DNA: Estrutura e Replicação

CAPÍTULO

Enovelamento do DNA [TED M. KINSMAN/Science Source].

Visão geral do capítulo e objetivos de aprendizagem

7.1DNA: o material genético

OA 7.1Descrever as evidências que demonstram que o DNA é o material genético.

7.2Estrutura do DNA

OA 7.2Descrever a evidência usada para construir o modelo de dupla-hélice de DNA.

OA 7.3Desenhar a estrutura química de uma dupla-hélice de DNA.

7.3Replicação semiconservativa

OA 7.4Descrever a evidência usada para sustentar a replicação semiconservativa do DNA.

7.4Replicação em bactérias

OA 7.5Descrever os fatores e os eventos envolvidos na replicação do DNA.

7.5Replicação em eucariotos
OA 7.6Explicar por que e como a replicação do DNA difere entre bactérias e eucariotos.

Objetivo do capítulo

Com base na descoberta dos geneticistas do início do século XX de que a hereditariedade

envolve cromossomos, o objetivo geral deste capítulo é compreender como a estrutura do
DNA, com suas fitas de bases pareadas, (1) mantém a informação genética que determina
como os organismos são construídos e (2) é copiada com precisão para possibilitar que a
informação genética seja herdada quando as células se dividem e os organismos se
reproduzem.

Neste capítulo, descrevemos a estrutura do DNA e o processo de replicação de DNA, que

produz uma cópia idêntica do DNA cada vez que a célula se divide. A história começa no início
dos anos 1900, quando resultados de vários experimentos levaram os cientistas a concluírem
que o DNA, em vez de outra molécula biológica como carboidrato, proteína ou lipídio, é o
material genético. O DNA é uma molécula simples composta de apenas quatro blocos de
construção, chamados nucleotídios. Portanto, era necessário entender como essa molécula
tão simples poderia ser o padrão para a incrível diversidade de organismos na Terra.

Grande parte desse entendimento veio da estrutura do DNA, que foi determinada em 1953
por James Watson e Francis Crick por meio de modelagem baseada em dados de terceiros. Seu
modelo da estrutura do DNA foi revolucionário porque definiu os genes em termos químicos e,
com isso, abriu o caminho para a compreensão da ação dos genes e da hereditariedade em
nível molecular. Para se ter uma dimensão da importância dessa descoberta, a estrutura em
dupla-hélice do DNA tornou-se um ícone cultural que é visto com cada vez mais frequência em
várias formas de arte.

O modelo de DNA proposto por Watson e Crick foi construído com base nos resultados de
cientistas anteriores a eles. Eles se basearam em descobertas anteriores da composição
química do DNA e das proporções de suas bases de nucleotídios. Além disso, imagens de fibras
de DNA produzidas por difração de raios X revelaram ao olho treinado que o DNA é uma hélice
de dimensões precisas. Watson e Crick concluíram que o DNA é uma dupla-hélice composta
por duas fitas de nucleotídios ligados que se enrolam uma na outra.

A estrutura proposta do DNA sugeriu imediatamente que a sequência de nucleotídios que

compõe as duas fitas de DNA da hélice poderia servir como um padrão para a construção de
um organismo. Além disso, a estrutura sugeria como o padrão poderia ser copiado em todas as
células de um organismo. Por causa das regras de complementaridade de bases descobertas
por Watson e Crick, a sequência de uma fita determina a sequência da outra. Dessa forma, a
informação genética na sequência de DNA pode ser passada de uma célula mãe para cada
célula-filha, fazendo com que cada uma das fitas separadas de DNA sirva como um modelo
para a produção de novas cópias de DNA de fita dupla.

Em resumo, este capítulo enfoca na estrutura do DNA e nas moléculas e nos mecanismos que
produzem cópias do DNA em um processo denominado replicação do DNA. Essas informações
são essenciais para a compreensão da base molecular dos genes e da herança genética. Como
exatamente o DNA é replicado ainda é uma área ativa de pesquisa mais de 65 anos após a
descoberta da estrutura de dupla-hélice. Nossa compreensão atual do mecanismo de
replicação atribui um papel central a uma máquina de proteínas chamada de replissomo. Esse
complexo de proteínas coordena inúmeras reações que são necessárias para uma replicação
de DNA rápida e precisa.

7.1DNA: o material genético

OA 7.1Descrever as evidências que demonstram que o DNA é o material genético.

Antes de descobrir como Watson e Crick solucionaram a estrutura do DNA, vamos revisar o
que se sabia sobre genes e DNA na época em que os dois começaram sua colaboração
histórica:

[Link] genes – os “fatores” hereditários descritos por Mendel – eram conhecidos por estarem
associados a características específicas, mas sua natureza física não era compreendida. Da
mesma forma, as mutações eram conhecidas por alterar a função do gene, mas a natureza
química precisa de uma mutação não era compreendida.

2.A hipótese de um-gene-uma-enzima (descrita no Capítulo 5) postulou que os genes

determinam a estrutura das proteínas.

[Link]-se que os genes estavam nos cromossomos.

[Link]-se também que os cromossomos consistiam em DNA e proteína.

[Link] descrito a seguir, experimentos iniciados na década de 1920 revelaram que o DNA
é o material genético.

A descoberta da transformação bacteriana: o experimento de Griffith

Em 1928, Frederick Griffith fez a observação intrigante de que o genótipo e o fenótipo de uma
cepa bacteriana viva podem ser alterados, ou seja, “transformados”, ao misturá-la com uma
cepa bacteriana diferente, morta pelo calor. Seus estudos usaram a bactéria Streptococcus
pneumoniae, que causa pneumonia em humanos e normalmente é letal em camundongos. No
entanto, algumas cepas dessa espécie bacteriana evoluíram para ser menos virulentas (menos
capazes de causar doenças ou morte). Em experimentos resumidos na Figura 7.1, Griffith usou
duas cepas que são distinguíveis pela aparência de suas colônias quando cultivadas em
culturas de laboratório. Uma cepa era do tipo virulento normal, mortal para a maioria dos
animais de laboratório. As células dessa cepa estavam envolvidas por uma cápsula de
polissacarídeo, dando às colônias uma aparência lisa; essa linhagem é identificada como S. A
outra cepa de Griffith era um tipo mutante não virulento que cresce em camundongos, mas
não é letal. Nessa cepa, o revestimento de polissacarídeo está ausente, dando às colônias uma
aparência áspera; essa cepa é chamada de R.

Griffith matou algumas células S virulentas fervendo-as. Depois, injetou as células mortas pelo
calor em camundongos. Os camundongos sobreviveram, mostrando que as carcaças das
células não causam a morte. No entanto, os camundongos injetados com uma mistura de
células S virulentas mortas pelo calor e células R não virulentas vivas morreram. Além disso, as
células vivas puderam ser recuperadas dos camundongos mortos; essas células deram colônias
lisas e eram virulentas na injeção subsequente. De alguma forma, os restos de células das
células S fervidas converteram algumas das células R vivas em células S vivas. Ou seja, as
células R vivas foram transformadas em células S ao coletar algum componente químico das
células S mortas. O processo, já discutido no Capítulo 6, é chamado transformação.

Figura 7.1 A presença de células S mortas pelo calor transforma as células R vivas em células S
vivas. A. Os camundongos morrem após a injeção de células S virulentas. B. Os camundongos
sobrevivem após a injeção de células R. C. Os camundongos sobrevivem após a injeção de
células S mortas pelo calor. D. Os camundongos morrem após a injeção de uma mistura de
células S e células R vivas. As células S vivas foram isoladas a partir de camundongos mortos,
indicando que as células S mortas pelo calor, de alguma forma, transformaram as células R não
virulentas em células S virulentas.

Evidências de que o DNA é o material genético das bactérias: os experimentos de Avery,

Macleod e McCarty

A próxima etapa foi determinar qual componente químico das células S mortas causava a
transformação. Essa molécula havia mudado o genótipo da cepa receptora e, portanto, era
candidata ao material hereditário. O problema foi resolvido por experimentos conduzidos em
1944 por Oswald Avery, Colin MacLeod e Maclyn McCarty (Figura 7.2). Sua abordagem do
problema era destruir todas as principais categorias de produtos químicos em um extrato de
células S mortas, uma de cada vez, e descobrir se o extrato havia perdido a capacidade de se
transformar. As células S virulentas tinham um revestimento polissacarídeo liso, enquanto as
células R não virulentas não; portanto, os polissacarídeos eram um candidato óbvio para o
agente de transformação. Porém, quando os polissacarídeos foram destruídos, a mistura ainda
era capaz de se transformar. Lipídios, RNAs e proteínas também mostraram não ser o agente
de transformação. Em contrapartida, a mistura perdeu sua capacidade de transformação
quando a mistura doadora foi tratada com a enzima desoxirribonuclease (DNase), que destrói
o DNA. Esses resultados implicaram fortemente o DNA como o material genético. Sabe-se
agora que fragmentos do DNA em transformação que conferem virulência entram no
cromossomo bacteriano e substituem suas contrapartes que conferem não virulência.

CONCEITO-CHAVE A demonstração de que o DNA é o agente transformador foi a primeira

evidência de que os genes (o material hereditário) são compostos de DNA.

Evidências de que o DNA é o material genético no fago: o experimento Hershey-Chase

Os experimentos conduzidos por Avery e seus colegas foram definitivos, mas muitos cientistas
relutaram em aceitar o DNA (em vez de proteínas) como material genético. Afinal, como uma
molécula de tão baixa complexidade como o DNA poderia codificar a diversidade de todos os
seres vivos? Em 1952, Alfred Hershey e Martha Chase forneceram evidências adicionais em um
experimento que fez uso do bacteriófago T2 (ou fago T2, para abreviar), um vírus que infecta
bactérias. Eles inferiram que o fago infectante deve injetar na bactéria as informações
específicas que direcionam a produção de novas partículas virais. Se conseguissem descobrir
qual material o fago estava injetando no hospedeiro bacteriano, eles teriam determinado o
material genético dos fagos.

O fago é relativamente simples na composição molecular. A estrutura T2 é semelhante ao T4

mostrado nas Figuras 6.20 a 6.22. A maior parte de sua estrutura é de proteína, com DNA
contido dentro da bainha de proteína de sua “cabeça”. Hershey e Chase usaram radioisótopos
para dar ao DNA e às proteínas rótulos distintos que eles puderam rastrear durante a infecção.
O fósforo não é encontrado nos blocos de construção de aminoácidos das proteínas, mas é
encontrado no DNA; inversamente, o enxofre não está nos blocos de construção dos
nucleotídios do DNA, mas sim nas proteínas. Hershey e Chase incorporaram um radioisótopo
de fósforo (32P) no DNA e um de enxofre (35S) em proteínas de culturas de fago separadas.
Radioisótopos são isótopos instáveis (i. e., radioativos) de um elemento que emite radiação
para se transformar em uma forma mais estável. A radiação emitida pode ser medida usando
instrumentos como um contador de cintilação ou um contador Geiger ou por autorradiografia
(descrito na Seção 7.3).

Figura 7.2 O DNA é o material genético que transforma células R não virulentas em células S
virulentas. Os camundongos sobrevivem quando injetados com uma mistura de células S
mortas pelo calor com DNA destruído e células R não virulentas vivas. No entanto, a destruição
de polissacarídeos, lipídios, RNAs ou proteínas não permite que os camundongos sobrevivam.
Portanto, o DNA é necessário para a transformação, mas não o polissacarídeo, o lipídio, o RNA
nem a proteína.

Como mostrado na Figura 7.3, depois de rotular o DNA do fago e as proteínas, eles infectaram
duas culturas de E. coli com muitas partículas de fago por célula: uma cultura de E. coli
recebeu o fago marcado com 32P e a outra recebeu o fago marcado com 35S. Depois de dar
tempo suficiente para que a infecção ocorresse, eles separaram as carcaças vazias do fago
(chamadas fantasmas) das células bacterianas em um liquidificador de cozinha. Eles separaram
as células bacterianas dos fantasmas fágicos em uma centrífuga e mediram a radioatividade no
sedimento sólido de bactérias e no sobrenadante líquido dos fantasmas fágicos. Quando os
fagos marcados com 32P foram usados para infectar E. coli, a radioatividade acabou dentro
das células bacterianas, indicando que o DNA do fago entrou nas células. Em contraste,
quando fagos marcados com 35S foram usados, o material radioativo acabou nos fantasmas do
fago, indicando que as proteínas do fago não entraram na célula bacteriana. Além disso, a
prole de fagos marcados com 32P permaneceu marcada, mas a prole de fagos marcados com
35S não foi marcada. Esses dados mais uma vez indicaram que o DNA é o material hereditário.
As proteínas do fago são meros pacotes estruturais que são descartados após a entrega do
DNA viral à célula bacteriana.

7.2Estrutura do DNA

OA 7.2Descrever a evidência usada para construir o modelo de dupla-hélice de DNA.

OA 7.3Desenhar a estrutura química de uma dupla-hélice de DNA.

Mesmo antes da estrutura do DNA ser elucidada, estudos genéticos indicavam que o material
hereditário devia ter três propriedades principais:

[Link] essencialmente todas as células do corpo de um organismo têm a mesma composição

genética, a replicação precisa do material genético em cada divisão celular é crucial. Assim, as
características estruturais do material genético devem permitir uma replicação precisa. As
características estruturais do DNA serão abordadas nesta seção do capítulo.

Figura 7.3 O experimento Hershey-Chase demonstra que o material genético dos fagos é DNA,
não proteína. O experimento usa dois conjuntos de fago T2. Em um conjunto, o revestimento
de proteína é marcado com enxofre radioativo (35S), não encontrado no DNA. No outro
conjunto, o DNA é marcado com fósforo radioativo (32P), não encontrado na proteína. Apenas
o 32P é recuperado de E. coli e da prole de fago, indicando que o DNA é o material genético
necessário para a produção de novos fagos.

[Link] devem codificar a coleção de proteínas expressas por um organismo, as características

estruturais do material genético devem ter conteúdo informativo. Como as informações
codificadas no DNA são decifradas para produzir proteínas é o assunto dos Capítulos 8 e 9.

[Link] as mudanças hereditárias, chamadas mutações, fornecem a matéria-prima para a

seleção evolutiva, o material genético deve ser capaz de mudar em ocasiões raras. No entanto,
a estrutura do material genético deve ser estável o suficiente para que um organismo usufrua
de suas informações codificadas. Os mecanismos de mutações de DNA serão abordados no
Capítulo 16.

A estrutura do DNA antes de Watson e Crick

Considere a descoberta da estrutura em dupla-hélice do DNA por Watson e Crick como a

solução para um complicado quebra-cabeça tridimensional. Para resolver esse quebra-cabeça,
Watson e Crick usaram um processo chamado “construção de modelo”, no qual reuniram os
resultados de experimentos anteriores e em andamento (as peças do quebra-cabeça) para
formar o quebra-cabeça tridimensional (o modelo de dupla-hélice). Para entender como eles
construíram o modelo de DNA, primeiro precisamos saber quais peças do quebra-cabeça
estavam disponíveis para eles.

Os blocos de construção do DNA. A primeira peça do quebra-cabeça era a compreensão dos

blocos básicos de construção do DNA. Como produto químico, o DNA é bastante simples. Ele
contém três componentes: (1) fosfato, (2) um açúcar chamado desoxirribose e (3) quatro
bases nitrogenadas – adenina, guanina, citosina e timina (Figura 7.4). O açúcar no DNA é
chamado de “desoxirribose” porque contém açúcares ribose que não possuem um átomo de
oxigênio. A desoxirribose tem um átomo de hidrogênio (H) no átomo de carbono 29, ao
contrário da ribose (um componente do RNA), que tem um grupo hidroxila (OH) nessa posição.
Duas das bases, adenina e guanina, têm uma estrutura de anel duplo característica de uma
classe de produtos químicos chamados purinas. As outras duas bases, citosina e timina, têm
uma estrutura de anel único característica de outra classe de substâncias químicas chamadas
pirimidinas. São atribuídos números aos átomos de carbono e nitrogênio nos anéis das bases
para facilitar a referência. Os átomos de carbono no grupo do açúcar também recebem
números – nesse caso, cada número é seguido por uma linha (19, 29 e assim por diante).

CONCEITO-CHAVE O DNA contém quatro bases – duas purinas (adenina e guanina) e duas
pirimidinas (citosina e timina).

As subunidades químicas do DNA são nucleotídios ou, mais especificamente,

desoxinucleotídios, cada um composto por um grupo fosfato, uma molécula de açúcar
desoxirribose e uma das quatro bases (Figura 7.4). É conveniente referir-se a cada nucleotídio
pela primeira letra do nome de sua base: A, G, C ou T. O nucleotídio com a base de adenina é
chamado de desoxiadenosina 59-monofosfato e abreviado dAMP, no qual o 59 se refere à
posição do átomo de carbono no anel de açúcar ao qual o único grupo (mono) fosfato está
ligado. Os outros nucleotídios são nomeados usando a mesma convenção.

CONCEITO-CHAVE Os nucleotídios do DNA são conhecidos como desoxinucleotídios e são

compostos por um fosfato, uma desoxirribose e uma base purina ou pirimidina.
Figura 7.4 Os nucleotídios são os blocos de construção fundamentais do DNA. Todos os
nucleotídios têm um fosfato, um açúcar e uma base. O açúcar é chamado de desoxirribose
porque é uma variante da ribose que carece de um átomo de oxigênio, indicado pela seta
vermelha. Existem duas bases purinas (adenina e guanina) e duas bases pirimidinas (citosina e
timina). Observe que cada uma das bases contém átomos de nitrogênio.

Regra de Chargaff de composição de bases. A segunda peça do quebra-cabeça usada por

Watson e Crick veio do trabalho feito vários anos antes por Erwin Chargaff. Ao estudar uma
grande seleção de DNAs de diferentes organismos (Tabela 7.1), Chargaff estabeleceu
determinadas regras empíricas a respeitos das quantidades de cada tipo de nucleotídio
encontrado no DNA:

1.A quantidade total de nucleotídios de purina (A 1 G) é sempre igual à quantidade total de

nucleotídios de pirimidina (T 1 C).

2.A quantidade de A sempre é igual à quantidade de T e a quantidade de G sempre é igual à

quantidade de C; ou seja, A/T e G/C é próximo a 1,0, independentemente da fonte de DNA
(Tabela 7.1).

3.A quantidade de A 1 T não é necessariamente igual à quantidade de G 1 C, como pode ser

visto na última coluna da Tabela 7.1. A proporção (A 1 T)/(G 1 C) varia entre os diferentes
organismos. Por exemplo, em ouriços-do-mar, a proporção é de 1,85, indicando que o genoma
do ouriço-do-mar tem quase duas vezes mais A 1 T do que G 1 C; diz-se que é rico em AT. Em
contraste, o genoma do Mycobacterium tuberculosis é rico em GC, com cerca de duas vezes
mais G 1 C do que A 1 T. No entanto, a proporção é praticamente a mesma em diferentes
tecidos do mesmo organismo (como visto para tecidos humanos nas últimas três linhas da
Tabela 7.1), sustentando a ideia de que todas as células de um organismo têm a mesma
sequência de DNA genômico.

CONCEITO-CHAVE O DNA contém uma quantidade igual de nucleotídios A e T e nucleotídios G

e C. Os organismos variam na quantidade relativa de A 1 T versus G 1 C, mas tecidos diferentes
no mesmo organismo têm a mesma quantidade relativa de A 1 T versus G 1 C.

Análise de difração de raios X de DNA: Rosalind Franklin. A terceira peça do quebra-cabeça

veio do padrão de difração de raios X das fibras de DNA (Figura 7.5A) que foi coletado por
Rosalind Franklin (Figura 7.5B). Nesse experimento, os raios X foram disparados em fibras de
DNA coletadas de células, como mostrado na fotografia de abertura deste capítulo. A
dispersão dos raios X das fibras é detectada como manchas no filme fotográfico (Figura 7.5A).
O ângulo de dispersão representado por cada ponto do filme fornece informações sobre a
posição de um átomo ou de determinados grupos de átomos no DNA. Os pontos mais escuros
são onde o filme foi atingido várias vezes por raios X de partes repetidas do DNA, como bases
de nucleotídios. Não é simples realizar (ou explicar) esse procedimento, e a interpretação dos
padrões pontuais requerem um tratamento matemático complexo que está além do escopo
deste texto. Os dados disponíveis sugerem que o DNA é longo e fino e que tem duas partes
semelhantes que são paralelas entre si e correm ao longo do comprimento da molécula. Os
dados de raios X mostraram que o DNA é helicoidal, como uma escada em espiral. Sem que
Franklin soubesse, sua melhor imagem de raios X (Figura 7.5) foi mostrada a Watson e Crick, e
essa peça crucial do quebra-cabeça permitiu que deduzissem a estrutura tridimensional do
DNA (Figura 7.6).

TABELA 7.1 Propriedades molares das bases* em DNAs de várias fontes.

Organismo

Tecido

Adenina

Timina

Guanina

Citosina

A 1 T/G 1 C

E. coli (K12)

26,0

23,9

24,9
25,2

1,00

D. pneumoniae

29,8

31,6

20,5

18,0

1,59

M. tuberculosis

15,1

14,6

34,9

35,4

0,42
Levedura

31,3

32,9

18,7

17,1

1,79

Ouriço-do-mar

Espermatozoide

32,8

32,1

17,7

18,4

1,85

Arenque
Espermatozoide

27,8

27,5

22,2

22,6

1,23

Rato

Medula óssea

28,6

28,4

21,4

21,5

1,33

Humano

Timo

30,9
29,4

19,9

19,8

1,52

Humano

Fígado

30,3

30,3

19,5

19,9

1,53

Humano

Espermatozoide

30,7

31,2
19,3

18,8

1,62

*Definido como moles de constituintes nitrogenosos por 100 g de átomos de fosfato no

hidrolisado. [Fonte: Dados de E. Chargaff and J. Davidson, eds., The Nucleic Acids. Academic
Press, 1955.]

Figura 7.5 O padrão de difração de raios X do DNA determinado por Rosalind Franklin.

CONCEITO-CHAVE O padrão de difração de raios X do DNA mostrou que ele é uma hélice de
duas fitas longas e delgadas (ou seja, uma dupla-hélice).

Figura 7.6 James Watson (esquerda) e Francis Crick (direita) com seu modelo tridimensional de
DNA e um desenho bidimensional de DNA na parede. [BARRINGTON BROWN/Science Source.]

A estrutura de dupla-hélice do DNA: Watson e Crick

Um artigo de 1953 de Watson e Crick na revista Nature começou com duas frases que
inauguraram uma nova era da biologia: “Queremos sugerir uma estrutura para o sal do ácido
nucleico desoxirribose (D.N.A). Essa estrutura possui características inovadoras que são de
considerável interesse biológico.”1 A estrutura do DNA tem sido um assunto de grande debate
desde os experimentos de Avery e colaboradores em 1944. A composição geral do DNA era
conhecida, mas como as partes se encaixavam, não se sabia. A estrutura tinha que cumprir os
principais requisitos de uma molécula hereditária:
7.4Replicação em bactérias

OA 7.5Descrever os fatores e os eventos envolvidos na replicação do DNA.

Nesta seção, percorreremos as etapas da replicação do DNA em bactérias, enfatizando as

atividades das enzimas no replissomo, a máquina molecular multiproteica que realiza a
replicação do DNA. Etapas semelhantes ocorrem em eucariotos e são realizadas por enzimas
análogas (Tabela 7.2).

Abertura da dupla-hélice de DNA

Quando a dupla-hélice foi proposta em 1953, a principal objeção era que a replicação dessa
estrutura exigiria a abertura da dupla-hélice e a quebra das ligações de hidrogênio que
mantêm as fitas unidas. Como seria possível abrir, ou desnovelar, o DNA tão rapidamente e,
mesmo se fosse possível, isso não iria sobrecarregar o DNA anterior à forquilha e torná-lo um
completo emaranhado? Podemos resolver o problema ao imaginar dois fios de uma corda que
são separados em uma extremidade enquanto a outra extremidade é mantida estática (Figura
7.12A). Hoje sabemos que o replissomo contém proteínas que abrem a hélice e evitam o
enrolamento excessivo: são as helicases e as topoisomerases, respectivamente.

As helicases são enzimas que rompem as ligações de hidrogênio que mantêm as duas fitas da
dupla-hélice unidas. A helicase de replicação de DNA é um homohexâmero em forma de anel
de proteínas DnaB (i. e., um complexo de seis cópias de DnaB) que envolve o DNA de fita
simples nas forquilhas de replicação. A partir dessa posição, as helicases usam a energia da
hidrólise de ATP para descompactar rapidamente a dupla-hélice antes da síntese de DNA
(Figura 7.12B, etapa 1). O DNA não enrolado é estabilizado por proteínas de ligação ao DNA de
fita simples (SSB), que se ligam ao DNA de fita simples e evitam que o dúplex se forme
novamente.
A abertura do DNA por helicases faz com que uma torção extra ocorra antes das forquilhas de
replicação, e superespirais se formam para liberar a tensão da torção extra (Figura 7.12B,
etapa 1). Torções e superespirais devem ser removidas (ou relaxadas, como se diz mais
comumente) para permitir que a replicação continue. Isso é feito por enzimas chamadas
topoisomerases, das quais um exemplo é a DNA girase (Figura 7.12B, etapas 2 e 3). As
topoisomerases relaxam o DNA superenrolado quebrando uma única fita de DNA ou ambas, o
que permite que o DNA rotacione e torne-se uma molécula relaxada. As topoisomerases
terminam seu trabalho religando as fitas do DNA agora relaxado (Figura 7.12B, etapa 4).

CONCEITO-CHAVE Helicases, topoisomerases e proteínas de ligação de fita simples geram e

mantêm o DNA de fita simples que é usado como molde para a replicação de DNA.

Montagem do replissomo: iniciação da replicação

A montagem do replissomo é um processo ordenado que começa em um local preciso no

cromossomo denominado origem de replicação, ou simplesmente origem. A replicação de E.
coli começa a partir de uma única origem (um locus denominado oriC) e avança em ambas as
direções (com forquilhas móveis em ambas as extremidades, como mostrado na Figura 7.11B)
até a fusão das forquilhas. OriC tem 245 pares de bases e contém cinco cópias de sequências
de 9 pares de bases chamadas caixas de DnaA e um elemento de desenovelamento de DNA
adjacente que é rico em AT (Figura 7.13). A primeira etapa na montagem do replissoma é a
ligação de uma proteína chamada DnaA às caixas de DnaA, o que auxilia outros exemplares de
DnaA a se ligarem na origem em um processo chamado de oligomerização. A ligação
subsequente de DnaA à região rica em AT promove o desenovelamento para formar uma
bolha de DNA de fita única. Lembre-se de que os pares de bases A-T são mantidos unidos com
apenas duas ligações de hidrogênio, enquanto os pares de bases G-C são mantidos unidos com
três. Portanto, é mais fácil separar (desnaturar) a dupla-hélice em trechos de DNA que são
enriquecidos em pares de bases A-T.

TABELA 7.2 Fatores análogos da replicação do DNA em bactérias e eucariotos.

Função

Bactéria (E. coli)

Eucariotos (humanos)

Reconhece as origens
DnaA

ORC (complexo de reconhecimento de origem)

Desenovela a dupla fita de DNA

Helicase DnaB

Helicase MCM2-7 (manutenção de minicromossomo 2 a 7)

Auxilia a ligação da helicase

DnaC

Cdc6 e ORC

Estabiliza a fita única de DNA

SSB

RPA (fator de replicação A)

Remove torções e superespirais

Girase

Topoisomerases

Sintetiza os primers de RNA

Primase

complexo DNA pol a-primase

Alonga o DNA

DNA pol III

DNA pol  (fita principal) e d (fita descontínua)

Grampo deslizante

Grampo b

PCNA (antígeno nuclear da célula proliferativa)

Carregador do grampo

Complexo t

RFC (fator de replicação C)

Remove os primers de RNA

DNA pol I

FEN1

Substitui os primers de RNA com DNA

DNA pol I
DNA pol 

Liga os fragmentos de Okazaki

DNA ligase

DNA ligase I

Figura 7.12 A. As regiões torcidas e superenroladas se acumulam à frente da forquilha de

replicação à medida que as fitas de DNA parentais se separam para a replicação, de forma
análoga ao que acontece quando uma corda é separada em filamentos individuais. B. A
helicase circunda uma cadeia de DNA em cada forquilha de replicação e utiliza a energia da
hidrólise do ATP para romper as ligações de hidrogênio entre as bases, separando as duas
cadeias e causando a torção e o superenrolamento. As moléculas SSB se ligam ao DNA de fita
simples para evitar que voltem a enovelar. Uma topoisomerase chamada DNA girase neutraliza
a torção e o superenrolamento, cortando as fitas de DNA, permitindo que rotacionem e, em
seguida, voltando a unir as fitas.

Após o início do desenovelamento, as proteínas DnaA adicionais ligam-se às regiões de fita

simples recém-desenroladas. Com a DnaA revestindo a origem, duas helicases DnaB agora se
ligam e deslizam na direção 59-para-39 para começar a abrir a hélice nas forquilhas de
replicação. Embora a DnaA seja necessária para a montagem do replissomo, ela não faz parte
da máquina de replicação. Em vez disso, sua função é apenas trazer o replissomo para o local
correto no cromossomo circular para o início da replicação. Conforme a replicação progride
por toda a origem, o replissomo desloca a DnaA a partir do DNA.

Figura 7.13 A síntese de DNA é iniciada na origem de replicação (oriC) em bactérias. As

proteínas DnaA (rosa) ligam-se primeiro às caixas de DnaA e depois ocorre a oligomerização
em toda a origem. No elemento de desenrolamento de DNA rico em AT, o DnaA separa as duas
fitas da dupla-hélice e recruta a helicase DnaB (verde) e outros componentes de replissomo
(azul) para as duas forquilhas de replicação.

CONCEITO-CHAVE O momento e o local da replicação são cuidadosamente controlados pela

montagem ordenada do replissomo em um sítio preciso chamado origem.

As DNA polimerases catalisam o alongamento da cadeia de DNA

Embora os cientistas suspeitassem que as enzimas desempenhassem um papel na síntese de
DNA, essa possibilidade não foi verificada até 1959, quando Arthur Kornberg isolou uma DNA
polimerase de E. coli e demonstrou sua atividade enzimática in vitro. Essa enzima adiciona
desoxirribonucleotídios à extremidade 39 de uma cadeia de nucleotídios em crescimento,
usando como molde uma fita única de DNA que foi exposta pelo desenovelamento localizado
da dupla-hélice (Figura 7.14). Os substratos para polimerases de DNA são as formas trifosfato
dos desoxirribonucleotídios, dATP, dGTP, dCTP e dTTP (dNTP é usado para se referir a qualquer
um dos quatro trifosfatos de desoxinucleosídio). A adição de cada base ao polímero em
crescimento é acompanhada pela remoção de dois dos três fosfatos na forma de pirofosfato
(PPi). A energia produzida pela clivagem dessa ligação e a subsequente hidrólise do pirofosfato
em duas moléculas de fosfato inorgânico ajudam a conduzir o processo de construção de um
polímero de DNA.

Hoje, são conhecidas cinco DNA polimerases em E. coli. A enzima que Kornberg purificou é
chamada DNA polimerase I ou DNA pol I. Essa enzima tem três atividades, que parecem estar
localizadas em diferentes partes da molécula: (1) uma atividade de polimerase que catalisa o
crescimento da cadeia de DNA na direção 59-para-39, (2) uma atividade de exonuclease 39-
para-59 que remove nucleotídios incompatíveis e (3) uma atividade de exonuclease 59-para-39
que degrada fitas únicas de DNA ou RNA. Voltaremos ao significado das duas atividades de
exonuclease posteriormente neste capítulo.

Embora a DNA pol I tenha um papel na replicação do DNA (consulte a próxima seção), alguns
cientistas suspeitavam que ela não era responsável pela maior parte da síntese de DNA porque
era muito lenta (cerca de 20 nucleotídios/segundo; nesse ritmo, demoraria cerca de 30 h para
replicar o genoma de E. coli), muito abundante (cerca de 400 moléculas/célula, o que é mais
do que o necessário para as duas forquilhas de replicação) e não era processiva (dissociava-se
do DNA após incorporar apenas 20 a 50 nucleotídios). Em 1969, John Cairns e Paula DeLucia
resolveram essa questão quando demonstraram que uma cepa de E. coli portadora de uma
mutação no gene da DNA pol I que tinha menos de 1% de atividade da DNA pol I ainda era
capaz de crescer normalmente e replicar seu DNA. Eles concluíram que outra DNA polimerase
catalisa a síntese de DNA na forquilha de replicação. Posteriormente, foi demonstrado que
essa enzima era a DNA polimerase III (DNA pol III).

CONCEITO-CHAVE As DNA polimerases sintetizam DNA na direção 59-para-39 usando DNA de

fita simples como molde.

A replicação do DNA é semidescontínua

Outro problema na replicação do DNA surge porque as DNA polimerases conseguem estender
uma cadeia, mas não são capazes de iniciar uma cadeia. Portanto, a síntese deve ser iniciada
por um primer, uma cadeia curta de nucleotídios que forma um segmento de ácido nucleico
dúplex (Figura 7.15). Os primers são sintetizados por um conjunto de proteínas denominado
primossomo, do qual um componente central é uma RNA polimerase chamada primase (Figura
7.16). A primase copia o molde de DNA na direção 59-para-39, produzindo um RNA curto de
cerca de 11 nucleotídios. A DNA pol III, então, assume e continua a copiar o molde de DNA,
estendendo-se para além da extremidade 39 do primer de RNA.

Figura 7.14 DNA polimerases catalisam a reação de alongamento da cadeia. Uma base dNTP,
neste caso, dCTP, pareia com o molde de DNA de fita simples, o grupo 39-OH livre no final da
cadeia de DNA em crescimento é ativado para atacar o fosfato alfa (a) do dNTP, resultando na
ligação de dNMP na extremidade 39 e liberação dos fosfatos b e g ligados (PPi). Assim, a cadeia
de DNA é alongada na direção 59-para-39 pelas DNA polimerases.

Figura 7.15 A replicação do DNA ocorre na forquilha de replicação, na qual a dupla-hélice é

desenrolada e as duas fitas são separadas. A replicação do DNA avança continuamente na
direção da forquilha de replicação que se desenrola para a fita principal, contínua. Em
contraste, o DNA é sintetizado em segmentos curtos na direção oposta à forquilha de
replicação para a fita descontínua. A DNA polimerase requer um primer, uma cadeia curta de
nucleotídios, para iniciar a síntese. Detalhes adicionais são fornecidos no texto.

Figura 7.16 A replicação do DNA ocorre em ambas as direções. Os mesmos fatores de proteína
são necessários para a síntese tanto da fita principal quanto da descontínua, mas a síntese
ocorre em um único trecho contínuo na fita principal e em trechos curtos na fita descontínua.
O grampo b é necessário para a síntese processiva de DNA. A helicase separa as fitas do DNA
parental e a girase (uma topoisomerase) remove as torções e superespirais do DNA. As
proteínas de ligação ao DNA de fita simples (SSBs) evitam que as fitas separadas do DNA se
enovelem novamente. A primase produz primers de RNA curtos para a síntese contínua pela
DNA pol III da fita principal, bem como a síntese descontínua da fita descontínua como
fragmentos de Okazaki. A DNA pol I remove primers de RNA e preenche as lacunas resultantes.
Por último, a DNA ligase une os fragmentos de DNA.

Como as DNA polimerases só sintetizam DNA na direção 59-para-39, apenas uma das duas fitas
do molde do DNA pode servir como molde para a replicação na mesma direção do movimento
de cada forquilha de replicação (ver Figura 7.15). Para essa fita, chamada de fita principal ou
contínua (leading), a síntese ocorre de maneira contínua e uniforme. A síntese no outro molde
também está na direção 59-para-39, mas como está na direção oposta à do movimento da
forquilha de replicação, ela deve ser feita em segmentos curtos. A reinicialização da síntese
ocorre para cada segmento à medida que a forquilha crescente expõe um novo molde de DNA.
Os trechos de 1000-2000 nucleotídios do DNA recém-sintetizado são chamados de fragmentos
de Okazaki, em homenagem ao seu descobridor, Reiji Okazaki. Tal como acontece com a
síntese da fita principal, cada fragmento de Okazaki é iniciado na extremidade 59 por um
primer de RNA sintetizado pela primase. Assim, para essa fita, chamada de fita descontínua
(lagging), a síntese ocorre de forma descontínua. Como a replicação do DNA é contínua para a
fita principal e descontínua para a fita descontínua, o processo geral é descrito como
semidescontínuo.
CONCEITO-CHAVE A replicação do DNA é descrita como semidescontínua porque uma fita
molde de DNA é sintetizada continuamente e a outra é sintetizada como uma série de
fragmentos descontínuos.

Uma DNA polimerase diferente, a DNA pol I, remove os primers de RNA com sua atividade de
exonuclease 59-para-39 e preenche as lacunas com sua atividade de polimerase 59-para-39
(Figura 7.16). Como mencionado anteriormente, a DNA pol I é a enzima originalmente
purificada por Kornberg. Outra enzima, a DNA ligase, une a extremidade 39 da lacuna de DNA
a ser preenchida à extremidade 59 do fragmento de Okazaki seguinte. Em geral, as ligases de
DNA unem pedaços quebrados de DNA catalisando a formação de uma ligação fosfodiéster
entre um fosfato 59 de um fragmento e um grupo 39 OH de um fragmento adjacente.

CONCEITO-CHAVE A síntese de DNA pela DNA polimerase III requer um primer de RNA,
sintetizado pela enzima primase, uma RNA polimerase.

A replicação do DNA é precisa e rápida

Uma característica da replicação do DNA é sua precisão, também chamada de fidelidade: no

geral, menos de um erro ocorre a cada 1010 nucleotídios. Parte da razão para a precisão da
replicação do DNA é que tanto a DNA pol I quanto a DNA pol III apresentam uma atividade de
exonuclease 39-para-59, que tem uma função de “revisão” por excisão de bases incompatíveis
inseridas incorretamente (Figura 7.17). Uma vez que a base incompatível é removida, a
polimerase tem outra chance de adicionar a base complementar correta.

Figura 7.17 As DNA polimerases I e III usam sua atividade de exonuclease 39-para-59 para
remover o pareamento errôneo A-C.

Como seria de se esperar, as cepas mutantes sem atividade funcional de exonuclease 39-para-
59 têm uma taxa mais alta de mutação. Além disso, como a primase não apresenta uma
função de revisão, o primer de RNA tem mais probabilidade do que o DNA de conter erros. A
necessidade de manter a alta fidelidade de replicação é uma das razões pelas quais os primers
de RNA nas extremidades dos fragmentos de Okazaki devem ser removidos e substituídos por
DNA. Somente depois que o primer de RNA desaparece, a DNA pol I catalisa a síntese de DNA
para substituir o primer. As incompatibilidades que escapam à revisão são corrigidas por
mecanismos de reparo de DNA que serão abordados em detalhes no Capítulo 15.

CONCEITO-CHAVE As DNA polimerases I e III apresentam atividade de revisão, mas a primase

não.

Outra característica da replicação do DNA é a velocidade. A E. coli leva cerca de 40 minutos

para replicar seu cromossomo. Portanto, seu genoma de cerca de 5 milhões de pares de bases
deve ser copiado a uma taxa de cerca de 2.000 nucleotídeos por segundo. A partir do
experimento de Cairns, sabemos que E. coli usa apenas duas forquilhas de replicação para
copiar todo o seu genoma. Assim, cada forquilha deve ser capaz de se mover a uma taxa de
cerca de 1.000 nucleotídios por segundo. O que é notável sobre todo o processo de replicação
do DNA é que ele não sacrifica a velocidade pela precisão. Como é possível manter a
velocidade e a precisão, dada a complexidade das reações na forquilha de replicação? A
resposta é que a DNA polimerase é parte de um grande complexo que coordena as atividades
na forquilha de replicação. Esse complexo, o replissomo, é um exemplo de uma “máquina
molecular”. Você encontrará outros exemplos nos capítulos posteriores. A descoberta de que
a maioria das funções principais das células – replicação, transcrição e tradução, por exemplo –
são realizadas por grandes complexos de multissubunidades mudou a maneira como
compreendemos as células. Para começar a entender o porquê, vamos examinar o replissomo
mais de perto.

Alguns dos componentes de interação do replissomo em E. coli são mostrados na Figura 7.18.
Na forquilha de replicação, o núcleo catalítico da DNA pol III é parte de um complexo muito
maior, denominado holoenzima DNA pol III, que consiste em dois núcleos catalíticos e várias
proteínas acessórias. Um dos núcleos catalíticos atua sobre a síntese da fita principal,
enquanto o outro atua sobre a fita descontínua. A fita descontínua é mostrada formando uma
alça para que o replissomo possa coordenar a síntese de ambas as fitas e se mover na direção
da forquilha de replicação. Algumas das proteínas acessórias (não visíveis na Figura 7.18)
formam uma conexão que liga os dois núcleos catalíticos, coordenando, assim, a síntese das
fitas principal e descontínua.

CONCEITO-CHAVE Uma máquina molecular chamada replissomo realiza a síntese de DNA. Ela
inclui duas unidades de DNA polimerase para atuas sobre a síntese em cada fita e coordena a
atividade das proteínas acessórias necessárias para abrir a dupla-hélice, estabilizar as fitas
simples e processar primers de RNA.

A ligação da DNA pol III ao molde de DNA é mantida por outras proteínas acessórias, o grampo
b (também conhecido como a grampo deslizante), que circunda o DNA como uma rosquinha, e
o carregador de grampo (também chamado de complexo t), que monta grampos b no DNA. O
grampo b transforma a DNA pol III de uma enzima que pode adicionar apenas 10 nucleotídios
antes de sair do molde (chamada de enzima distributiva) em uma enzima que fica na forquilha
em movimento e adiciona dezenas de milhares de nucleotídios (chamada de enzima
processiva). Em suma, por meio da ação de proteínas acessórias, a síntese de ambas as fitas,
principal ou contínua e atrasada ou descontínua, é rápida e altamente coordenada.

Figura 7.18 Um dímero de enzimas de DNA pol III coordena a replicação das cadeias de DNA
principal e descontínua. A alça do molde para a fita descontínua a orienta para a síntese pela
DNA pol III na direção 59-para-39. A DNA pol III libera o molde de fita descontínua depois de
sintetizar 1000-2000 nucleotídios, uma nova alça é formada e a primase sintetiza um primer de
RNA para iniciar outro fragmento de Okazaki.

Observe que a primase, a enzima que sintetiza o primer de RNA, não está tocando a proteína
grampo. Portanto, a primase atua como uma enzima distributiva – adiciona apenas alguns
ribonucleotídios antes de se dissociar do molde. Esse modo de ação faz sentido porque os
primers só precisam ser longos o suficiente para formar um ponto de partida dúplex adequado
para a DNA pol III.

CONCEITO-CHAVE O grampo b converte a DNA polimerase III de uma enzima distributiva em

uma processiva.

7.5Replicação em eucariotos

OA 7.6Explicar por que e como a replicação do DNA difere entre bactérias e eucariotos.

A replicação do DNA em bactérias e eucariotos usa um mecanismo semiconservativo e

emprega a síntese das fitas principal e descontínua. Por esse motivo, não deve ser surpresa
que os componentes dos replissomos bacterianos e eucarióticos sejam muito semelhantes (ver
Tabela 7.2). Contudo, como os genomas eucarióticos são maiores e têm cromossomos
lineares, não circulares, existem complexidades mecanísticas adicionais e fatores associados.
Bactérias como E. coli geralmente completam a replicação em cerca de 40 minutos, mas em
eucariotos, a quantidade de tempo para completar a replicação pode variar de alguns minutos
a muitas horas, a depender de várias características, incluindo o tamanho do genoma, o
número de origens e o tipo de célula. Os eucariotos também precisam resolver o problema de
coordenação da replicação de mais de um cromossomo.

Origens eucarióticas de replicação

Para entender as origens da replicação eucariótica, primeiro vamos voltar nossa atenção para
a levedura eucariótica simples (Saccharomyces cerevisiae). Muitas proteínas eucarióticas com
funções nas origens de replicação foram identificadas pela primeira vez na levedura devido à
facilidade da análise genética (consulte o quadro Organismo modelo de levedura no Capítulo
12). As origens de replicação na levedura são referidas como sequências de replicação
autônoma (ARS) e são muito semelhantes à oriC em E. coli. As ARS têm cerca de 100 a 200
pares de bases de comprimento e contêm vários elementos de sequência de DNA
conservados, incluindo um elemento rico em AT que se abre quando uma proteína iniciadora
se liga a elementos adjacentes. Ao contrário dos cromossomos bacterianos, cada cromossomo
eucariótico tem muitas origens de replicação para replicar rapidamente os genomas
eucarióticos muito maiores. Aproximadamente 400 origens de replicação estão dispersas nos
16 cromossomos da levedura, e os humanos têm de 40.000 a 80.000 origens entre os 23
cromossomos. Portanto, em eucariotos, a replicação avança em ambas as direções a partir de
vários pontos de origem (Figura 7.19). As hélices duplas que são produzidas em cada origem se
alongam e, por fim, unem-se umas às outras. Quando a replicação das duas fitas está
completa, originam-se duas moléculas-filhas idênticas de DNA.
Figura 7.19 A replicação do DNA avança em ambas as direções a partir de uma origem de
replicação. Três origens de replicação são mostradas neste exemplo.

CONCEITO-CHAVE A replicação avança em ambas as direções a partir de centenas ou milhares

de origens em cromossomos eucarióticos lineares.

Replicação de DNA e o ciclo celular da levedura

A síntese de DNA ocorre apenas na fase S (síntese) do ciclo celular eucariótico (Figura 7.20).
Como o início da síntese de DNA é limitado a esta única fase? Na levedura, o método de
controle é vincular a montagem de replissomo ao ciclo celular. A Figura 7.21 mostra o
processo. Na levedura, três proteínas são necessárias para iniciar a montagem do replissomo.
O complexo de reconhecimento de origem (ORC) primeiro liga-se às sequências nas origens da
levedura, assim como a proteína DnaA faz em E. coli. O ORC, atua, então como uma
plataforma de pouso para recrutar Cdc6 para origens no início da fase gap 1 (G1) do ciclo
celular. Juntos, ORC e Cdc6 carregam um complexo de Cdt1 e helicase. Um segundo complexo
helicase-Cdt1 é recrutado por meio da associação com o complexo helicase-Cdt1 já montado.
Uma vez que as helicases estão no DNA na fase S inicial, o Cdc6 e o Cdt1 são liberados e as
polimerases de DNA são carregadas no DNA. A replicação está ligada ao ciclo celular através da
disponibilidade de Cdc6 e Cdt1. Na levedura, essas proteínas são sintetizadas durante a mitose
tardia (M) e a fase G1 e são destruídas por proteólise no início da fase S. Dessa forma, o
replissomo só pode ser montado antes da fase S. Uma vez que a replicação se iniciou, novos
replissomos não podem se formar nas origens, porque Cdc6 e Cdt1 não estão mais disponíveis.

CONCEITO-CHAVE A replicação do DNA em eucariotos requer Cdc6 e Cdt1, proteínas que estão
disponíveis apenas durante a mitose tardia (M) e a fase G1, garantindo que o genoma seja
replicado apenas uma vez por ciclo celular.

Origens de replicação em eucariotos superiores

Como já exposto, a maioria das aproximadamente 400 origens de replicação em leveduras são
compostas de sequências de motifs de DNA semelhantes (100 a 200 pares de bases de
comprimento) que são