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NÃO PODE FALTAR
CONFECÇÃO, COLORAÇÃO DE ESFREGAÇOS SANGUÍNEOS E
ALTERAÇÕES DOS ERITRÓCITOS
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Fernando Marques Rodrigues
seõçatona reV
PRATICAR PARA APRENDER
A análise de lâminas hematológicas adequadamente coradas constitui uma parte
importante do hemograma. É durante a avaliação microscópica das células
sanguíneas que se consegue confirmar resultados de parâmetros obtidos por meio
dos testes automatizados e que se obtêm informações que antes passariam
desapercebidas pelas análises manuais.
No entanto, o processo de avaliação de uma lâmina hematológica requer alguns
cuidados básicos, a começar pela sua confecção. O esfregaço exige determinados
cuidados para que seja corretamente estendido sobre a lâmina e para que as
células não fiquem todas sobrepostas umas às outras, atrapalhando sua adequada
caracterização. Adicionalmente, outra etapa pré-analítica fundamental para o
processo é a correta coloração do esfregaço, segundo a bateria de corantes
hematológicos escolhidos.
Como exemplo do que foi exposto, imagine a seguinte situação: você é um analista
de laboratório e solicita ao técnico de laboratório que confeccione um esfregaço
sanguíneo de uma amostra cujos hematócrito e hemoglobina apresentaram
valores diminuídos. O técnico realiza a manipulação conforme preconizado nos
procedimentos operacionais padrão do laboratório. Porém, no momento de
visualizar a lâmina, percebem-se algumas hemácias com coloração ligeiramente
mais arroxeada do que o normal. Você solicita ao técnico que refaça o esfregaço, e
novamente é observado o mesmo padrão de coloração, ainda que ele confirme
que a técnica está sendo executada adequadamente. Será que está ocorrendo um
erro pré-analítico na coloração não detectado pelos profissionais? Em caso
contrário, esse achado é coerente com alguma situação patológica?
A leitura bem executada de uma lâmina hematológica deve ter seus achados
reportados em laudo e, portanto, figura como uma análise fundamental à
interpretação clínica dos achados do hemograma. Dessa forma, veremos nesta
seção quais fatores influenciam a qualidade dessa análise.
Bons estudos!
CONCEITO-CHAVE
ANÁLISE HEMATOLÓGICA
Os principais pontos a serem analisados e interpretados no hemograma são: a
série vermelha, representada pelas hemácias e seus componentes estruturais e
funcionais; a série branca, indicada pelos leucócitos; e a série plaquetária,
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composta pelas plaquetas. Todos esses três pontos podem ser avaliados a partir
da análise de esfregaços sanguíneos.
A análise de um esfregaço de sangue devidamente confeccionado e bem corado,
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com o auxílio de um microscópio óptico, é um dos exames mais eficientes para a
avaliação e detecção de anormalidades dos componentes do sangue. A contagem
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de leucócitos e plaquetas pode ser estimada por meio da avaliação microscópica
da lâmina e posterior verificação do resultado fornecido pelo analisador
hematológico automatizado. A contagem diferencial leucocitária também pode
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ser obtida por esse meio, e a morfologia das séries vermelha, branca e plaquetária
pode ser avaliada quanto à presença de alterações. No entanto, apesar dos
avanços da automação no laboratório de hematologia, ainda é necessária a
presença de profissionais habilidosos e experientes para revisar sistematicamente
as lâminas selecionadas.
A avaliação do esfregaço sanguíneo compreende três partes: análise da porção
espessa, em que as células se encontram aglomeradas; análise da porção mediana,
com as células em quantidade e qualidade ideais para a visualização microscópica;
e a análise da parte fina, na qual poucas células se encontram presentes.
Comumente, no meio laboratorial, é costume utilizar os termos cabeça, corpo e
cauda, respectivamente, para se referir a essas porções do esfregaço sanguíneo.
Além da disposição ideal do material sobre a lâmina, outro fator essencial para a
evidenciação correta do material refere-se ao procedimento de coloração,
efetuado com a utilização de corantes específicos, tais como como Leishman,
Giemsa, May- Grünwald e Wright.
REFLITA
A avaliação macroscópica da lâmina pode fornecer indicativos da
alteração que será observada na microscopia ou do resultado da contagem
a ser verificada. Uma extensão de sangue que é mais azulada que o normal
pode sugerir a presença de determinadas proteínas no plasma ou
policromasia; uma extensão com aparência granular pode indicar presença
de aglutinação eritrocitária, evidenciando a presença de crioaglutininas;
buracos na extensão podem significar que o paciente tem hiperlipidemia e
que os parâmetros de série vermelha devem ser revisados quanto à
possível interferência da lipemia no hemograma.
COMPREENDENDO A TÉCNICA DE ESFREGAÇO DE SANGUE
Para que se possa confeccionar uma extensão sanguínea adequada, o primeiro
cuidado que se deve ter é com a qualidade da lâmina onde o procedimento será
realizado. As lâminas de vidro ideais geralmente medem 75 mm de
comprimento/25 mm de largura/1 mm de espessura. Essas lâminas devem ser
transparentes, planas e livres de imperfeições, tais como ranhuras e ondulações.
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Quando lâminas novas são adquiridas no comércio, podem vir limpas ou sujas: as
limpas geralmente têm um pedaço de papel entre cada uma delas, enquanto as
sujas não têm. Ainda que sejam limpas, no entanto, as lâminas novas devem ser
mantidas mergulhadas em etanol absoluto por um período mínimo de 24 horas.
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Em seguida, é preciso realizar sua secagem com gaze estéril, e seu armazenamento
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deve ser feito em caixas fechadas, de onde as lâminas serão retiradas somente
antes do uso.
Por sua vez, as lâminas novas sujas devem ser imersas em detergentes de uso
laboratorial e, em seguida, passar por enxaguamento em água corrente. Enquanto
as lâminas estão sendo enxaguadas, é possível observar se estão desengorduradas
– se estiverem, a água escoará facilmente por elas. Posteriormente, as lâminas
também devem ser mergulhadas em etanol absoluto por 24 horas e, após esse
tempo, secas com gaze estéril antes de seu armazenamento, de forma a
minimizar a formação de umidade em suas superfícies.
As lâminas que serão reutilizadas (lâminas com extensões não coradas, lâminas
com extensões coradas, lâminas com ou sem óleo de imersão) devem ser
mergulhadas em solução detergente quente (60°C) por um período mínimo de 30
minutos. Em seguida, com uma esponja macia, a extensão sanguínea deve ser
retirada de cada lâmina, e posteriormente as lâminas são enxaguadas e
novamente mergulhadas em detergente (temperatura ambiente) por 30 minutos.
Por fim, as lâminas devem ser lavadas em água corrente, para visualização da
eficácia da retirada de gorduras residuais, seguindo-se as etapas descritas de
mergulho em etanol e armazenamento em caixas até o uso.
Uma vez que as lâminas se encontram devidamente viáveis para utilização, para
minimizar os efeitos da distribuição celular irregular, recomenda-se utilizar
extensoras um pouco mais estreitas que a lâmina de vidro, de modo que as partes
laterais da extensão não se encostem nas bordas da lâmina de vidro. Na prática,
uma segunda lâmina de vidro é frequentemente utilizada como extensora, e esse
procedimento é aceitável desde que a extensora tenha bordas arredondadas ou
chanfradas.
PREPARAÇÃO DA LÂMINA
Uma boa lâmina extensora contribui muito para que se forme uma satisfatória
distribuição celular no final da extensão. A lâmina extensora deve ser colocada na
frente do sangue; posteriormente, deve ser puxada para trás, estando com toda a
sua superfície de seu dorso encostada na outra lâmina. Quando a extensora tocar
o sangue, deve-se esperar que ele se espalhe, por capilaridade, por toda a
superfície de contato da extensora. Em caso de distribuição do sangue desigual por
toda a extensora, deve-se, com um movimento delicado e sem levantá-la, movê-la
para a esquerda e a direita, para que o sangue se distribua uniformemente.
O volume de sangue a ser utilizado deve permitir a confecção de uma extensão
com espessura e comprimento adequados: quanto maior a quantidade de
sangue a ser estendida, mais grossa ficará a extensão e quanto menor a
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quantidade, mais fina será a extensão. A gota de sangue deve ser posicionada a
aproximadamente 1 cm de um dos lados da lâmina.
A velocidade do movimento determina o comprimento da extensão: quanto mais
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rápido ele for, mais curta ficará a extensão e vice-versa. O ângulo formado
entre a extensora e a lâmina que receberá a extensão influencia também o seu
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comprimento: quanto menor for esse ângulo, mais comprida e vice-versa. Da
mesma forma, a suavidade e a uniformidade no movimento determinam a
qualidade da extensão: quando se coloca muita força, a extensora vai parando, e
isso leva o esfregaço a apresentar falhas ao longo de sua extensão. O processo
completo de extensão da lâmina pode ser visualizado na Figura 1.4.
Figura 1.4 | Passos da confecção de um esfregaço sanguíneo
Fonte: Wikimedia Commons.
Em uma extensão sanguínea bem executada, as células se distribuem
aleatoriamente ao longo da lâmina, conforme o seu tamanho: as células maiores,
tais como neutrófilos e monócitos, tendem a localizar-se nas bordas da extensão,
enquanto as menores, tais como linfócitos, se localizam mais ao centro. Extensões
mal executadas interferem na distribuição ao acaso das células e podem levar a
erros, tanto nos resultados das contagens diferenciais quanto na avaliação
morfológica das células sanguíneas.
O ideal é que a extensão sanguínea seja confeccionada no momento da coleta e
sem anticoagulantes. Contudo, excelentes resultados são obtidos com amostras
em EDTA preparadas entre 2 a 4 horas após a coleta, sendo este o padrão
adotado pela maioria dos laboratórios clínicos no Brasil. Tais amostras em EDTA
devem ser sempre homogeneizadas após o armazenamento prolongado por um
mínimo de 20 inversões completas dos tubos ou durante 5 minutos em
homogeneizadores automatizados, haja visto que podem ocorrer alterações
morfológicas significativas decorrentes do tempo e temperatura de
armazenamento inadequados de extensões, dificultando o reconhecimento da
morfologia celular.
Uma vez que o esfregaço sanguíneo foi confeccionado, ele deve ser
adequadamente corado para visualização microscópica. As técnicas de coloração
hematológica classificam os corantes como ácidos, básicos e neutros, sendo que as
combinações desses corantes se tornaram a base para as colorações de
Romanowsky, Giemsa, Wright, May-Grünwald e por panótico.
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MÉTODOS DE COLORAÇÃO HEMATOLÓGICA
Os corantes hematológicos podem ser divididos em corantes tradicionais e
corantes rápidos. Atualmente, as extensões de sangue periférico coradas pelos
métodos e corantes de Wright, May-Grünwald-Giemsa e panótico rápido são as
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mais utilizadas no Brasil, devido a praticidade de uso e por propiciarem grande
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discriminação das morfologias celulares hematológicas.
ASSIMILE
Os artefatos decorrentes do preparo de extensões sanguíneas, tanto
manuais como automatizadas, podem ocorrer devido a falhas técnicas na
confecção da extensão, secagem lenta em condições de umidade, fixação
insuficiente ou tardia e contaminação dos fixadores e corantes com água,
bem como utilização de lâminas engorduradas ou extensoras contendo
ranhuras. Alguns tipos celulares também podem ser danificados no preparo
inadequado da extensão.
A base de todos os métodos de coloração hematológica é similar,
independentemente da técnica considerada. Os corantes são misturas de sais
ácidos (eosina) e sais básicos (azul de metileno e derivados). O complexo eosina-
azul de metileno tem afinidade por estruturas celulares citoplasmáticas ácidas
(eosinofílicas) ou básicas (basofílicas), ao passo que os corantes eosina-derivados
de azul de metileno apresentam afinidade por componentes citoplasmáticos e
nucleares.
A característica fundamental dos métodos tradicionais de coloração é que eles
foram extensivamente padronizados ao longo dos anos e são solidamente aceitos
como referências no âmbito laboratorial.
O tempo de coloração deve ser padronizado e/ou cronometrado, para que todas
as lâminas tenham a mesma qualidade de coloração, não importando o
profissional que realize esse procedimento. Os tempos podem ser modificados
conforme a preferência tintorial, mas uma vez estabelecido o tempo ideal para o
laboratório, esse deve ser seguido por todos. Geralmente, é de comum acordo que
uma extensão sanguínea bem corada mostre eritrócitos com tonalidade rosa
salmão, linfócitos e neutrófilos com núcleo com coloração púrpura intensa e
monócitos com núcleos corados em púrpura mais leve.
Os melhores resultados em relação à coloração costumam ser obtidos em
extensões recém-confeccionadas, em virtude de o sangue fresco agir como um
tampão no processo de coloração. Extensões coradas após uma semana ou mais
adquirem coloração azulada intensa.
Por fim, o controle de qualidade dos corantes hematológicos é intimamente
associado ao controle de qualidade da confecção das extensões, visto que esta
última impacta diretamente sobre a qualidade das colorações. Portanto, somente
partindo-se do pressuposto que uma extensão foi devidamente confeccionada,
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não se pode afirmar com certeza que o esfregaço se encontra viável para leitura
microscópica. Assim, a qualidade das colorações é um componente fundamental
para que uma lâmina seja satisfatória para a análise microscópica visual.
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EXEMPLIFICANDO
Contagens de leucócitos e de plaquetas extremamente altas podem ser
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detectadas por meio de presença de pequenos pontilhados azuis nos
arredores da cauda da extensão, ao passo que extensões extremamente
finas e com tonalidade clara podem sugerir uma amostra de paciente com
anemia.
ERITROGRAMA E DISTÚRBIOS DA SÉRIE ERITROCITÁRIA
A análise conjunta de vários itens avaliados nas diferentes etapas de execução do
hemograma contribui muito para a precisão do diagnóstico clínico, assim como
fundamenta a conduta terapêutica. Tal raciocínio se aplica precisamente às
doenças hematológicas da série vermelha, especialmente anemias e policitemias.
Essas doenças podem se apresentar de diferentes maneiras, distintas entre si em
termos de causas, patogenia, sintomatologia e tratamento. O laboratório clínico,
por sua vez, ao analisar amostras de sangue de pacientes com essas condições,
permite ao clínico diferenciar os vários tipos existentes, o que viabiliza a
individualização do tratamento e da propedêutica.
Anemia é definida como a diminuição do número de hemácias circulantes,
acarretando uma diminuição de oxigenação tecidual. Várias condições levam ao
aparecimento de anemia por meio de dois mecanismos básicos: redução da
sobrevida das hemácias (exemplo: hemólise ou sangramento) ou diminuição da
capacidade de produção dessas células pela medula óssea. Eventualmente, ambos
os mecanismos estão presentes.
Assim, se há redução da vida das hemácias, a medula óssea responde com o
aumento da eritropoiese e a consequente elevação do número de reticulócitos. Por
outro lado, se o problema se relaciona à produção, o paciente apresentará
reticulócitos normais ou baixos, mesmo na presença de anemia.
A investigação laboratorial deve iniciar com o hemograma e a contagem de
reticulócitos. Pacientes que apresentam reticulocitose devem ser investigados no
que diz respeito a hemorragias ou causas hemolíticas. A pesquisa de sangramento
precisa incluir os tratos gastrintestinais alto e baixo (endoscopia, verificação de
sangue oculto nas fezes e colonoscopia podem ser necessários). Em mulheres, o
sangramento uterino anormal por disfunção hormonal, miomatose ou mesmo
neoplasias malignas são causas frequentes de anemia ferropriva e devem ser
investigadas ativamente.
No caso de contagem reticulocitária normal ou baixa, o próximo índice a ser
avaliado é o tamanho da hemácia, laboratorialmente indicado pelo VCM. A maior
parte das causas de anemia apresentará VCM normal (anemias normocíticas). No
entanto, a presença de VCM baixo (microcítica) ou alto (macrocítica) geralmente
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sugere um número restrito e específico de diagnósticos diferenciais, facilitando o
raciocínio clínico. A deficiência de ferro, causa mais comum de anemia
ambulatorial, é caracteristicamente microcítica, tendo como principal diagnóstico
diferencial a talassemia. A deficiência de folato ou vitamina B12 é tipicamente
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macrocítica.
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Didaticamente, as anemias podem ser divididas em dois grandes grupos: anemias
arregenerativas e regenerativas. As anemias arregenerativas são aquelas nas quais
a causa base localiza-se na medula óssea (defeito central), geralmente por
deficiência de algum fator nutricional essencial à eritropoiese adequada. Incluem-
se nesse grupo as anemias carenciais, como a anemia ferropriva e as anemias
megaloblásticas, assim como as anemias por depósito anormal ou acúmulo, como
a anemia sideroblástica.
Por sua vez, as anemias regenerativas possuem causa periférica, isto é, a
diminuição da massa eritrocitária é decorrente não de problemas na medula
óssea, mas sim de defeitos intrínsecos aos eritrócitos ou de fatores externos que
levam à diminuição de sua sobrevida. Destacam-se nesse contexto as anemias por
anomalias de membrana, hemoglobinopatias, enzimopatias e anemias hemolíticas
imunomediadas.
A anemia por deficiência de ferro é uma condição na qual a carência de ferro
impede a formação do anel heme e, consequentemente, de hemoglobina e
eritrócitos para transportar oxigênio aos tecidos. Os eritrócitos estarão diminuídos,
microcíticos (VCM diminuído) e hipocrômicos (HCM reduzido e CHCM variável, pois,
se a anemia for recente, pode ser normocítica); anisocitose (RDW aumentado),
ovalocitose moderada, codocitose e eliptocitose também podem ser observadas.
As anemias megaloblásticas constituem um grupo heterogêneo de doenças
provocadas por defeitos na síntese de DNA e caracterizadas pela presença de
hemácias macrocíticas (VCM elevado) no sangue periférico. As principais causas de
anemia megaloblástica são as deficiências de vitamina B12 e/ou ácido fólico, sendo
que o motivo mais comum para a deficiência clínica de vitamina B12 é a ausência
de fator intrínseco nas secreções gástricas, provocada por gastrite atrófica
autoimune, historicamente conhecida como anemia perniciosa.
As hemácias apresentam alterações no tamanho (anisocitose) e forma
(poiquilocitose), normalmente são grandes e ovais e, em casos avançados, podem
apresentar pontilhado basofílico e restos nucleares (corpúsculos de Howell-Jolly e
anéis de Cabot). A anemia é macrocítica e o aumento do VCM é proporcional à
diminuição da concentração de hemoglobina. A alteração nuclear em neutrófilos é
um sinal precoce de megaloblastose, consistindo na presença de
hipersegmentação nuclear com neutrófilos de seis ou mais lobos nucleares.
No grupo das anemias regenerativas, as hemoglobinopatias são condições
hereditárias caracterizadas por mutações nos genes que codificam as cadeias
globínicas. Essas mutações resultam em alterações que podem ser qualitativas,
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como a substituição de aminoácidos culminando no aparecimento de
hemoglobinas variantes observadas na anemia falciforme; ou quantitativas,
quando há redução na síntese de cadeias, como nas talassemias.
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Talassemia é o nome dado às alterações do gene da globina associadas à
diminuição da síntese de uma ou mais cadeias globínicas (alfa, beta, delta) e à
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consequente redução da síntese da(s) hemoglobina(s). As talassemias vinculadas à
cadeia delta não possuem significado clínico, ao passo que mutações nos genes da
cadeia alfa (alfa-talassemia) e beta (beta-talassemia) podem ter significância clínica,
já que há impacto na síntese da hemoglobina A (alfa-2-beta-2), a principal
hemoglobina na vida adulta. Laboratorialmente, há anemia microcítica e
hipocromia de moderada a acentuada, com a concentração de hemoglobina
podendo variar. Esfregaços de sangue periférico mostram anisocitose acentuada
com microcitose, hipocromia e poiquilocitose com presença de células em alvo,
dacriócitos e hemácias fragmentadas. Há reticulocitose e pode haver inclusões
basofílicas e, raramente, eritroblastos circulantes.
A anemia falciforme é uma hemoglobinopatia caracterizada pela hemoglobina S
em homozigose, enquanto pacientes heterozigotos são assintomáticos. A
hemoglobina S está sujeita à polimerização quando submetida a baixas tensões de
oxigênio, levando à falcização da hemácia em pacientes homozigotos. As hemácias
falcizadas são rígidas e expressam maior quantidade de moléculas de adesão,
fatores que contribuem para a oclusão vascular responsável por grande parte das
manifestações clínicas associadas à doença. Ao longo do primeiro ano, conforme
aumenta a concentração de hemoglobina S, começa a haver diminuição da
concentração de hemoglobina e elevação da contagem de reticulócitos: em geral, o
VCM fica normal e o RDW aumentado.
As anomalias de membrana eritrocitária herdadas são denominadas conforme a
morfologia característica do eritrócito, observada no esfregaço de sangue
periférico: por exemplo, esferocitose (esferócitos), eliptocitose (eliptócitos),
estomatocitose (estomatócitos), etc. Os defeitos de membrana englobam grupos
heterogêneos de anemias hemolíticas causadas tanto por alteração na organização
estrutural da membrana celular (exemplos: esferocitose hereditária, eliptocitose
hereditária, piropoiquilocitose hereditária e ovalocitose do sudeste asiático), como
por alteração na função de transporte da membrana (exemplos: hidrocitose e
xerocitose hereditária). Podem ser adquiridas ou herdadas, assim como primárias
ou secundárias, sendo que nesses casos as poiquilocitoses representam um dos
achados laboratoriais mais significativos, além da reticulocitose variável.
ASSIMILE
A grande variedade de etiologias das anemias torna o papel do laboratório
clínico essencial no diagnóstico inicial e acompanhamento de pacientes
com tais condições. Para tanto, é necessário que o profissional de
laboratório esteja familiarizado com a terminologia técnica das alterações
eritrocitárias e, assim, os laudos dos exames laboratoriais possuam
informações coerentes.
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REFERÊNCIAS
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