NNOORRM ABNT NBR

MAA ISO
BBRRAASSI 4833-1
ILLEEIIRRA
A Primeira edição
05.02.2015

Válida a partir de
05.03.2015

Versão corrigida
22.07.2015

Microbiologia da cadeia produtiva de alimentos

– Método horizontal para a enumeração de
microrganismos
Parte 1: Contagem de colônias a 30 ° C pela
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técnica de pour plate

Microbiology of the food chain — Horizontal method for the enumeration
of microorganisms
Part 1: Colony count at 30 °C by the pour plate technique

ICS 07.100.30 ISBN 978-85-07-05435-1

Número de referência
ABNT NBR ISO 4833-1:2015
9 páginas

© ISO 2013 - © ABNT 2015

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Sumário Página

Prefácio Nacional................................................................................................................................iv
1 Escopo.................................................................................................................................1
2 Referências normativas.....................................................................................................1
3 Termos e definições...........................................................................................................2
4 Princípio...............................................................................................................................2
5 Meios de cultura e diluentes..............................................................................................2
5.1 Geral.....................................................................................................................................2
5.2 Diluentes..............................................................................................................................2
5.3 Meio de cultura: plate count agar (PCA).............................................................................2
5.3.1 Composição........................................................................................................................2
5.3.2 Preparo................................................................................................................................3
5.3.3 Ensaio de desempenho do meio de cultura.....................................................................3
5.4 Meio de sobrecamada (se necessário; ver 9.2.7)............................................................4
5.4.1 Composição........................................................................................................................4
5.4.2 Preparo................................................................................................................................4
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6 Aparelhagem.......................................................................................................................4
7 Amostragem........................................................................................................................5
8 Preparação da amostra de ensaio....................................................................................5
9 Procedimento......................................................................................................................5
9.1 Alíquota de ensaio, suspensão inicial e diluições..........................................................5
9.2 Inoculação e incubação.....................................................................................................5
9.3 Contagem de colônias.......................................................................................................6
10 Expressão dos resultados.................................................................................................6
10.1 Método de cálculo..............................................................................................................6
10.2 Precisão...............................................................................................................................6
10.2.1 Geral.....................................................................................................................................6
10.2.2 Repetibilidade.....................................................................................................................6
10.2.3 Reprodutibilidade...............................................................................................................6
10.3 Interpretação dos resultados dos ensaios.......................................................................7
10.3.1 Geral.....................................................................................................................................7
10.3.2 Condições de repetibilidade..............................................................................................7
10.3.3 Condições de reprodutibilidade........................................................................................7
11 Relatório de ensaio.............................................................................................................7
Anexo A (informativo) Utilização da diferença crítica para a interpretação dos resultados..........8
A.1 Geral.....................................................................................................................................8
A.2 Condições de reprodutibilidade........................................................................................8
A.3 Comparação com um limite (ensaio unilateral)...............................................................8
Bibliografia...........................................................................................................................................9

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Prefácio Nacional

A Associação Brasileira de Normas Técnicas (ABNT) é o Foro Nacional de Normalização. As

Normas Brasileiras, cujo conteúdo é de responsabilidade dos Comitês Brasileiros (ABNT/CB), dos
Organismos de Normalização Setorial (ABNT/ONS) e das Comissões de Estudo Especiais
(ABNT/CEE), são elaboradas por Comissões de Estudo (CE), formadas pelas partes interessadas
no tema objeto da normalização.

Os Documentos Técnicos ABNT são elaborados conforme as regras da Diretiva ABNT, Parte 2.

A ABNT chama a atenção para que, apesar de ter sido solicitada manifestação sobre eventuais
direitos de patentes durante a Consulta Nacional, estes podem ocorrer e devem ser comunicados à
ABNT a qualquer momento (Lei nº 9.279, de 14 de maio de 1996).

Ressalta-se que Normas Brasileiras podem ser objeto de citação em Regulamentos Técnicos.
Nestes casos, os Órgãos responsáveis pelos Regulamentos Técnicos podem determinar outras
datas para exigência dos requisitos desta Norma, independentemente de sua data de entrada em
vigor.

A ABNT NBR ISO 4833-1 foi elaborada pela Comissão de Estudo Especial de Microbiologia de
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Alimentos (ABNT/CEE-157). O Projeto circulou em Consulta Nacional conforme Edital nº 11, de

14.11.2014 a 14.12.2014, com o número de Projeto 157:000.00-009/1.

Esta Norma é uma adoção idêntica, em conteúdo técnico, estrutura e redação, à ISO 4833-1:2013,
que foi elaborada pelo Technical Committee Food Products (ISO/TC 34), Subcommittee
Microbiology (SC 9), conforme ISO/IEC Guide 21-1:2005.

A ABNT NBR ISO 4833, sob o título geral “Microbiologia da cadeia produtiva de alimentos – Método
horizontal para a enumeração de microrganismos”, tem previsão de conter as seguintes partes:

— Parte 1: Contagem de colônias a 30 ° C pela técnica de pour plate;

— Part 2: Colony count at 30 degrees C by the surface plating technique.

Esta versão corrigida da ABNT NBR ISO 4833-1:2015 incorpora a Errata 1, de 22.07.2015.

O Escopo desta Norma Brasileira em inglês é o seguinte:

Scope
This Part of ABNT NBR ISO 4833 specifies a horizontal method for enumeration of microorganisms
that are able to grow and form colonies in a solid medium after aerobic incubation at 30 °C. The
method is applicable to:

a) products intended for human consumption and for animal feed;

b) environmental samples in the area of food and feed production and

handling. This Part of ABNT NBR ISO 4833 is applicable to:

products that require a reliable count when a low limit of detection is specified (below 102/g or
102/mL for liquid samples or below 103/g for solid samples);

products expected to contain spreading colonies that obscure colonies of other organisms, e.g. milk
and milk products likely to contain spreading Bacillus spp.

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 ABNT NBR ISO 4833-1:2015

The applicability of this Part of ABNT NBR ISO 4833 to the examination of certain fermented
food and animal feeds is limited and other media or incubation conditions can be more appropriate.
However, this method can be applied to such products even though it is possible that the
predominant microorganisms in those products are not detected effectively.

For some matrices, the method specified in this Part of ABNT NBR ISO 4833 can give different
results to those obtained using the method specified in ISO 4833-2.
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 NORMA BRASILEIRA ABNT NBR ISO 4833-1:2015

Microbiologia da cadeia produtiva de alimentos – Método horizontal para

a enumeração de microrganismos
Parte 1: Contagem de colônias a 30 ° C pela técnica de pour plate

1 Escopo
Esta Parte da ABNT NBR ISO 4833 descreve um método horizontal para enumeração de
microrganismos capazes de crescer e formar colônias em um meio sólido após incubação aeróbica
a 30 ° C. O método é aplicável a:

a) produtos destinados ao consumo humano e para alimentação animal;

b) amostras ambientais na área de produção e manipulação de alimentos e alimentos para animais.

Esta Parte da ABNT NBR ISO 4833 é aplicável a :

1) produtos que requerem uma contagem confiável quando um limite baixo de detecção é
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especificado (abaixo de 102/g ou 102/mL para amostras líquidas ou abaixo de 10 3/g para
amostras sólidas);

2) produtos que possivelmente contenham colônias invasoras que obscureçam colônias de

outros organismos, por exemplo, leite e produtos lácteos susceptíveis de apresentarem
invasão por Bacillus spp.

A aplicabilidade desta Parte da ABNT NBR ISO 4833 para a análise de determinados alimentos
fermentados e alimentos para animais é limitada, e outros meios ou condições de incubação podem
ser mais apropriados. Este método pode ser aplicado a estes produtos, embora seja possível que os
microrganismos predominantes nestes produtos não sejam detectados de forma eficaz.

É possível que, para algumas matrizes, o método especificado nesta Parte da ABNT NBR ISO 4833
dê resultados diferentes aos obtidos usando o método especificado na ISO 4833-2.

2 Referências normativas
Os documentos relacionados a seguir são indispensáveis à aplicação deste documento. Para
referências datadas, aplicam-se somente as edições citadas. Para referências não datadas, aplicam-
se as edições mais recentes do referido documento (incluindo emendas).

ISO 6887 (all parts), Microbiology of food and animal feeding stuffs – Preparation of test samples,
initial suspension and decimal dilutions for microbiological examination

ISO 7218, Microbiology of food and animal feeding stuffs – General requirements and guidance for
microbiological examinations

ISO 11133, Microbiology of food, animal feed and water – Preparation, production, storage and
performance testing of culture media

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3 Termos e definições
Para os efeitos deste documento, aplicam-se os seguintes termos e definições.

3.1
microrganismo
entidade de tamanho microscópico, englobando bactérias, fungos, protozoários e vírus

[ISO/TS 11139:2006,3 2.26]

NOTA 1 Para efeitos desta Parte da ABNT NBR ISO 4833, os microrganismos são bactérias, leveduras e
fungos capazes de produzir colônias nas condições especificadas nesta Parte da ABNT NBR ISO 4833.

4 Princípio
Uma determinada quantidade da amostra de ensaio líquida, ou uma quantidade específica de uma
suspensão inicial , no caso de outros produtos, é distribuida em uma placa de petri vazia e misturada
a um meio de cultura específico de agar fundido para formar uma placa vertida.
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Outras placas são preparadas sob as mesmas condições, utilizando diluições decimais da amostra
ou da suspensão inicial.

As placas são incubadas sob condições aeróbicas a 30 ° C por 72 h.

O número de microrganismos por grama ou por mililitro da amostra de ensaio é calculado a partir do
número de colônias obtidas nas placas que contenham menos do que 300 colônias.

5 Meios de cultura e diluentes

5.1 Geral

Seguir a ISO 11133 para o preparo, produção e ensaios de desempenho dos meios de cultura.

5.2 Diluentes

Usar o(s) diluente(s) especificado(s) na ISO 6887 para o produto em questão ou a Norma específica
para tratar o produto a ser ensaiado.

5.3 Meio de cultura: plate count agar (PCA)

5.3.1 Composição

Peptona de caseína 5,0 g

Extrato de levedura 2,5 g
Glicose anidra ( C6H12O6) 1,0 g
Agara 9 g a 18 g
Água 1 000 mL
a Dependendo da força de gelificação do agar.

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Quando produtos lácteos forem examinados, adicionar leite em pó desnatado a 1,0 g/L de meio de
cultura. O leite em pó desnatado deve ser isento de substâncias inibidoras.

5.3.2 Preparo

Dissolver os componentes ou o meio completo desidratado na água, por aquecimento, se

necessário. Misturar bem e deixar repousar por alguns minutos.

Ajustar o pH (6.4), se necessário, de modo que, após a esterilização, esteja 7,0 ± 0,2 a 25 ° C.

Repartir o meio em tubos, frascos ou garrafas (6.8) de capacidade adequada. Esterilizar em

autoclave (6.1) a 121 ° C por 15 min.

Se o meio for utilizado imediatamente, arrefecer de 44 ° C a 47 ° C em um banho de água (6.3)

antes da utilização. Se não, armazená-lo no escuro, a uma temperatura de (5 ± 3) °C, por um
período máximo de 3 meses, em condições que não permitam qualquer alteração em sua
composição e propriedades.

Antes de iniciar o ensaio microbiológico, fundir completamente o meio, em seguida, arrefecer,

de 44 °C a 47 °C em um banho de água (6.3) antes da utilização. Ver ISO 11133.
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Utilizar o ágar fundido tão rapidamente quanto possível; não convém que seja mantido por mais de 4 h.

5.3.3 Ensaio de desempenho do meio de cultura

[Link] Geral

Plate Count Agar é um meio não seletivo, usado nesta Parte da ABNT NBR ISO 4833 como pour
plate. A produtividade deve ser ensaiada de acordo com a ISO 11133.

[Link] Produtividade

Incubação ( 30 ± 1) °C por ( 72  3 ) h
Escherichia coli WDCM 00013 ou WDCM 00012a
cepas de controle [World Data Centre for Microorganisms (WDCM)]
Bacillus subtilis subsp. spizizenii WDCM 00003 a
Staphylococcus aureus WDCM 00032 ou 00034
WDCM
Meio de referência Agar triptona de soja
Método de controle

Quantitativo

Critério Índice de produtividade (IP) ≥ 0,7

a Cepas a serem utilizadas, no mínimo, pelo laboratório. Ver Referência [7] para obter informações sobre
os números da cepa da coleção de culturas e detalhes de contato.

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5.4 Meio de sobrecamada (se necessário; ver 9.2.7)

5.4.1 Composição

Agar a 12 g a 18 g
Água 1 000 mL
a Dependendo da resistência do gel do agar.

5.4.2 Preparo

Adicionar o agar à água e aquecer até a ebulição, agitando frequentemente até a completa
dissolução do agar, ou em vapor por cerca de 30 min.

Ajustar o pH (6.4), se necessário, de modo que, após a esterilização, esteja 7,0 ± 0,2 a 25 °C.

Distribuir o meio em tubos, frascos ou garrafas (6.8) de capacidade apropriada.

Esterilizar em autoclave a 121 °C por 15 min.

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Se o meio for utilizado imediatamente, arrefecer de 44 °C a 47 °C em um banho de água (6.3) antes

da utilização. Se não, armazená-lo no escuro, a uma temperatura de (5 ± 3) °C, por um período
máximo de de 3 meses, em condições que não permitam qualquer alteração em sua composição
e propriedades.

Antes de iniciar o exame microbiológico, fundir completamente o meio, em seguida, arrefecer de 44

°C a 47 °C em banho de água (6.3) antes da utilização. Ver ISO 11133.

6 Aparelhagem
Aparelhagem descartável é uma alternativa aceitável para vidro ou plástico reutilizável, se tiverem as
especificações adequadas.

Equipamentos usuais de laboratório de microbiologia (ver ISO 7218) e em particular o seguinte.

6.1 Forno para esterilização a seco ou autoclave para esterilização úmida, utilizados de acordo
com ISO 7218.

6.2 Estufa de incubação, capaz de ser mantida a (30 ± 1) °C.

6.3 Banho-maria, capaz de ser mantido de 44 °C a 47°C.

6.4 pHmetro, com exatidão de ± 0,1 unidade de pH a 25 °C.

6.5 Placas de petri, de vidro ou plástico, de 90 mm a 100 mm de diâmetro.

6.6 Pipetas graduadas de escoamento total, com capacidade nominal de 1 mL, com divisões de
0,1 mL, ISO 835[1] classe A, ou pipeta automática, ISO 8655-2[2], com ponteiras estéreis.

6.7 Contador de colônias (opcional), composto de uma base com iluminação e, opcionalmente,
um contador mecânico ou eletrônico digital.

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6.8 Tubos, frascos ou garrafas, de capacidade apropriada e não maiores que 500 mL.

7 Amostragem
A amostragem não é parte do método especificado nesta Parte da ABNT NBR ISO 4833. Ver a
Norma específica de acordo com o produto em questão. Se não houver Norma Internacional
específica, recomenda-se que as partes envolvidas entrem em acordo sobre este assunto.

É importante que o laboratório receba uma amostra verdadeiramente representativa, que não tenha
sido danificada ou alterada durante o transporte ou o armazenamento.

8 Preparação da amostra de ensaio

Preparar a amostra de ensaio de acordo com a Norma específica apropriada ao produto em questão.

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9.1 Alíquota de ensaio, suspensão inicial e diluições

Seguir as especificações da ISO 6887 ou da Norma específica (apropriada ao produto em questão.

9.2 Inoculação e incubação

9.2.1 Tomar duas placas de Petri estéreis (6.5). Transferir para cada placa, por meio de pipeta
estéril (6.6), 1 mL da amostra de ensaio se líquida, ou 1 mL da suspensão inicial (diluição 10-1) no
caso de outros produtos. Se forem preparadas placas para mais de uma diluição, pode ser reduzido
para apenas uma placa por diluição (ISO 7218).

9.2.2 Tomar outra placa de Petri estéril (6.5). Usar outra pipeta estéril (6.6) para dispensar 1 mL da
diluição 10-1 (produto líquido) ou 1 mL da diluição 10-2 (outros produtos).

9.2.3 Se necessário, repetir o procedimento para diluições posteriores, usando uma nova pipeta
para cada diluição decimal.

9.2.4 Se apropriado e possível, selecionar apenas as diluições críticas (no mínimo duas diluições
decimais consecutivas) para inoculação nas placas de Petri que resultarão em contagens entre
10 colônias e 300 colônias por placa.

9.2.5 Verter de 12 mL a 15 mL do agar plate count (5.3) de 44 °C a 47 °C em cada placa de Petri.

O tempo decorrido entre o final do preparo da suspensão inicial (ou da diluição 10-1, se for produto
líquido) e o momento em que o meio (5.3) é vertido na placa não pode exceder 45 min.

9.2.6 Misturar cuidadosamente o inóculo com o meio por rotação da placa de Petri e aguardar a
solidificação da mistura mantendo a placa sobre uma superfície horizontal e fria.

9.2.7 Após a solidificação completa, e apenas nos casos em que há suspeita de que o produto em
análise contém microrganismos cujas colônias cubram a superfície do meio, verter cerca de 4 mL do
meio de sobrecamada (5.4) ou do agar plate count (5.3) de 44 °C a 47 °C sobre a superfície do meio
inoculado. Aguardar a solidificação conforme especificado em 9.2.6.

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9.2.8 Inverter as placas preparadas e colocá-las na estufa de incubação (6.2) a (30 ± 1) °C,
de acordo com a ISO 7218. Incubar por (72 ± 3) h.

9.3 Contagem de colônias

9.3.1 Após o período de incubação especificado (9.2.8), manter, se possível, as placas com menos
do que 300 colônias. Contar as colônias nas placas, utilizando, se necessário, o equipamento de
contagem de colônia (6.7). Examinar as placas com luz difusa. É importante que as pequenas
colônias sejam incluídas na contagem, no entanto, é essencial que o analista evite confundir
partículas de matéria não dissolvida ou precipitada nas placas com pequenas colônias. Examinar
cuidadosamente as partículas duvidosas, utilizando maior ampliação quando necessário, a fim de
distinguir as colônias de materiais estranhos.

9.3.2 As colônias invasoras devem ser consideradas como colônias individuais. Se menos de um
quarto da placa estiver coberto por colônias invasoras, contar as colônias da parte não afetada da
placa e calcular o número correspondente para toda a placa. Se mais de um quarto for coberto com
colônias invasoras, rejeitar a contagem.

10 Expressão dos resultados

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10.1 Método de cálculo

Seguir o procedimento especificado na ISO 7218.

10.2 Precisão
10.2.1 Geral

A precisão dos dados tem sido avaliada para placas contendo mais de 15 colônias e menos
de 300 colônias. A precisão dos dados depende da microbiota associada e da matriz da amostra.
Os dados apresentados são provenientes de estudos colaborativos (ver Referências [4] - [6]) e são
válidos para o leite cru e pasteurizado. Estes dados podem ser utilizados como estimativas quando
as contagens de colônias em outros produtos são determinadas.

10.2.2 Repetibilidade

A diferença absoluta entre dois resultados de ensaios individuais independentes, obtidos usando
o mesmo método em materiais de ensaio idênticos, no mesmo laboratório, pelo mesmo analista,
utilizando o mesmo equipamento em um curto intervalo de tempo, não será maior do que o limite de
repetibilidade, r = 0,25, em log10N, onde N é o número de microrganismos por mililitro
(correspondentes a 1,8 na escala normal, em microrganismos por mililitro).
NOTA Este limite de repetibilidade vem de estudos colaborativos com leite cru e pasteurizado
(ver Referências [4] - [6]) e pode ser usado para esses produtos.

10.2.3 Reprodutibilidade

A diferença absoluta entre dois resultados individuais, obtidos utilizando o mesmo método em
materiais de ensaio idênticos, em laboratórios diferentes, com analistas diferentes e utilizando
equipamentos diferentes, não será maior do que o limite de reprodutibilidade, R = 0,45, em log10N,
onde N é o número de microrganismos por mililitro (correspondente a 2,8 na escala normal, em
microrganismos por mililitro).
NOTA Este limite da reprodutibilidade vem de estudos colaborativos com leite cru e pasteurizado
(ver Referências [4] - [6]) e pode ser usado para esses produtos.

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10.3 Interpretação dos resultados dos ensaios

10.3.1 Geral

Nos exemplos (10.3.2 e 10.3.3), são consideradas a média da precisão dos dados, em um nível de
probabilidade de 95 %, e a análise de uma amostra. Convém notar que, sob condições práticas,
a média de várias amostras é frequentemente utilizada. Os dados são expressos em números de
microrganismos por mililitro.

10.3.2 Condições de repetibilidade

Primeiro resultado: 105 = 100 000

Não convém que a diferença entre o primeiro e o segundo resultados sejam maiores do que 0,25

log10N. Segundo resultado: Limite inferior: 104,75 = 56 000

Limite superior : 105,25 = 178 000

A diferença entre o primeiro e o segundo resultados é aceitável se o segundo resultado não for
inferior a 56 000, ou não for superior a 178 000.
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10.3.3 Condições de reprodutibilidade

Os resultados obtidos no primeiro laboratório (média da determinação em duplicata): 105 = 100 000

Não convém que a diferença entre o primeiro e o segundo resultados obtida no segundo laboratório
seja maior do que 0,45 unidades log10N:

Os resultados do segundo: Limite inferior: 104,55 = 36 000

Limite superior: 105,45 = 280 000

A diferença dos resultados obtidos entre o primeiro e o segundo laboratórios é aceitável se o

segundo laboratório obtiver um resultado que não seja inferior a 36 000 e não seja superior a 280
000.

O Anexo A mostra o cálculo e a utilização da diferença crítica (DC) para interpretar os resultados.

11 Relatório de ensaio
O relatório de ensaio deve conter no mínimo as seguintes informações:

a) todas as informações necessárias para a identificação completa da amostra;

b) o método de amostragem utilizado, se for conhecido;

c) o método de ensaio utilizado, de acordo com esta Parte da ABNT NBR ISO 4833;

d) todas as condições operacionais não especificadas nesta Parte da ABNT NBR ISO 4833,
ou consideradas opcionais, incluindo detalhes de todos os incidentes que possam ter
influenciado o(s) resultado(s) do ensaio;

e) o(s) resultado(s) do ensaio obtido(s);

f) o resultado final obtido da repetibilidade, caso tenha sido verificada.

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Anexo A
(informativo)

Utilização da diferença crítica para a interpretação dos resultados

A.1 Geral
Nos exemplos (A.2 e A.3), são considerados a média da precisão dos dados, em um nível de
probabilidade de 95 %, e a análise de uma amostra. Convém notar que, sob condições práticas,
é frequentemente utilizada a média de várias amostras. Os dados são expressos em números de
microrganismos por mililitro.

A.2 Condições de reprodutibilidade

Os resultados obtidos no primeiro laboratório (média da determinação em duplicata): 105 = 100 000
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A diferença entre este resultado e um resultado obtido por um segundo laboratório (média de n
determinações, n = 2, neste exemplo) é aceitável se não exceder a diferença crítica dc, em unidades
log10N:
 1 r2 0,252
d  R2  r 2 1  
R2   0,452   0,41
C
  
n 2 2
onde

r é o limite de repetibilidade;

R é o limite de reprodutibilidade.

A diferença dos resultados obtidos entre o primeiro e o segundo laboratórios é aceitável se o

segundo laboratório obtiver um resultado que não seja inferior a 39 000 = 10 4,59, ou não seja
superior a 105,41 = 257 000.

A.3 Comparação com um limite (ensaio unilateral)

Limite: 105 = 100 000

É necessário comparar a diferença entre o limite e o resultado laboratorial (média de n determinações,

n = 2, neste exemplo) com o limite de DC, dCL:
0,84  1 0,84 r 2
d  R2  r 2 1    R2   0,24

CL   
2 n 2 2

Os resultados dos ensaios de até 105,24 = 174 000 não indicam o não atendimento ao limite.
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Bibliografia

[1] ISO 835, Laboratory glassware — Graduated pipettes

[2] ISO 8655 2, Piston-operated volumetric apparatus — Part 2: Piston pipettes

[3] ISO/TS 11139:2006, Sterilization of health care products — Vocabulary

[4] PITON C., GRAPPIN R. A model for statistical evaluation of precision parameters of
microbiological methods: Application to dry rehydratable film methods and IDG reference
methods for enumeration of total aerobic mesophilic flora and coliforms in raw milk. J. Assoc.
Off. Anal. Chem. 1991, 74 pp. 92–103

[5] SCOTTER S., ALDRIDGE M., BACK J., WOOD R. Validation of European Community methods
for microbiological and chemical analysis of raw and heat-treated milk. J. Assoc. Public Anal.
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[6] DAHMS S., WEISS H. Estimation of precision values for microbiological reference methods:
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[7] WORLD DATA CENTRE FOR MICROORGANISMS. Reference strain catalogue pertaining to
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