus (Figura 27).

As PGs bruta e eluída obtida na cromatografia (282ml a 294mL

de eluição – Figura 20B) de [Link], semelhantemente ao observado em
R. pusillus, tiveram maior afinidade pela pectina de baixa esterificação (Figura
27). Este resultado é semelhante ao obtido por Sathish-Kumar e Palanivelu
(1999) para uma PG purificada de [Link]. No referido trabalho, a PG
apresentou, em pectina, apenas 33% da atividade observada em pectato, que
é um substrato com baixíssima esterificação. Muitas PGs têm ação preferencial
pela pectina de baixa esterificação (MARTINS, 2006).
 62

5.7 Produção de PG em FES por A. fumigatus em diferentes substratos

Os cultivos de A. fumigatus produziram PGs mais

termoestáveis, e suas soluções enzimáticas brutas apresentaram maiores
atividades de PG (U/g). Por estas razões esta espécie foi selecionada para a
realização de novos cultivos em misturas de farelo de trigo e bagaço de cana-
de-açúcar lavado, em farelo de algodão e em bagaço de laranja lavado.

A Figura 28 mostra que a maior produtividade foi observada no

cultivo em mistura com 80% de farelo de trigo e 20% de bagaço de cana. Neste
caso, a atividade de PG cresceu linearmente até o 4º dia de cultivo (35 U/g).
Do 4º ao 10º dia a atividade estacionou na faixa de 35 a 40 U/g.

As FES em farelo de algodão e em mistura com 50% de farelo

de trigo e 50% de bagaço de cana apresentaram perfis semelhantes de
produção de PG, com picos de atividade média de PG de 22 U/g e 26 U/g,
respectivamente. O bagaço de laranja foi o meio para o qual se observou
menor produtividade, com atividade máxima de PG de 16 U/g alcançada no 7º
dia de fermentação.

Uma comparação entre as Figuras 04 e 27 permite concluir

que, dentre todos os meios de cultivo testados, o que proporcionou maior
produção de PG por A. fumigatus em FES foi aquele usado inicialmente, em
que o farelo de trigo foi a única fonte de carbono.
 63

60

50
Atividade PG (U/g)

40

30

20

10

0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Tempo (dias)

Figura 28: Produção de PG pelo fungo A. fumigatus em diferentes substratos: ̛Ŷ̛ 50% de
farelo de trigo e 50% de bagaço de cana lavado, ̛Ɣ̛ 80% de farelo de trigo e 20% de bagaço de
cana lavado, ̛Ÿ̛ farelo de algodão, ̛ź̛ bagaço de laranja lavado.
 64

6. CONCLUSÕES

O farelo de trigo foi um bom substrato para a produção de

PGs para todos os fungos. A. fumigatus foi capaz de produzir boas
quantidades de PG em misturas de farelo de trigo e bagaço de cana-de-
açúcar lavado e em farelo de algodão, porém o farelo de trigo foi o melhor
meio para produção de PGs por esta espécie.

As PGs dos fungos termofílicos apresentaram maiores

valores de temperatura ótima que as PGs dos mesofílicos. T. laniginosus
produziu a PG com maior temperatura ótima (70ºC). A. fumigatus produziu a
PG mais termoestável, mantendo 100% da atividade original após 1 h de
incubação a 50ºC em ausência de substrato, com temperatura ótima de
50-60ºC para a solução enzimática bruta, sendo estável na faixa de pH 4,0-
11 e com temperatura ótima de 60ºC para a fração obtida no pico de
atividade da filtração em gel.

As soluções enzimáticas brutas de todos os fungos

apresentaram maiores valores de atividade de Endo-PGs do que de Exo-
PGs. As PGs dos fungos termofílicos apresentaram maior especificidade
para pectinas de baixa esterificação. A PG de A. fumigatus apresentou
grande especificidade para pectina com esterificação de 64-72%.
 65

Os zimogramas que apresentaram melhor resolução foram

aqueles realizados para P. italicum e para os termofílicos (T. lanuginosus e
R. pusillus).

Os fungos termofílicos produziram poucas isoformas de PG

(no máximo 3 isozimas). A PG produzida por A. fumigatus apresentou maior
afinidade por pectina com 64-72% de esterificação. As PGs de R. pusillus e
de T. lanuginosus apresentaram maior afinidade por pectinas de baixa
esterificação.
 66

7. LITERATURA CITADA

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