TRABALHO GRUPO BIOLOGIA - PCR
Reação em cadeia da polimerase
Contexto histórico:
1983: Kary Mullis cria a técnica.
1986: descobre-se a bactéria Thermus Aquaticus, que permite a criação da Taq
polimerase (enzima necessária à técnica - dizer que explicamos depois).
1987: A empresa Perkin patenteia a Técnica, e permite o desenvolvimento do
termociclador( aparelho necessário ao controlo da temperatura- dizer que
explicamos depois também).
1993: Kary Mullis recebe o prémio Nobel de Química pelos seus trabalhos.
O que é o PCR:
O PCR é uma técnica de engenharia genética utilizada para clonar ou
amplificar regiões específicas de DNA de forma sucessiva (milhões/bilhões de
cópias), é uma técnica realizada in vitro (em ambiente controlado, fora do indivíduo).
Recorre-se normalmente a esta técnica quando as amostras de DNA disponíveis
são muito reduzidas e é necessária a sua amplificação para estudo, (para que o
investigador tenha também mais meio de contacto com a amostra), posteriormente
o DNA é estudado e possui inúmeras aplicações que especificaremos mais à frente.
Processo de realização:
Explicar o processo de realização da técnica de PCR:
para realizá-la é necessário utilizar a molécula de DNA molde que será
amplificado, é necessária a utilização de taq polimerase (explicar aqui a taq
polimerase) , A taq polimerase é uma enzima isolada da bactéria Thermus aquaticus
descoberta no parque de Yellowstone, é usada no processo pois catalisa as
replicações de DNA agindo como uma DNA polimerase. É uma enzima muito
resistente ao calor, sobrevive a altas temperaturas, sendo por isso a utilizada -
(aumento de temperatura necessário para separar as cadeias de DNA no início do
processo não interfere na sua sobrevivência). É ainda necessária a utilização de
nucleótidos (dATP,dCTP,dGTP,dTTP); de primers constituídos por cadeias simples
com cerca de 20 nucleótidos (sintetizados quimicamente e necessário para a
síntese de DNA pois sinalizam a ação da DNA polimerase) e de uma solução
tampão com iões de Mg2+ (solução necessário para que a taq polimerase funcione).
A técnica compreende 3 fases a Desnaturação, o emparelhamento e a
extensão;
1º (Desnaturação) - Na primeira etapa, a amostra é aquecida a uma
temperatura muito alta, de cerca de 95ºC de modo a que se quebram ligações e
haja separação das duas cadeias de DNA
2º (Emparelhamento) - Na segunda fase a temperatura é reduzida para
aproximadamente 65ºC de modo a permitir que os primers se liguem a sequências
específicas do DNA para as quais foram projetados.
3º (extensão) - Na terceira fase a amostra é novamente sujeita a aumento de
temperatura para cerca de 72ºC , entra em ação a Taq polimerase que vai
adicionando os nucleotidos ou dNTSs a partir das extremidades dos primers ligados
à cadeia molde e é assim concluída a primeira replicação do DNA.
As fases são repetidas sucessivamente até se obter a quantidade de DNA
desejada, podem ser necessários vários ciclos.
Todo o processo exige o uso de termocicladores que são equipamentos
sofisticados de laboratório capazes de realizar mudanças precisas de temperatura
necessárias a todas as etapas mencionadas anteriormente.
Vantagens:
● é uma técnica relativamente rápida de realizar - o resultado é apresentado
em algumas horas;
● O processo de realização é relativamente simples ( fácil de realizar);
● Sensível ( O PCR é capaz de detetar pequeníssimas amostras de material
genético por isso é possível o uso da técnica em amostras muito
pequenas);
● Permite amplificar exponencialmente o DNA para criando um número
quase infinito de cópias do DNA alvo;
● Pode ser usada para amplificar DNA de organismos já mortos:pois como
a amplificação ocorre em vitro é apenas necessária a amostra de DNA.
Desvantagens / limitações:
● Facilidade na contaminação da amostra com interferência nos resultados:
Por ser uma técnica muito minuciosa e de alta sensibilidade, existe a probabilidade
de contaminação das amostras se não forem tomados os devidos cuidados, se o
ambiente de trabalho não for o ideal alguns fragmentos de outras amostras
estudadas no mesmo local podem existir em forma de aerossol ou de outras formas
(partículas no ar) e contaminar a amostra levando a resultados não fidedignos.
● Necessidade de equipamentos específicos e dispendiosos:
Como qualquer outra técnica laboratorial esta também exige o uso de equipamentos
que acabam por ser dispendiosos como os termocicladores;
● Os primers usados exigem dados de sequência- como os primers são
sintetizados especificamente para uso num gene então se não existem o
PCR não pode ser usado pois não existem dados suficientes;
● Primers podem ligar-se a partes semelhantes do DNA amplificado a
sequência de genes errada.
Finalidade da técnica;
O PCR é uma técnica muito utilizada e possui uma série de finalidades em
diferentes áreas:
● é usada em estudos forenses para comparação de DNA relativo ao crime
com DNA dos suspeitos desse crime, a amplificação de DNA nestes casos é
necessária para a investigação;
● O PCR pode ser usado para realizar testes de paternidade, com o DNA de
dois indivíduos é possível averiguar graus de parentesco.
● É possível a detecção de doenças hereditárias através do estudo de DNA
previamente amplificado na técnica, pois podem desta forma detetar-se
mutações em alelos, identificando-se as doenças.
● Reconhecimento de oncogenes alterados
● Estudar a evolução das espécies - é possível extrair DNA de organismos
extintos como mamutes através de fósseis, por exemplo , a posterior
amplificação auxilia no estudo do DNA e permite a obtenção de dados
importantíssimos para o conhecimento das espécies.
● identificar a presença de fungos, bactérias ou vírus - é possível através do
PCR detetar a presença de bactérias no controlo alimentar ou da água, ou
ainda detetar a presença de agentes patogênicos como vírus
Curiosidades:
Vídeos:
[Link]
Sites importantes:
[Link]
(vídeos mais explicação das desvantagens e vantagens).
[Link]
ion-Fact-Sheet
[Link] (ficheiro
transferido 13/04)
[Link]
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