ORGENTEC Diagnostika GmbH METODOLOGIA

Carl-Zeiss-Straße 49-51 Os poços encontram-se revestidos com antigénio purificado Scl-70

55129 Mainz - Germany A determinação é baseada numa reacção imune indirecta associada à enzima com as seguintes fases: Os
Phone: +49 (0) 61 31 / 92 58-0 anticorpos, presentes nas amostras, reagem com os antigénios que revestem a superfície do poço, formando um
Fax: +49 (0) 61 31 / 92 58-58 complexo antigénio-anticorpo. Após incubação, uma primeira fase de lavagem remove as moléculas que não se
Internet: [Link] ligaram, existentes no soro e no plasma. O conjugado, anticorpo anti-humano conjugado com Horseradish
peroxidase (HRP), liga-se ao anticorpo da amostra, formando-se um complexo antigénio-anticorpo-conjugado.
Após a incubação, uma segunda fase de lavagem remove o conjugado de enzima não ligado. Com a adição de
i 512_3 uma solução de substrato de enzima, ocorre uma reação de hidrolização e desenvolvimento de uma cor azul
durante a incubação. A adição de um ácido pára a reação, formando um produto final de cor amarelo. A
intensidade da cor amarela tem uma correlação com a concentração do complexo antigénio-anticorpo, podendo
ser medida fotometricamente a 450 nm.
ORG 512 Anti-Scl-70
AVISOS E PRECAUÇÕES
• Todos os reagentes desta embalagem de teste devem ser exclusivamente usados por profissionais
FINALIDADE PREVISTA especializados no diagnóstico in vitro.
O Anti-Scl-70 é um teste de ELISA destinado a quantificação de autoanticorpos IgG contra a Scl-70 em soro e • Os componentes contendo soro humano foram testados através de metidos reconhecidos pela FDA, com
plasma humanos. Este produto é destinado exclusivamente para uso profissional no diagnóstico in vitro. resultados negativos para HBsAg, HCV, HIV1 e HIV2. Nenhum teste pode garantir a ausência de HBsAg, HCV,
Os anticorpos contra Scl-70 (DNA topoisomerase 1) são um marcador aceite para a esclerodermia progressiva HIV1 e HIV2. No entanto, é recomendado que todos os reagentes deste kit, contendo soro humano, sejam
sistémica. Estes contribuem para o diagnóstico diferencial da esclerodermia. A avaliação dos resultados do teste manuseados como se pudessem transmitir infeções.
deve ter sempre em consideração todos os resultados dos diagnósticos clínicos e laboratoriais. • Albumina de soro de bovino (BSA), presente nos reagentes, foi testada quanto a BSE e considerada negativa.
• Evitar o contato com o substrato enzimático TMB (3,3´,5,5´- Tetrametilbenzidina).
• Solução de paragem contém ácido. Esta concentração não está classificada como sendo perigosa. Evitar
contato com a pele.
• O controlo, tampão de amostra e tampão de lavagem contêm azida de sódio 0.09% como conservante. Esta
concentração não está classificada como sendo perigosa.
• O conjugado enzimático contém 0.05% ProClin 300 como conservante. Esta concentração não está classificada
como sendo perigosa.
No manuseio dos reagentes, controlos e amostras dos pacientes, considerar que todas as diretivas preventivas e
boas práticas de laboratório sejam cumpridas:
• Medidas de primeiros-socorros: Em caso de contato com a pele lavar imediatamente com água limpa e sabão. O
vestuário e calçados contaminados devem ser lavados a antes da sua reutilização. Caso o líquido do sistema
entrar em contato com a pele, lavar abundantemente com água. Caso ocorra o contato com os olhos, estes
SÍMBOLOS UTILIZADOS
devem ser lavados com água abundante e corrente, durante no mínimo 10 minutos. Caso necessário consultar

V Dispositivo médico para diagnóstico in vitro Microplaca

Calibrador
um médico.
• Medidas de prevenção de segurança: Observar as diretivas de segurança de boas práticas de laboratório. Evitar
M Fabricante
Calibrador
contato com a pele e com os olhos. Não pipetar com a boca. Não comer, beber, fumar ou maquilhar-se nas
zonas de manuseio das amostras ou componentes do produto. Limpar os produtos vertidos com material
h Número de catálogo
Calibrador absorvente e eliminar no lixo apropriado.
• Medidas e equipamentos de proteção pessoal: Usar luvas de nitrilo ou de latex. Usar óculos de proteção. Em
X96 Suficiente para Calibrador caso de utilização apropriada não são conhecidas nenhumas reacções perigosas.
Calibrador • Condições a serem evitadas: Como o substrato TMB é sensível à luz, prevenir exposições prolongada. O frasco
g Código do lote
Calibrador
deve ser armazenado em espaços escuros.

H Prazo de validade
Controlo positivo
• Os resíduos devem ser eliminados de acordo com os regulamentos ambientais nacionais.
Consultar as diretivas do controlo da qualidade no laboratório médico relativamente ao uso de soros de controlo.

2:r
8: Limites de temperatura Controlo negativo

w Manter afastado da luz solar

Tampão de amostra
D Não reutilizar
Conjugado enzimático

N Data de fabrico
TMB solução de substrat
C Marcado CE de acordo com 98/79/CE
Solução de paragem
i Consultar as instruções de utilização
Tampão de lavagem
512_3 Instrução eletrônica de utilização: versão Pronto para usar

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CONTEÚDO DO KIT ou anticorpo.
• Não é recomendável a utilização de soros inativados pelo calor.
ORG 512 X96 Suficiente para 96 determinações
1 Uma microplaca é constituída por 12 tiras de 8 poços. Pronto a usar . ARMAZENAMENTO E ESTABILIDADE
Código de cores no módulo • Armazenamento da embalagem de teste a 2-8 °C em espaço escuro.
1x 1.5 ml Calibrador A 0 U/ml, contendo matriz de soro/tampão (PBS, BSA, detergente, NaN3 • Durante a utilização ou armazenamento, não expor os reagentes ao calor, sol ou fonte de incidência de luz forte.
0.09%). Pronto para usar. • Armazenar microplaca selada no saco fornecido com o secante.
1x 1.5 ml Calibrador B 12.5 U/ml, contendo anticorpos Scl-70 numa matriz de soro/tampão (PBS, • O tempo de validade, da embalagem do teste fechada, é de 18 meses a partir do dia de produção. Os reagentes
BSA, detergente, NaN3 0.09%). Pronto para usar. fechados estão estáveis até à data de validade da embalagem de teste. Ver etiqueta dos lotes individuais.
1x 1.5 ml Calibrador C 25 U/ml, contendo anticorpos Scl-70 numa matriz de soro/tampão (PBS, • O tampão de lavagem e o tampão de amostra, diluídos, estão estáveis até 30 dias quando armazenados a 2-8°C.
BSA, detergente, NaN3 0.09%). Pronto para usar. Recomendamos a utilização da solução preparada no mesmo dia.
1x 1.5 ml Calibrador D 50 U/ml, contendo anticorpos Scl-70 numa matriz de soro/tampão (PBS,
BSA, detergente, NaN3 0.09%). Pronto para usar. NOTAS DE PROCEDIMENTO
1x 1.5 ml Calibrador E 100 U/ml, contendo anticorpos Scl-70 numa matriz de soro/tampão (PBS, • Não utilizar os componentes do kit após expirar o prazo de validade.
BSA, detergente, NaN3 0.09%). Pronto para usar. • Não utilizar componentes de kits de lotes diferentes e produtos.
1x 1.5 ml Calibrador F 200 U/ml, contendo anticorpos Scl-70 numa matriz de soro/tampão (PBS, • Todos os componentes devem estar à temperatura ambiente (20-28°C) antes de usar.
BSA, detergente, NaN3 0.09%). Pronto para usar. • Preparar todos os regentes e amostras. Uma vez iniciado o teste, este deverá ser conduzido sem interrupções.
1x 1.5 ml Controlo positivo, contendo anticorpos Scl-70 numa matriz de soro/tampão (PBS, BSA, • Determinações em duplicado poderão ser efectuadas. Por conseguinte, poderão ocorrer erros de pipetagem.
detergente, NaN3 0.09%). Pronto para usar. A concentração encontra-se especificada • Executar os passos do teste pela ordem indicada no protocolo.
no certificado de análise que acompanha o produto. • Usar sempre amostras diluídas frescas.
• Pipetar todos os reagentes e amostras no fundo dos poços.
1x 1.5 ml Controlo negativo, contendo anticorpos Scl-70 numa matriz de soro/tampão (PBS,
• Para evitar contaminação substituir as pontas das micropipetas entre pipetagens de amostras e de diferentes
BSA, detergente, NaN3 0.09%). Pronto para usar. A concentração encontra-se
controlos.
especificada no certificado de análise que acompanha o produto.
• É importante lavar os micropoços cuidadosamente e remover restos de solução de lavagem.
20 ml Tampão de amostra P, amarelo; contendo PBS, BSA, detergentes; azida de sódio
• Todos os passos da incubação deverão ser corretamente cronometrados.
0.09% como conservante; 5x concentrado.
• Não reutilizar poços das microplacas.
15 ml Conjugado enzimático, vermelho claro; contendo anticorpos de IgG anti-humanos
marcados com HRP; PBS, BSA, detergentes; 0.05% PROCLIN como conservante. PREPARAÇÃO DOS REAGENTES
Pronto a usar.
15 ml Solução de substrato; contendo TMB (3,3’,5,5’-tetrametilbenzidina). Pronto a usar. Antes da utilização, diluir o conteúdo do frasco concentrado (50x) com água destilada ou desionizada para um
15 ml Solução de paragem; contendo ácido. Pronto a usar. volume final de 1000 ml. (Sugestão: pipetar 20 ml de solução concentrada e perfazer com 980 ml de água
20 ml Tampão de lavagem; contendo Tris, detergente, azida de sódio 0.09% como destilada).
conservante; 50x concentrado.
i 1 Certificado de análise Tampão de amostra P: Antes de usar, diluir o conteúdo (20 ml) de cada frasco de tampão de amostra concentrada
(5x) com água destilada até a um volume final de 100 ml.
Preparação da amostra
MATERIAIS NECESSÁRIOS Antes de iniciar o teste, fazer uma diluição das amostras de 1:100 com tampão de amostras: Colocar 990 µl de
• Leitor de microplacas com um filtro óptico de 450 nm; opcional: filtro óptico de 620nm tampão de amostra pré-diluída num tubo de poliestireno e adicionar 10 µl de amostra. Misturar bem.
• Software de redução de dados
• Dispensador Multi-canal ou pipeta de repetição para 100 μl
• Agitador de tubos (tipo Vortex)
• Micropipetas com pontas descartáveis para 10 µl, 100 µl, 1000 µl
• Relógio de Laboratório
• Água destilada ou desionizada
• Cilindro de medição para 1000 ml, 100 ml
• Frasco de plástico (esguicho) para a solução de lavagem
Automação
Este ensaio de ELISA pode ser utilizado em sistemas automáticos abertos de ELISA. Cada ensaio deve ser
validado no respetivo sistema automático. A informação é fornecida mediante solicitação.

COLETA DA AMOSTRA, ARMAZENAMENTO E MANUSEAMENTO

• As amostras de sangue devem ser recolhidas em conformidade com as diretivas e processos aplicáveis para
evitar hemólise.
• Deixar o sangue coagular e obter o soro ou plasma através de centrifugação.
• Evitar o uso de soros hemolíticos ou lipémicos, apesar de não interferir com o ensaio.
• As amostras de soro e de plasma podem ser guardadas até cinco dias, a uma temperatura entre 2 e 8 °C. Caso
necessário, poderá ser armazenada a -20ºC até seis meses.
• Evitar ciclos de congelação e descongelação da amostra, para prevenir a perdas de atividade do autoanticorpo

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 Linearidade
EXECUÇÃO DO TESTE
As amostras de pacientes, com elevada concentração de anticorpos específicos, foram diluídas em série em
Preparar o número de tiras necessárias para os calibradores, soros controlo e amostras pré-diluídas.
tampão de amostra para demonstrar o intervalo dinâmico do ensaio e o limite superior e inferior de linearidade. A
1. Pipetar 100 μl de calibradores, soros controlo e amostras pré-diluídas nos poços. atividade dos anticorpos de cada diluição foi calculada a partir da curva de calibração, utilizando a coordenada 4-
Incubar durante 30 minutos à temperatura ambiente (20-28°C) Parâmetro Fit com lin-log (Curva de regressão linear).
Deitar fora o conteúdo dos poços e lavar 3 vezes com 300 μl de solução de lavagem.
..
2. Pipetar 100 μl do conjugado em cada poço. Amostra Diluição Observado Esperado O/E
Incubar 15 minutos à temperatura ambiente. .. .. U/ml U/ml [%]
Deitar fora o conteúdo dos poços e lavar 3 vezes com 300 μl de solução de lavagem. 1 1:100 146.9 146.9 100
3. Pipetar 100 μl de solução de TMB em cada poço. . 1:200 76.3 73.5 104
Incubar 15 minutos à temperatura ambiente. . 1:400 38.1 36.7 104
4. Adicionar 100 μl de solução de paragem (stop solution) a cada poço. . 1:800 18.8 18.4 102
Incubar (sem agitação) 5 minutos à temperatura ambiente. 2 1:100 122.3 122.3 100
Ler a densidade ótica a 450 nm e calcular os resultados. . 1:200 60.4 61.2 99
A coloração obtida mantém-se estável por 30 minutos. Ler durante este período de tempo. . 1:400 29.6 30.6 97
. 1:800 14.8 15.3 97
Exemplo de um esquema de pipetagem:
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Limite de detecção
A A P1 A sensibilidade functional foi determinada para ser 1 U/ml
B B P2
C C P3 Dados Técnicos
D D Precisão Intra-Ensaio: O coeficiente de variação (CV) foi calculado para cada três amostras a partir dos resultados
E E de 24 determinações num único ensaio. Os resultados da precisão intra-ensaio estão resumidos na tabela abaixo.
F F Precisão Inter-Assay: O coeficiente de variação (CV) foi calculado para cada três amostras a partir dos resultados
G C+ de 6 determinações em 5 ensaios. Os resultados da precisão de cada ensaio estão resumidos na tabela abaixo.
H C-
.
P1, ... Amostras A-F Calibrador C+, C- Controlo Intra-análise Interanálise
Amostra Recurso . Amostra Recurso .
VALIDAÇÃO . U/ml CV % . U/ml CV %
O resultado do teste é considerado válido apenas se a densidade ótica a 450 nm, para calibradores / controlos, 1 45.7 4.0 1 41.1 2.8
estiver de acordo com os valores de referência respetivos, indicados no certificado de análise incluídos no kit. Se 2 90.4 3.2 2 89.9 2.8
algum destes valores não coincidir, os resultados deverão ser considerados inválidos e o teste deverá ser repetido. 3 184.1 3.4 3 157.4
. 2.3
.

CÁLCULO DOS RESULTADOS

Para a análise de resultados quantitativos, criar uma curva de calibração com a densidade ótica do calibrador Interferências
versus concentração do calibrador. A concentração das amostras dos pacientes pode, então ser calculada, a partir Não foi observada qualquer interferência com soros ou plasmas hemolíticos (até 1000 mg/dl) ou lipémicos (até
da curva de calibração, por interpolação. Utilizando um software de redução de dados, aplicar uma coordenada 4- 3g/dl de triglicéridos) ou com bilirrubina (até 40 mg/dl) contendo soro ou plasma. Também não foram observados
Parameter Fit com lin-log para a densidade ótica e concentração (Curva de regressão linear). quaisquer efeitos interferentes com a utilização de anticoagulantes (EDTA, heparina, citrato de sódio). Contudo,
por razões práticas, é recomendado evitar amostras demasiado hemolizadas ou lipémicas.
VALORES DE REFERÊNCIA
Resultados de estudo
CALIBRAÇÃO .
O sistema de ensaio é calibradoda a referência internacional para soro de CDC, Atlanta EUA. Study population n n Pos %
Scleroderma 25 19 76.0
Amplitude de medição
Rheumatoid arthritis 20 0 0.0
O cálculo dos limites do ensaio de ELISA é 0 - 200 U/ml
Normal human sera 80 1 1.3
Valores normais .
No âmbito de um estudo de intervalo de referência com amostras de dadores de sangue saudáveis foram Diagnóstico clínico
determinados os seguintes valores para este ensaio de ELISA: Cut-off 25 U/ml POS NEG
ORG 512 POS 19 1
Interpretação dos resultados NEG 6 99
negativo < 15 U/ml 25 100 125
indeterminado 15 - 25 U/ml Sensibilidade 76.0 %
positivo > 25 U/ml Especificidade 99.0 %
Eficiência diagnóstica 94.4 %

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 . Rheumatology guidelines for screening, treatment, and management of lupus nephritis. Arthritis Care Res
(Hoboken ) 2012; 64(6):797-808.
LIMITES DO PROCESSO
Este teste é um auxiliar de diagnóstico. Um diagnóstico clínico definitivo não deve ser baseada nos resultados de Um aviso aos utilizadores (União Europeia):
um teste único, mas deve ser feita pelo médico depois de tudo dados clínicos e laboratoriais foram avaliadas em Qualquer incidente grave ocorrido em relação com o dispositivo deve ser comunicado ao fabricante e à autoridade
relação à imagem inteira clínica do paciente. Também todas as decisões para a terapia deve ser tomada competente do Estado-Membro em que os utilizadores e/ou doentes estão estabelecidos.
individualmente.
Os intervalos de referência acima patológicas e normais de anticorpos nas amostras dos pacientes deve ser Change Control
considerada como apenas recomendações. Cada laboratório deve estabelecer suas próprias faixas de acordo com Former version: ORG 512_IFU_PT_QM114827_2012-08-01_1 Reason for revision: Introduction electronic IFU on homepage
a ISO 15189 ou outras diretrizes de laboratório aplicáveis.

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