ISSN 679-0154
BOLETIM DE Novembro/ 2018
PESQUISA E
DESENVOLVIMENTO
171
Estratégias para Identificação de Falso-
Positivos no Processo de Obtenção
de Duplo-Haploides em Milho
HAPLÓIDES DIPLÓIDES INIBIÇÃO
ISSN 1679-0154
Novembro/2018
Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária
Embrapa Milho e Sorgo
Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento
BOLETIM DE PESQUISA
E DESENVOLVIMENTO
171
Estratégias para Identificação de Falso-
Positivos no Processo de Obtenção
de Duplo-Haploides em Milho
Isabel Regina Prazeres de Souza
Roberto dos Santos Trindade
Maria José Vilaça de Vasconcelos
Ana Luíza Soares Pereira de Paula
Paulo Evaristo de Oliveira Guimarães
Lauro José Moreira Guimarães
Meire de Cássia Alves
Embrapa Milho e Sorgo
Sete Lagoas, MG
2018
Esta publicação está disponível no endereço: Comitê Local de Publicações
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Normalização bibliográfica
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Tratamento das ilustrações
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Projeto gráfico da coleção
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Editoração eletrônica
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Dos autores
1ª edição
Formato digital (2018)
Todos os direitos reservados.
A reprodução não autorizada desta publicação, no todo ou em parte,
constitui violação dos direitos autorais (Lei nº 9.610).
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)
Nome da unidade catalogadora
Estratégias para identificação de falso-positivos no processo de
obtenção de duplo-haploides em Milho/ Isabel Regina Prazeres de Souza ...
[et al.]. – Sete Lagoas : Embrapa Milho e Sorgo, 2018.
20 p. : il. -- (Boletim de Pesquisa e Desenvolvimento / Embrapa Milho e Sorgo,
ISSN 1679-0154; 171).
1. Melhoramento genético vegetal. 2. Genética vegetal. 3. Zea mays. 4.
Genótipo. I. Souza, Isabel Regina Prazeres de. II. Trindade, Roberto dos Santos.
III. Vasconcelos, Maria José Vilaça de. IV. Paula, Ana Luiza Soares Pereira de. V.
Guimarães, Paulo Evaristo de Oliveira. VI. Guimarães, Lauro José Moreira. VII.
Alves, Meire de Cássia. VIII. Série.
CDD 631.52 (21. ed.)
Rosângela Lacerda de Castro (CRB 6/2749)
© Embrapa, 2018
Sumário
Resumo.......................................................................................4
Abstract.......................................................................................6
Introdução...................................................................................7
Material e Métodos......................................................................8
Resultados e Discussão............................................................11
Conclusões................................................................................18
Agradecimentos........................................................................19
Referências...............................................................................19
4 BOLETIM DE PESQUISA E DESENVOLVIMENTO 171
Estratégias para Identificação de Falso-
Positivos no Processo de Obtenção
de Duplo-Haploides em Milho
Isabel Regina Prazeres de Souza*1
Roberto dos Santos Trindade2
Maria José Vilaça de Vasconcelos3
Ana Luíza Soares Pereira de Paula4
Paulo Evaristo de Oliveira Guimarães5
Lauro José Moreira Guimarães6
Meire de Cássia Alves7
Resumo – A tecnologia de duplo-haploides reduz o tempo para obtenção
de linhagens homozigotas de milho. Entretanto, um dos fatores que afetam
o processo são as plantas diploides (falso-positivos) não eliminadas nas
fases iniciais e que permanecem nas etapas subsequentes, consumindo
tempo e recursos até a sua correta identificação e eliminação. Nesse estudo,
foram analisadas as características morfoanatômicas das células-guarda
do estômato, o número de estômatos e a microgametogênese do grão de
pólen em genótipos haploides, duplo-haploides e diploides de milho, visando
verificar a existência de variabilidade dessas características entre esses tipos
de genótipos que pudesse ser utilizada na fase inicial de seleção na obtenção
de duplo-haploides. Os resultados desse trabalho mostram importantes
informações que permitem distinguir as três classes de plântulas em estádios
iniciais, por meio do número de estômatos no limbo foliar e comprimento das
células-guarda do estômato. Verificou-se que diploides podem ser distinguidos
*1
Eng.-Agrôn., PhD. Em Plant Science, Pesquisadora da Embrapa Milho e Sorgo.*Autor correspondente,
E-mail: [Link]@[Link]
2
Eng.-Agrôn., Dr. Em Genética e Melhoramento de Plantas, Pesquisador da Embrapa Milho e Sorgo.
3
Farmácia, PhD. Plant Molecular Biology, Pesquisadora da Embrapa Milho e Sorgo .
4
Graduanda em Engenharia Química, Centro universitário de Sete Lagoas, UNIFEMM.
5
Eng.-Agrôn., Dr. Em Genética e Melhoramento de Plantas, Pesquisador da Embrapa Milho e Sorgo.
6
Eng.-Agrôn., PhD. Em Genética e Melhoramento de Plantas, Pesquisador da Embrapa Milho e Sorgo.
7
Bióloga, MSc em Genética e Melhoramento de Plantas, Analista da Embrapa Milho e Sorgo.
Estratégias para Identificação de Falso- Positivos no Processo de Obtenção de 5
Duplo-Haploides em Milho
dos duplo-haploides e haploides por meio do número de estômatos e do
comprimento da célula-guarda do estômato. Para número de estômatos, os
diploides apresentaram valores intermediários entre os haploides e duplo-
haploides, média de 8 estômatos/1.000 μm². Para comprimento da célula-
guarda, os diploides apresentaram o maior valor, média de 39,18 μm. Por
meio do acompanhamento do desenvolvimento da microgametogenese do
grão de pólen foi possível distinguir genótipos haploides dos diploides e
duplo-haploides. Para distinção de diploides (falso-positivos), em fase inicial
da obtenção de duplo-haploides, a contagem do número de estomatos/área
e a medida do comprimento das celulas-guarda do estômato constituem
técnicas não destrutivas e de fácil uso em laboratório, sendo que a sua
implementação aumentará a eficiência do processo de produção de duplo-
haploides em milho.
Termos para Indexação: Zea mays L., estômato, célula-guarda,
microgametogenese, carmin propiônico
6 BOLETIM DE PESQUISA E DESENVOLVIMENTO 171
Strategies for Identification of False Positives in
the Production of Double-Haploides in Maize
Abstract - The doubled haploid technology allows obtaining maize inbred lines
in a relatively quickly way. However, one of the factors that affect the process
is the presence of diploid (false positive) plants not eliminated in the initial
stages of duplication remaining in the subsequent stages, consuming time and
resources until their correct identification. In this study, the morpho-anatomical
characteristics of the stomatal guard cells, the number of stomates and the
microgametogenesis of the pollen grain were analyzed in haploid, double-
haploid and diploid maize genotypes to verify the existence of variability for
these characteristics among these genotypes, that could be used in the initial
selection phase of double-haploids process. The results obtained provide
important information that allows distinguishing the three classes of seedlings
at an early stage by means of the number of stomata in the leaf and the
length of the guard cells. For the number of stomates, the diploids presented
intermediate values between haploids and double-haploids, mean of the 8
stomata/1.000 μm². For the length of the guard cells, the diploids had the
highest value, mean of the 39.18 μm2. Through the microgametogenesis of
the maize pollen grain was possible to distinguish haploid genotypes from
diploids and double-haploids. In order to distinguish diploids (false positives),
in the initial phase of the double-haploids process, counting the number of
stomates/area and measuring the guard cells length are non-destructive
techniques and easy to use in the laboratory, and its implementation will
increase the efficiency of the maize double-haploid production process.
Index Terms: Zea mays L., stomates, guard cells, microgametogenesis,
propionic carmine
Estratégias para Identificação de Falso- Positivos no Processo de Obtenção de 7
Duplo-Haploides em Milho
Introdução
Um duplo-haploide (DH) é um genótipo 100% homozigoto obtido pela
duplicação do genoma de indivíduos haploides de forma espontânea ou
artificial (Prigge; Melchinger, 2012). No sistema de produção de linhagens
duplo-haploides a homozigosidade é obtida em apenas uma geração,
eliminando a necessidade de várias gerações de autofecundações (Murovec;
Bohanec, 2012). Desta forma, esta tecnologia tem sido cada vez mais utilizada
em programas de melhoramento de milho para acelerar o desenvolvimento
de linhagens.
A produção de duplo-haploides em milho passa por quatro etapas (Prigge;
Melchinger, 2012): i) indução de haploidia; ii) identificação de possíveis
haploides com base em marcadores fenotípicos; iii) duplicação cromossômica;
e iv) a autofecundação das linhagens obtidas. Para seleção de sementes
haploides, Nanda e Chase (1966) desenvolveram um sistema baseado no
marcador fenotípico expresso pelo gene R1-navajo, com alelos dominantes
presentes apenas no indutor de haploidia. Neste sistema, sementes cujo
endosperma possui pigmentação púrpura, mas com embrião de coloração
branca, indicando presença de genes provenientes apenas do genótipo-
fonte, são selecionados para obtenção de linhagens duplo-haploides.
Quando a indução de haploidia é realizada em populações-fonte de origem
tropical, a pigmentação da semente por antocianina pode variar em extensão
e intensidade, havendo redução ou ausência da marcação de sementes, o
que dificulta ou impede a identificação de haploides putativos (Chaikam et al.,
2015). Este fato possibilita a presença de falsos-positivos na produção de DHs
em campo, demandando a identificação de duplo-haploides putativos com
base em avaliações visuais após estabelecimento no campo, considerando
que as plantas que passam pelo processo de duplicação cromossômica são
frágeis, de baixa estatura e pouca produção de pólen e sementes. Desta
forma, torna-se importante a avaliação de processos que reduzam a margem
de erro implicada na identificação visual pelo sistema R1-nj, e a identificação
de diploides (falsos-positivos) no campo após o processo de duplicação
cromossômica, para maior efetividade no processo de desenvolvimento
de linhagens duplo-haploides de milho, bem como redução de gastos com
insumos, mão de obra e espaço.
8 BOLETIM DE PESQUISA E DESENVOLVIMENTO 171
Alguns estudos visam identificar características das plantas que possam
servir como um indicador na seleção de genótipos haploides. Dentre esses,
Shrestha e Kang (2016) verificaram em pimenta doce (Capsicum annuum L.)
que o comprimento médio do estômato foi maior em diploides, 35.2±2.5μm,
quando comparados aos haploides, 26.4±2.4μm, e essa diferença foi
significativa, permitindo utilizá-la como um indicador do nível de ploidia nessa
espécie.
Przywara et al. (1988) verificaram associação entre o comprimento
das células-guarda dos estômatos na distinção entre plantas haploides e
diploides de Actinidia deliciosa, respectivamente, com 24±1.7μm e 33±2.4μm.
Em milho subtropical, Choe et al. (2012) verificaram que a característica
comprimento médio das células-guarda dos estômatos mostrou-se como um
possível método promissor na identificação de plantas haploides e diploides.
Entretanto, não avaliaram a densidade estomatal no limbo foliar, dada
pelo número de estômatos/área. Estes parâmetros podem ser ferramentas
importantes dentro do processo de produção de DHs para determinar o
nível de eficiência dos indutores de haploidia utilizados e do processo de
duplicação cromossômica.
O objetivo do presente trabalho foi avaliar o uso de características ligadas
à anatomia foliar, como número de estômatos e comprimento da célula-
guarda, e a microgametogênese de grãos de pólen como parâmetros para
distinção entre plantas haploides, diploides e duplo-haploides de milho,
durante o processo de produção de linhagens duplo-haploides.
Material e Métodos
Experimentação e genótipos avaliados
Os experimentos foram realizados na Embrapa Milho e Sorgo, entre
março e setembro de 2017. Foram avaliados três tipos de genótipos de milho:
dois diploides (D), 91500214 e 91500216, dois haploides (H) derivados do
cruzamento dessas mesmas populações com o indutor de haploidia TAIL
P1 x TAIL P2 (91501821 e 91501832), e duas linhagens duplo-haploides
(DH) (91501947 e 91501977), obtidas por tratamento de plântulas haploides
Estratégias para Identificação de Falso- Positivos no Processo de Obtenção de 9
Duplo-Haploides em Milho
derivadas das populações anteriormente citadas com inibidores de mitose,
utilizando-se o protocolo preconizado por Prasanna et al. (2012).
Estes genótipos foram semeados na mesma época em casa de vegetação
com controle de temperatura e umidade, para avaliação da anatomia foliar
e desenvolvimento do grão de pólen durante a microgametogênese. Cada
tratamento foi semeado em oito vasos contendo 25 litros de solos devidamente
adubados, sendo mantidas 3 plantas/vaso, totalizando 24 plantas para cada
tratamento como repetição. A adubação de cobertura e o manejo de irrigação
seguiram todas as recomendações preconizadas para a cultura do milho.
Coleta de amostras de tecido foliar
Para a avaliação da anatomia foliar em diploides, haploides e duplo-
haploides de milho, de cada planta no estádio de V6 coletou-se uma amostra
da quarta folha expandida. A amostra consistiu de uma lâmina de 1 cm de
largura, cortada no sentido transversal, da parte mediana do limbo da quarta
folha da planta de milho, contada de baixo para cima. As amostras, 10 por
tipo (haploide, duplo-haploide e diploide) foram imersas e mantidas em
solução de etanol 70%, com troca diária da solução, durante três dias, sendo
mantidas nessa solução sob refrigeração, até análise.
Comprimento das células-guarda e número de estômatos
A medida e a contagem de estômatos foram realizadas na parte abaxial
da folha, iniciando-se imediatamente abaixo da nervura central. Para a
tomada dos dados dessas duas características empregou-se o microscópio
estereoscópico modelo ZEISS Axio Zoom V16 na magnificação máxima
(112x), empregando escala de medida do equipamento (Figura 1). A área
delimitada pelo aumento de 112x, 0,459 mm2, foi utilizada para a contagem
de estômatos e o comprimento médio das células-guarda foi obtido de 10
desses estômatos.
10 BOLETIM DE PESQUISA E DESENVOLVIMENTO 171
Figura 1. Foto da parte abaxial do limbo foliar demonstrando a medição do compri-
mento, em micrometro, das células-guarda do estômato de planta haploide.
Desenvolvimento do grão de pólen (microgametogênese)
Os pendões foram coletados antes da emergência, quando ainda se
apresentavam encartuchados, e foram imersos em solução de etanol
70%, com troca diária da solução, durante três dias, sendo mantidos
nessa solução na geladeira até as análises. Foi empregado o microscópio
ótico Zeiss Axioplan para fotodocumentar, em diferentes magnificações, a
microgametogênese nos genótipos haploides, duplo-haploides e diploides.
Para as análises, as anteras foram individualmente colocadas sobre a lâmina,
cortadas ao meio com bisturi e ligeiramente pressionadas para liberação do
conteúdo. Foi utilizado o corante carmin propiônico 0,6% (m/v) para coloração
e visualização dos núcleos (Jahier et al., 1996). A lamínula foi disposta sobre
a amostra e selada com esmalte transparente de secagem rápida. As lâminas
foram observadas em diferentes magnificações, sendo a máxima de 1.000X.
As fotomicrografias foram feitas em microscópio ótico Zeiss, empregando-se
câmera digital.
Análises estatísticas
Foram realizadas análises de variância para os dados de número e
comprimento de estômatos, considerando-se as classes de genótipos
avaliados: diploides, haploides e duplo-haploides e os genótipos dentro de
cada classe, em um modelo inteiramente casualizado. Em seguida, efetuou-
Estratégias para Identificação de Falso- Positivos no Processo de Obtenção de 11
Duplo-Haploides em Milho
se o ranqueamento de médias entre materiais e tipos de genótipos avaliados
pelo teste t (LSD). Todas as análises foram realizadas com o auxílio do
programa SISVAR (Ferreira, 2011).
Resultados e Discussão
Número de estômatos e comprimento das células-guarda
Os coeficientes de variação (dados não mostrados) da análise de
variância do tratamento classes de genótipos foram de 10,84% e 12,86%
para as características densidade de estômatos (número de estômatos/área)
e comprimento das células-guarda, respectivamente. Considerando-se os
genótipos como tratamentos, os coeficientes de variação foram de 12,33%
e 10,41% para as características densidade de estômatos e comprimento da
célula-guarda, respectivamente. Em ambas as análises esses valores dos
coeficientes refletem boa precisão experimental nas medições tanto para as
diferentes classes de genótipos avaliados (haploides, DHs e diploides) como
para os diferentes genótipos em estudo.
Para classes de genótipos, a média do número de estômatos/área variou de
5,3 a 12,4 estômatos/1.000 μm2 (Tabela 1, Figura 2), respectivamente, para
duplo-haploides e haploides. A classe diploide apresentou valor intermediário
entre o duplo-haploide e o haploide (8,0 estômatos/1.000 μm2). Para essa
característica, o teste de médias separou os três grupos distintamente.
A mesma tendência foi apresentada na análise por genótipos (Tabela 2,
Figura 3), com o número de estômatos/área de 5,2 estômatos/1.000 μm2
(9150177-DH) e 5,3 estômatos/1.000 μm2 (91501947-DH) para os duplo-
haploides, 12,3 estômatos/1.000 μm2 (91501821-H) e 12,6 estômatos/1.000
μm2 (91501832-H) para os haploides e valores intermediários 7,5
estômatos/1.000 μm2 (9150216-D) e 8,5 estômatos/1.000 μm2 (9150214-
D) para os diploides. Verifica-se que, nas duas análises, por classe ou por
genótipo, os diploides formaram um grupo distinto dos haploides e duplo-
haploides, apresentando os valores intermediários para densidade de
estômatos (número de estômatos/área).
12 BOLETIM DE PESQUISA E DESENVOLVIMENTO 171
Em relação ao comprimento das células-guarda do estômato, a classe de
haploides apresentou o menor valor, 28,11 μm, seguido por duplo-haploides,
35,61 μm e diploides, 39,18 μm (Tabela 1, Figura 4). A mesma tendência
foi observada na análise por genótipos, com os haploides apresentando os
menores valores, 27,7 μm (91501821-H) e (91501832-H), seguido por duplo-
haploides 33,9 μm (9150177-DH) e 36,7 μm (91501947-DH) e diploides 35,0
μm (9150214-D) e 43,4 μm (9150216-D) (Tabela 2, Figura 5). Para essa
característica, comprimento das células-guarda do estômato, tanto por classe
de ploidia como por genótipos, os diploides apresentaram os maiores valores
formando um grupo distinto.
O menor comprimento das células-guarda nos genótipos haploides está
em concordância com Magoon e Khanna (1963), que mencionam que os
haploides, na grande maioria dos casos, apresentam baixo vigor em relação
ao genitor do qual derivaram, isto é evidente a partir da aparência geral da
planta, bem como do tamanho reduzido de órgãos e de células. Entretanto,
considerando os valores de comprimento das células-guarda do estomato,
para as diferentes classes de genótipos, nossos dados estão em concordância
com os obtidos por Choe et al. (2012).
Os dados obtidos e as análises para a característica densidade de
estômatos nos permitem inferir que, tanto pela classe de ploidia como por
genótipos, os haploides podem ser identificados a partir de valores iguais
ou acima de 9 estômatos/1.000 μm2 (Tabelas 1 e 2 e Figuras 2 e 3). Para
a característica comprimento da celula-guarda, tanto pela classe de ploidia
como por genótipos, os haploides podem ser identificados a partir de valores
iguais ou abaixo de 30 μm (Tabelas 1 e 2 e Figuras 4 e 5).
Estratégias para Identificação de Falso- Positivos no Processo de Obtenção de 13
Duplo-Haploides em Milho
Tabela 1. Médias de número de estômatos/área e do comprimento de células-guar-
da de estômatos, medidos na quarta folha, das classes haploides, duplo-haploides e
diploides, de milho tropical.
Densidade de Comprimento de
Tratamentos estômatos células-guarda
(No. de estômatos/1.000 μm2) (μm)
Haploide 12,4 c 28,11 c
Duplo-Haploide 5,3 b 35,61 b
Diploide 8,0 a 39,18 a
Médias seguidas pela mesma letra na coluna não diferem estatisticamente entre si pelo teste t (LSD) a 5% de
probabilidade.
Tabela 2. Médias de número de estômatos e do comprimento de células-
guarda de estômatos, obtidas na quarta folha, dos genótipos diploides (-D),
haploides (-H) e duplo-haploides (-DH).
Densidade de estômatos Comprimento de
Tratamentos (No de estômatos/1.000μm2) células-guarda (μm)
9150214-D 8,5 b 35,0 c
9150216-D 7,5 bc 43,4 a
91501821-H 12,3 a 27,7 d
91501832-H 12,6 a 28,5 d
91501947-DH 5,3 c 36,7 b
9150177-DH 5,2 c 33,9 c
Médias seguidas pela mesma letra na coluna não diferem estatisticamente entre si pelo teste t (LSD) a
5% de probabilidade.
14 BOLETIM DE PESQUISA E DESENVOLVIMENTO 171
Figura 2. Médias do número de estômatos/área no tratamento classes de ploidia
(haploide, diploide e duplo-haploide).
Figura 3. Média de número de estômatos/área para cada genótipo avaliado.
Estratégias para Identificação de Falso- Positivos no Processo de Obtenção de 15
Duplo-Haploides em Milho
Figura 4. Comprimento médio de células-guarda de estômatos no tratamento classes
de ploidia (diploide, duplo-haploide e haploide).
Figura 5. Comprimento médio de células-guarda de estômatos para cada genótipo
avaliado.
16 BOLETIM DE PESQUISA E DESENVOLVIMENTO 171
Desenvolvimento de grãos de pólen em genótipos
haploides, duplo-haploides e diploides
Neste trabalho, os genótipos haploides foram derivados de cruzamentos
de populações-fonte com o indutor de haploidia TAIL P1 x TAIL P2. E os
genótipos duplo-haploides foram provenientes da duplicação cromossômica
de parte desses haploides por meio do tratamento com colchicina. O
desenvolvimento da microgametogênese foi observado nesses dois tipos
de genótipos e em plantas diploides, isto é, plantas derivadas da população
original.
Na Figura 6 (A e B) verifica-se elevado número de grãos de pólen
pequenos e degenerados em plantas haploides. As setas indicam
micrósporos uninucleados que apresentam tamanho dentro da normalidade
e núcleo corado. A primeira etapa da formação de gametas masculinos no
milho corresponde à fase de micrósporo uninucleado, onde a região central
é ocupada por vacúolo grande e o núcleo e o citoplasma são empurrados
para a periferia (Hu, 2005). Os haploides têm somente metade do número de
cromossomos do diploide, apresentam comportamento citológico peculiar e
grau variável de esterilidade das partes reprodutivas, cuja meiose altamente
anormal resulta em gametas estéreis (Magoon; Khanna, 1963). Entretanto,
esses autores também mencionam que, ocasionalmente, pode ocorrer uma
restituição do núcleo em razão da falha em uma das divisões meióticas. A
duplicação do número cromossômico do haploide, de forma espontânea
ou induzida pela aplicação de agentes antimitóticos, como a colchicina, por
exemplo, recupera a condição diploide restaurando a fertilidade. Esta planta,
chamada de duplo-haploide, será homozigota, isto é, cada cromossomo terá
sua cópia (Santos; Zanettini, 2001; Trindade et al., 2017).
Os genótipos duplo-haploides, obtidos da duplicação cromossômica dos
haploides, apresentaram produção normal de grãos de pólen. Na Figura
7 verifica-se que em ambas as fotos os grãos de pólen apresentam dois
núcleos bem corados resultantes da primeira mitose (cariocinese), sendo um
vegetativo e o outro da célula germinativa.
Em milho, o grão de pólen é liberado no estádio trinucleado, pois o núcleo
da célula generativa se divide mais uma vez, isto é, passa pela segunda
mitose (cariocinese) formando dois gametas masculinos, enquanto o
Estratégias para Identificação de Falso- Positivos no Processo de Obtenção de 17
Duplo-Haploides em Milho
núcleo vegetativo permance indiviso (Mahendru; Sarkar, 2000). Nessa fase
(Figuras 8 e 9), dificilmente se visualizam núcleos, pois o grão de pólen está
todo preenchido com amido, a não ser que se utilize técnica específica de
coloração. Couto et al. (2015) empregaram teste colorimétrico para estimar a
viabilidade dos grãos de pólen, incluindo o carmin propiônico, e consideraram
viáveis quando estes se coravam de vermelho e os não corados foram
considerados inviáveis. O desenvolvimento do grão de pólen dos genótipos
duplo-haploides foi o mesmo apresentado pelos indivíduos diploides, e pelo
tipo de coloração que apresentaram demonstram a prevalência de grãos
de pólen viáveis. Entre os genótipos haploides verificou-se elevado número
de micrósporos degenerados e um número extremamente escasso de
micrósporos apresentando desenvolvimento aparentemente normal.
A B
V
Figura 6. Setas indicam micrósporos uninucleados corados com carmin propiônico
0,6% (m/v) de plantas haploides dos genótipos 91501832 (A - 200x) e 91501821 (B
- 100x) e os demais micrósporos de tamanho menor são degenerados. V= vacúolo.
NV
NV CG
CG
Figura 7. Grãos de pólen de plantas duplo haploides, do genótipo 91501977, após
primeira mitose (cariocinese) apresentando-se binucleados, magnificação de 1.000x.
NV= núcleo vegetativo e CG = célula germinativa.
18 BOLETIM DE PESQUISA E DESENVOLVIMENTO 171
A C
B
Figura 8. Grãos de pólen apresentando preenchimento total com amido corado com
carmin propiônico 0,6% (m/v) (A - 400x e B - 200x) e antera seccionada ao meio
apresentando liberação de grãos de pólen (C - 100x) de plantas duplo-haploides do
genótipo 91501947.
A B
Figura 9. Grãos de pólen do genótipo diploide 91501947 nas magnificações de 400x
(A) e 200x (B).
Conclusões
No processo de obtenção de linhagens duplo-haploides de milho,
considerando-se as classes de genótipos haploides, duplo-haploides e
diploides, foi possível identificar os diploides (falso-positivos), em fase inicial
do processo, por meio da densidade de estômatos e do comprimento das
células-guarda de estômatos. Foi possível também distinguir os haploides
por meio do desenvolvimento da microgametogenese.
Entretanto, a medida do comprimento de células-guarda de estomatos e
de densidade de estômatos é uma técnica mais eficiente, fácil, não destrutiva
e, sendo implementada, aumentará a eficiência na produção de duplo-
Estratégias para Identificação de Falso- Positivos no Processo de Obtenção de 19
Duplo-Haploides em Milho
haploides permitindo distinguir os diploides (falsos-positivos) de plantas
haploides e duplo-haploides num estádio mais inicial.
Agradecimentos
Agradecemos ao assistente Célio Ramos das Neves pelo apoio nos
trabalhos em casa de vegetação e laboratório.
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CGPE 14883