Views HIL PCR Muticlass E genes na mesma amostra com primas específicos

HIV
infecta TCD4 e ↑
carga viral = ↓ contagem de TCD4
. LANAT hiv, hep Be C .

P Se 3 pois tem

idee
entrave :
genes ,
avelamento pode dificultar cada gene suo
↑
↓ tempo .

Nas 195 semanas

, o vírus a se
replicar ,
seg Variando To IgM recente
e45 começa
e - Igo cônico
ind
, causando
entamente sintomas inespecíficos
.

biomo
Sonsente com alto
carga vial que os anticapos Hepatite O elisa indireto
Hav
. Es Ez
Ag
-

janela imunol ampla

usã produzidos - 6 .
semanas RNA o de fita simples enveopado
.

O fígado
O este lisa indireto s1a baixa I mès 2 Per
.

2 -
meses
pela marcadores
.
or

Elisa

produção de anticorpos
. clássico ainda IgG >3 meses com Elise
.

Pero teste elisa indireto de 42

geraçã IgM ,
é detectare (d tempo). vins crônico -
smp material genético
.

A partir da 1a semana
, pode-se detectar material genético u ral no undivíduo -

&
10 dias .

teste mat /presentes um bancos de .

sangue

HIV ,
bep .
Be .
0

Aplicações do Elisa 03 : 21 Hepatite B confere resistência 444

ja
:

autoimunes , treposema p . , alergias , ,

yarasitos HIV e
bepatites DNAv , dupea fita
envelopado /
ptr HDSAg/de superfícies. Capsídeo é composto
L da vacina
composiçã .
~ Ac suficientes
para detecçã - 3 sem a 6 meses
, pelo pin HBe.

o me vauzida ma carge
e
in Teste socológico

HBSAG
pl saber

tem
se a
pessoa

hepatite
tem ou teve ? anti Ba
por Elisa

diferencia
indireto
.

&
.
6 m infecção recente + anti HBc

S
* 10 d a - e > C de va c i n a

Incontato
Inicial d a 3 sem >
- biomol . * Gm - infecção cônica .

detecção ↓ val
períodorecipie
& pa

a ,
transmissão período de lincubação.

gag , po e enve
genes que produzem pens p/diagnóstico .
viral

Aco
pzy
Antígeno # e
=
infecção ,
recente a prod Ac replicaçã
,
.
viral

Elisa de 28G -
presença de vírus vintíticos nos kits .
[Somente IgG] Antígeno O e AcD =
já teve e se ara

3° o - Anti-HBS vacina Eise UBSAG

de detecção de anticorpos IgG IgM se direto
=
e

indireto pl anti

46 -
IgG o
IgM além ,
da
plY
.

S- G -
identifica os 3 de
forma esparada, qual fase a infecçã es

Tá

Janela imunológica
+ a cada geração de Elisa
.

Biologia Boucear :

PCR I
janela imunológica
·
:
.

Amplificação e replicação do DNA viral no termocicados

,
trabalhando com varia

coes de To
I

>
-
Passo a
passo
:
fita dupla enovelada

↑
e

baterial genético a ser pesquisado - adicionar a sanção de Vise de culas ,

usangue ,
suab mata o vírus e vivera DNA -
abertura da fita dupla um
1 F etapa : desnaturacos
↑ 90 A 1 min
11
°

, a gene bank
2 simples
fitas - adiciona-se um
par de
primer que será "oferecido" para
anelar-teste negativo
a se
a

a DNA-polimerase I
primer faz andamento ao DNA -
DNA-polimerase reconhece e poli
2
=
etapa , 55165 A min
região auto

meriza o
primer
, ade nucleotídeo - e o cico se repete com diversas Cópias
.

3 etapa : comprado pl fornecer as DNA .

polimerase
.
-

709 I min bact DNTPS

s
termogia
.
↑
,

No PCR,
dra-poli de TAes

Cada Ciclo -3
estapas que Variam To dentro do termocicador
.

L 35 a 36 ciclos
.

lonto de Mg - cofata da TAC

polimerase
, obrigatório
20 master mix que vai
nãoform
25 ul /aparelho
.
e
a - se

ge de
agarose forma tama com DNA , formando banda ,
formado se houver
t

pentes (hiar
poços) amplificação ,
destas este D
t

tampo

escada de PNA -
quantos pares de base um cada banda
.
 Aula 1 Sobre o HIV

Contexto histórico

A síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS, do inglês acquired Notas:

immune deficiency syndrome) é causada pelo vírus da imunodeficiência
humana (HIV, do inglês human immunodeficiency virus). 1 - pandemia –
caracteriza uma epidemia
com larga distribuição
Os primeiros casos de AIDS foram diagnosticados no início da década geográfica, atingindo mais
de um país ou de um
de 1980. A doença disseminou-se pelo mundo, tornando-se uma continente.
pandemia1.

Segundo dados levantados pela Organização Mundial de Saúde (OMS),

em 2012, dentre os infectados, aproximadamente 1,6 milhão de pessoas
morrem, por ano, em decorrência da AIDS e já existem mais de 35
milhões de pessoas vivendo com HIV/AIDS, no mundo.

No Brasil, o primeiro caso de AIDS foi identificado clinicamente em São

Paulo, em 1982.

No início, a epidemia atingiu principalmente os usuários de drogas

injetáveis, homens que faziam sexo com homens e pessoas que tinham
recebido transfusão de sangue e de hemoderivados contaminados.

Entretanto, na metade dos anos de 1990, verificou-se que a epidemia

assumiu outro perfil. A transmissão heterossexual passou a ser a
principal via de transmissão do HIV.

Atualmente, há uma tendência de crescimento da infecção em jovens

de 15 a 24 anos e em adultos com 50 anos ou mais, tanto em homens
quanto em mulheres.

Diagnóstico do HIV - Aula 1 4

 Síndrome da ImunoDeficiência Adquirida
Síndrome é um grupo de sinais Imunodeficiência é um distúrbio, Adquirida significa que
e sintomas que, considerados ou uma doença, na qual a não é congênita, ou seja, o
em conjunto, caracterizam uma resposta imune está diminuída indivíduo não nasceu com a
doença. ou ausente. É caracterizada pela imunodeficiência.
incapacidade de produzir uma
resposta efetiva ao desafio de
antígenos, como vírus, bactérias,
protozoários, fungos, células
tumorais etc.

Acesse o site do TELELAB para saber mais sobre os dados

epidemiológicos da infecção pelo HIV, no Brasil:
[Link].

Estrutura do HIV

Os vírus da imunodeficiência humana (HIV-1 e HIV-2) são retrovírus pertencentes à família dos
lentivírus.

Essa família inclui vírus capazes de provocar infecções persistentes, com evolução lenta. Por
isso, produzem degeneração progressiva do sistema imune.

!
Retrovírus são vírus que têm seu material genético constituído de
RNA e apresentam a enzima transcriptase reversa, que é capaz
de transformar o RNA viral em cDNA. Este cDNA é inserido pela
enzima integrase ao DNA da célula infectada para começar o ciclo
viral.

O vírus apresenta algumas características próprias. Dentre elas, a existência de uma camada mais
externa, o envelope, que contém lipídeos e proteínas.

As proteínas virais encontradas no envelope são as glicoproteínas 120 (gp120) e 41 (gp41). A

gp120 é a mais externa, responsável pela ligação do vírus com as células hospedeiras. Ela está
ligada à gp41, que atravessa o envelope viral.

Diagnóstico do HIV - Aula 1 5

Na parte interna do envelope viral, existe uma estrutura proteica 2 - integrase – enzima
constituída pela proteína 17 (p17). produzida pelos retrovírus,
incluindo o HIV, que
faz a integração do
A estrutura seguinte é o cerne ou capsídeo viral, constituído pela DNA produzido pela
proteína p24, que envolve duas fitas de RNA (genoma viral) e as enzimas transcriptase reversa
com o DNA da célula
transcriptase reversa, integrase2 e protease3. hospedeira.

As proteínas e glicoproteínas virais são identificadas por números que

correspondem ao seu peso molecular em quilodaltons. Por exemplo, a 3 - protease – enzima que
quebra ligações peptídicas
gp120 tem 120 quilodaltons, a p17 tem 17 quilodaltons. entre os aminoácidos
das proteínas. Também
são conhecidas como
Essas proteínas (ou os anticorpos4 contra elas) são detectadas em proteinases, peptidases ou
testes laboratoriais. enzimas proteolíticas.

Observe a figura a seguir.

4 - anticorpos – proteínas
(imunoglobulinas)
produzidas pelo sistema
imune em resposta a um
ou mais antígenos.

Figura 1 – Estrutura do vírus HIV.

Diagnóstico do HIV - Aula 1 6

 Etapas da infecção pelo HIV

O HIV é capaz de infectar células que apresentam receptores do tipo CD4, na sua superfície,
como os linfócitos T helper (T auxiliar), os macrófagos e as células dendríticas.

Essas células participam ativamente na defesa do organismo contra agentes infecciosos.

A infecção inicial ocorre nas células T CD4 .

A partícula viral aproxima-se das células e as
gp120 do vírus ligam-se nos receptores CD4.
Essa ligação desestabiliza a gp120 e expõe
sua alça V3, que interage com um correceptor
denominado CCR5. À medida em que a infecção
progride, outras células são infectadas como,
por exemplo, os linfócitos T que apresentam
receptores CD4 e correceptores CXCR4.

Após a ligação entre o vírus e a célula, ocorre

a ativação da proteína gp41 e a fusão entre o
envoltório viral e a membrana celular, permitindo
a penetração do vírus.

No citoplasma celular, ocorre o afrouxamento do

capsídeo viral e início da síntese do cDNA pela
enzima transcriptase reversa.

Diagnóstico do HIV - Aula 1 7

 No final, o RNA viral é transformado em DNA
de fita dupla, por ação da enzima transcriptase
reversa. Ao DNA de fita dupla, liga-se à enzima
integrase e, juntos, migram para o núcleo da
célula.

Dentro do núcleo, a integrase insere o DNA

viral no DNA da célula hospedeira. O DNA viral
inserido é denominado DNA proviral.
A partir desse momento, o vírus passa a
controlar a síntese celular, iniciando, no núcleo
da célula hospedeira, a produção de RNA
mensageiro viral. Os RNAs mensageiros serão
utilizados na síntese das proteínas e do genoma
viral.

Todos os RNAs produzidos saem do núcleo

para o citoplasma da célula. No citoplasma,
as proteínas são sintetizadas como grandes
moléculas precursoras (Gag, Gag-Pol e Env),
que posteriormente são cortadas por ação de
enzimas proteases celulares e virais, durante o
processo de maturação viral. É o que acontece,
por exemplo, com a glicoproteína gp 160 que,
depois de cortada por uma protease celular, dá
origem às glicoproteínas gp120 e gp41.
Em seguida, o genoma e as proteínas virais
migram para a extremidade do citoplasma, onde
serão reunidas para formar novas partículas
virais.

Todos os componentes do vírus são reunidos

próximos à membrana celular e as partículas
saem da célula hospedeira por brotamento,
quando adquirem o envoltório. Fora da célula,
o processo de maturação das partículas virais
será completado pela clivagem das moléculas
de Gag e Gag-Pol, feita pela protease do HIV,
tornando os vírus capazes de infectar novas
células.

Quadro 1 – Infecção das células humanas pelo HIV.

Diagnóstico do HIV - Aula 1 8

 A dinâmica da resposta 5 - provírus –
denominação que se dá

imunológica ao cDNA viral integrado ao

genoma celular, também
conhecido como DNA
proviral.
Marcadores da infecção pelo HIV na corrente
sanguínea
As proteínas, o genoma viral (RNA e provírus5 ) e os anticorpos
formados em resposta à infecção pelo HIV são os marcadores da
infecção que os testes utilizados para o diagnóstico detectam.

Os marcadores virais são detectados, no sangue, na ordem cronológica

listada a seguir.

Com a progressão da
O RNA viral é o primeiro Em seguida, a proteína p24
infecção, são detectados
marcador a ser detectado. é detectada.
anticorpos contra o vírus.

Veja, na figura a seguir, quando surgem os diferentes marcadores da

infecção pelo HIV, na corrente sanguínea da maioria dos indivíduos
infectados. Note que, logo após o aparecimento dos anticorpos, há uma
redução na quantidade de RNA e de p24 circulantes.

Figura 3 – Marcadores da infecção pelo HIV na corrente sanguínea de acordo com o período em que
surgem, seu desaparecimento ou manutenção ao longo do tempo. Fonte: BUTTÒ, S. et al. Laboratory
diagnostics for HIV infection. Annali dell’Istituto Superiore di Sanità [S.l.], v. 46, n. 1, p. 24–33, 2010.
Adaptado de: HIV – Estratégias para Diagnóstico no Brasil Telelab/MS.

Diagnóstico do HIV - Aula 1 9

Um sistema de estagiamento da infecção recente6 pelo HIV foi proposto 6 - infecção recente – é a
por Fiebig e colaboradores7. fase entre o surgimento de
anticorpos em quantidade
detectável por um teste
O sistema permite fazer projeções da duração de cada estágio da sorológico até a completa
infecção pelo HIV, com base na reatividade dos diferentes ensaios maturação da resposta dos
anticorpos.
diagnósticos.

Esse conhecimento permite o estabelecimento de fluxogramas que 7 - Ver referência no final

tornam o diagnóstico mais confiável. O estagiamento de Fiebig será da aula 11: FIEBIG et al,
2003
discutido em mais detalhes, adiante, nesse manual.

Acesse o site do TELELAB para ler também o “Manual Técnico

para o Diagnóstico da Infecção pelo HIV no Brasil”, que foi
aprovado pela portaria n.º 29 de 17 de dezembro de 2013 – SVS-
MS: [Link].

Diagnóstico do HIV - Aula 1 10