UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA

INSTITUTO DE QUÍMICA

Rafael de Almeida Cordeiro

Síntese e avaliação da atividade antimicrobiana e da citotoxicidade de um

peptídeo conjugado ao ácido gálico

Projeto De Monografia De Graduação

Brasília - DF
2023/2
 UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA
INSTITUTO DE QUÍMICA

Rafael de Almeida Cordeiro

Síntese e avaliação da atividade antimicrobiana e da citotoxicidade de um

peptídeo conjugado ao ácido gálico

Projeto de trabalho de conclusão do curso de

Bacharelado em Química apresentado ao
Instituto
de Química da Universidade de Brasília como
requisito parcial de obtenção do título de
bacharel em Química.

Orientador(a): Dr. Guilherme Dotto Brand

Brasília – DF
2023/2
 Rafael de Almeida Cordeiro

Síntese e avaliação da atividade antimicrobiana e da citotoxicidade de um

peptídeo conjugado ao ácido gálico

Projeto de trabalho de conclusão do curso de

Bacharelado em Química apresentado ao
Instituto
de Química da Universidade de Brasília como
requisito parcial de obtenção do título de
bacharel em Química.

Orientador(a): Dr. Guilherme Dotto Brand

_________________________________________

Prof. Dr. Guilherme Dotto Brand

Orientador

_________________________________________

Prof. Dra. Erica Cristina Moreno Nascimento

Membro Titular

_________________________________________

Prof. Dr. Ângelo Henrique de Lira Machado

Membro Titular

_________________________________________

Prof. Dra. Katia Mara de Oliveira

Membro Suplente
 RESUMO

A resistência a antibióticos é um desafio global porque compromete a eficácia dos

tratamentos tradicionais e pressiona o desenvolvimento de novas estratégias para
combater agentes patogênicos humanos. O ácido gálico (GA), um polifenol distribuído
em uma variedade de plantas do reino vegetal, tem demonstrado atividades
antimicrobianas, anti-inflamatórias e antioxidantes. No entanto, a biodisponibilidade e
os efeitos farmacocinéticos resultantes de seu metabolismo são fatores limitantes para
seu uso. Dados os atuais benefícios de aprimoramento da seletividade de drogas em
relação a seus alvos biológicos e o aumento significativo na permeabilidade celular,
os conjugados peptídeo-droga apresentam uma alternativa viável para aumentar
seletivamente a atividade antimicrobiana, possibilitando a redução da citotoxicidade
pelo agente terapêutico. O presente projeto apresenta o desenho de um Peptídeo-
Droga Conjugado (PDC) formado pelo peptídeo intragênico antimicrobiano (IAP),
Hs11, e GA, no qual o peptídeo em questão mostrou ação antimicrobiana em
concentração micromolar, apresentando também grande amplitude de alvos e boa
seletividade, podendo ser comparável aos Peptídeos Antimicrobianos (AMPs). Logo,
considerando que o IAP Hs11 e o GA exibem atividades semelhantes, porém com
mecanismos de ação potencialmente distintos, busca-se avaliar os efeitos
antimicrobianos e citotóxicos do conjugado em comparação à ação dessas atividades
nas entidades separadamente. A avaliação da citotoxicidade do conjugado é
necessária para futuras avaliações de sua atividade anti-inflamatória, manifesta tanto
no GA quanto no Hs11 separadamente.

Palavras-chave: Peptídeo intragênico antimicrobiano, ácido gálico, conjugado

peptídeo droga.
 ABSTRACT

Resistance to antibiotics is a global challenge because it compromises the

effectiveness of traditional treatments and puts pressure on the development of new
strategies to combat human pathogens. Gallic acid (GA), a polyphenol distributed in a
variety of plants in the plant kingdom, has demonstrated antimicrobial, anti-
inflammatory, and antioxidant activities. However, the bioavailability and
pharmacokinetic effects resulting from its metabolism are limiting factors for its use.
Given the current benefits of enhancing drug selectivity towards biological targets and
the significant increase in cellular permeability, peptide-drug conjugates present a
viable alternative to selectively increase antimicrobial activity, enabling a reduction in
cytotoxicity by the therapeutic agent. This project presents the design of a Peptide-
Drug Conjugate (PDC) formed by the intragenic antimicrobial peptide (IAP), Hs11, and
GA, in which the peptide in question has shown antimicrobial action at micromolar
concentrations, also demonstrating a broad range of targets and good selectivity,
comparable to Antimicrobial Peptides (AMPs). Therefore, considering that IAP Hs11
and GA exhibit similar activities but with potentially distinct mechanisms of action, the
aim is to evaluate the antimicrobial and cytotoxic effects of the conjugate in comparison
to the action of these activities separately. The assessment of the conjugate's
cytotoxicity is necessary for future evaluations of its anti-inflammatory activity,
manifested in both GA and Hs11 separately.
Keywords: Intragenic antimicrobial peptide, gallic acid, peptide-drug conjugate.
 Tabela de aminoácidos

Símbolo de uma Símbolo de três

Aminoácido
Letra letras
Ácido aspártico D Asp
Ácido glutâmico E Glu
Alanina A Ala
Arginina R Arg
Asparagina N Asn
Cisteína C Cys
Fenilalanina F Phe
Glicina G Gly
Glutamina Q Gln
Histidina H His
Isoleucina I Ile
Leucina L Leu
Lisina K Lys
Metionina M Met
Prolina P Pro
Serina S Ser
Tirosina Y Tyr
Treonina T Thr
Triptofano W Trp
Valina V Val
LISTA DE ABREVIATURA

ACN: Acetonitrila
ARE: Antioxidant Response Element
AMP: Peptídeos antimicrobianos
CAT: Catalase
CAIQ: Central Analítica do Instituto de Química
CLAE: Cromatografia líquida de alta eficiência
DCM: Diclorometano
CD14: Cluster of Differentiation 14
DIC: N, N’-diisopropilcarbodiimina
DIPEA: N-N’-diisopropiletilamina
DMSO: Dimetilsulfóxido
DMF: N, N-dimetilformamida
ELISA: Enzyme-linked immuno sorbent assay
EsI: Electrospray
Fmoc: 9-fluorenilmetoxicarbonil
GSH: Glutathione
GPx: Glutathione Peroxidase
HBTU: 2-(1H-benzotriazol-1-il) -1,1,3,3-tetrametiluroicohexafluorofosfato
HCCA: Ácido α-ciano 4-hidroxicinâmico
HDP: Peptídeos de defesa de hospedeiro
IAP: Peptídeos antimicrobianos intragênico
IL: Interleucina
IR: Razão da infecção
KCN: Cianeto de potássio
LIMI: Laboratório de imunologia e inflamação
LPB: LPS binding protein
LPS: Lipopolissacarídeos
MICs: Concentração mínima inibitória
NF-kB: Fator nuclear kB
Oxyma: Acetato de etil 2-ciano-2- (hidroxiimino)
P: Fosfato
ROS: Reactive Oxygen Species
SOD: Superoxide Dismutase
SPFS: Síntese de peptídeos em fase sólida
TFA: ácido trifluoroacético
TLR4: Receptor do tipo 4
TNF-α: Fator alfa de necrose de tumor
TLR-4: Toll-like receptor
UCB: Universidade Católica de Brasília
UnB: Universidade de Brasília
 SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO................................................................................................ 9
1.1 Peptídeos antimicrobianos (AMPs)........................................................9
1.2 Peptídeos curtos em folhas- β..............................................................12
1.3 Peptídeos anti-inflamatórios.................................................................13
1.4 Peptídeos Intragênicos Antimicrobianos.............................................16
1.5 Ácido Gálico............................................................................................21
1.6 Conjugados Peptídeo-Droga.................................................................24
2. JUSTIFICATIVA.............................................................................................27
3. METODOLOGIA.............................................................................................28
3.1 Síntese de peptídeo em fase sólida......................................................30
3.1.1 Acoplamento do ácido gálico..........................................................32
3.1.2 Clivagem.........................................................................................33
3.2 Purificação do conjugado por cromatografia líquida de alta
eficiência.................................................................................................33
3.3 Análise do conjugado por espectrometria de massa..........................34
3.4 Análise de MS e MS/MS..........................................................................34
3.5 Determinação de MIC.............................................................................35
3.6 Citotoxidade do conjugado...................................................................36
4. PRÓXIMAS ETAPAS E CRONOGRAMAS...................................................36
5. REFERÊNCIAS..............................................................................................38
1 INTRODUÇÃO

1.1 Peptídeos antimicrobianos (AMPs)

Os antibióticos são responsáveis por salvar vidas. A capacidade de tratamento de
doenças infecciosas por parte desses fármacos foi uma descoberta que levou ao seu
uso em diversos setores da sociedade. No entanto, no atual cenário, a resistência das
bactérias em função do abuso de antibióticos tem apresentado desafios à comunidade
científica na busca por novas drogas que sejam eficientes e pouco tóxicas (Bassetti et
al., 2013).

Os peptídeos antimicrobianos integram parte do sistema imunológico inato dos

organismos multicelulares contra uma gama de microrganismos, incluindo bactérias,
fungos, parasitas e vírus. Essa classe de peptídeos se distribui nos 6 reinos, desde
bactérias e plantas até complexos sistemas imunológicos de animais, e são expressos
para realizar um primeiro combate a microrganismos invasores e mediar as respostas
inflamatórias dos hospedeiros. Estas moléculas apresentam as vantagens de possuir
baixa toxicidade para células eucarióticas, uma alta estabilidade térmica, alta
solubilidade e baixo peso molecular (LI et al., 2019). Sua atividade antimicrobiana
decorre de interações com componentes intracelulares e da modulação da
permeabilidade de suas membranas, o que dificulta a aquisição de resistência por parte
das bactérias. (WANG et al., 2019a).

A parede celular de uma bactéria corresponde à primeira barreira de defesa contra

agentes extracelulares. As bactérias Gram-negativas possuem duas membranas, onde
a membrana interna envolve seus componentes citoplasmáticos, e a membrana externa
separa a célula de seu ambiente circundante. A composição da membrana externa
dessas bactérias é constituída por uma bicamada, na qual a porção interna contém
fosfolipídios e a externa apresenta, além de outras biomoléculas, um componente
estrutural, um tipo de glicolipídeo, denominado lipopolissacarídeo (LPS) (ZHANG;
MEREDITH; KAHNE, 2013).

O LPS é um glicolipídeo grande composto por três domínios estruturais: o lipídio

A, o oligossacarídeo do núcleo e o antígeno O. Ele desempenha funções estruturais para

9
a manutenção da integridade das bactérias, atuando como uma barreira contra a entrada
de moléculas pequenas e hidrofóbicas, o que confere resistência a compostos
antimicrobianos.

Para garantir a estabilidade dessas estruturas, que contêm grupos fosfato com
carga negativa, ocorre a formação de interações poliônicas com cátions divalentes, como
Ca2+ e Mg2+(HIROSHI, 2003). Além de exercer papel estrutural, os LPS desencadeiam
uma resposta imunológica induzindo citocinas inflamatórias em células
imunocompetentes por meio do receptor Toll do tipo 4 (TLR4) (CAVAILLON, 2018). Uma
resposta exacerbada dessa via pode levar o hospedeiro a sepse (Levin etal.,1970).

Os AMPs compartilham entre si algumas propriedades físico-químicas que

garantem sua ação antimicrobiana e seletividade, embora parcial, para células
procarióticas. Eles são comumente catiônicos, ou seja, possuem uma carga líquida
positiva. A carga positiva desses peptídeos é responsável pelas primeiras interações
eletrostáticas com os componentes carregados negativamente das membranas
bacterianas, como os LPSs presentes em bactérias Gram-negativas, ou os ácidos
teicóicos ou teicurônicos encontrados nas membranas das bactérias Gram-positivas (MI
et al., 2017). Um aumento na carga líquida total dos peptídeos promove uma melhor
afinidade entre o AMP e a membrana bacteriana, resultando em uma ampliação de sua
atividade antibacteriana (ZHOU et al., 2019). No entanto, o aumento na natureza
catiônica pode também promover a atividade hemolítica. A hidrofobicidade, dentre as
propriedades físico-químicas, desempenha o papel de modulador na interação do
peptídeo com a membrana bacteriana, sendo que valores baixos estão associados à
perda da capacidade de romper a membrana celular. (J. Sun et al., 2014). A
hidrofobicidade deve, assim como a carga, ser mantida dentro de limites, uma vez que
um aumento exacerbado nessa propriedade resulta em maior atividade hemolítica e
perda de seletividade contra o agente patogênico alvo (WIEPRECHT et al., 1997). A
anfifilicidade é um dos fatores mais relatados para a atividade biológica dos AMPs
catiônicos. Com a segregação de resíduos polares e hidrofóbicos em faces opostas da
estrutura molecular, os AMPs se organizam diante de células compostas por
fosfolipídeos, resultando em um vetor momento hidrofóbico significativo (EDWARDS et
al., 2016). Na busca por melhorias nesse parâmetro, estudos demonstram que estruturas
10
perfeitamente anfipáticas estão relacionadas ao aumento da atividade antimicrobiana,
no entanto, a citotoxicidade aumenta simultaneamente. Por outro lado, anfipatias
imperfeitas, resultantes da incorporação de resíduos hidrofóbicos em porções
moleculares hidrofílicas, levaram a uma redução nos efeitos indesejados da atividade
hemolítica(TAN; FU; MA, 2021).

Os AMPs são, frequentemente, desestruturados em solvente aquoso e

subsequentemente a sua interação com a membrana, tendem a se organizar em um
processo de minimização energética, fazendo com que essas moléculas apresentem
estruturas secundárias variadas de acordo com sua composição e/ou suas interações
intra e inter-residuais, onde há comumente 3 tipos de estruturação: α-hélice (Figura1-A),
fita-β (Figura 1-C), randômica (Figura 1-B), ou uma mistura delas (Figura 1-D).

Figura 1 - Representação em cartoon das estruturas secundárias mais comuns em AMPs. (A)
Conformação de α-helice (representada na cor laranja), estrutura observada no AMP LL-37 ao estar em
presença de micelas; (B) Conformação estendida, estrutura observada quando os AMPs não adotam
conformação 3D definida, como a Indolicidina; (C) Conformação fita-β (representado na cor verde),
normalmente favorecida pela presença de ligações de dissulfeto (representado na cor amarela), por
exemplo, peptídeo da aranha gomesina derivado de um gancho-beta. (D) Conformação com junção das
estruturas anteriores, por exemplo, o peptídeo de inseto CSαβ defensina formicina que contém elementos
de α-helice e fita-β; Imagem extraída de Koehbach & Craik, 2019.

11
 A conformação desses são obtidas, em sua maior parte, quando em contato com
o patógeno, tal qual os peptídeos catiônicos anfifílicos que não apresentam estruturas
definidas em soluções aquosas. As estruturas dos AMPs se relacionam a suas atividades
e mecanismos de ação bactericida (Torres et al., 2019a).

Distribuídos entre insetos, peixes, anfíbios, mamíferos e plantas, os AMPs

estruturados em α-hélice são os mais frequentes. Estes AMPs apresentam de 12 a 40
aminoácidos, e adotam estruturas helicoidais quando em contato com membranas ou
solventes orgânicos que as mimetizam. Para além de estruturas alfa-helicoidais, os
AMPs possuem também como estruturas secundárias as folhas- β que se estruturam em
ambiente semelhantes aos AMPs de α-hélice. Resíduos de cisteína são encontrados
nessa estrutura para formação de ligações dissulfeto, que proporcionam estabilização e
atividade antimicrobiana (J. Wang et al., 2019b).

Folhas-β exibem características notáveis, destacando-se pela resistência

significativa à hidrólise promovida por peptidases. A manutenção da integridade
estrutural dessas moléculas é alcançada por meio de ligações de hidrogênio, um
elemento crucial que exerce impacto na conformação tridimensional e nas propriedades
funcionais nos sistemas biológicos. A estabilidade de sua estrutura secundária é
sustentada não apenas pelas ligações de hidrogênio, mas também por interações
hidrofóbicas das cadeias laterais, em um mecanismo similarmente observado em
peptídeos α-helicoidais.

1.2 Peptídeos curtos em folhas- β

O uso clínico de AMPs é limitado por fatores associados à sua seletividade,

toxicidade sistêmica e custo de síntese. AMPs sintéticos curtos foram desenvolvidos com
o intuito de otimizar sua seletividade e eficácia, ao mesmo tempo que minimizam a
toxicidade sistêmica e custos de produção. Assim, acredita-se que peptídeos curtos
sejam alternativas viáveis para o contorno de seus problemas inerentes (Zhong et al.,
2017).

12
 Um estudo apresentou uma estratégia de síntese para peptídeos curtos em
folhas-β, com 8 a 12 resíduos de aminoácidos, com base em AMPs encontrados
naturalmente. Para obtenção de sua estrutura anfifílica, propriedade necessária a
ruptura da membrana de bactérias, resíduos de aminoácidos intercalados com
características hidrofóbicas, representados por X (Val e Ile ou Phe ou Trp), e catiônicas
representados por Y (Arg ou Lis), foram usadas em busca da recorrência (X1Y1X2Y2)n-
NH2, onde o número de repetições (n) variou entre 2 e 3. Esses peptídeos foram
produzidos com o C-terminal amidado, uma vez que essa modificação fortalece o caráter
catiônico da molécula, eliminando a carga negativa do carboxiterminal. Isso resulta em
um aumento da atividade antimicrobiana(ONG; GAO; YANG, 2013).

Os peptídeos resultantes demonstraram atividade antimicrobiana de amplo

espectro contra diferentes tipos de microrganismos, incluindo bactérias Gram-positivas
e Gram-negativas, bem como leveduras. Notavelmente, as sequências otimizadas
exibiram alta seletividade e menor toxicidade in vivo em comparação com antibióticos
clinicamente utilizados. Além disso, esses peptídeos mostraram eficácia na inibição do
crescimento bacteriano em biofilmes e dispersão de biomassa. A capacidade de ligação
e neutralização de endotoxinas, sem causar efeitos citotóxicos significativos nas
concentrações necessárias para atividade funcional, destaca a promissora aplicabilidade
desses peptídeos em contextos clínicos (Ong et al., 2013).

1.3 Peptídeos anti-inflamatórios

Os processos inflamatórios são mecanismos de defesa promovidos por danos

celulares causados por fatores químicos ou físicos, bem como por patógenos que atuam
como promotores de inflamação. Quando não tratada, uma resposta imunológica
desregulada e prolongada leva à destruição de tecidos, o que, em caso de persistência,
pode resultar em doenças crônicas no organismo(WEISS, 2008). A sepse está inserida
em um tipo de inflamação prolongada, que pode ser causada por diferentes
microrganismos, incluindo bactérias(LAKSHMIKANTH et al., 2016).

13
 As bactérias do tipo Gram-negativa são conhecidas por promover inflamações
crônicas. A detecção de endotoxinas em pacientes com septicemia causada por essas
bactérias demonstrou a capacidade infecciosa desses organismos (Levin et al., 1970). A
resposta imunológica a essas bactérias resulta da indução de citocinas pró-inflamatórias
devido à presença de estruturas encontradas em sua camada externa, os LPSs
(VENKATARANGANAYAKA ABHILASHA; KEDIHITHLU MARATHE, 2021).

O processo inflamatório promovido por LPS é mediado pela liberação de TNF-α,

IL-6 e IL-1β, que desempenham um papel importante nos processos infecciosos
mencionados (Wu et al., 2015). Os LPS, também conhecidos como endotoxinas, têm um
papel essencial no processo mencionado, pois são liberados em situações como morte
celular, divisão celular e em resposta ao tratamento com antibióticos, frequentemente
associado a infecções. Uma vez liberados, essas endotoxinas são identificadas pelos
fagócitos mononucleares, que incluem monócitos e macrófagos e fazem parte do
sistema imunológico do hospedeiro. O reconhecimento do LPS ocorre quando ele forma
um complexo com uma proteína de ligação conhecida como LPB (LPS-binding protein).
Essa formação do complexo acelera a ligação do LPS ao CD14, um receptor encontrado
principalmente em fagócitos mononucleares. A interação entre essas duas entidades
desencadeia a ativação dos fatores de transcrição NF-κB como resultado da interação
com o TLR-4 (Toll-like receptor). Esses fatores de transcrição são vitais na regulação da
resposta imunológica (WRIGHT et al., 1990).

Os peptídeos antimicrobianos têm demonstrado potencial atividade contra

infecções devido à sua capacidade de suprimir citocinas em processos inflamatórios
desencadeados por LPS, os quais induzem a secreção de citocinas pró-inflamatórias,
incluindo TNF-α, IL-1β, IL-6 e IL-8(NAGAOKA et al., 2001; ROSENFELD; SHAI, 2006).

Yosef Rosenfeld e Yechiel Shai propuseram que as propriedades anti-endotoxina

podem ser observadas tanto pela ligação direta dos peptídeos ao LPS, impedindo sua
interação com o LBP, quanto pela ligação ao receptor CD14. (ROSENFELD; SHAI,
2006). A ligação entre o AMP e o LPS desempenha um papel crucial na atividade
antimicrobiana e anti-inflamatória. A carga líquida positiva e a hidrofobicidade são

14
propriedades físico-químicas direcionadas à interação com o LPS da membrana
fosfolipídica, desagregando sua estrutura e impedindo sua associação ao LBP. Uma vez
inibida a formação do complexo LPS-LBP, a cascata inflamatória é suprimida (Y. Sun &
Shang, 2015).

O LPS participa na formação de fatores pro-inflamatórios por meio do fator

nuclear-κB (NF-κB), que é uma proteína que atua como um fator de transcrição
responsável pela produção de sinais inflamatórios em resposta a agentes patogênicos.
Ele é composto por um grupo de cinco estruturas conhecidas como RelA (p65), RelB, c-
Rel, p50 (e sua precursora p105) e p52 (e sua precursora p100). Esses grupos podem
se associar uns aos outros na forma homodimérica ou heterodimérica. A clássica forma
encontrada de NF-kB consiste em um heterodímero das subunidades p65/RelA e
p50(BALDWIN JR., 2001).

Quando o NF-kB não está estimulado, encontra-se no citoplasma ligado a uma

proteína inibitória chamada IkB. No entanto, na ausência dessa ligação, o IkB é
fosforilado e degradado, o que resulta na translocação do NF-kB para o núcleo, onde se
liga a genes-alvo, que estão envolvidos na produção de mediadores em processos
inflamatórios e oxidativos(GLEZER et al., 2000). A subunidade p50 do heterodímero p50-
p65 foi relatada por seu papel no reconhecimento da sequência de DNA, onde se
encontram os genes alvos que serão expressos (HISCOTT; KWON; GÉNIN, 2001).

Dada a importância da ativação da NF-kB pelo seu reconhecimento e ligação aos

elementos de kB, com sua estrutura dimerizada p-50-p65 como forma prevalente, um
peptídeo chamado AIP-6 (do inglês, anti-inflammatory peptide 6) foi avaliado na
supressão da via inflamatória NF-kB. A atividade anti-inflamatória desse peptídeo foi
relatada pela sua inibição na formação da ligação entre a porção p65 e os elementos de
kB. O peptídeo demonstrou uma inibição seletiva na transcrição mediada por NF-kB ao
se ligar à subunidade p65, prejudicando consequentemente a ligação entre NF-kB e a
sequência de DNA responsável pela transcrição de genes inflamatórios (WANG et al.,
2011). Os diferentes mecanismos mostrados ao longo da sessão podem ser observados
esquematicamente na figura 2:

15
Figura 2 - Principais estágios na indução de sepse por bactérias e os pontos potenciais nos quais
peptídeos catiônicos podem intervir. A administração de antibióticos pode desencadear a liberação de
endotoxinas (LPS), que posteriormente se ligam à proteína ligadora de LPS (LBP) circulante no sangue.
Esse complexo é então transferido para o receptor CD14 localizado na superfície das células imunes,
iniciando cascadas de sinalização intracelular que levam à produção de citocinas inflamatórias. Os
peptídeos antimicrobianos (AMPs) contrapõem esse processo por meio de vários mecanismos: (A)
ligando-se diretamente ao LPS, impedindo sua interação com a LBP; (B) competindo com o LPS pela
ligação ao complexo de sinalização TLR; (C) inibindo a translocação do NF-κB para o núcleo; (D)
modulando a expressão de genes inflamatórios por meio da ativação direta das vias MAPK; e (E)
eliminando diretamente micróbios, seja por meio da desestruturação de suas membranas ou pela
interação com moléculas internas(ADAPTADA)(ROSENFELD; SHAI, 2006).

1.4 Peptídeos Intragênicos Antimicrobianos

A busca por peptídeos com atividades biológicas desejáveis dentro de sequências

de proteínas tem sido uma estratégia para a prospecção de biomoléculas no combate
contra microrganismos causadoras de infecções (Ramada et al., 2017). Essas
sequências, quando sintetizadas como cadeias polipeptídicas individuais, apresentam
atividade antimicrobiana, diferentemente de suas proteínas de origem, e são chamadas
de peptídeos intragênicos antimicrobianos. A presença desses IAPs dentro de
16
sequências de proteínas foi avaliada usando o software Kamal, no qual, para sua
identificação, os critérios físico-químicos comumente encontrados em AMPs, como
estrutura secundária, carga líquida positiva e hidrofobicidade, foram considerados.
(BRAND et al., 2012)

Um estudo conduzido por Brand et al. buscou, por meio do software Kamal, Hs
IAPs com propriedades anfifílicas e estruturas α-helicoidais no proteoma humano. As
proteínas foram examinadas na busca de possíveis IAPs, que possuem entre 16 e 22
resíduos de aminoácidos e exibem uma repetição característica típica de segmentos
anfifílicos em forma de α-hélice. Para isso, foram considerados três ângulos polares
possíveis: 192°, 160° e 128°. Foram estabelecidas diretrizes específicas para determinar
quais aminoácidos poderiam compor as regiões hidrofóbicas e hidrofílicas dessas
sequências, utilizando como referência uma escala de hidrofobicidade. Na porção
hidrofóbica, eram permitidos aminoácidos como Ala, Phe, Ile, Leu, Met, Val e Trp,
enquanto a porção hidrofílica tinha critérios menos restritivos, admitindo aminoácidos
como Ala, Asp, Glu, Gly, His, Lys, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr e Tyr. Sequências que
incluem Pro ou Cys foram excluídas. A escolha dos peptídeos teve por base critérios
físico-químicos, como a presença de resíduos com hidrofobicidade média específica,
uma carga líquida dentro de um intervalo de +2 a +6 e uma propensão à agregação de
acordo com critérios predefinidos (BRAND et al., 2019).

Por meio de experimentos, esses peptídeos demonstraram a capacidade de

estruturar em α-hélices em modelos miméticos da bicama lipídica de bactérias,
apresentando-se desestruturados em tampão fosfato, tal qual AMPs normalmente são.
O Hs02 (Figura 3), um IAP identificado como parte da proteína miosina humana não-
convencional-1h, destacou-se em sua atividade biológica. Este peptídeo apresentou
atividade antibacteriana direta, causando a ruptura da membrana citoplasmática de
bactérias em concentrações micromolares baixas, sendo compatível com os AMPs mais
potentes conhecidos. Efeitos positivos no retardamento da proliferação e na diminuição
da viabilidade de biofilmes formados por dois patógenos, P. aeruginosa e S. aureus,
também foram relatados. O Hs02 também inibiu a produção de TNF-α em macrófagos
de ratos estimulados por LPS em concentrações mais baixas que aquelas necessárias

17
à manifestação de sua atividade antimicrobiana, indicando que essa molécula é ainda
um potente peptídeo anti-inflamatório (BRAND et al., 2019).

Figura 3 – Representação da estrutura do peptídeo Hs02 em alfa-hélice a partir da interação com

micelas de DPC-d38. Onde é demonstrado em vermelho resíduos de carga positiva e em verde os
resíduos hidrofóbicos (Guilherme D. Brand et al., 2019).

Outra estrutura secundária comum em segmentos de proteínas são as folhas-β.

Essa configuração resulta da formação de ligações de hidrogênio entre os grupos N-H e
C=O na cadeia polipeptídica, sem envolver as cadeias laterais dos resíduos de
aminoácidos. As folhas-β podem adotar duas formas, uma com a cadeia polipeptídica
orientada na mesma direção paralelamente (Figura 4-B) ou, de forma oposta, com
orientação antiparalela (Figura 4-A) entre suas cadeias (ALBERTS et al., 2002). A
presença de resíduos de aminoácidos hidrofóbicos e hidrofílicos intercalados nesses
segmentos são responsáveis pela natureza anfifílica dessa estrutura, uma vez que
ocorre a separação entre as faces hidrofóbicas e hidrofílicas. Estruturações desse tipo
são ideais para atividades antimicrobianas, como resultado de interações com
membranas bacterianas.

18
 Figura 4- Dois tipos de folhas-β. (A) Estrutura antiparalela de folha-β (B) Estrutura paralela de
folha-β (Alberts et al., 2002).

A atividade antimicrobiana depende fortemente da anfifilicidade das moléculas. A

anfifilicidade não é observada somente em estruturas helicoidais, mas também em
folhas-β (SANTOS et al., 2023).

A busca por IAPs curtos derivados de fitas-β em segmentos internos de proteínas

emerge como uma opção promissora para explorar moléculas capazes de controlar
microrganismos invasores. Utilizando o software Kamal, a análise dos segmentos
internos de proteínas foi conduzida considerando resíduos de aminoácidos alternados
entre hidrofóbicos e hidrofílicos, com extensão de 7 a 11 resíduos de aminoácidos. Além
disso, apenas peptídeos com carga líquida ≥ +2 foram selecionados(SANTOS et al.,
2023).

Cinco Hs IAPs curtos em folha-β foram sintetizados e revelam descobertas

notáveis, destacando que três deles demonstraram potente atividade antimicrobiana. O
peptídeo Hs10, em particular, exibiu seletividade para bactérias Gram-negativas. Esse
peptídeo mostrou-se promissor não apenas pela sua eficácia antimicrobiana, mas
também pela baixa citotoxicidade em células de mamíferos. Além disso, sua capacidade
de perturbar a estrutura da membrana de E. coli ressalta seu potencial como um agente

19
antimicrobiano seletivo. Esses resultados abrem caminho para futuras aplicações de
peptídeos curtos estruturados em folhas-β (SANTOS et al., 2023).

Os peptídeos Hs11, Hs12, Hs13, Hs14, todos curtos e com perfil alternado de
resíduos hidrofóbicos/hidrofílicos, foram testados como antimicrobianos em cepas de
bactérias Gram-negativas (E. coli, P. aeruginosa, K. pneumoniae) e Gram-positiva (S.
aureus). Os peptídeos Hs11 e Hs12 demonstraram eficácia antibacteriana ao inibir todas
as cepas testadas na faixa de concentração de 8 a 128 µM (SANTOS et al., 2023).

Tabela 1 - Concentração inibitória mínima (MIC), dado em µM, para bactérias patogênicas humanas
(SANTOS et al., 2023)

Peptídeos S. aureus E. coli K .pneumoniae P. aeruginosa

Hs10 N/A 32 ± 0 / 32 ± 0 64 ± 0 / 64 ± 0 43 ± 18/ 53 ± 18
Hs11 16 ± 0 / >32 16 ± 0 / >32 128 ± 0 / > 128 8 ± 0 / >16
Hs12 16 ± 0 / 32 ± 0 16 ± 0 / >32 64 ± 0 / > 128 8 ± 0 / >16
Hs13 N/A N/A N/A N/A
Hs14 N/A N/A N/A N/A
N/A significa que não apresentou atividade dentro da concentração testada

Já em ensaio de viabilidade de macrófagos murinos tratados com peptídeos,

nenhuma das moléculas testadas afetou a viabilidade celular em 24 horas até a máxima
concentração testada, de 100µM. O peptídeo Hs11, apesar de sua eficácia como
antimicrobiano, não apresentou citotoxicidade nas concentrações testadas, sendo
particularmente interessante pela baixa citotoxicidade em comparação com seus valores
de MIC para P. aeruginosa (8 µM) e S. aureus (16 µM). Macrófagos de murinos também
foram expostos ao LPS, onde o peptídeo Hs11 reduziu a secreção de TNF-α,
previamente incubado com LPS, para os níveis normais. Além disso, ocorreu a redução
da liberação de citocinas mesmo em seu nível basal, em células não estimuladas por
LPS, indicando ação anti-inflamatória mesmo sem indução de inflamação (SANTOS et
al., 2023).

20
1.5 Ácido Gálico

A mitocôndria é responsável pela produção de ATP na célula por meio de um fluxo

de elétrons entre os complexos proteicos, gerando uma força prótomotriz entre
membranas, onde o último aceptor de elétrons nessa cadeia respiratória é o oxigênio,
O2. A formação de O2•− a partir da redução de um elétron de O2 é uma das diversas
reações que envolvem a produção de ROS (do inglês, Reactive Oxygen Species) dentro
da mitocôndria. Esse superóxido também funciona como um precursor na formação de
peróxido de hidrogênio, H2O2, pela ação da enzima superóxido dismutase(MURPHY,
2008). As moléculas são as chamadas espécies reativas de oxigênio, dentre as quais o
radical hidroxila (OH) e oxigênio singleto (1O2) fazem parte. Há também radicais livres
biologicamente importantes como: hidroperóxido lipídico (ROOH), radical peroxila
lipídico (ROO) e radical alcoxila lipídico (RO), que estão associados aos lipídios da
membrana (KURUTAS, 2016).

Quando a produção de ROS ultrapassa a capacidade antioxidante celular

endógena, ocorre o estabelecimento do estresse oxidativo. Esse cenário está associado
à disfunção mitocondrial, a qual desempenha um papel crucial na origem de diversas
condições, tais como câncer, doenças cardiovasculares e distúrbios metabólicos como
obesidade, resistência à insulina e diabetes (GLOIRE; LEGRAND-POELS; PIETTE,
2006). Para o controle oxidativo celular em resposta a produção de ROS, a célula
responde ao estresse oxidativo por meio da produção de enzimas antioxidantes, que são
produzidas pela regulação de fatores de transcrição na determinação da expressão
gênica. ARE (do inglês, Antioxidant Response Element) é a região promotora da
expressão de enzimas responsáveis para o equilíbrio redox da célula tais como a hemo-
oxigenase-1, catalase, glutationa peroxidase, glutationa S-transferase, superóxido
dismutase e NAD(P)H quinona oxidoredutase(Jayasuriya & Ramkumar, 2021). Outra
fonte de ROS é a via NF-κB, que desencadeia um aumento na atividade mitocondrial e
na expressão da NADPH oxidase, as quais são as principais fontes de radicais livres
endógenos. O NF-κB está associado à Nrf2, que, em situações de estresse oxidativo,
não ativa a via de produção de fatores antioxidantes. Portanto, a redução da Nrf2 leva a
vias inflamatórias (WARDYN; PONSFORD; SANDERSON, 2015).

21
 Compostos antioxidantes são encontrados em uma variedade de plantas na
natureza, fazendo parte da dieta humana. Um exemplo dessas substâncias são os
polifenóis (SCALBERT; JOHNSON; SALTMARSH, 2005). Os polifenóis representam
uma classe importante de antioxidantes naturais que exibem uma variedade de
atividades biológicas, incluindo propriedades anticancerígenas, antifúngicas,
antibacterianas, antivirais, antiúlcera e anticolesterol, entre outras. Dentre esses
polifenóis o ácido gálico (GA), também conhecido como ácido 3,4,5-trihidroxibenzoico, é
um composto fenólico de baixo peso molecular encontrado em uma variedade de fontes,
incluindo bebidas, nozes, repolho, folhas de chá, morangos, frutas vermelhas, chá verde
e várias ervas medicinais (BADHANI; SHARMA; KAKKAR, 2015).

A estrutura do GA (Figura 5) é composta por um grupo carboxila ocupando a

posição 1 e os grupos hidroxila ocupando as posições 3, 4 e 5, nos quais essas
substituições estão associadas às suas propriedades antioxidantes e anti-radicalares.
No entanto, essa natureza não é influenciada pelo ligante carboxilato (SROKA;
CISOWSKI, 2003).

Figura 5 - Estrutura ácido gálico

A mitocôndria é a organela citoplasmática central no desenvolvimento de radicais

livres. O oxigênio, como último aceptor da cadeia respiratória mitocondrial, é em sua
maior parte reduzido a água; no entanto, uma fração é reduzida parcialmente nesse
processo, assim como em outros processos fisiológicos. Esses oxigênios parcialmente
reduzidos, como já mencionado, são espécies reativas de oxigênio envolvidas em
processos de estresse oxidativo celular. As espécies produzidas nesses processos, tais
22
como O2•− e H2O2, são insuficientemente reativas para oxidar macromoléculas como
proteínas, ácidos nucleicos, carboidratos e lipídios de membrana. No entanto, uma vez
na presença de ferro, esse metal de transição participa na catálise para a produção de
radicais hidroxilas pela reação abaixo (GALARIS; BARBOUTI; PANTOPOULOS, 2019;
KURUTAS, 2016):

Figura 6 - Reação entre íons ferro e espécies reativas de oxigênio

Na proporção em que o ácido gálico está em excesso em relação ao Fe 3+, ocorre

a neutralização de radicais livres, enquanto, quando essa proporção é inferior a 2,
observa-se a liberação de radicais livres. Devido à sua estrutura, o ácido gálico possui a
propriedade de quelar o Fe3+, minimizando assim as reações mencionadas
anteriormente (KOSURU et al., 2018).

O tratamento com ácido gálico foi avaliado em processos inflamatórios e em

condições de estresse oxidativo. Um estudo foi conduzido para avaliar esses processos
em ratos, que foram induzidos a doenças cardiovasculares causadas por partículas em
suspensão no ar e, como resultado, apresentaram lesões no miocárdio. Este estudo
demonstrou a capacidade do ácido gálico de restaurar os níveis de fatores inflamatórios,
como IL-6 e TNF-α, aos valores normais. Dentro da atividade oxidativa o tratamento com
GA causou um aumento evidente nos níveis e na síntese de enzimas antioxidantes,
como GPx, GSH, CAT e SOD. A atividade em questão sugere a neutralização de
espécies reativas de oxigênio geradas pelas lesões no miocárdio (RADAN et al., 2019).

O ácido gálico também possui propriedades protetoras contra o enfisema induzido

em ratos. Este efeito parece ser atribuído à capacidade do ácido gálico de reduzir a
inflamação pulmonar, preservar o tecido pulmonar e agir como antioxidante. A análise
genética indica uma influência do ácido gálico na expressão de genes associados à
inflamação, em decorrência da redução na expressão do gene NF-Κb (SOHRABI et al.,
2021).

23
 O GA é conhecido também por sua capacidade imunomoduladora. Em células
infectadas pelo parasita do gênero Leishmania, o ácido gálico foi capaz de aumentar a
atividade lisossômica em macrófagos em concentrações baixas, no valor de 15 μg/mL.
A produção de óxido nítrico é uma via responsável pela resposta à infecção pelo parasita,
sendo ativada pela ação sinérgica de citocinas. O GA demonstrou a capacidade de
induzir um aumento na concentração de NO em macrófagos infectados, resultando em
um eficiente mecanismo de defesa contra a Leishmania. Outro fator destacado no estudo
foi um aumento significativo nos níveis de cálcio intracelular, desempenhando um papel
como agente antimicrobiano e mediador da produção da proteína quinase C (PKC)
(ALVES et al., 2017).

1.6 Conjugados Peptídeo-Droga

Em busca da melhoria da distribuição, redução da citotoxicidade e aumento da

seletividade de fármacos, os conjugados peptídeo-droga apresentam-se como um
sistema emergente no transporte de fármacos para células-alvo. Os PDCs demonstram
a capacidade de reconhecer células específicas, e, com essa especificidade, a dose
administrada pode ser reduzida. No caso de células cancerosas, por exemplo, a
diferenciação entre células saudáveis ocorre devido à presença de diferentes enzimas,
pH e equilíbrio redox (ZHU; TANG; LV, 2021).

PDCs são constituídos por três componentes (Figura 7): peptídeo, linkers e droga
citotóxica. Até hoje, os PDCs são mais estudados no contexto do câncer, onde fármacos
citotóxicos são conjugados a peptídeos visando o aumento de seletividade. Contudo,
alguns trabalhos demonstram que o mesmo racional é também facilmente aplicável a
novos antibióticos, tal foi demonstrado em resultados obtidos demonstrando a viabilidade
dessa estratégia ao evidenciar a melhora significativa na atividade antimicrobiana contra
cepas resistentes à ampicilina, sem induzir citotoxicidade em células humanas
(YAMAUCHI et al., 2022). Destaca-se a importância de considerar fatores como a
escolha do peptídeo, do ligante e do local de conjugação para otimizar a eficácia
antibacteriana. Adicionalmente, observou-se que a modificação estratégica na estrutura
do peptídeo e a introdução de um ligante clivável no interior das células bacterianas
24
contribuem para uma interação mais eficaz com os alvos, reforçando a utilidade dessa
abordagem(FU et al., 2023; YAMAUCHI et al., 2022).

A escolha do peptídeo deve ser feita para assegurar uma melhor distribuição da
droga conjugada a ele. Critérios como especificidade para células-alvo, baixa resposta
imunológica, alta estabilidade e redução de sua degradação em meio celular são fatores
determinantes na ação terapêutica (FU et al., 2023).

Figura 7- Modelo para criação de conjugado peptídeo-droga (ADAPTADA) (FU et al., 2023)

Peptídeos em PDC possuem normalmente baixa massa molecular, o que reduz a

resposta imune do hospedeiro. Atuando como carreadores do fármaco no sistema devido
à sua menor complexidade em comparação com as proteínas, os peptídeos apresentam
vantagens sobre os conjugados droga-proteína. Isso ocorre tanto pela melhor
estabilidade proporcionada pela sua menor complexidade estrutural em comparação
com as estruturas quaternárias e terciárias de proteínas. A síntese do peptídeo é outro
componente que atrai a atenção para os PDCs, devido à rapidez da síntese em fase
sólida. Os peptídeos podem agir tanto conjugados diretamente à célula quanto por meio
de um linker, cujo design é determinado pelo alvo biológico a ser atingido (ULAPANE et
al., 2017). A síntese racional de carreadores é crucial, uma vez que seus resíduos de
aminoácidos podem ser modificados para otimizar a seletividade em relação ao alvo
biológico e às propriedades físico-químicas. Os mecanismos de ação desses peptídeos
podem ser divididos com base em sua interação com a membrana do alvo biológico. Os

25
peptídeos direcionadores de células (CTPs) são cadeias curtas de aminoácidos que
exploram a superexpressão de receptores específicos na superfície de células
cancerosas para realizar a entrega precisa de medicamentos. Dependendo do receptor-
alvo, os CTPs podem levar a um acúmulo localizado de medicamentos ao redor do tumor
ou induzir a endocitose após a ligação.

Os CTPs compartilham semelhanças com anticorpos monoclonais (mAbs) em sua

ligação de alta afinidade a receptores específicos, mas seu tamanho menor permite uma
melhor penetração nos tumores. Uma limitação dos CTPs está na dependência da
expressão de receptores específicos para que sejam eficazes. Técnicas como o phage
display, podem ser empregadas para identificar sequências de peptídeos que se ligam
seletivamente a células cancerosas, superando essa limitação (Bolhassani, 2011).

O linker é responsável pela ligação entre o peptídeo e a droga citotóxica. Sua

escolha é fundamentada no mecanismo que se busca com essa conexão, ou seja, pode
ou não ser clivado quando em contato com o alvo biológico. Busca-se também a
estabilidade durante a passagem por diferentes ambientes durante a circulação,
prevenindo a liberação da droga fora da célula de interesse, o que preveniria a
propriedade de interesse para a minimização do efeito citotóxicos(FU et al., 2023).
Geralmente, os peptídeos transportadores são conectados aos fármacos por ligações
não cliváveis, geralmente consistindo em ligações de amida ou éster, que são resistentes
à clivagem extracelular. Como resultado, a droga permanece em seu estado ativo com
o linker parcialmente ou integralmente ligado. Por outro lado, linkers sensíveis a enzimas
têm ligações, como ésteres, que podem ser clivadas por enzimas, como esterases,
levando à liberação da droga. Além disso, existem linkers que são clivados pelo ambiente
intracelular, mais oxidativo que o meio extracelular. Por exemplo, a glutationa,
encontrada em maiores concentrações no interior das células cancerosas devido às
condições de hipóxia locais, torna esses linkers suscetíveis à clivagem nesse meio
devido às ligações de dissulfeto (Heh et al., 2023).

26
2 JUSTIFICATIVA

Descobertas recentes destacam que determinados trechos internos de proteínas,

caracterizados por propriedades físico-químicas específicas, manifestam atividade
antimicrobiana quando isolados e sintetizados como cadeias polipeptídicas
independentes. Essas entidades, reconhecidas como peptídeos intragênicos
antimicrobianos (IAPs), exibem um espectro abrangente de atividades biológicas,
semelhantes aos AMPs, com seletividade comparável e uma extensa capacidade
antimicrobiana(Mariano et al., 2021). Os IAPs podem também exibir atividade anti-
inflamatória. Essa reação à inflamação foi notada devido a inibição da liberação de TNF-
α em resposta à presença de LPS em modelos celulares. Em experimentos com células
expostas ao LPS, o peptídeo Hs11, um IAP de configuração β, reduziu a secreção de
TNF-α em macrófagos, normalizando os níveis desta citocina (dados não publicados).
Além disso, houve uma diminuição nas citocinas mesmo em seu estado basal, indicando
uma ação anti-inflamatória mesmo na ausência de indução inflamatória (Santos et al.,
2023).

Certos compostos naturais, como o ácido gálico (GA), revelam-se multifacetados,

exibindo propriedades antimicrobianas e anti-inflamatórias. Estudos indicam que o GA
demonstra ação antimicrobiana tanto direta quanto indireta, embora os mecanismos
subjacentes ainda sejam pouco compreendidos. A ação antimicrobiana direta do GA é
observada contra diversas bactérias, embora em concentrações relativamente elevadas,
da ordem de mg/ml. No entanto, sua influência indireta, através da ativação de
macrófagos, se manifesta em concentrações mais reduzidas. Esta molécula conduziu à
redução do número de macrófagos infectados pelo parasita do gênero Leishmania,
estimulando a capacidade fagocítica, o volume lisossomal, a liberação de nitrito e a
mobilização de [Ca2+] intracelular (ALVES et al., 2017).

Uma das aplicações mais promissoras e atuais de peptídeos como fármacos é

sua conjugação a drogas conhecidas, formando os chamados conjugados peptídeo-
droga (PDC, do inglês Peptide drug conjugates). Nesses conjugados, peptídeos atuam
como transportadores, visando especificidade na ação de medicamentos em células de
interesse. Os componentes que constituem os PDCs são: peptídeos, linkers e drogas

27
citotóxicas. Todos os componentes são variáveis e dependem do modo de ação
desejado. Até o momento vários PDCs foram desenhados, sendo a maior parte desses
voltada para o tratamento de câncer. Contudo, o conceito de conjugação de peptídeos a
drogas pode ser expandido para outras áreas do conhecimento (FU et al., 2023; GONG
et al., 2023).

Nesse sentido, dado que os IAPs e AG possuem atividades similares, porém com
mecanismos de ação potencialmente diferentes, espera-se que seus conjugados sejam
capazes de exercer uma ação sinergística. Logo, o presente projeto engloba a síntese e
a avaliação da bioatividade desses conjugados, os quais terão suas determinações de
Concentração Inibitória Mínima (MIC) tanto como entidades individuais quanto em sua
forma conjugada. A avaliação de citotoxicidade será realizada de maneira semelhante,
visando uma baixa citotoxicidade ideal do conjunto posteriormente. A atividade anti-
inflamatória será também avaliada em esforços futuros, dada a complexidade dos
experimentos.

3 METODOLOGIA

3.1 Síntese de peptídeo em fase sólida

O método usado para a obtenção do IAP desejado será a Síntese de Peptídeos

em Fase Sólida (SPFS, do inglês solid phase peptide synthesis). A síntese química em
questão foi desenvolvida por Robert Bruce Merrifield, que simplificou o processo, uma
vez que todas as reações ocorrem em um único ambiente químico, e a ausência de
manipulações evita perdas por transferência de materiais (MERRIFIELD, 1985).

A Síntese de Peptídeos em Fase Sólida segue um processo composto por

características principais que incluem a fixação do primeiro bloco de construção a uma
matriz filtrável (Figura 8) seguido da realização de ciclos repetidos de transformações
químicas. Um resíduo de aminoácido com a função amina protegida é acoplado a um
suporte sólido pelo resíduo de aminoácido C-terminal. Em seguida, o grupo amina pode
ser desprotegido para o acoplamento dos próximos resíduos de aminoácidos, que

28
possuem proteção em suas cadeias laterais, no sentido C-terminal a N-terminal.
(JENSEN, 2013).

Figura 8- Estrutura da resina Rink Amide (MDHA). Em vermelho está o grupo amino protegido pelo
Fmoc e o P representa a cadeia polimérica atrelada a resina (PIRES; BEMQUERER; DO
NASCIMENTO, 2014).

Em decorrência da síntese de um peptídeo amidado, o suporte sólido usado será

a Rink Amide (MDHA) que possui em seu N-terminal o grupo de proteção temporário
Fmoc (9-fluorenilmetoxicarbonil). A resina anteriormente a etapa de desproteção é
lavada com solvente tais quais DMF (dimetilformamida) ou DCM (diclorometano). Essa
etapa é realizada para a remoção de impurezas solúveis, que posteriormente escoadas
para fora da seringa com o auxílio de uma bomba de baixa pressão. A etapa de
desproteção do N-terminal da resina (Figura 9) é realizada pela de 4-metil-piperidina que
retira o hidrogênio ácido de Fmoc, que resulta em uma estrutura aromática estável por
ressonância. Posterior a essa etapa há um eliminação-β, com a liberação de monóxido
de carbono, e assim, a amina se encontra livre para prosseguir o acoplamento do
primeiro resíduo de aminoácido(PIRES; BEMQUERER; DO NASCIMENTO, 2014).

29
 Figura 9 - Desproteção do N-terminal (W. C. Chan and P. D., 2000)

Para a verificação da desproteção da amina, realiza-se o teste de Kaiser, ou teste

de nihidrina. A ninidrina realiza uma sequência de reações com aminas primárias,
resultando, ao final, na formação de um composto de coloração azul escuro denominado
"Ruhemann's blue". Este procedimento pode ser utilizado para verificar a remoção bem-
sucedida do grupo protetor Fmoc, liberando assim uma amina primária(PIRES;
BEMQUERER; DO NASCIMENTO, 2014).

Para realizar o teste, conforme descrito no método de Chan e White (2000), é

necessário pipetar alguns grãos da amostra em um tubo de ensaio. Em seguida,
adicionam-se duas gotas de cada uma das seguintes soluções: ninidrina a 5% (m/v) em
etanol, fenol a 80% em etanol e uma solução preparada com 2 mL de KCN a 0,001 mol
em 98 mL de piperidina. Após as adições, o conteúdo do tubo de ensaio deve ser
meticulosamente misturado e aquecido a 120°C por um período de 4 a 6 minutos. A
presença da coloração azul escura indica a presença de aminas livres (Figura 10).

30
 Figura 10-Mecanismo para verificação de acoplamento (Pires et al., 2014).

Em caso positivo de desproteção o acoplamento pode ser efetuado utilizando

DIC/Oxyma ou HBTU/DIPEA, ambos processos que utilizam ésteres ativados. Na
abordagem com DIC/Oxyma, a Oxyma Pure (acetato de etil 2-ciano-2-(hidroxiimino))
reage com o C-terminal na presença de carbodiimida, formando o intermediário éster
ativado desejado. Essa reação envolve a síntese de um éster de aminoácido que atua
como eletrófilo para o ataque nucleofílico do grupo amina na resina. Dessa forma, a
ligação amida, ou acoplamento, é estabelecida.

No caso da reação de acoplamento utilizando HBTU/DIPEA também ocorre um

mecanismo de formação de um éster intermediário. O reagente HBTU (2-(1H-
benzotriazol-1-il) -1,1,3,3-tetrametilurôniohexafluorofosfato), na presença da amina
terciária DIPEA (N, N’-diisopropiletilamina), converte o Fmoc-Aminoácido em seu éster
correspondente OBt, o intermediário ativado Benzotriazolil. Esse intermediário sofre o

31
ataque nucleofílico do grupo amina no N-terminal livre, formando assim a ligação
peptídica (Figura 11) (PIRES; BEMQUERER; DO NASCIMENTO, 2014).

Figura 11: Mecanismo de reação de acoplamento de aminoácidos mediante o uso de carbodiimidas e

oxima (ADAPATADA) (PIRES; BEMQUERER; DO NASCIMENTO, 2014).

3.1.1 Acoplamento do ácido gálico

Anterior ao acoplamento do ácido gálico, será feita a desproteção do último

resíduo de aminoácido por 4-metil-piperidina. Em seguida, será adicionado 0,1021
gramas (4 equivalentes da quantidade de resina) de ácido gálico, que terá sua porção
ácida ligada ao N-terminal do resíduo de aminoácido. Em seguida, serão acrescentados

32
4 equivalentes de acetato de etil 2-ciano-2-(hidroxiimino) (oxyma Pure) (85,3mg), 2 mL
de DMF e 93 µL de N, N’-diisopropilcarbodiimina (DIC) (que também correspondem a 4
equivalentes da quantidade de resina). Depois, esta suspensão será colocada sob
agitação a 200 rpm por 1 hora e 30 minutos. Ao fim desse tempo, será feita a lavagem,
três vezes, do sólido com cerca de 4 mL de DMF, seguido de 4 mL DCM. Para a
confirmação do acoplamento, faz-se também o teste de Kaiser de uma pequena alíquota
do material para verificação de acomplamento.

3.1.2 Clivagem

Após acoplar o GA, será necessário realizar o processo de clivagem para retirar
o conjugado preso na resina. Primeiramente, será realizada a desproteção do sólido
resultante (peptídeo-GA+resina). Em seguida, será preparado o ‘coquetel’ de clivagem,
composto por ácido trifluoroacético (TFA)/tioanisol/água/fenol/etanoditiol na proporção
82,5:5:5:5:2,5 (v/v) (Chan W. C., et al 2000). Será adicionado o sólido seco dentro do
coquetel e agitado por 1 hora e 30 minutos a 200 rpm. Após o tempo determinado, o TFA
será removido com o auxílio de um fluxo de argônio. Ao retirar o TFA, irá ser ultizado éter
diisopropílico gelado para precipitar o peptídeo-GA e a resina, com posterior filtração e
descarte da fase etérea, já que o peptídeo e a resina ficam retidos no filtro. Em seguida,
o peptídeo-GA será solubilizado com uma mistura de metanol/água ou acetonitrila/água
1:1 (v/v), ficando retido no filtro apenas a resina. Posteriormente, o peptídeo-GA
solubilizado será liofilizado no Laboratório de Espectrometria de Massa da Embrapa
Recursos Genéticos e Biotecnologia.

3.2 Purificação do conjugado por cromatografia líquida de alta eficiência

A remoção de produtos indesejáveis e impurezas no processo de síntese, o

conjugado peptídeo-GA a ser sintetizado será submetido à purificação por cromatografia

33
líquida de alta resolução (CLAE) no Laboratório de Anatomia Molecular e Nanomedicina
da Faculdade de Medicina da UnB. O processo de purificação será conduzido em um
cromatógrafo Shimadzu (Japão), equipado com um sistema binário de bombeamento
(LC-20AR), detector de arranjo de diodo (DAD, SPD-M20A), injetor manual e sistema de
análise e processamento de dados LabSolutions versão 5.92. A coluna a ser empregada
será uma coluna preparativa de fase reversa Jupiter C18 (250 x 21,2 mm, 10 µm, 300 Å)
da Phenomenex. A fase móvel consistirá em acetonitrila (ACN) + 0,1% de TFA/água +
0,1% de TFA, a uma taxa de 10 mL/min. O gradiente a ser utilizado seguirá o perfil a
seguir:

-0-5min: 5% de ACN+TFA;

- 5-40min: 5%-100% de ACN+TFA;

- 40-45min:100% de ACN+TFA;

- 45-46min:100%-5% de ACN+TFA;

- 46-55min:5% de ACN+TFA;

A solução que conterá 20 mg/mL do peptídeo sintetizado liofilizado solubilizado

em água será manualmente injetada no sistema de Cromatografia Líquida de Alta
Eficiência (CLAE). Para a detecção, os comprimentos de onda de 216 nm e 280 nm
serão monitorados, correspondendo à absorção da ligação peptídica e à absorção das
cadeias laterais de moléculas aromáticas, respectivamente. Durante a análise contínua
do cromatograma, serão manualmente coletadas frações contendo o peptídeo puro.
Essas frações serão subsequentemente liofilizadas no Laboratório de Espectrometria de
Massa da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia.

3.3 Análise do conjugado peptídeo-GA por espectrometria de massa

Para a confirmação da estrutura do peptídeo sintetizado, o produto da purificação

por CLAE já liofilizado será submetido à análise por espectrometria de massas, em que
será analisado o produto com relação a sua massa/carga.

34
3.4 Análise de MS e MS/MS

Cerca de 1mg do conjugado sintetizado será solubilizado em 500 μL de água

ultrapura. Em seguida, 3 μL desta solução será retirada e solubilizada em 997 μL de
água e ácido fórmico. Esta amostra solubilizada será analisada em um espectrômetro
de massa de alta resolução presente no instituto de química da Universidade de Brasília.
Este espectrômetro de massas é do modelo Triple Tof 5600+ (Sciex, Ontario, Canadá)
que foi acoplado a um cromatógrafo líquido (Eksigent UltraLC 100, Sciex) que tem a
função de injetar a amostra em uma vazão de 0.3mL/min. A fonte de ionização é do tipo
electrospray (EsI, do inglês ion spray) e os espectros de massa serão adquiridos em
modo positivo com valores de massa entre 100 e 2000 Da, juntamente a utilização de
uma calibração externa. Os parâmetros de aquisição serão: TEM 450 (Temperatura da
fonte), GS1 45 (Gás de nebulização), CUR 25 (Gás de cortina, contracorrente), GS2 50
(Gás de dessolvatação), ISVF 5500 (voltagem aplicada a probe) e DP 140 (potencial de
declusterização de íons). Os produtos de íons escaneados serão adquiridos com CE 45
e CES 20, parâmetros relacionados a extensão de fragmentação do precursor. Por fim,
os dados obtidos serão analisados com a utilização do software PeakView v2.1.

3.5 Determinação de MIC

Com a finalidade de examinar as propriedades antimicrobianas do conjugado,

procederemos ao teste de suscetibilidade de microrganismos em diluição em caldo,
seguindo os protocolos M7-A10, M27-A3 e M38-A2 do CLSI (Clinical and Laboratory
Standards Institute). Quatro microrganismos serão selecionados a partir da biblioteca da
Universidade Católica de Brasília (UCB), conforme apresentado na Tabela 2. Esses
testes serão executados no Laboratório de Análise de Biomoléculas do Programa de
Pós-Graduação em Ciências Genômicas e Biotecnologia da UCB, em colaboração com
a equipe de pesquisa liderada pelo Dr. Marcelo H. S. Ramanda e supervisionados pela
Mrs. Bianca Oliveira.

35
 O conjugado será incubado em uma faixa de concentração de 128 µM a 0,25 µM,
durante 24 horas a 37ºC, em um meio de cultura líquido contendo bactérias, com
concentrações finais de 5 x 105 células/mL. Esse procedimento ocorrerá no meio
Mueller-Hinton (Himedia). A gentamicina será utilizada como controle positivo, variando
de 20 µM a 0,039 µM.

3.6 Citotoxicidade do conjugado

Para análises da citotoxicidade do conjugado peptídeos-GA, células BV-2 são

plaqueadas em placas de 96 poços a uma densidade de 10.000 células por poço. Após
24 horas, adiciona-se aos poços, em quintuplicata, o conjugado peptídeo-GA (nas
concentrações de 128, 64, 32, 16, 8, 4, 2 e 1 μg/mL), 25% DMSO (como controlo positivo)
e PBS (como controlo negativo). As células são incubadas durante 24 horas a 37°C e
5% de CO2. Após a incubação, adiciona-se 20 μL da solução de MTT (50 mg/ml). As
células são incubadas por 4 horas e com a término desse período, o sobrenadante é
removido e, em seguida, adiciona-se DMSO para solubilizar os cristais de formazam. A
leitura da placa foi feita a 570 nm utilizando se um leitor de microplacas (Spectramax 190
- Molecular Device). A viabilidade então é calculada após normalização dos resultados
tendo o controlo positivo como 0% de viabilidade e o controlo negativo como
100% de viabilidade.

4 PRÓXIMAS ETAPAS E CRONOGRAMA

O presente trabalho terá como ponto de partida a síntese do Hs11 e sua conjugação ao
ácido gálico. Posteriormente, para a eliminação de produtos indesejados, o conjugado
será purificado em CLAE para sua análise em espectrometria de massa. A determinação
do MIC será realizada após os procedimentos anteriormente apresentados. Em seguida,
a última análise do trabalho será feita para a determinação da citotoxicidade do
conjugado.

36
 Tabela 2 - Cronograma das próximas etapas do trabalho

Atividade Fevereiro Março Abril Maio Junho Julho

Síntese do X X
conjugado Hs11-
GA
Purificação/análise X X
de massa do
Hs11-GA
Ensaios de X X X
determinação de
MIC de Hs11-GA
Citotoxicidade de X X X
Hs11-GA
Redação / X
apresentação do
TCC

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