ESTRUTURA DE UMA PROTEÍNA A NÍVEL MOLECULAR

Esta pode ser obtida por difractometria de raios-X (gerador de raios-X ou sincrotrão), esta é
uma técnica que requer cristais e em que a estrutura é refinada até obtermos uma resolução
aceitável. De notar que esta técnica deve ser complementada com estudos de dinâmica
molecular, pois a estrutura do estado sólido não coincide necessariamente com a estrutura em
solução.

ASPETOS GERAIS

Relação de de Broglie

Mostra que o comprimento de onda é inversamente

proporcional ao momento linear da partícula e que a
frequência é diretamente proporcional à energia
cinética da partícula.

O comprimento de onda de matéria é também

chamado comprimento de onda de De Broglie.
 Espetroscopia

A espetroscopia é o estudo da transferência de energia entre a radiação eletromagnética e a

matéria. À escala atómica e molecular a energia de um sistema está quantificada  energia de
estado estacionários.

A transferência de energia corresponde ao fotão ceder a sua energia (hv) à molécula que passa
de um estado E1 para um estado de energia superior E2.

Aproximação de Born-Oppeinheimer  curvas de energia em função da distância

interatómica!

Esta aproximação, em termos matemáticos, corresponde em fatorizar a função de onda numa

função de onda eletrónica e numa função de onda nuclear. A função de onda eletrónica
depende apenas das coordenadas dos eletrões. Portanto, na ausência de um campo
magnético, a energia da molécula pode ser assumida com a contribuição de três termos
independentes:

População dos níveis de energia

Quando a diferença de energia entre os níveis fundamental e

excitados é grande (~100 kJmol-1) apenas o estado fundamental está
populado.

Condição para interação com o campo eletromagnético (vetor campo

elétrico): existência de um dipolo oscilante à frequência de absorção.

Redistribuição de carga:
Deslocamento linear  momento elétrico.
Rotação de carga  momento magnético.

A intensidade de uma transição depende do número de partículas

presentes e da população relativa dos estados. O tempo em que
ocorre uma transição é dado por 1/v.
 Exemplos:

1. Mover um eletrão de um estado

fundamental para um estado excitado
(Eletrónico), levando a observações
na região espectroscópica
ultravioleta-visível;

2. Reorientação de um eletrão num

campo magnético (spin eletrónico)
como visto na espectroscopia de
ressonância paramagnética eletrónica
(EPR);

3. Reorientar um momento nuclear num campo magnético (spin nuclear) como observado em
espectrometria de ressonância magnética nuclear (RMN);

4. Detecção de energia absorvida ou emitida em ligações deformantes entre átomos em

moléculas (Evibração), como observado na espectroscopia Raman infravermelho ou de
ressonância.

ESPETROSCOPIA ELETRÓNICA UV-VIS

A espectroscopia ultravioleta-visível (espectroscopia UV-visível) é a observação da absorção da

radiação eletromagnética nas regiões UV e visível do espectro.
 As orbitais moleculares podem ser ligantes (π ou ∂), não ligantes (n) ou anti-ligantes (π* ou
∂*).

Se uma molécula absorve uma quantidade inapropriada de energia, um eletrão numa orbital
ocupada é excitado para uma orbital não ocupada ou parcialmente ocupada. A separação
HOMO-LUMO é tal que os espetros de absorção são geralmente observados na zona do
ultravioleta ou do visível do espetro eletromagnético. As energias das orbitais são
quantificáveis, logo uma dada transição está associada a uma dada energia, ∆E. A absorção
eletrónica molecular consiste geralmente em bandas largas, pois ao contrário dos átomos, as
moléculas têm momentos vibracionais e rotacionais que são muito mais lentos que a absorção
de um fotão. Assim, uma transição eletrónica é um “snap shot” da molécula num estado
vibracional e rotacional particular.

Transições eletrónicas que dão origem a espetros de absorção:

As energias da maioria das transições ∂* ← ∂ são muito elevadas para

serem observadas usando um espetrofotómetro UV-vis normal. As
absorções mais intensas na região dos 200-800nm tipicamente são
devidas a transições π* ← π, ∂* ← n, π* ← n ou transferências de
carga. Exemplos da última, são as transições LMCT ou MLCT em que
carga eletrónica é transferida entre as orbitais do ligando e do metal.

Quando se faz a comparação de espetros, é relevante perceber se as bandas mudaram para

uma maior ou menor energia. Um desvio batocrómico, é uma desvio da absorção em direção
à zona do vermelho do espetro (maiores λ, menor E) e um desvio hipsocrómico é um desvio
de uma banda em direção a λ menores (zona azul do espetro.

Desvio batocrómico Desvio hipsocrómico

Zona vermelho (n-π* e π-π*) Zona azul (n – π*)
O aumento da polaridade do solvente faz O aumento da polaridade do solvente leva a
aumentar as forças de polarização atrativas uma melhor solvatação de pares de eletrões
entre solvente e cromóforo (conjunto de (nível n tem menor energia).
átomos de uma molécula responsável pela
sua cor), o que diminui a energia dos estados
não excitados e estados excitados, quando a
diminuição destes últimos é maior.
~5nm ~30nm (energia das lig H-H)
Em proteínas:

Em metais:

São necessários cromóforos: as transições d-d são muito pouco intensas. (Vamos ter LMCT –
MLCT p.e. nos centros de Fe-S (Fe/S) e π*  π nas porfirinas e outros anéis pirrólicos, estas
são muito intensas).

Transferência de carga (transferência de eletrões, processo redox interno)

LMCT (ligando p/ metal) MLCT (metal p/ligando)
Energias menores: M com energia de Ligandos têm orbitais aceitadoras π,
ionização elevada, ou seja, com orbitais d tipicamente orbitais vazias π* (CO, CN-, SCN-,
vazias de baixa energia (Mn (VII), Pt (IV)) bipy, S2CNR2-)
L com reduzida afinidade eletrónica, ou seja,
com orbitais preenchidas de energia elevada
(Se2-, I-)
Ocorre uma redução temporária do metal Ocorre uma oxidação temporária do metal

A cor roxa das soluções aq. de MnO4-

advém de uma intensa absorção LMCT na
zona do visível. As bandas LMCT movem-
se para comprimentos de onda menores
quando o centro metálico se torna mais
difícil de reduzir e para comprimentos de
onda maiores quando o ligando se torna
mais difícil de oxidar.
Diagrama de Jablonski - Fluorescência

Quando uma molécula é excitada

(estado S2), vai libertar energia
(setas para baixo) regressando ao
estado fundamental (S0). Pode
fazê-lo por um processo não
radiativo, quer dissipando a
energia (cinética) para outros
níveis vibracionais do mesmo
estado eletrónico excitado
(relaxação vibracional) ou para
estados vibracionais de outros
estados eletrónicos excitados (S1)
(conversão interna), ou ainda em fases condensadas para moléculas vizinhas.

O processo radiativo de passagem de S1 para S0 com emissão de um fotão designa-se

fluorescência.

ESPETROSCOPIA VIBRACIONAL (INFRAVERMELHO E RAMAN )

Usada frequentemente para caracterizar compostos em termos de força, rigidez e número de

ligações presentes. Baseia-se na dispersão inelástica, ou dispersão Raman, da luz
monocromática, geralmente proveniente de um laser na faixa visível, próxima do infravermelho.
A luz laser interage com vibrações moleculares, fonões ou outras excitações no sistema,
resultando num desvio para cima ou para baixo na energia dos fotões do laser. A mudança na
energia fornece informações sobre os modos vibracionais no sistema. A espectroscopia no
infravermelho produz informação similar, mas complementar.

A radiação eletromagnética do ponto iluminado é recolhida com uma lente e enviada através
de um monocromador. A radiação elástica espalhada no comprimento de onda
correspondente à linha de laser (dispersão de Rayleigh) é filtrada por um filtro de entalhe,
filtro de passagem de borda ou um filtro passa banda, enquanto o resto da luz recolhida é
dispersa num detector.
Considerando uma molécula diatómica, XY, a
frequência vibracional da ligação depende da
massa dos átomos X e Y e na constante da força da
ligação, k. Se voltarmos a esticar uma mola, então
a constante de força é uma medida da rigidez da
mola. Se os átomos X e Y são de massa similar, eles
contribuem quase igualmente para a vibração
molecular. Se as massas forem diferentes, o átomo
mais leve move-se mais que o mais pesado: massa
reduzida é necessária µ. Para uma molécula diatómica, a transição do estado vibracional
fundamental para o primeiro estado vibracional excitado dá origem a absorção fundamental
no espetro vibracional. A frequência desta absorção é dada pela equação acima.
Espetro de infravermelho: obtido expondo a
amostra a uma radiação IF e registando a
variação da absorção com a frequência, comp de
onda ou nº de onda. Os resultados podem ser
expressos na forma de um espetro de absorção
ou de transmissão: 100% de transmissão
corresponde a 0% de absorção.

A espectroscopia Raman convencional envolve o fotão a causar uma transição para um estado
excitado "virtual" que então colapsa de volta a um estado real inferior, emitindo o fotão
detectado no processo. A técnica não é muito sensível, mas um grande aprimoramento é
alcançado se a espécie sob investigação for colorida e o laser de excitação estiver sintonizado
numa transição eletrónica real. A última técnica é conhecida como espectroscopia de
ressonância Raman e é particularmente valiosa para estudar o ambiente de átomos de d-
metal em enzimas porque apenas vibrações próximas ao cromóforo eletrónico são excitadas e
os muitos milhares de ligações no resto da molécula estão em “silêncio”.

A energia pode ser transferida para a amostra levando a linhas Stokes, linhas no espetro com
energias menores que a energia de excitação, ou então pode ser transferida da amostra para o
fotão, originando as linhas anti-Stokes, que aparecem a energias maiores que a energia de
excitação.

Raman e IF são complementares muitas vezes visto que ambas as técnicas examinam estados
vibracionais com diferentes atividades: um corresponde a uma mudança no momento dipolar
(IF) e outro corresponde a uma mudança na polarizibilade – mudança na distribuição
eletrónica numa molécula causada pela aplicação de um campo elétrico (Raman).
RESSONÂNCIA MAGNÉTICA NUCLEAR (NMR)

Técnica baseada nas propriedades do núcleo do átomo. A interação dos eletrões com o núcleo
produz importantes informações químicas e estruturais que podem ser recolhidas usando
técnicas de RMN. A espectroscopia de ressonância magnética nuclear pode fornecer
informações sobre estrutura, dinâmica, cinética, processos de ligação, estrutura eletrônica e
propriedades magnéticas de moléculas bioinorgânicas em solução. Também fornece
informações sobre sobre a velocidade e natureza da troca de ligandos.

Podemos definir spin usando a seguinte equação:

Os núcleos de isótopos naturais podem possuir
momentos angulares ou spin e consequentemente Spin = (h/2π) [I(I+1)]1/2 em que I = momento
momentos magnéticos µ. A aplicação de um campo nuclear angular 0, ½, 1….
I pode ser quantificado em termos de magnitude
magnético externo divide os estados de spins em
em que m=I, levando a 2I + 1 estados de spin com
diferentes estados de energia  base do NMR.
números angular I igualmente separados.

Ou seja, quando um núcleo com I > 0 está num campo magnético, as

suas orientações 2I+1 têm diferentes energias. O diagrama mostra
os níveis de energia para um núcleo com I = ½ (como 1H, 13C, 31P).

A sensibilidade da
RMN depende de
vários fatores,
incluindo a
abundância do isótopo
e o tamanho de seu
momento magnético
nuclear. Por exemplo,
1H, com 99,98% de
abundância natural e
um grande momento
magnético, é mais fácil
de observar do que 13C, que tem um momento magnético menor e apenas 1,1% de abundância
natural.
Uma limitação comum para os núcleos exóticos é a presença de um momento de quadrupolo
nuclear, uma distribuição não uniforme de carga elétrica (que está presente em todos os núcleos
com número quântico de spin nuclear I> 12), que amplia os sinais e degrada os espectros.
Núcleos com números atómicos (e até números de massa) pares (como 12C e 16O) têm rotação
zero e são invisíveis em RMN.
Cada sinal num espectro de RMN é denotado por um valor de deslocamento químico, δ', um
valor que é dado em relação ao sinal observado para um composto de referência especificado.
O parâmetro δ é independente da intensidade do campo magnético aplicado. A diferença de
frequência ("∆v"), em Hz, entre o sinal de interesse e alguma frequência de referência definida
(v0) é dividida pela frequência absoluta do sinal de referência. Mais uns cálculos são efetuados
de modo a poder passar Hz para ppm e medir assim os desvios. A referência standard (δ=0)
tanto para o 1H como para o 13C é o TMS (SiMe4). Desvios para valores mais positivos de δ
significam desvios para maiores frequências.

Existe uma mudança no

desvio químico no núcleo de
31P na conversão de
tripenilfosfato no óxido
correspondente. Este desvio
para maiores frequências é
típico quando um fosfano
terciário é oxidado. Também é
comum quando um ligando
fosfano coordena a um centro
metálico d.

RESSONÂNCIA P ARAMAGNÉTICA ELETRÓNICA (EPR)

É uma forma de espetroscopia de ressonância que é sensível a eletrões

livres ou desemparelhados. Numa experiência de EPR, expomos a amostra
a radiação micro-ondas de frequência fixa enquanto se aplica um campo
magnético, e transições são promovidas. O momento de spin do eletrão
desemparelhado (ms = +- ½ para um eletrão livre) interage com um campo
magnético aplicado produzindo o efeito de Zeeman.

Efeito de Zeeman

A aplicação de um campo magnético leva a que os eletrões se

alinhem quer contra quer a favor do campo aplicado (paralelo
ou antiparalelo). A orientação paralela encontra-se num estado
de menor energia que a antiparalela, sendo a diferença de
energia entre os dois estados, ΔE, dada por ΔE = geμBB0, em que
ge é a razão giromagnética do electrão (a razão entre o seu
momento magnético dipolar e o seu momento magnético
angular). Para passar do nível mais baixo de energia para o mais
elevado, o electrão tem de absorver radiação electromagnética
de energia ΔE: ΔE = hν = geμBB0, sendo esta a equação
fundamental na espectroscopia de RPE.
Resumindo: Na ausência de um campo magnético, os estados – ½ e + ½ são degenerados, mas
B0 remove essa degenerescência quando interage com o eletrão desemparelhado, levando a
uma divisão dos estados de energia. A energia a energia absorvida é monitorizada e convertida
num espectro de RPE. Um electrão livre, ou seja, teoricamente não influenciado por qualquer
factor externo, tem um valor ge igual a 2,0023. Isto significa que, ao usar uma radiação de
frequência 9,5 GHz (a frequência normalmente usada na chamada banda X de RPE), ocorre
ressonância à volta de 3400 G (0,34 tesla).

A força de campo magnético ao qual ΔE leva a ressonância com a transição falada

anteriormente, vai levar ao aparecimento de um pico ao longo do eixo das abcissas (B0).

O espetro EPR corresponde à

primeira derivada de um pico de
absorção (Obtém-se uma deteção
mais sensível desta forma).

Para derivada (curva) =0, temos o pico de absorção

máxima. É a força de campo magnético deste ponto
que é monitorizada. Assim, o fator g da amostra é
calculado substituindo o valor de B0 na equação de ΔE.
O fator g determina o campo magnético (para uma
dada frequência) ao qual ocorre a transição.

A possibilidade de detetar sinais EPR permanece no

facto de existir uma diferença entre o número de
eletrões nos níveis de energia mais altos e mais
baixos, sendo que a maior parte está nos níveis mais
baixos.

Para o caso mais simples de um eletrão desemparelhado (S= ½), o momento magnético
associado não é simplesmente um número, mas sim direccionalmente orientado, ou seja,
anisotrópico. Tendo em conta as interações spin-orbital para espetros EPR temos 4 casos
limitantes:

1. gx=gy=gz. O momento magnético é independente da orientação. Este caso é chamado

isotrópico e uma única absorção EPR simétrica é obtida.
2. gx=gy<gz. Os dois valores de g comuns (x, y) são chamados de g perpendiculares
enquanto que o gz é chamado de g paralelo. Diz-se que o espetro é axial. (Ex. Se o Cu
(II) d9 em complexos octaédricos exibirem elongação da orbital d ao longo do eixo z por
causa do efeito de John Teller).
3. gx=gy > gz. O espetro é axial.
4. gx≠gy≠gz. O espetro é rômbico. 3 valores diferentes de EPR são gravados.
Interações Hiperfinas e Superhiperfinas

Interações hiperfinas nos espetros EPR surgem quando o paramagneto se encontra na

vizinhança de um núcleo que tem spin nuclear e consequentemente um momento magnético
nuclear.

• Interações Hiperfinas: o eletrão desemparelhado que interage com o núcleo que tem
spin nuclear pertence ao mesmo átomo.
• Interações Superhiperfinas: o eletrão desemparelhado que interage com o núcleo que
tem spin nuclear pertence a outro átomo da molécula.

Há uma introdução de novos estados de energia e consequentemente de mais linhas no

espetro.

Exemplos:

São encontradas 4 linhas hiperfinas no espetro EPR

da Cu, Zn- superóxido dismutase devido ao spin
nuclear do núcleo de cobre de I = 3/2. (2 x 3/2 + 1 =
4)

A interação superhiperfina é observada para complexos metálicos em casos em que os

ligandos têm momento nuclear. Os complexos de Fe (II) com ligandos NO (nos hemes) contêm
2 ligandos N equivalentes axiais. O 14N (I=1) acopla fortemente com o eletrão
desemparelhado, levando a um tripleto largamente separado com cada componente de igual
intensidade e separados por 1,2 mT.
ESPETROSCOPIA MOSSBAUER

O efeito Mossbauer como método espetroscópico sonda transições dentro do núcleo dos
átomos e, portanto, requer um núcleo com estados excitados de “baixa” energia. Para
aplicações em química bioinorgânica, o núcleo de 57Fe tem a maior relevância e por isso é o
maior foco. Esta espetroscopia requere 1. Emissão de raios Ƴ do elemento fonte num estado
nuclear excitado e 2. Absorção destes pelo mesmo elemento na amostra em estudo. O
fenómeno de Mossbauer requer que a emissão e absorção da radiação Ƴ tenha lugar de uma
forma livre de recuo; isto é conseguido colocando o núcleo numa matriz sólida ou congelada.

Fornece indicações sobre:

▪ Estado de oxidação do metal;

▪ Vizinhança eletrónica;
▪ Propriedades magnéticas;
▪ Desvio isomérico δ;
▪ Desdobramento quadropolar ΔEQ;
▪ Propriedades magnéticas.

Pode-se esperar que o espectro de Mössbauer de uma amostra contendo ferro num único
ambiente químico consista numa única linha devido à absorção de radiação com a energia
necessária (ΔE) para excitar o núcleo do seu estado fundamental para o estado excitado. A
diferença entre ΔE da amostra e aquela do metal 57Fe é chamada de desvio isomérico e é
expressa em termos da velocidade necessária para alcançar a ressonância pelo desvio Doppler.
O valor de ΔE depende da magnitude da densidade de eletrões no núcleo e, embora esse
efeito seja principalmente devido a eletrões s (porque as suas funções de onda são diferentes
de zero no núcleo), os efeitos de proteção fazem com que ΔE seja sensível ao número de
eletrões p e d também. Como resultado, diferentes estados de oxidação, como Fe (II), Fe (III) e
Fe (IV), podem ser distinguidos, bem como a ligação iónica e covalente.
 57Co – fonte! Decai para o estado excitado

de 57Fe que emite radiação Ƴ ao decair

para o estado fundamental  medição
de E

Três tipos de interações do núcleo de interesse com a vizinhança causam mudanças detetáveis
na energia necessária para absorção:

1. A linha de ressonância muda devido a mudanças no ambiente do eletrão  desvio

isomérico.
2. Interações quadropolares
3. Interações magnéticas (importantes no estudo de centros Fe-S)

Como um núcleo 57Fe* tem I= 3/2, possui um momento de

quadrupolo elétrico (uma distribuição não esférica de carga
elétrica) que interage com os gradientes do campo elétrico.
Como resultado, e desde que o ambiente eletrónico do
núcleo não seja isotrópico, o espectro de Mössbauer divide-
se em duas linhas de separação ΔEQ. A divisão é um bom guia
quanto ao estado do Fe em proteínas e minerais, uma vez
que depende do estado de oxidação e da distribuição da
densidade de eletrões-d. Campos magnéticos produzidos por
um imã grande ou internamente em alguns materiais
ferromagnéticos também causam mudanças nas energias
dos vários estados de orientação de spin de um núcleo 57Fe
*. Como resultado, o espectro Mössbauer divide-se em seis
linhas.

O desvio isomérico é uma medida da

densidade eletrónica s no núcleo de Fe.
Influências neste parâmetro incluem
mudanças na população s (somente
eletrões em orbitais s demonstram
probabilidade não nula porque a sua
forma esférica 3D incorpora o volume
captado pelo núcleo) na camada de
valência ou efeitos de blindagem causados por um aumento ou diminuição da densidade
eletrónica p ou d. Pode ser usado para determinar o estado de oxidação do Fe na amostra, do
spin, da esfera de coordenação, etc.

A divisão quadropolar reflete a interação entre os níveis de energia nuclear e o gradiente de

campo elétrico circundante (EFG). Os núcleos em estados com distribuições de carga não
esféricas, isto é, todos aqueles com número quântico angular (I) maior que 1/2, têm um
momento de quadrupolo nuclear. Neste caso, um campo elétrico assimétrico (produzido por
uma distribuição de carga eletrónica assimétrica ou arranjo de ligante) divide os níveis de
energia nuclear. No caso de um isótopo com um estado excitado I = 3/2, tal como 57Fe, o
estado excitado é dividido em dois subestados mI = ± 1/2 e mI = ± 3/2. O panorama para
transições de estado excitado aparece como dois picos específicos num espectro, às vezes
referido como um "dupleto". A divisão quadropolar é medida como a separação entre esses
dois picos e reflete o caráter do campo elétrico no núcleo.

A divisão hiperfina magnética é um resultado da interação entre o núcleo e qualquer campo

magnético circundante (Efeito Zeeman).

Espetro da desoximioglobina. Espetros de centros Fe-S.