FUNDAMENTOS DE MICROBIOLOGIA

1. INTRODUÇÃO

Microbiologia é a ciência que estuda os micro-organismos que podem ser encontrados como
células únicas ou grupamentos celulares. Estão incluídos neste grupo os vírus – seres microscópicos
de natureza acelular.
Os micro-organismos são, em geral, capazes de realizar seus processos vitais de crescimento,
geração de energia e reprodução, sem depender de outras células, do mesmo tipo ou diferentes. Já os
organismos multicelulares são diferentes.
A célula corresponde à unidade fundamental do ser vivo. É uma entidade, separada das outras
células por uma membrana (e, algumas vezes, por parede celular). A membrana celular corresponde
a uma barreira que separa o interior da célula do meio externo. Internamente existem várias estruturas
e compostos químicos que permitem o funcionamento celular. De maneira geral encontramos o
citoplasma e o núcleo (ou nucleóide). Todas as células são compostas por 4 macromoléculas:
proteínas, lipídios, ácidos nucléicos e polissacarídios.
Todos os micro-organismos celulares, para serem considerados sistemas vivos devem
constituir uma forma de metabolismo, exibir algum processo de reprodução, sofrer processo de
diferenciação (ex.: formação de esporo), se comunicar primariamente por meio de compostos
químicos liberados ou captados, apresentar com certa frequência capacidade para se movimentar e
evoluir apresentando novas características.

2. IMPORTÂNCIA

Agricultura - fixação de N2
- ciclo dos nutrientes N, S
Criação de animais - digestão no rúmen

Alimentos - preservação
- alimentos fermentados
- aditivos (glutamato monossódico, ácido cítrico, leveduras).
Doenças - identificação de novas doenças
- tratamento, cura e prevenção
Energia/Meio Ambiente - Biocombustíveis
- Biorremediação (derramamento de óleo)
- Mineração microbiana (CuSCu2+Cu0)
Biotecnologia - organismos geneticamente modificados
- síntese de produtos farmacêuticos (insulina e proteínas
humanas)
- terapia gênica de doenças

3. PROCARIOTOS X EUCARIOTOS

As células eucarióticas são geralmente maiores e mais complexas que as procarióticas sendo
a principal característica a presença de estruturas delimitadas por membranas, denominadas
organelas, as quais estão ausentes nos procariotos. Dentre as principais organelas, podemos citar o
núcleo, as mitocôndrias e os cloroplastos.

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 4. REINOS

Monera – organismos unicelulares procariotos (bactérias)

Protista – organismos unicelulares eucariotos (algas, fungos limosos e protozoários)
Plantae – plantas verdes fotossintéticas e algas
Animalia – animais que ingerem alimentos
Funghi – bolores e leveduras

5. CLASSIFICAÇÃO DOS MICRO-ORGANISMOS

É o arranjo dos micro-organismos em grupos, de preferência obedecendo às relações

evolutivas. A nomenclatura de micro-organismos é binomial e em latim. O primeiro nome indica o
gênero e é iniciado com letra maiúscula e o segundo nome é a espécie.

Saccharomyces cerevisiae Escherichia coli

gênero espécie gênero espécie

5.1. Forma
As bactérias apresentam 3 formas básicas:
- esféricas denominadas cocos
- cilíndricas ou em forma de bastão chamadas bacilos
- espiraladas ou helicoidais assemelhando-se a saca-rolhas chamadas de espirilos.

Exemplos de bactérias:

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5.2. Arranjo
Os cocos se organizam de várias formas:

a) Streptococcus: os cocos estão dispostos em

uma linha.

b) Diplococcus: disposição dois a dois.

c) Pediococcus: dispostos quatro a quatro.

d) Sarcina: normalmente oito cocos agrupam-

se em um bloco.

e) Staphylococcus: não há uma organização

bem definida.

6. ULTRA-ESTRUTURA DOS MICRO-ORGANISMOS

6.1. Flagelos
Filamentos finos com forma helicoidal que se estendem a partir da membrana citoplasmática
e atravessam a parede celular. O flagelo funciona por rotação e são responsáveis pela motilidade do
micro-organismo. Cocos raramente possuem estas organelas.

Tipos de flagelos

A) Monotríquio = único flagelo polar

B) Lofotríquio = vários flagelos num

único pólo.

C) Anfitríquio = flagelos em dois pólos.

D) Peritríquio = flagelos sobre toda

superfície.

Um grupo de bactérias helicoidais chamado espiroquetas tem um flagelo especial denominado flagelo
periplasmático (também conhecido como filamento axial).

6.2. Pili e Fímbrias

Muitas bactérias, particularmente as Gram-negativas, tem acessórios que não estão
relacionados com motilidade. Estas estruturas filamentosas são ocas como flagelos, mas não são
helicoidais. As fímbrias são mais curtas e numerosas que os flagelos.
A principal função está relacionada à adesão em superfícies. Em infecções, as fímbrias
auxiliam a bactéria patogênica a aderir às células superficiais. Esta adesão previne que as células
bacterianas sejam retiradas do local pelo fluxo de muco ou outros fluídos corporais e permite o início
da infecção.

4
 Os pili se assemelham às fimbrias, sendo em geral mais longos e presentes. Estas estruturas
são ocas e servem para ligar duas bactérias, de modo a trocarem plasmídeos (informações genéticas).

6.3. Glicocálice
Algumas células bacterianas são circundadas por uma camada de material viscoso chamada
glicocálice. Este é um composto de polímeros. Quando o glicocálice é organizado de maneira definida
é chamado de cápsula, porém quando é desorganizado ou frouxamente acoplado é denominado de
camada limosa.
O glicocálice apresenta diversas funções e a aderência é a principal delas (ex. Streptococcus
mutans que adere ao dente e causa a cárie). Esta estrutura apresenta grupos polares que protegem a
célula contra o dessecamento (ligam-se à água), também podem servir de reservatório de alimentos,
podem evitar a adsorção e lise da célula por bacteriófagos e protegem as bactérias patogênicas da
fagocitose por células sanguíneas da série branca, que defendem o corpo dos mamíferos, aumentando
a chance da infecção.

Imagem de S. mutans

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6.4. Parede celular
Estrutura rígida que mantém a forma característica de cada célula bacteriana. A parede celular
previne a expansão e eventualmente o rompimento da célula devido à entrada de água. A parede
celular bacteriana também corresponde de 10-40% do peso seco da célula.
Dependendo do micro-organismo, a parede celular apresenta diferentes espessuras e
composições, explicando alguns traços característicos das bactérias como sua resposta à coloração de
Gram e sua habilidade em causar doenças.
As bactérias ditas Gram-negativas, coram-se de vermelho e possuem parede celular mais fina
(10-15 nm) e as Gram-positivas que são coradas pelo cristal violeta apresentam parede celular mais
espessa (20-25 nm).
O componente da parede celular que determina sua forma é em grande parte o peptideoglicano
(ou mureína) que é encontrado somente em procariotos. Difere ligeiramente de uma espécie para
outra na composição química, mas a estrutura básica contém três tipos de unidades estruturais:
- N-acetilglicosamina (NAG)
- Ácido N-acetilmurâmico (NAM)
- Peptídeo formado de 4 aminoácidos [L-alanina, D-alanina, ácido D-glutâmico e lisina ou ácido
diaminopimélico (DAP)]

6.5. Membrana citoplasmática

É o sítio de atividade enzimática específica e do transporte de moléculas para dentro e fora da
célula. É composta principalmente de fosfolipídios e proteínas.

6
6.6. Esporos
O endósporo é uma célula, formada no interior da célula vegetativa, altamente resistente ao
calor, dessecação e outros agentes físicos e químicos, capaz de permanecer em estado latente por
longos períodos e de germinar dando início a uma nova célula vegetativa.
A esporulação tem início quando os nutrientes bacterianos se tornam escassos, geralmente
pela falta de carbono e nitrogênio.

7. CONTROLE MICROBIANO

7.1. MÉTODOS FÍSICOS

Para manter os micro-organismos em níveis aceitáveis são utilizados vários agentes físicos e
químicos. A escolha do melhor agente depende em parte do fato de se querer destruir ou remover
todos os micro-organismos presentes, destruir somente certos tipos de micro-organismos ou
simplesmente prevenir a multiplicação daqueles micro-organismos já presentes.
São exemplos de métodos físicos de controle da população microbiana: aquecimento, baixas
temperaturas, radiação, filtração e a dessecação. O principal critério de escolha do método a ser
empregado é em função do material que contém os micro-organismos.

7.1.1. Altas temperaturas

Calor úmido
É muito mais eficiente que o calor seco para destruir os micro-organismos. Isto porque o calor
úmido causa desnaturação e coagulação das proteínas vitais como as enzimas, enquanto o calor seco
causa oxidação dos constituintes orgânicos da célula (isto é, ele “queima” lentamente as células). A
desnaturação de proteínas ocorre com temperatura e tempos de exposição menores do que aqueles
requeridos para a oxidação.
Endósporos bacterianos são as formas mais resistentes de vida. Por outro lado as células
vegetativas das bactérias são mais sensíveis ao calor e são usualmente mortas dentro de 5-10 minutos
pelo calor úmido a 60-70º C.
Vapor d’água sob pressão – forma mais segura e prática de se obter a aplicação do calor úmido (ex.
autoclave e panela de pressão).
Água fervente – mata apenas os micro-organismos vegetativos, mas não os esporos.
Pasteurização – mata células vegetativas de micro-organismos patogênicos ou não, aumentando o
tempo de estocagem e a qualidade do produto.

Calor seco
É utilizado quando o material não poderá ser exposto à umidade, entretanto esta técnica não é
tão efetiva quanto o calor úmido e, portanto, são necessárias temperaturas muito altas e tempo de
exposição maior. Por exemplo, a esterilização de vidrarias de laboratório (placa de Petri, pipetas)
requer um tempo de 2 horas de exposição a 160-180ºC, enquanto a esterilização dos mesmos materiais
em autoclave requer 15 minutos a 121ºC.

Incineração
È uma prática de rotina no laboratório; alças ou agulhas de semeadura bacteriológica são
regularmente colocadas na chama do bico de Bunsen e aquecidas ao rubro.

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7.1.2. Baixas temperaturas

São usualmente microbiostáticas e geralmente são utilizadas para manutenção de amostras em

estoque.

7.1.3. Radiações

As radiações podem matar as células, principalmente as de alta energia (raios , raios X e luz
ultravioleta). Além de serem microbiocidas estes raios penetram em embalagens e produtos.
Os raios  são mais baratos porém são difíceis de controlar porque são emitidos
espontaneamente por isótopos radiativos como 60Co (eles não podem ser ligados ou desligados como
raios X).

7.1.4. Filtração

Os filtros são utilizados no laboratório e na indústria para esterilizar materiais sensíveis ao

calor como, por exemplo, vitaminas e antibióticos.
No processo de filtração uma membrana filtrante (disco de celulose extremamente fino  150
m) é colocada num filtro plástico, embrulhada e então esteriliza-se em autoclave. A membrana
filtrante apresenta diferentes tamanhos de poros, de acordo com a finalidade. Existem membranas
com poros pequenos o suficiente para impedir a passagem de células e esporos.

7.1.5. Dessecação

Este método foi largamente utilizado antes do desenvolvimento da técnica do resfriamento.

As células quando dessecadas interrompem o metabolismo afetando o crescimento e causando o
declínio da população.

7.2. AGENTES QUÍMICOS

Os agentes químicos empregados para matar ou inativar micro-organismos são classificados

em dois grupos: desinfetantes e agentes quimioterápicos.

7.2.1. Desinfetantes

São substâncias que atuam sobre a célula diminuindo a população do micro-organismo. As

principais estruturas e moléculas alvo são as da membrana citoplasmática. Como os desinfetantes
atuam sobre estruturas comuns a todas células, estes são tóxicos gerais, não possuindo especificidade.
Quando o desinfetante apresenta uma ação menos tóxica, pode ser usado na superfície de
tecidos vivos e neste caso são chamados de antissépticos.

7.2.2. Quimioterápicos

São substâncias que interferem em determinadas vias metabólicas, sendo restrito às células
dos micro-organismos que possuem a via metabólica sensível.
Os quimioterápicos podem ser sintéticos como as sulfas ou naturais como a penicilina,
estreptomicina e tetraciclina. Nos dois casos há a possibilidade do agente ser microbiocida (causa a
morte do micro-organismo) ou microbiostático (impede sua proliferação).

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8. EXIGÊNCIAS NUTRICIONAIS E MEIO MICROBIOLÓGICO

Os micro-organismos são os seres mais versáteis e diversificados em suas exigências

nutricionais. Alguns micro-organismos podem crescer com poucas substâncias inorgânicas como sua
única exigência nutricional, enquanto outros micro-organismos assemelham-se aos organismos
superiores na sua necessidade de compostos orgânicos complexos. Todos os organismos vivos
possuem necessidades nutricionais em comum, como fontes de carbono, nitrogênio e água. A água é
extremamente importante para os micro-organismos porque a maioria deles só consegue absorver os
nutrientes se estes estiverem dissolvidos em água.
A maioria dos micro-organismos podem ser cultivados in vitro (em meios artificiais de
laboratório) outros apresentam exigências nutricionais complexas e indefinidas, razão pela qual não
se consegue seu cultivo em meios artificiais. Tais micro-organismos são cultivados in vivo, ou seja,
num hospedeiro vivo.
Os organismos que utilizam compostos orgânicos como principal fonte de carbono são
chamados heterotróficos, já os que utilizam CO2 como principal ou única fonte de carbono são
chamados autotróficos. O organismo que usa uma substância química inorgânica como fonte de
energia e CO2 como fonte de carbono é chamado de quimioautotrófico. Quimio-heterotrófico é aquele
que usa moléculas orgânicas como fonte de carbono e energia.
Os micro-organismos ainda podem ser classificados de maneira genérica de acordo com as
vias metabólicas que apresentam. Se degradam gorduras são chamados de lipolíticos, se atuam sobre
proteínas – proteolíticos, se causam a degradação do amido – amilolíticos, de acordo com o tipo de
quebra em células sanguíneas  ou -hemolíticos e etc.

8.1. Principais constituintes de meios

A maioria dos meios de cultura apresentam produtos naturais adicionados à sua composição
como, por exemplo, extrato de carne (extrato de carne aquoso concentrado em pasta), peptonas
(proteínas parcialmente hidrolisadas), extrato de levedura (contém vitaminas do complexo B), em
alguns casos nutrientes específicos como sangue, soro e/ou leite. Todos estes substratos são
substâncias químicas complexas contendo açúcares, aminoácidos, vitaminas e sais; a composição
exata é desconhecida. Ainda é utilizado ágar – um polissacarídio complexo extraído de uma alga
marinha que não é metabolizado durante o crescimento microbiano. Quando um micro-organismo
necessita de um número grande de compostos diferentes, estes são chamados de fastidiosos.
Todos fungos são heterotróficos: eles absorvem nutrientes aos invés de ingeri-los. Em geral
meios para o cultivo de fungos apresentam maior concentração de açúcar e pH mais baixo (entre 3,8-
5,6) que o meio bacteriano. Esta combinação favorece o crescimento do fungo, mas inibe o
crescimento da maioria das bactérias. Normalmente observa-se crescimento de bactérias em carne e
leite enquanto os fungos crescem em frutas cítricas. Quando o fungo requer matéria orgânica morta
este é chamado de saprófita.

8.2. Meios com finalidades especiais

Dependendo do tipo de micro-organismo que se deseja identificar e/ou isolar são necessários
alguns cuidados. Para o isolamento do micro-organismo desejado é adicionado ao meio substâncias
que inibam o crescimento das outras bactérias (como a adição de novobiocina ou sais biliares em
meio para enterobactérias para inibir os Gram-positivos) mas ao mesmo tempo não pode injuriar a
célula do micro-organismo a ser isolado de maneira significativa. Estes meios são chamados de meios
seletivos.
Os meios seletivos permitem o crescimento de um tipo particular de micro-organismo ou
suprimem o crescimento de outros tipos de micro-organismos. O meio pode ser seletivo em função
da presença de açúcar/pH; presença de corantes e/ou antibióticos.

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 Quando se deseja favorecer o crescimento de um determinado micro-organismo presente
somente em pequeno número utiliza-se um meio de enriquecimento. Já para deixar um determinado
micro-organismo em estoque, é utilizado um meio com os mínimos nutrientes necessários – meio de
manutenção, então a cultura é guardada no refrigerador em média por um mês. A mesma cultura
poderá ser estocada por um período um pouco mais longo se for feita uma mistura de 1/3 da cultura
em caldo com 2/3 de glicerol estéril (crioprotetor).

Tipo Finalidade
Quimicamente Usado para análises microbiológicas. A fórmula química de
definido todos os compostos do meio são conhecidas (glicose=C6H12O6;
glicina=C2H5O2N).
Complexo Utilizado para o crescimento da maioria dos micro-organismos.
Apresenta substâncias que não se conhece a fórmula química, ou
seja, substâncias naturais (amido, leite, extrato de carne)
Redutor Necessário para o crescimento de bactérias anaeróbias estritas.
Seletivo Impede o crescimento de micro-organismos não desejados e
favorece o crescimento daquele de interesse.
Diferencial Permite diferenciar as colônias do micro-organismo de interesse
dos outros.
Enriquecimento Semelhante ao seletivo, mas com a característica importante de
aumentar o nº de bactérias de interesse, tornando-a detectável.

9. CULTIVO E CRESCIMENTO DE MICRO-ORGANISMOS

Os micro-organismos não necessitam apenas do meio de cultura, mas também apresentam

grandes diferenças com relação às condições físicas.
Quatro condições principais influenciam o meio físico de um micro-organismo: temperatura,
pH, atmosfera gasosa e pressão osmótica.

9.1. Temperatura

A temperatura tem grande influência no crescimento de micro-organismos, uma vez que os

processos de crescimento são dependentes de reações químicas que são afetadas pela temperatura.
Para determinar-se a temperatura ótima de crescimento faz-se um ensaio de taxa de crescimento.
Normalmente a temperatura ótima para uma espécie microbiana não é a temperatura média entre as
temperaturas máxima e mínima, e sim a temperatura próxima ao limite superior. Isto porque a
velocidade das reações enzimáticas aumentam com o aumento da temperatura até um ponto em que
as enzimas são danificadas pelo calor e as células param de crescer.
De acordo com a temperatura que crescem melhor os micro-organismos, eles podem ser
divididos em três grupos.
- Psicrófilos – crescem em baixas temperaturas (-3 até 25ºC)
- Mesófilos –crescem em temperaturas moderadas(20 a 45ºC)
- Termófilos –crescem em altas temperaturas (40 até 80ºC)

9.2. Atmosfera Gasosa

Os principais gases que afetam o crescimento das células microbianas são o dióxido de
carbono e o oxigênio. O CO2 é utilizado por todas as células para certas reações químicas, já o O2 é
necessário para alguns micro-organismos, mas é toxico para outros.

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 Em função da resposta do micro-organismo ao oxigênio eles podem ser classificados em
quatro grupos fisiológicos.

Micro-organismos aeróbios
Requerem o O2 da atmosfera padrão. Normalmente adquirem mais energia dos nutrientes do
que aqueles que não utilizam o O2. Quando a necessidade de CO2 é muito elevada, normalmente as
bactérias são microaerófilas. A maioria dos micro-organismos patogênicos cresce melhor em
elevadas concentrações de CO2 e este tipo de resposta configura o grupo chamado capnofílico.

peroxidase H2O
- SOD
O2
superóxido H2O2
radical
superóxido dismutase
catalase H2O + O2

Micro-organismos facultativos
Os micro-organismos crescem na presença do ar atmosférico e também em anaerobiose. Estes
não precisam de O2 para o crescimento, embora possam utilizá-lo. Sob condições anaeróbias, os
micro-organismos obtêm energia por um processo metabólico chamado fermentação.

Micro-organismos anaeróbios
São aqueles que podem ser mortos pelo O2, não podem crescer em presença de ar e não
utilizam O2 para produção de energia. Alguns anaeróbios podem tolerar baixas concentrações de
oxigênio, mas os anaeróbios estritos são mortos por uma breve exposição ao gás.

Micro-organismos microaeróbios
Utilizam o oxigênio, mas não resistem a níveis de O2 atmosférico (21%) e normalmente
crescem melhor em níveis de O2 variando em torno de 1 a 15%.

9.3. pH

O valor ótimo de pH é o valor mediano da variação de pH para a taxa de crescimento.

Independente do pH do meio, a célula deve ser capaz de manter o pH intracelular em torno de 7,5.
Para as bactérias o pH de crescimento varia de 4-9. Os bolores e leveduras têm uma variação de pH
mais extensa do que as bactérias. Além disso o pH ótimo para seu crescimento é mais baixo.

9.4. Pressão Osmótica

Quando a célula está num meio isotônico, a concentração dos solutos no meio é igual àquela
no interior da célula e não há movimentação de água para dentro ou para fora. Quando a concentração
dos solutos no meio externo é maior do que dentro da célula (meio hipertônico) a água flui para fora
da célula, resultando na desidratação e inibição do crescimento, podendo a célula morrer. Quando a
concentração dos solutos no meio externo é menor do que dentro da célula a água flui para o interior
da célula, com isto o protoplasto é forçado contra a parede celular; se a parede for fraca, pode romper-
se.

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10. INSTRUMENTOS DE INOCULAÇÃO

Para inocular ou repicar micro-organismos de um local para outro utilizam-se os materiais:

alça e agulha (fio) de platina ou de níquel cromo – instrumentos encontrados na forma esterilizável e
descartável (em alguns casos a alça pode vir com a gota de volume pré-determinado). A alça e o fio
devem ser esterilizados imediatamente antes e após o uso. Para isso, as partes metálicas devem
permanecer na chama do bico de Bunsen até atingir o rubro. Antes do contato com a cultura, a fim de
não destruir os micro-organismos a serem inoculados, a alça ou o fio devem ser resfriados em
superfície estéril (superfície interna do tubo ou da placa) e testados no ágar.

11. MÉTODOS DE INOCULAÇÃO

Quando a alça estéril é mergulhada em uma suspensão contendo micro-organismos e a seguir

retirada do meio, forma-se uma película (gota) contendo um determinado número de micro-
organismos. Essa “alçada” é chamada de inóculo; o tamanho deste inóculo vai depender de dois
fatores perfeitamente controláveis: concentração de células em suspensão e diâmetro da alça. No caso
de pipetas estéreis utilizadas para inocular volumes variáveis conforme a necessidade, elas também
podem ser utilizadas, desde que acopladas a sistemas pipetadores ou peras de borracha que garantam
a segurança no trabalho.

11.1. Inóculos líquidos em meios líquidos

A partir de uma suspensão contendo micro-organismos, podemos inocular meios líquidos

mergulhando uma alçada ou gotas da suspensão no meio líquido. Imediatamente após a inoculação
alças e fios devem ser novamente flambados até o rubro, para prevenir a contaminação do indivíduo
ou do ambiente de trabalho. Pipetas após o uso devem ser imediatamente imersas em solução
desinfetante.

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11.2. Inóculos sólidos em meios líquidos

A alça e o fio de platina podem ser usados para retirar pequenas quantidades de material
sólido. Por exemplo. Micro-organismos provenientes de uma colônia em ágar. Para tanto, basta tocar
a laça ou fio no material; a quantidade de material ou o número de micro-organismos retidos na
superfície não é mensurável e, portanto, este método de inoculação só poderá ser utilizado quando a
quantidade não for importante. A alça ou fio contendo os micro-organismos é mergulhada no meio
líquido e lentamente agitados para a liberação do inóculo.

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11.3. Inóculos líquidos ou sólidos em meios sólidos

11.3.1. Semeadura para obtenção de colônias isoladas (em estrias)

Essa técnica é utilizada quando desejamos obter colônias isoladas, bem separadas umas das
outras. Isto pode ocorrer porque o inóculo contém diferentes ou muitos micro-organismos de uma
mesma espécie. Nessa técnica, o inóculo é progressivamente espalhado, de modo a promover a
separação das células na superfície do ágar. Durante a semeadura em estrias, a alça deve tocar
levemente a superfície do meio, a fim de evitar rasuras no ágar. Entre cada novo bloco de estrias a
alça deve ser flambada para eliminar os micro-organismos remanescentes na mesma.
Este método baseia-se no fato de que cada célula (ou grupo de células) origina uma colônia,
assim cada colônia isolada corresponde a uma cultura pura.

11.3.2. Semeadura em ágar inclinado e semissólido

Esse método é utilizado quando se quer promover o crescimento de micro-organismos
simultaneamente, em condições de semi-anaerobiose e aerobiose. Para isso, usamos o meio sólido
inclinado em tubo. Espetamos o fio de platina contendo o inóculo na base do meio de cultura sólido,
retirando-o em seguida e passando lentamente em ziguezague pela superfície do meio. Dessa forma,
o inóculo fica distribuído na base (condição de anaerobiose) e na superfície do meio (condição de
aerobiose). Nos tubos contendo meio semissólido, o procedimento é o mesmo, porém este meio não
apresenta superfície inclinada uma vez que não é completamente sólido.

11.3.3. Semeadura com espalhamento em superfície

Esta técnica consiste no espalhamento de um inóculo contido em um pequeno volume
(normalmente entre 0,05 e 0,1 mL) sobre a superfície de um meio de cultura sólido em placa. Para
garantir a obtenção de colônias isoladas para a contagem, o inóculo deve ser previamente diluído e
espalhado com alça de Drigalski ou bastão de vidro em forma de L com movimentos leves e
homogêneos.

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11.3.4. Semeadura “pour plate” ou profundidade
Neste caso o inóculo é colocado em placa de Petri (estéril)e então é adicionado o meio sólido
estéril fundido, em frasco, a temperatura do meio deve ser  40ºC. A placa é homogeneizada fazendo-
se movimentos suaves, como estivéssemos escrevendo o número 8. Após o resfriamento e
solidificação a placa é então incubada em estufa, por tempo e temperatura adequados. O crescimento
das colônias pode ser observado em toda profundidade do meio, conforme as características do micro-
organismo semeado.
Placas de Petri sempre são incubadas invertidas. A razão pela qual elas ficam invertidas (de
cabeça para baixo) é para o meio não desidratar, condensando então água na tampa.

12. COLORAÇÃO DE MICRO-ORGANISMOS

12.1. Preparação de esfregaços e fixação pelo calor

Para que uma amostra seja corada, geralmente as células são previamente mortas e fixadas.
Os esfregaços devem ser feitos sobre uma lâmina de vidro. Os passos para a preparação do esfregaço
são mostrados na figura.

(a) Colocar sobre uma lâmina limpa e seca uma gota de água.
(b) Emulsionar na lâmina os micro-organismos aderidos na alça, provenientes de cultura em meio
sólido. Se o inóculo for uma suspensão, não há necessidade da gota de água.
(c) Misturar o inóculo na gota.
(d) Espalhar o inóculo de modo a formar uma fina película sobre a lâmina.
(e) Deixar secar em temperatura ambiente. Não secar diretamente na chama, para não modificar a
morfologia dos micro-organismos.
(f) Fixar o material, passando rapidamente a lâmina 3 vezes sobre a chama do bico de Bunsen. Deixar
esfriar antes da coloração.

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12.2. Coloração de Gram

(a) Cobrir o esfregaço com solução de cristal violeta e aguardar 1 minuto.

(b) Desprezar o corante no béquer.
(c) Cobrir a lâmina com lugol, aguardar 1 minuto e desprezar o excesso.
(d) Inclinar a lâmina e gotejar um solvente (etanol 95% ou álcool acetona) até que não haja
desprendimento do corante (cerca de 30 segundos).
(e) Lavar a lâmina rapidamente em água deionizada.
(f) Cobrir com safranina e aguardar 30 segundos.
(g) Lavar a lâmina com água deionizada.
(h) Secar com papel de filtro sem esfregar.

Notas
1. O etanol poderá ser usado como agente descorante fraco.
2. O material dos corantes empregados na técnica, principalmente sedimento do cristal violeta,
poderá aparecer como artefato.
3. O descoramento para mais ou para menos é resultante da incorreta diferenciação pelo álcool
acetona.
4. A idade da cultura bacteriana tem importância fundamental na coloração de Gram. Em culturas
envelhecidas, células Gram positivas frequentemente se tornam Gram-negativas.

12.3. Preparação dos corantes de Gram

Cristal Violeta
Cristal violeta ................................................. 0,1 g
Fenol ............................................................... 0,2 g
Álcool absoluto .............................................. 10 mL
Água destilada ................................................ 100 mL
Triturar num gral o corante e acrescentar o álcool. Juntar aos poucos o fenol, misturando
sempre, de modo a obter uma mistura bem homogênea. Acrescentar a água, pouco a pouco,
misturando bem. Filtrar após 24 horas de repouso, em papel de filtro. Estocar a solução por no
máximo 2 meses.

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 Lugol
iodo ................................................................. 1g
Iodeto de potássio ........................................... 2g
Água destilada ................................................ 300 mL
Triturar num gral o iodo com o iodeto até que forme uma pasta homogênea. Acrescentar a
água e misturar bem. Preparar em quantidade que seja usada antes de 30 dias.

Álcool acetona
Álcool ............................................................. 800 mL
Acetona .......................................................... 200 mL
Misturar bem os dois componentes. Preparar antes do uso.

Safranina
Safranina ......................................................... 2,5 g
Água destilada ................................................ 500 mL
Misturar bem o pó com água, até dissolver completamente.

Todas soluções de corantes devem ser estocadas em frasco de vidro âmbar.

13. TESTE DE SENSIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS

O método de disco-difusão é uma das abordagens mais antigas para realização de testes de
sensibilidade aos antimicrobianos e permanece como um dos mais amplamente utilizados na rotina
dos laboratórios clínicos. É adequado para testar a maioria dos patógenos bacterianos, incluindo as
bactérias fastidiosas mais comuns, é versátil em relação a gama de agentes antimicrobianos que
podem ser testados e não requer equipamento especial.
O teste é realizado em ágar Mueller-Hinton (MH) que deve ser preparado de acordo com as
instruções do fabricante, deve ser colocado em placas de Petri estéreis e o meio deve ter uma espessura
de 4,0 ± 0,5 mm. A superfície do ágar deve estar seca antes do uso. Nenhuma gota de água deve estar
visível na superfície do ágar ou no interior da tampa. Não secar excessivamente as placas. Após
secagem, elas podem ser armazenadas em geladeira (4-8°C). Para placas estocadas em geladeira pode
ser necessária a secagem antes do uso. Isto é necessário para impedir o excesso de umidade que pode
resultar em halos com bordas distorcidas e/ou névoa no interior dos halos.
Para preparar o inóculo, é utilizado o método de suspensão direta das colônias em soro
fisiológico estéril para fazer a suspensão de microrganismos de modo a obter densidade equivalente
ao padrão de turbidez 0,5 da escala McFarland, que corresponde aproximadamente a 1-2 x 108
UFC/mL para Escherichia coli. O método da suspensão direta das colônias é apropriado para todos
os microrganismos, incluindo os microrganismos fastidiosos. Usar alça estéril para preparar a
suspensão a partir de um crescimento overnight em um meio não seletivo, utilizar várias colônias
morfologicamente similares (quando possível) para evitar selecionar variantes atípicas. Suspender as
colônias em soro fisiológico estéril e homogeneizar até obter uma suspensão uniforme. O ajuste da
densidade da suspensão do inóculo de modo a obter turbidez equivalente ao padrão 0,5 da escala de
McFarland é feito adicionando-se soro fisiológico estéril ou mais bactéria. Um inóculo mais denso
pode resultar em halos menores e inóculo com menor densidade terá um efeito oposto. A suspensão
deve ser utilizada, de preferência, em até 15min e obrigatoriamente em até 60min após a preparação.

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13.1. Preparação do padrão de turbidez 0,5 de McFarland

1) Adicionar 0,5 mL de solução de BaCl2 0,048 mol/L (1,175% p/v BaCl2·2H2O) a 99,5 mL de
solução 0,18 mol/L (0,36 N) de H2SO4 (1% v/v) e misturar bem.
2) Conferir a densidade óptica da suspensão em um espectrofotômetro com trajeto de luz de 1 cm e
cubetas apropriadas. A absorbância em 625 nm deve estar na faixa de 0,08 a 0,13.
3) Distribuir a suspensão em tubos de mesmas dimensões que aqueles utilizados para preparar o
inóculo bacteriano. Vedar os tubos.
4) Armazenar os padrões vedados, no escuro e em temperatura ambiente.
5) Agitar os padrões vigorosamente em um misturador vórtex imediatamente antes do uso.
6) Renovar os padrões ou conferir a absorbância após 6 meses de armazenamento.

13.2. Inoculação nas placas de ágar

1) Garantir que as placas (ágar MH) estejam em temperatura ambiente previamente à inoculação.
2) Preferencialmente, utilizar a suspensão ajustada do inóculo em até 15min após a preparação. A
suspensão deve ser obrigatoriamente utilizada em até 60 minutos após a preparação.
3) Mergulhar um swab de algodão estéril na suspensão. Para evitar a inoculação excessiva de
microrganismos gram-negativos nas placas, remover o excesso de líquido pressionando e girando
o swab contra a parte interna do tubo, acima do nível da suspensão. Para bactérias gram-positivas,
não pressionar o swab contra a parte interna do tubo.
4) Quando inocular várias placas com a mesma suspensão do inóculo, repetir o procedimento do
item 3 para cada placa de ágar.
5) As placas podem ser inoculadas espalhando o inóculo uniformemente em três direções. Espalhar
o inóculo uniformemente sobre toda a superfície assegurando que não haja falhas entre as estrias.
Para bactérias gram-positivas, tenha atenção especial a fim de garantir que não haja
descontinuidade ou falhas entre as estrias.
6) Aplicar os discos em até 15min após a inoculação da placa. Se as placas inoculadas forem
deixadas em temperatura ambiente por períodos prolongados, antes da aplicação dos discos, os
microrganismos podem iniciar o crescimento, resultando em redução errônea do tamanho dos
halos de inibição.

13.3. Aplicação dos discos de antimicrobianos

1) O conteúdo (potência) dos discos a serem utilizados está descrito nas Tabelas de Pontos de Cortes
e de Controle de Qualidade no site do BrCAST ([Link] Os diâmetros dos halos de
inibição dos pontos de corte do BrCAST-EUCAST e os critérios utilizados para o controle de
qualidade são validados para discos de papel de 6 mm.
2) Os discos devem estar à temperatura ambiente antes da abertura dos cartuchos ou recipientes
utilizados para o armazenamento dos discos.
3) Aplicar os discos firmemente na superfície da placa de ágar em até 15 minutos da inoculação. O
contato dos discos com a superfície do ágar deve ser por completo. Os discos não devem ser
removidos após a aplicação nas placas, uma vez que a difusão dos agentes antimicrobianos dos
discos é muito rápida.
4) O número de discos nas placas deve ser limitado para impedir sobreposição dos halos de inibição
e a interferência entre os antimicrobianos. É importante que os diâmetros dos halos sejam
medidos corretamente. O número máximo de discos varia de acordo com o microrganismo e a
seleção dos discos.
5) Armazenar os discos em estoque de acordo com as instruções do fabricante.

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13.4. Incubação das placas

1) Inverter as placas e verificar se os discos não se desprendem da superfície do ágar. Incubar em

até 15 minutos após a aplicação dos discos. Se as placas forem deixadas em temperatura ambiente
após a aplicação dos discos, a pré-difusão pode resultar em halos de inibição erroneamente
aumentados.
2) O empilhamento das placas na incubadora pode alterar os resultados devido ao aquecimento
desigual entre elas. A eficiência das incubadoras varia, portanto, o controle da temperatura de
incubação, incluindo o número apropriado de placas empilhadas deve fazer parte do programa
de garantia de qualidade do laboratório. Para a maioria das incubadoras, idealmente, empilhar no
máximo cinco placas.
3) Incubar as placas 35±1°C em aerobiose por 18 ± 2h.
4) A incubação além do limite de tempo recomendado não é permitida uma vez que resulta no
crescimento no interior do halo de inibição e reporte de isolados falso resistentes.

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13.5. Avaliação das placas após incubação

1) Um inóculo correto e placas satisfatoriamente semeadas devem resultar em um crescimento

confluente. Quando colônias isoladas forem observadas, o inóculo é muito escasso e o teste deve
ser repetido.
2) O crescimento deve ser uniformemente distribuído na superfície do ágar para obter halos de
inibição uniformemente circulares (não distorcidos).
3) Verificar se os diâmetros dos halos de inibição das cepas de controle de qualidade estão dentro
dos limites aceitáveis ([Link]

Referências Bibliográficas

BORZANI, W.(coord.) et alli, Biotecnologia Industrial - [Link].1 São Paulo: Edgar

Blücher, 2001.

BrCAST – Brazilian Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. Teste de sensibilidade aos

antimicrobianos. Método de disco-difusão BrCAST-EUCAST. Disponível em [Link]
Data de acesso: 01/02/2024.

MADIGAN, M.T.; MARTINKO, J.M. e PARKER, J. Microbiologia de Brock. São Paulo: Prentice
Hall, 2004.

PELCZAR, M. J.; CHAN, E. C. S. e KRIEG, N. R. Microbiologia: Conceitos e Aplicações. Vol 1.

São Paulo: Makron Books, 1996.

RIBEIRO, M. C. e SOARES, M. M. Microbiologia Prática: Roteiro e Manual. São Paulo: Atheneu,

1993.

TORTORA, G. J., FUNKE, B. R. & CASE, C. L. Microbiologia. 6ª ed. Porto Alegre: Artes
Médicas Sul, 2000.

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