PCR (Reação em Cadeia da Polimerase ):
A técnica de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) é uma das mais usadas em Análises clínicas
e Biologia molecular, nesta usamos a enzima DNApol com o intuito de fazermos sucessivas
polimerização até chegarmos no nosso produto final, ou seja, fazemos múltiplas cópias de uma
região/fragmento//segmento específico do DNA e para isto usamos os primers, que vão indicar onde
começa e térmica a região desejada.
★ PCR CONVENCIONAL:
No PCR (Reação em Cadeia da Polimerase) convencional usamos DNApolimerese com a finalidade
de replicarmos regiões específicas do DNA, para isso usamos primers (5’ -- 3’) que se
ancoram/paream na fita simples recém desnaturadas, permitindo que a DNApol o reconheça e
comece a polimeriza até o final do mesmo, amplificando a região desejada a cada ciclo (cada fita de
DNA dá origem a duas novas fitas da região desejada).
Nos ciclos ao aumentarmos a temperatura (94-95°C) as fitas se separam/desnaturam, em seguida
chegamos a uma certa temperatura (55-65°C) onde resfriamos até chegarmos na temperatura de
reconhecimento/anelamento dos primers nas fitas e posteriormente aumentamos a temperatura
(depende da enzima) para o funcionamento/polimerização da DNApol fazendo com que a mesma
reconhece os primers, de modo que todo esse processo é feito em um equipamento conhecido
como termociclador.
OBS: ultimamente usamos uma enzima termoestável (sobrevive em ambientes extremos) com o
funcionamento ótimo a 72°C.
No termociclador colocamos a amostra e programamos de acordo com a enzima as temperaturas e
a quantidade de ciclos a serem feitas (normalmente são 30), mas temos limite de detecção da
técnica, impedindo que o equipamento consiga diferenciar quantidades diferentes de ciclos, o que
não ocorre na PCR em tempo real.
★ PCR EM TEMPO REAL:
Na PCR em tempo real fazemos o acompanhamento da curva de amplificação em tempo real de até
150 pares de bases. Na técnicas além do par de primers específicos para a região que desejamos
amplificar, também podemos obter:
-Sistema/Sonda TaQ: funciona como prímer, contém em uma de suas extremidades um repórter,
ou seja, uma molécula/fluorófilo que “emite” um sinal indicando que houve a emissão, além do
repórter a Sonda Taq conta também com um Quencher na sua outra extremidade e é o responsável
por absorver a sinal emitido.
A medida que a polimerização acontece, a DNApol chega na região que contém a Sonda Taq que
está pareando na região interna da sequência desejada, fazendo com que o Repórter se solte e o
Quencher deixe de absorver o sinal, permitindo que o repórter emita o sinal em comprimento de
onda livremente e assim sabemos que a polimerização está ocorrendo e podemos fazer o
acompanhamento em tempo real.
-SYBR Green: usamos uma molécula/corante que reconhece fita dupla recém polimerizada,
intercalando-as na medida que ocorre a polimerização.
A medida que ocorre a amplificação na PCR em tempo real podemos ver os Gráficos de amplitudes
quantitativa, com as curvas indicando:
- linha de base: leitura mínima do detector;
- CT: números de ciclos;
- fase exponencial: pouca saturação;
- platô: estabilização da amplificação.
OBS: nas curvas de amplificação quanto maior a quantidade (massa) de DNA, menor a quantidade
de ciclos para chegar no sinal desejado e vice-versa.
Na PCR em tempo real trabalhamos o mínimo com triplicatas de replicação técnica (erro dentro da
mesma amostra - triplicata) de amostras biológicas.
Replica biológicas/do indivíduo (amostras diferentes) X replicação técnica (erro dentro da mesma
amostra - triplicata)
A PCR em tempo real pode ser:
-quantitativa: quantificamos a quantidade de DNA por exemplo, usado normalmente para exames
como os de carga viral.
-relativa: analisamos a expressão de um gene que varia em relação a outro que não varia na
mesma condição, nos dando gráficos onde tememos:
GOI: gene de interesse (alvo);
HKG (Rause kip): gene com menor variação para aquilo que vc quer analisar, como os da Actina,
Kinases, Ubiquitina, Ribossomal, etc
Vamos ter CT para ambos os genes permitindo fazermos cálculos relativos, ou seja, comparar a
expressão de um gene que varia em relação a outro que não varia na mesma condição de modo
que, valor de CT próximos para um mesmo gene indica que o mesmo não varia muito, enquanto se
observamos CTs diferentes para um mesmo gene, indica uma variação, nos permitindo calcular qual
gene expressou mais (ambos na mesma condição).
★ Outros tipos de PCR:
-qPCR: PCR quantitativa, nos permite quantificar quanto de material genético contém na amostra;
-RT-PCR: transcrição reversa seguida de PCR
-RTq-PCR: transcrição reversa seguida de PCR quantitativa
-nPCR: nested PCR, com terminação
-dPCR: PCR digital, nos permite sequenciar uma única célula
★ Equipamentos:
-Termociclador: usamos tubos, strip (vários tubos) ou placas de 96 poços.
- Gel de Agarose: podemos adicionar além dos componentes naturais, como Formamida, Glicerol,
Tween20 (detergente) ou DMSO que ajudam na melhor visualização da banda.
A PCR se baseia no par de primer e o mesmo deve ter:
- eficiência: relacionada ao número de ciclos. Se o primer se anelar a si mesmo (Self anile) ou o par
de primer fizer um Cross (pareamento) a eficiência diminui;
- especificidade: o par de primer precisa se anelar a região correta, amplificando somente o que
desejamos;
- Fidelidade: fiel a sequência de DNA amplificada (número de erros acrescentados a sequência) e
serve para quantificar algo;
- Evitar bases repetitivas;
- os últimos 5 pares devem ter TCTAT;
- na amplificação de DNA genômico vamos amplificar toda a região (com exons e íntrons).