Biologia e Geologia

10.º Ano

Nome:_____________________________N.º: _____ Turma: ___ Ficha informativa

O MICROSCÓPIO ÓTICO COMPOSTO (MOC)

A utilização do microscópio ótico implica vários conhecimentos e procedimentos com que os alunos devem
estar familiarizados.
Constituição de um microscópio ótico composto (MOC)
O MOC é constituído por duas partes: uma parte mecânica e uma parte ótica. Cada parte engloba uma série de
componentes com diferentes funções (Fig. 1). No seu conjunto, a parte ótica permite a obtenção da imagem e
a mecânica serve para dar estabilidade e suporte à parte ótica.

1 Tubo (ou canhão) • Cilindro que suporta os sistemas de lentes, com a ocular na 9 Lente ocular • Encaixada na extremidade
extremidade superior e o revólver, com as objetivas, na extremidade inferior. superior do tubo, a sua função é aumentar
Nos microscópios monoculares (com uma só ocular), o tubo é um cilindro reto a imagem fornecida pela objetiva. O aumento
ou oblíquo. Nos microscópios binoculares (com duas oculares), o tubo pode ser fornecido pela ocular está geralmente inscrito
inclinado e a distância entre as duas oculares pode ser ajustada em função nela. Por exemplo: 5×; 8×; 10×.
do espaço entre os olhos de cada observador.
10 Lentes objetivas • Encaixadas no
2 Revólver (ou tambor) • Peça giratória adaptada à parte revólver, permitem a ampliação da
inferior do tubo, onde estão inseridas as lentes das imagem de um objeto.
objetivas de diferentes ampliações, e que, por rotação, O aumento fornecido por cada
permite trocar de objetiva. Gira-se o revólver sempre objetiva encontra-se inscrito em
de uma objetiva de menor ampliação para a de maior cada uma. Para se utilizar
ampliação ao lado. a objetiva de 100× coloca-se uma
gota de óleo de cedro (gota de
3 Braço (ou coluna) • Peça fixa
imersão) em cima da lamela;
à base, na qual estão aplicadas
isso permite um maior
todas as outras partes
aproveitamento de luz, pois com a
constituintes mecânicas, como
objetiva seca parte dos feixes
o tubo, a platina, o porta-
luminosos são desviados.
-condensador e os parafusos
macro e micrométrico). Pode ser
reclinável ou fixo. Condensador e diafragma • Localizados
abaixo da platina.
4 Platina • Peça circular, quadrada
ou retangular, paralela à base, 11 Condensador • É constituído por um
onde se coloca a preparação a conjunto de lentes que concentram os raios
observar, possuindo, no centro, luminosos, fazendo-os incidir na
um orifício circular ou alongado preparação. Assim, a luz é distribuída
que possibilita a passagem dos regularmente no campo visual do
raios luminosos captados pelo microscópio.
espelho e concentrados
(direcionados) pelo condensador 12 Diafragma • Está associado ao condensador
e pelo diafragma, passando pelo e permite regular
material, pela objetiva e pela a intensidade luminosa no campo visual
ocular até à retina do do microscópio. Por norma, ao utilizar
observador. as objetivas de pequena ampliação, deve
ser fechado para eliminar os raios laterais.
Deve ser aberto quando se utilizam
5 Charriot • Peça opcional, as objetivas de maior ampliação.
na platina, que permite
o deslocamento da preparação. 13 Fonte de luz ou espelho • Peça encaixada por
baixo do condensador. Existem vários tipos de
6 Pé (ou base) • Suporta o microscópio,
fontes luminosas, podendo ser uma lâmpada
assegurando a sua estabilidade.
(iluminação artificial), ou um espelho que reflita a
7 Parafuso macrométrico • Botão 8 Parafuso micrométrico • Botão luz solar (iluminação natural). O espelho quando
que se roda para fazer movimentos que se roda para fazer movimentos existe tem duas faces: uma plana, usada nas
de grande amplitude no tubo ou de amplitude reduzida no tubo grandes ampliações, incluindo a de imersão, uma
na platina. É necessário para fazer ou na platina. Permite completar vez que capta e projeta os raios luminosos
a focagem. Permite um movimento a focagem. O movimento paralelos e divergentes; e a face côncava, usada
vertical de 7,5 cm. é no máximo de 2 milésimos nas pequenas ampliações, uma vez que capta
de milímetros (2 µm). e projeta os raios convergentes.

Fig. 1 Constituição de um microscópio ótico composto (MOC). Os elementos da parte mecânica estão
representados a laranja e os da parte ótica estão a verde.
Funcionamento do MOC e características da imagem obtida
O MOC permite observar material biológico ampliado e em pormenor, usando um feixe de luz que atravessa
o objeto. A imagem é então ampliada pela objetiva, seguidamente é transmitida a um espelho (no canhão) e,
finalmente, sofre nova ampliação pela ocular. Esse percurso dos raios luminosos justifica as características
da imagem que o observador vê. Relativamente ao objeto real, a imagem obtida ao MOC é ampliada,
invertida e simétrica.
O poder de ampliação e a resolução permitem tornar visível ao olho do ser humano objetos que sem o MOC
são invisíveis. A ampliação a que se observa o objeto é calculada multiplicando a ampliação da ocular pela
ampliação da objetiva. A resolução é a menor distância a que devem estar dois pontos para que possam ser
observados como distintos. O MOC tem um limite de resolução de 0,3-0,2 µm. O poder de resolução
depende da abertura numérica da objetiva, do comprimento de onda da luz utilizada e da refração que o
meio oferece.
O que se observa focado ao MOC é função da profundidade de campo, que se define como a variação da
posição de foco da objetiva que não provoca alterações na acuidade visual e nitidez da imagem de um ponto
no centro do campo. A profundidade de campo, bem como, o campo de visão, são inversamente
proporcionais à ampliação. Em termos práticos, aumentar a ampliação implica reduzir o campo de visão e ter
maior dificuldade em focar o objeto.

PREPARAÇÃO DO MATERIAL PARA OBSERVAÇÃO AO MOC

Preparações temporárias ou definitivas

Para observação ao microscópio, o material biológico deverá ser preparado numa camada muito fina entre
lâmina e lamela, para poder ser examinado, pois a luz tem de atravessar o conjunto –
a preparação biológica. As preparações são normalmente constituídas por quatro elementos,
a saber: a lâmina, o meio de montagem, o objeto biológico em estudo e a lamela.
As preparações biológicas podem ser temporárias ou definitivas, se apresentam, respetivamente, curta ou
longa duração. As preparações temporárias permitem observar o material vivo, inclusive no seu meio normal
de vida: água salgada, água doce ou fluidos corporais. Esses meios, nos quais se encontram as células a
observar, constituem o meio de montagem. O soro fisiológico e a solução de Ringer são soluções isotónicas
que permitem manter, em equilíbrio hídrico, respetivamente, células animais e células vegetais vivas.
As preparações temporárias têm uma duração limitada, uma vez que o meio de montagem evapora e as
células também se degradam e autodestroem por autólise.
Nas preparações definitivas, como as que se podem adquirir a empresas especializadas, o material é
submetido a técnicas morosas que requerem equipamento especializado. Apesar de não permitirem
observar material biológico vivo, têm a vantagem de a preparação ter uma grande durabilidade. Nas aulas de
microscopia só se irão efetuar preparações temporárias, mas o estudo destas pode e deve ser
complementado com a utilização de preparações definitivas, porque a qualidade das mesmas,
nomeadamente os cortes histológicos, permite visualizar estruturas que de outra forma não seriam
observáveis. Estas preparações apresentam ainda uma mais-valia em termos didáticos, pois, devido a
técnicas de coloração diversas, põem em evidência determinadas estruturas celulares, extracelulares e
ultracelulares.

Técnicas de coloração
As células apresentam estruturas muito transparentes que não contrastam suficientemente de modo a
tornarem-se distintas umas das outras. As exceções são os cloroplastos e os vacúolos, que têm pigmentos
hidrossolúveis das células vegetais, e os cromatóforos, que são células animais especializadas. A função dos
mcorantes é dar maior contraste/evidência a estruturas celulares que, pela sua transparência e fraco
contraste ótico, se tornariam difíceis de observar.
Existem corantes vitais e corantes não vitais; os primeiros mantêm o material biológico vivo e os segundos
não. No entanto, o mesmo corante pode ser vital ou não, dependendo da concentração em que se usa. Os
corantes vitais são geralmente usados em concentrações muito baixas.
Não existe uma técnica de coloração que ponha em evidência todas as estruturas celulares.
A coloração das células deve-se sobretudo à combinação dos corantes com as proteínas, dependendo da sua
carga elétrica. Por esta razão, o facto de os corantes poderem corar especificamente um organelo e não
outro – corantes seletivos – está relacionado com a diferença de cargas elétricas existente entre as proteínas
dos diferentes organelos celulares e os corantes que a elas se podem ligar quimicamente. Assim, quando
colocamos corante azul (ex. azul de metileno) numa preparação, podemos verificar de início que toda a
preparação fica azul, mas, se lavarmos a preparação, o corante que não se encontra ligado a nenhuma
estrutura é arrastado.
Nas preparações definitivas é frequentemente utilizado mais do que um corante. Em preparações de cortes
histológicos de tecidos animais, a técnica de coloração mais utilizada é da hematoxilina-eosina. A
hematoxilina (hemateína) cora substâncias ácidas presentes no núcleo (ácidos nucleicos) e a eosina cora os
compostos básicos do tecido, como o citoplasma. Em cortes histológicos de órgãos vegetais apenas as
paredes são visíveis e geralmente apresentam-se coradas de forma diferenciada, de acordo com a presença
ou não de lenhina.
A tabela 1 indica alguns corantes de uso comum e a sua aplicabilidade.
Tabela 1
Corante Aplicabilidade
Em espécimes animais e vegetais. Cora o núcleo e alguns
organelos como os lisossomas e os vacúolos.
Vermelho neutro Pode ser utilizado para evidenciar tecidos e seres planctónicos.
É um corante vital.
Em espécimes animais e vegetais.
Azul de metileno Cora rapidamente o núcleo.
É um corante vital.
Em espécimes animais.
Carmim acético
Cora o núcleo.
Em espécimes animais e vegetais.
Safranina Cora o núcleo.
Em tecidos vegetais cora as paredes lenhificadas
Deteta a presença de açúcares redutores (monossacarídeos, como
Solução de Fehling A + B
a glucose, e dissacarídeos, como a maltose e a lactose) e aldeídos.
Em espécimes vegetais.
Soluto de lugol
Cora estruturas com amilose.

A aplicação do corante pode ser feita de diferentes formas.

Coloração por imersão

Nesta técnica de coloração, o material biológico fica imerso
durante algum tempo no corante selecionado (Fig. 2).

Fig. 2 Técnica de coloração por imersão.

Coloração por irrigação
Na técnica de coloração por irrigação substitui-se o meio de montagem de uma preparação pelo corante.
Para tal, coloca-se o corante num dos lados da preparação e, no outro lado, absorve-se o meio original com
papel absorvente (Fig. 3).

Fig. 3 Técnica de coloração por irrigação.

Montagem de uma preparação

Etapas a seguir para a montagem de uma preparação:
1. Na parte central da lâmina bem limpa, coloca-se uma gota do meio de montagem que se vai utilizar.
2. Sobre o meio de montagem, coloca-se o material a observar e cobre-se com a lamela.
Nota: Para evitar a formação de bolhas de ar na preparação, deve-se colocar a lamela fazendo um ângulo de
45° com a lâmina e, com a ajuda de uma agulha de disseção, deixá-la cair lentamente sobre a lâmina (Fig. 4).

Fig. 4 Montagem de uma preparação.

Por vezes, no estudo de microrganismos e de tecidos animais ou vegetais, temos necessidade de observar o
material in vivo (ao vivo), no seu estado natural, sem uso de fixadores nem corantes, que de algum modo
sempre criam artificialidades no material da observação.
Existem técnicas especiais que são vantajosas em determinadas situações.

Técnica de esfregaço
Esta técnica utiliza-se quando as células a observar estão em meio líquido, como é o caso das células
sanguíneas ou das bactérias do iogurte. A técnica do esfregaço consiste em espalhar o material biológico ao
longo de uma lâmina de vidro, com o auxílio de outra lâmina de vidro, sob a forma de uma camada delgada e
homogénea (Fig. 5-A). Também poderá ser efetuada com o auxílio de uma ansa de inoculação (Fig. 5-B).
 A

Fig. 5 A – Técnica do esfregaço com

lâmina de vidro. B – Técnica do
esfregaço com uma ansa.

Técnica de esmagamento
Este método é usado nos casos em que existe uma aderência fraca entre as células do tecido a observar.
Para visualizar as células, basta colocar um pequeno fragmento do tecido entre a lâmina e a lamela e fazer
uma pequena pressão com o polegar. Provoca-se assim um esmagamento do tecido, o que faz que as células
se espalhem, formando uma fina camada, que é facilmente atravessada pela luz.

Fig. 6 Técnica do esmagamento.

UTILIZAÇÃO DO MOC

Nas aulas de microscopia deve estar disponível um microscópio ótico por aluno ou no máximo para ser
partilhado por dois alunos. Deve-se frisar, aos alunos, que partilhar um microscópio não é utilizá-lo
simultaneamente por dois alunos, apesar de possuir dois parafusos macrométricos e dois parafusos
micrométricos.
Na utilização do MOC devem ser seguidas algumas regras básicas:
1. Se o MOC possuir uma ocular, deve-se olhar por ela com o olho esquerdo (se se for destro), mantendo
os dois olhos abertos. Se o MOC tiver duas oculares, deve-se olhar por ambas.
2. A mão dominante deve ficar livre para desenhar as observações; assim, os parafusos de comando
devem ser manuseados com a outra mão.
 3. Os mecanismos de deslocação não devem ser forçados. Os parafusos macrométricos e micrométricos
são muito sensíveis e a sua substituição tem um custo elevado.
4. No final da sua utilização deve-se: desligar a fonte de luz; rodar o revólver de modo a colocar no eixo
ótico a objetiva de menor ampliação; baixar a platina com o parafuso macrométrico e retirar a
preparação; deixar a platina e as lentes (ocular e objetivas) limpas.

Iluminação da preparação
As imagens do MOC são obtidas por transparência e, muitas vezes, não é com mais luz que se conseguem as
melhores imagens. Como numa fotografia, a luz é o mais importante, mas na «dose» e na incidência certas.
A iluminação é regulada de acordo com o material a observar, pois algumas preparações exigem mais luz do
que outras.
Na iluminação de uma preparação devem ser observadas as seguintes etapas:
1. Ligar a fonte de luz. Alguns microscópios têm um reóstato que permite regular a intensidade da fonte
de luz.
2. Regular o condensador, rodando-o, até que o campo do microscópio se apresente claro e uniforme. As
mudanças de objetiva devem ser acompanhadas de um ajuste do condensador.
3. Regular a abertura do diafragma, de forma a obter a iluminação ideal. Para objetos com grande
transparência, o fecho do diafragma pode fornecer uma luz oblíqua que evidencia o que se pretende
observar.

Técnica de focagem da imagem

Focagem com a objetiva de menor ampliação

1. Descer completamente a platina e verificar se a objetiva de menor ampliação está devidamente
colocada no eixo ótico. Se não estiver, roda-se o revólver até se sentir um pequeno estalido, que é
indicador da posição de encaixe.
2. Fixar a lâmina preparada para observação na platina, usando as pinças.
3. Deslocar a platina horizontalmente de modo que o material a observar fique alinhado com a objetiva.
4. Sem olhar pela ocular, mas sim lateralmente e para a preparação, subir completamente a platina,
movendo o parafuso macrométrico.
5. Observar pela ocular e mover lentamente o parafuso macrométrico até que o material fique visível.
6. Aperfeiçoar a focagem com o parafuso micrométrico. Corrigir a iluminação, se necessário.
Focagem com as objetivas de maior ampliação

1. Para aumento de ampliação, trocar a objetiva. Para o efeito, depois de focar com a objetiva de menor
ampliação, iluminar o melhor possível o material e situar no centro do campo do microscópio o
pormenor que se quer observar mais ampliado.
2. Rodar o revólver, de modo a colocar a objetiva que tem a ampliação imediatamente superior.
3. Focar, utilizando exclusivamente o parafuso micrométrico, movendo-o muito lentamente, pois
qualquer movimento brusco pode partir a preparação ou danificar a objetiva (alguns microscópios têm
mecanismos de travão que evitam danos).
4. Ajustar de novo a iluminação.
5. Se não se conseguir focar, repetir todas as operações pela ordem indicada.
REGISTO DAS OBSERVAÇÕES
Fotografias de imagens ao MOC
«Uma imagem vale mais de que mil palavras.» Na microscopia isso também é verdade, mas existem algumas
limitações. A imagem ao MOC foca apenas um plano, pelo que uma fotografia capta apenas esse plano. No
entanto, quando se faz uma observação ao microscópio pode ficar-se com uma ideia da estrutura 3D
movimentando o parafuso micrométrico, o que permite focar vários planos.
As fotografias de preparações microscópicas podem ser realizadas com câmaras digitais acopladas à ocular
ou simplesmente com um telemóvel (já existem no mercado objetos para acoplar os telemóveis à ocular).
Execução de desenhos de observação microscópica
Para quê fazer desenhos, se é mais moroso e difícil do que tirar fotografias?
A prática do desenho tem uma importância fundamental na interpretação e na descoberta dos pormenores,
pois desenvolve as faculdades de observação e ajuda a memória a reter os aspetos morfológicos. Pode
também ser «uma dor de cabeça» para alguns alunos, porque consideram que não tem jeito para o desenho,
ou mesmo para o professor, porque alguns alunos podem ser tentados a fazer desenhos artísticos que não
representem o real observável. É necessário explicar muito bem, quais são as regras que os alunos devem
seguir neste trabalho.
Antes de desenhar, o aluno deve ter bem presente o objetivo em vista. O desenho, antes de mais nada, é
uma escolha e um resumo. Com uma objetiva de baixa ampliação, o aluno deve explorar a preparação em
toda a sua extensão e selecionar o seu objetivo. Deve colocar a parte selecionada no centro do campo de
visão, recorrer à ampliação adequada e fazer então o seu registo.
Para realizar cada desenho deve-se usar lápis preto macio, papel branco e borracha. O desenho deve ocupar
sensivelmente meia folha A4.
É desnecessário fazer um círculo em volta do desenho para mostrar que foi visto ao microscópio. O desenho
esquemático tem de estar centrado no que se pretende ver, pelo que não faz nenhum sentido representar,
por exemplo, uma bolha de ar ou um resíduo de corante, simplesmente porque está lá. O aluno deve
representar apenas o que vê, confiar na sua capacidade de observação e não copiar representações
esquemáticas realizadas por colegas ou existentes em livros, pois o que está a ver pode até ter muito mais
interesse.
O aluno deve começar com traços muito suaves e apagar o mínimo de vezes possível (não faz mal que
fiquem alguns traços ténues no fundo). É indispensável que compare muitas vezes o seu desenho com o que
vê. Deve mexer o parafuso micrométrico para focar diferentes planos e integrar no esquema a informação
que recolheu. Por fim, é importante que realce os pormenores pretendidos.

Como legendar fotografias ou esquemas

Na legendagem devem ser seguidas as seguintes regras:
 dar um título à representação e indicar a ampliação total com que foi obtida;
 fazer a legenda fora do esquema e em letra legível;
 usar um lápis e uma régua para desenhar as linhas da legenda;
 colocar, preferencialmente, as linhas da legenda na horizontal.
Fontes:
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(consultados em 09/04/2021)