RELATÓRIO Norma

TÉCNICO ISO/
TR6579-
Primeira edição
3
2014’07-15

Microbiologia da cadeia alimentar —

Método horizontal para detecção,
enumeração e sorotipagem de
Salmonella —
Parte 3:
Diretrizes para sorotipagem de
Salmonella spp.
Microbiologia da cadeia alimentar — Método horizontal de pesquisa, ou
seja, desdenominação e sorotipia de Salmonella —
Parte 3: Diretrizes de linhas para a sorotipia de Salmonella spp.

Número de referência
ISO/TR 6579-3:2014(E)

eISO 2n14
ISO/TR6579 -3:2014(E)

DOCUMENTO PROTEGIDO POR DIREITOS AUTORAIS

© IS0 2014
Todos os direitos reservados. A menos que especificado de outra forma, nenhuma parte desta publicação pode ser reproduzida ou
utilizada de qualquer forma ou por qualquer meio, eletrônico ou mecânico, incluindo fotocópia ou publicação na internet ou intranet,
sem permissão prévia por escrito. A permissão pode ser solicitada à ISO no endereço abaixo ou ao órgão membro da ISO no país
do solicitante.
Escritório de direitos autorais ISO
Caso postale 56 • CH-1211 Genebra 20
Telefone+ 41 22 749 01 1 1
Fax+ 41 22 749 09 47
E-mail copyright@[Link]
Site [Link]
Publicado na Suíça

© ISO 2014 - Todos os direitos

reservados
 ISO/TR6579-3:2014(E)

Conteúdo Página

Prefácio---------------------------------------------------------------------------------------------- -- - ------------------------------4
Introdução..----------------------------------------------------------------------------------------------...
-------------------------------------------você
1 Escopo______________________________________________________________________________1
2 Referências normativas--------------------—......................................................................................... 1
3 Termos e definições 1

4 Princípio___________________________________________________________________________2
5 Meios de cultura e soros________________________________________________________________2
5.1 Em geral_____________________________________________________________________2
5.2 Meios de cultura e reagentes ________________ 2
5.3 Antissoros ................... -.................................................................................................. 2

6 Appa rat u $_____________________

____________________________________________________2
7 Amostra............................——............................................................................................................ 3
8
Taxonomia da Salmonella ____________ _____________________________________-............ 3
8.1 Em geral....... ....................................................................................................................... 3
8.2 Nomenclatura-----------------------------------------------------------—-------------------------------—--------3
8.3 Características bioquímicas------------------------------------------------ ------- -------------------------------4
8.4 Características antigênicas---------.— _________________________________— — __________S
9 Procedimento para sorotipagem de Salmonella____________________________________________7
9.1 Em geral ____________________________________________________________________7
9.2 Exemplo de procedimento para sorotipagem de cinco sorovares de Salmonella relacionados à
saúde pública 7
10 Controle de qualidade eu- ■ 1 eu
11 Relatório I1 g
Norma ISO/ TR6579-3..............................................................................................................................1
DOCUMENTO PROTEGIDO POR DIREITOS AUTORAIS.........................................................2
1 Escopo........................................................................................................................................1
2 Referências normativas..............................................................................................................1
3 Termos e definições....................................................................................................................1
4 Princípio.....................................................................................................................................8
5 Meios de cultura e soros.............................................................................................................8
5.1 Em geral..................................................................................................................................8
5.2 Meios de cultura e reagentes...................................................................................................8
5.3 Antissoros...............................................................................................................................8
6 Aparelho.....................................................................................................................................8
7 Amostra......................................................................................................................................3
8 Taxonomia da Salmonella..........................................................................................................3
8.1 Em geral..................................................................................................................................3
8.2 Nomenclatura..........................................................................................................................3
8.3 Características bioquímicas....................................................................................................5
8.4 Características antigênicas......................................................................................................6

direitos até
ISO/TR6579 -3:2014(E)

9 Procedimento para sorotipagem de Salmonella.........................................................................7

9.1 Em geral..................................................................................................................................7
9.2 Exemplo de procedimento para sorotipagem de cinco sorovares de Salmonella relacionados
à saúde pública...................................................................................................................................8
9.2.1 Em geral..............................................................................................................................8
10 Controle de qualidade...........................................................................................................11
11 Relatórios..............................................................................................................................11
Anexo A (informativo).......................................................................................................................13
Al Geral...........................................................................................................................................13
A.2 Ágar nutriente...........................................................................................................................13
A.2.1 Composição...........................................................................................................................13
A.2.2 Preparação..............................................................................................................................15
A.3 Meio de ágar enxame — Sven Gard (exemplos)......................................................................20
A.3.1 Exemplo 1 (Referência (161).................................................................................................20
A.3.2 Exemplo 2..............................................................................................................................20
A.6.2 Solução de fosfato monossódico (1,0 mol/l).........................................................................17
A.7 Caldo D-Tartrato (tartarato de ácido orgânico)........................................................................17
A.7.1 Composição...........................................................................................................................17
A.7.2 Preparação..............................................................................................................................17
AB Solução de acetato de chumbo..................................................................................................17
A.8.1 Composição...........................................................................................................................17
A.8.2 Preparação..............................................................................................................................17
A.9 Caldo de infusão cérebro-coração (BH1).................................................................................24
A.9.1 Composição...........................................................................................................................24
A,9,2 Preparação..............................................................................................................................24
A. 10 Solução salina formal (fração de volume de 1%)..................................................................24
A.10.1 Composição.........................................................................................................................24
A. 10.2 Preparação...........................................................................................................................24
A. 11 tubos Craigie..........................................................................................................................24
A.11.1 Composição.........................................................................................................................24
A.11.2 Preparação............................................................................................................................25
A.12 Gelatina nutritiva....................................................................................................................25
A.12.1 Composição.........................................................................................................................25
A.12.2 Preparação............................................................................................................................25
Anexo B (informativo).......................................................................................................................26
Anexo C (informativo}......................................................................................................................30
C.1 Distinção entre subespécies de Salmonella...............................................................................30
C.1.1 Geral.......................................................................................................................................30

© ISO 2014 - Todos os direitos

reservados
 ISO/TR6579-3:2014(E)

C.1.2 Teste de malonato..................................................................................................................30

C.1.3 Teste de dulcitol.....................................................................................................................30
C.1.4 Teste ON PG..........................................................................................................................30
C.1.5 Teste de gelatinase.................................................................................................................30
C.2 Distinção entre Salmonella Paratyphi B e Salmonella Paratyphi B bio- var Java....................25
Anexo D (informativo).......................................................................................................................32
Anexo E (informativo).......................................................................................................................27
E.3 Placa de microtitulação 2 para antígenos O..............................................................................34
E.4 Placa de microtitulação para antígenos H.................................................................................34
Anexo F (informativo).......................................................................................................................29
Método simplificado de Sven Gard.................................................................................................29
F.2 Método do tubo de Craigie........................................................................................................29
F.2.1 Geral.......................................................................................................................................29
F.2.2 Preparação do tubo Craigie para inversão de fase..................................................................29
F.2.3 Procedimento para inversão de fase usando um tubo Craigie................................................29
F.3 Método da ponte de papel..........................................................................................................36
ICS 07.100.30..................................................................................................................................40

direitos até
ISO/TR6579 -3:2014(E)

Prefácio
A ISO (Organização Internacional para Padronização) é uma federação mundial de organismos nacionais de
normalização (órgãos membros da ISO). O trabalho de preparação de Normas Internacionais é normalmente
realizado por meio de comitês técnicos da ISO. Cada órgão membro interessado em um assunto para o qual
um comitê técnico foi estabelecido tem o direito de ser representado nesse comitê. Organizações
internacionais, governamentais e não governamentais, em colaboração com a ISO, também participam do
trabalho. A ISO colabora estreitamente com a Comissão Eletrotécnica Internacional (IEC) em todos os
assuntos de padronização eletrotécnica.

Os procedimentos utilizados para desenvolver este documento e aqueles destinados à sua manutenção
posterior estão descritos nas Diretivas ISO/IEC, Parte 1. Em particular, devem ser observados os diferentes
critérios de aprovação necessários para os diferentes tipos de documentos ISO. Este documento foi elaborado
de acordo com as regras editoriais das Diretivas ISO/IEC, Parte 2 (consulte [Link]/directives).

Chama-se a atenção para a possibilidade de que alguns elementos deste documento possam ser objeto de
direitos de patente. A ISO não será responsabilizada pela identificação de quaisquer ou todos esses direitos de
patente. Detalhes de quaisquer direitos de patente identificados durante o desenvolvimento do documento
estarão na Introdução e/ou na lista ISO de declarações de patentes recebidas (consulte [Link]/patents).

Qualquer nome comercial usado neste documento é uma informação fornecida para conveniência dos usuários
e não constitui um endosso.

Para uma explicação sobre o significado dos termos e expressões específicas da ISO relacionadas à avaliação
da conformidade, bem como informações sobre a adesão da ISO aos princípios da OMC nas Barreiras
Técnicas ao Comércio (TUT), consulte o seguinte URL: Prefácio • Informações complementares

O comitê responsável por este documento é o ISO/TC 34, Produtos alimentícios, Subcomitê SC 9,
Microbiologia.

A ISO 6579 consiste nas seguintes partes, sob o título geral Microbiologia da cadeia alimentar — Método
horizontal para detecção, enumeração e sorotipagem de Salmonella:

— Parte 1: Método horizontal para detecção de Salmonella spp.1)

— Parte 2: Enumeração por uma técnica de número mais provável miniaturizada [Especificação técnica])

— Parte 3: Diretrizes para sorotipagem de Salmonella spp. | Relatório Técnico]

1) Em preparação. (Revisão da ISO 6579:2002)

2) O elemento principal do título da série foi alterado desde que a Parte 2 foi publicada. Pretende-se que, após a
revisão, o elemento principal do título seja alinhado com a Parte 3.

© ISO 2014 - Todos os direitos

reservados
 ISO/TR 6579-3:2014(E)

Introdução
Esta parte da ISO 6579 fornece informações sobre a taxonomia de Salmonella spp. e fornece orientação sobre
a sorotipagem de variantes Sa/mone//ose, com base no esquema White-Kauffmann-Le Minor (ver Referência
(9]).

minn14..Al riehts reservado

 RELATÓRIO TÉCNICO ISO/TR6579-3:2014(E)

Microbiologia da cadeia alimentar — Método horizontal para

detecção, enumeração e sorotipagem de Salmonella —
Parte 3:
Diretrizes para sorotipagem de Salmonella spp.
AVISO — Para proteger a saúde do pessoal do laboratório, é essencial que os testes para detecção e tipagem
de Salmonella sejam realizados apenas em laboratórios devidamente equipados, sob o controle de um
microbiologista qualificado, e que muito cuidado seja tomado no descarte de todos os materiais incubados.

IMPORTANTE — As pessoas que usam este documento devem estar familiarizadas com as práticas normais de
laboratório. Este documento não pretende abordar todos os aspectos de segurança, se houver, associados ao
seu uso. É responsabilidade do usuário estabelecer práticas adequadas de segurança e saúde e garantir a
conformidade com quaisquer condições regulatórias nacionais.

1 Escopo

Esta parte da ISO 6579 fornece orientação sobre o procedimento de sorotipagem de sorovares de Salmonella e
é aplicável à sorotipagem de culturas puras de Salmonella spp., independentemente da fonte da qual são
isoladas.

2 Referências normativas

Os seguintes documentos, no todo ou em parte, são referenciados normativamente neste documento e são
indispensáveis para sua aplicação. Para referências datadas, aplica-se apenas a edição citada. Para referências
sem data, aplica-se a edição mais recente do documento referenciado (incluindo quaisquer alterações).

ISO 6579-1, Microbiologia da cadeia alimentar — Método horizontal para detecção, enumeração e sorotipagem
de Salmonella — Parte 1: Método horizontal para detecção de Salmonella spp.

(SO 7218, Microbiologia de alimentos e rações para animais — Requisitos gerais e orientações para exames
microbiológicos

ISO 11133, Microbiologia de alimentos, ração animal e água — Preparação, produção, armazenamento e testes
de desempenho de meios de cultura

3 Termos e definições

Para os fins deste documento, aplicam-se os seguintes termos e definições.

3.1
Salmonela
bactérias gram-negativas, oxidase-negativas, facultativamente anaeróbicas, não formadoras de esporos, em
forma de bastonete, que geralmente formam colônias de 2 mm a 4 mm de diâmetro em meios seletivos sólidos e
apresentam características bioquímicas e sorológicas descritas quando os testes são realizados de acordo com
esta parte da ISO 6579

min.2a14..Allriehts reservados 1
ISO/TR6579-3:2014(E)

3.2
sorotipagem de Salmonella
determinação da presença ou ausência de antígenos O, antígenos H e antígenos Vi específicos em um isolado
confirmado como Salmonella (3.11

3.3
fórmula antigênica
combinação de números e letras representando os antígenos 0, H e Vi de um isolado confirmado como
Salmonella (3.1)

4 Princípio

Para a sorotipagem de Salmonella spp. os seguintes antígenos são determinados para isolados
bioquimicamente confirmados como Salmonella spp.:

Antígenos O, antígenos H e antígenos Vi.

OBSERVAÇÃO Procedimentos alternativos podem ser usados para confirmar que o isolado é Salmonella spp. desde
que a adequação
do procedimento alternativo é verificado (ver ISO 7218).

5 Meios de cultura e soros

5.1 Em geral

Para práticas laboratoriais atuais, aplique a ISO 7218.

Para testes de desempenho de mídia, siga as recomendações da ISO 11133.

5.2 Meios de cultura e reagentes

Ver Anexo A.

5.3 Antissoros

Os antissoros O, H e Vi estão disponíveis em vários fornecedores comerciais. Informações sobre antissoros

polivalentes e antissoros monovalentes relevantes podem ser encontradas no Anexo B.

6 Aparelho

Suprimentos descartáveis são uma alternativa aceitável aos artigos de vidro reutilizáveis, desde que tenham
especificações semelhantes.

Equipamentos usuais de laboratório microbiológico e, em particular, os seguintes.

6.1 Incubadora, para cultivo de isolados de Salmonella, capaz de operar na faixa de 34 °C a 3(1 °C.

NOTA Nesta parte da ISO 6579, a temperatura de incubação não é um parâmetro diferencial. Os isolados são
cultivados para obter material suficiente para realizar os testes em uma cultura pura. Portanto, a etapa de cultura é
realizada em uma temperatura ideal de crescimento. Para Salmonella, geralmente é uma temperatura entre 34 °C e
38 °C.

6.2 Estufa (para esterilização a seco) ou autoclave (para esterilização úmida). Veja ISO 7218.

6.3 Refrigerador (para armazenamento de meios preparados), capaz de operar a 5 °C ± 3 °C.

6.4 Lâminas de vidro.

© ISO 21)14 - Todos os direitos

reservados
ISO/TR6579-3:2014(E)

6.5 Instrumento de inoculação estéril, por exemplo, agulhas, fios, bastões de madeira, alças (por exemplo, de I
pl).

© ISO 21)14 - Todos os direitos

reservados
 ISO/TR6579-3:2014(E)

6.6 Tubos de ensaio e frascos estéreis, de capacidade apropriada. Podem ser utilizados frascos ou garrafas e
tubos de ensaio com tampas metálicas ou plásticas (de rosca) não tóxicas.

6.7 Placas de Petri estéreis, com diâmetros aproximados de 55 mm e 90 mm.

6.8 Banho-maria, capaz de operar a 47-50 °C.

6.9 Banho-maria (ou incubadora), capaz de operar a 50 °C ± 2 °C.

7 Amostra

É importante que o laboratório trabalhe com uma cultura pura que tenha sido bioquimicamente confirmada como
Salmonella spp.

8 Taxonomia da Salmonella

8.1 Em geral

Aproximadamente a cada 7 anos, o Centro Colaborador da OMS para Referência e Pesquisa sobre Salmonella
(Instituto Pasteur, Paris) publica uma atualização das "Fórmulas antigênicas dos sorovares de Salmonella", que
é a base para a atribuição de nomes e fórmulas de sorovares a isolados de Salmonella spp. No momento da
publicação, a versão mais recente do esquema White-Kauflmann-Le Minor é a de 2007 (Referência 9]).

NOTA: Os suplementos ao esquema White-Kauffmann-Le Minor são publicados em Research in Microbiology, uma
publicação do Institut Pasteur (anteriormente chamado Annales de rinstitut Pasteur/Microhtologie). Por exemplo, o
suplemento n.º 47 foi publicado em 2010 e caracteriza novos sorovares encontrados entre 2003 e 2007 (Referência
[10]).

Esta parte da ISO 6579 fornece orientação sobre a sorotipagem de sorovares de Salmonella.

8.2 Nomenclatura

Diferentes nomenclaturas foram usadas (ou ainda são usadas) para cepas de Salmonella:

— originalmente, Kauffmann (Referência [ 12]) considerou cada sorovar de Salmonella como uma espécie
separada;

— diferentes espécies-tipo foram utilizadas: S. enterica vs. S. cho/eraesuis, cada uma com uma cepa-tipo
diferente;

— algumas cepas "importantes" de Salmonella (como Salmonella Typhi e Salmonella Paratyphi) eram
consideradas espécies e não "apenas" sorovares de uma espécie.

A Comissão Judicial do Comitê Internacional de Sistemática de Procariotos indicou que muitos sinônimos
podem ser usados na nomenclatura de Salmonella (Referência [22]]. Nesta parte da ISO 6579, é usada a
nomenclatura atual amplamente aceita, que também é aprovada pelo Centro Colaborador da OMS para
Referência e Pesquisa sobre Salmonella (Referência [2]), a Sociedade Americana de Microbiologia (Referência
[20]), os Centros de Controle e Prevenção de Doenças (Referência [3] e o manual de Bergey (Referência [17]).
De acordo com a nomenclatura atual, o gênero Salmonella pertence à família das Enterobacteriaceae e é
composto por apenas duas espécies: 5. enterica e S. bongori, S. enterica é dividida em seis subespécies: S.
enterica subsp. enterica, S. enterica subsp. salamae, S. enterica subsp. arizonae, S. enterica subsp. diarizonae,
S. enterica subsp. houtenae e 5. enterica subsp. indica.

Os sorovares de Salmonella pertencentes a S. enterica subsp. enterica são isolados com mais frequência (mais
de 99,5% das cepas isoladas de Salmonella) e são designados por um nome, geralmente relacionado ao local
geográfico onde o sorovare foi isolado pela primeira vez. Os sorovares pertencentes a outras subespécies de 5.
enterica e aqueles de 5. bongori são designados por sua fórmula antigênica.

.-**1 direitos reservados 3

ISO/TR 6579-3:2014(E)

Devido a combinações de subespécies e muitos sorovares, os nomes completos são longos (por exemplo,
Salmonella enterica subsp. enterica sorovar Typhimurium). Portanto, geralmente é aceito usar uma forma mais
curta para indicar os nomes dos sorovares da subespécie enterica. O esquema White-Kauffmann-Le Minor
sugere os seguintes nomes abreviados: 5. entehcu sorovar Typhimurium ou Salmonella sen Typhimurium. De
acordo com a Referência [3], na primeira citação de um sorovar em um texto, o nome do gênero deve ser
fornecido seguido pela palavra "serovar" ou pelo termo abreviado "ser", e então o nome do sorovar.
Posteriormente, o nome pode ser escrito com o gênero seguido diretamente pelo nome do sorovar (por
exemplo, Salmonella Typhimurium). Essa maneira de indicar sorovares de Salmonella também é aceita na
maioria dos periódicos [por exemplo, periódicos da Sociedade Americana de Microbiologia (ASM)] e também é
usada nesta parte da ISO 6579.

Em resumo, a nomenclatura da Salmonella:

família: Enterobacteriaceae (primeira letra maiúscula, itálico)

gênero: Salmonella (primeira letra maiúscula, itálico)

espécie: enterica (sem maiúscula, em itálico)

subespécie: enterica (sem maiúscula, em itálico)

serovar (sorotipo ou sen): por exemplo Typhimurium (primeira letra maiúscula, não itálico)

subespécie: salamae
Arizona
diarizonae houtenae indica

espécie: bongori

No 47º Suplemento do esquema White-Kauffmann-Le Minor (Referência [10]) mais de 2600 sorovares de
Salmonella são mencionados e os números aumentam regularmente, conforme resumido na Tabela 1.

Tabela 1 — Número de sorovares de Salmonella ao longo dos anos

Suplemento
Espécies/subespécies 1998n 2001b 2007c
Número de sorovares
Salmonela entérica 2 443 2 502 2 587
subsp. entérica 1454 1 492 1 547
subsp. salamae 489 500 513
subsp. arizonae 94 95 100
subsp. diarizon ae 324 331 341
subsp. houtenae 7(1 71 73
subsp. indica 12 13 13
Salmonela bunfiori 20 21 23
Nº total de sorovares (gênero Salmonella) 2 463 2 523 2 610
um Referência [18].
b Referência [12].
*Barbatana de referência],abrangendo 2003-2007.

8.3 Características bioquímicas

As espécies e subespécies de Salmonella são identificadas com base em diferentes testes bioquímicos. Na
Tabela 2, as características diferenciais estão listadas. Ver Referência [9] e Anexo C para mais detalhes.

© ISO 2014 - Todos os direitos

reservados
 ISO/TR 6579-3:2014(E)

Tabela 2 — Características bioquímicas das espécies e subespécies de Salmonella {Referência [9])

Espécies S. entérica
S. Hongori
Subespécies entérica salamoe Arizona diarizonas houtenae indica
Dulcitol + + - - - e +
ONPGa (2 h) - - + + - e +
Ma lunato - + + + — — —

Gelatinase - 4- + + + + -
Sorbitol + + + 4- + - +
Crescimento com KCNb - - - - + - +
L(+)-tartratec + - - - - - -
Galactonato - + - + + + +
y-Glutamiltransferase +e + — + + + +
-Glucuronidase e e - + - e -
Mucato + ♦ - (70%) - 4- 4-
Salicina - — — - + - —
Lactose - - - (75 %) + (75 %)+ - e -
Lise pelo fago 01 ♦ + - + - ♦ e
+ = 90% ou mais de reação positiva
- = 90% ou mais de reação negativa
ci = reações diferentes dadas por diferentes sorovares
um o-Nitrofenil--p-galactopiranosídeo (teste para ({'galactosidase}.
b Cianeto de potássio.
c - D-Tartrato, Paratyphi B: Paratyphi B biovar Java: +
e = Typhimurium: d. Dublin:

8.4 Características antigênicas

8.4.1 Em geral

As características antigênicas importantes da Salmonella para testes sorológicos são divididas em três tipos
principais, sendo:

— o antígeno O, também chamado de antígeno somático;

— o antígeno H, também chamado de antígeno flagelar;

— o antígeno Vi, também chamado de antígeno capsular.

A fórmula antigênica da Salmonella spp. é constituída por três tipos de antígenos, relatados da seguinte forma:
Antígenos O, Antígeno Vi (se presente): Antígenos H da primeira fase: Antígenos H da segunda fase. Por
exemplo, a fórmula antigênica da Salmonella Paratyphi C é: 6,7,[Vi]:c:1,5; com antígenos O 0:6 e 0:7; com o
antígeno Vi, que pode estar presente ou ausente (indicado pelos colchetes); com antígeno H H:c para a primeira
fase; com antígenos H H:1 e H:5 para a segunda fase.

8.4.2 O antígeno O (antígeno somático)

Este antígeno consiste em um componente da parede celular e as principais substâncias são polissacarídeo,
proteína e fosfolipídio. O antígeno O é muito robusto e pode resistir a temperaturas de até 100 °C por 150 min,
tratamento com etanol de fração de volume de 95% ou ácido diluído (Referência [16]).

mm1en.n14.Al1 direitos reservados 5

ISO/TR6579-3:2014(E)

A reação do antígeno O com antissoros resulta em aglutinação granular. Historicamente, os antígenos O foram
classificados em grupos individuais de antígenos O no esquema de Kauffmann-White (Referência [9]). Os
grupos foram nomeados com letras romanas começando com o grupo A, que inclui o antígeno 0:2, até o grupo
Z, que contém o antígeno 0:50. Como havia mais antígenos O do que letras, os antígenos restantes não foram
dados como grupo, mas foram nomeados pelos antígenos O de 0:51 a 0:67. Atualmente, é preferível designar
cada grupo O usando o fator O característico. As letras foram mantidas e são mostradas entre colchetes, por
exemplo 0:4 (B) (Referência [9]). Na Tabela 3, as designações antigas e novas são resumidas.

Tabela 3 — Sorogrupos de Salmonella (antiga designação) e antígenos O relevantes (nova designação)

Grupo O-antígeno Grupo O-antígeno Grupo 0-antígeno
UM 2 Sol-Sol2 13 Pq 39
B 4 O 6,14 R 40
CiGC*)' 6,7 EU 16 S 41
C2, Ca 8 Eu 17 E 42
E 9 E 18 você 43
D2 9,46 eu 21 V 44
Ds 9,46,27 M 28 c 45

CE E2, E3)b 3,10 Não 30 X 47

E+ 1.3,19 0 35 E 48

F 11 P 38 Z então
* C foi mesclado com C1.
b E2 e E3 foram fundidos em E1.

8.4.3 O antígeno H (antígeno flagelar)

Este antígeno está localizado no flagelo e o principal componente é a proteína. É menos robusto que os
antígenos O. Pode ser facilmente decomposto por álcool, ácido e temperatura acima de 60 °C, mas é resistente
a uma solução de formalina com uma fração de volume de 0,5% (Referência [16]).

A reação do antígeno H com antissoros resulta em aglutinação flocular. Muitas espécies de Salmonella possuem
duas fases do antígeno H, mas variantes monofásicas e trifásicas também são conhecidas. A primeira fase é
chamada de fase específica e a segunda fase é chamada de fase não específica. A primeira fase é indicada por
uma letra minúscula, de a a z. Entretanto, desde a identificação do antígeno z, muitos novos antígenos H foram
detectados e são denominados 21, Z2, Z3 ... z9.

Exemplos de sorovares monofásicos são:

— Salmonella Paratyphi em 1,2,[Link][1,5]; com H:a para a primeira fase e onde os colchetes indicam que a
segunda fase (H:l,5) pode estar presente ou ausente;

— Salmonella Typhi: 9,12,[ViJ;d:-; com H:d para a primeira fase;

— Salmonella Derby: 1,4,[5],12:f,g:[1,2]; com H:f,g para a primeira fase e onde a segunda fase (H:l,2) pode
estar presente ou ausente;

— Salmonella Enteritidis: 19,12: g,m:-; com H:g,m para a primeira fase. Além dos fatores H:g,m, algumas
cepas podem ter o fator H:p, ou H:f, ou H:t. Cepas excepcionais podem ter o antígeno H:l,7 como segunda
fase;

— Salmonella Dublin: i,9,12,[Vi |:g,p:-; com H:g,p para a primeira fase.

NOTA I Os fatores o sublinhados são determinados pela conversão do fago. Eles só estão presentes se a
cultura for lisogenizada pelo fago conversor correspondente (Referência [9]).

© ISO 2014 - Todos os direitos

reservados
 ISO/TR6579-3:2014(E)

NOTA 2 Os fatores □ ou H indicados entre colchetes podem estar presentes ou ausentes, sem relação com o fago
conversão (Referência [2]}.

NOTA 3 As cepas difásicas de Salmonella Derby e Salmonella Enteritis são muito raras, sendo possível que seja
necessária a inversão de fase para detectar essas cepas raras. No entanto, isto só é necessário para certos casos
(especiais) [por exemplo, no caso de fontes divergentes e/ou no caso de casos (especiais) relacionados com viagens].

8.4.4 Vi-antígeno (antígeno capsular)

Este antígeno é um antígeno de superfície (capsular) e pode mascarar os antígenos O para que as bactérias
não sejam aglutinadas com os antissoros O. O principal componente do antígeno Vi é o polissacarídeo. As
cepas de Salmonella que possuem um antígeno Vi são mais virulentas do que as cepas sem antígeno Vi. O
antígeno Vi pode estar presente em apenas três sorovares de Salmonella:

— Salmonella Typhi: 9,12, Vi]:d:-;

— Salmonella Paratyphi C: 6,7,[Vi]:c:1,5;

— Salmonella Dublin: 19,12,[ViJ:g,p:-.

Os colchetes indicam que o antígeno Vi pode estar ausente do apresentador.

NOTA A presença de antígenos Vi em isolados de Salmonella de alimentos ou amostras veterinárias é muito rara. Se
Vi estiver presente, ele mascara a detecção de antígenos O. Para detectar os antígenos O, pode ser necessário
aquecer uma suspensão do isolado (por exemplo, em solução salina fisiológica) a 100 °C por 60 minutos ou a 120 °C
por 15 minutos.

9 Procedimento para sorotipagem de Salmonella

9.1 Em geral

Antes de iniciar a sorotipagem, é importante confirmar bioquimicamente que o isolado pertence ao gênero
Salmonella (conforme especificado na ISO 6579-1). Embora os antígenos H sejam específicos para Salmonella,
vários antígenos O são comuns em diferentes gêneros de Enterobacteriaceae (por exemplo, Salmonella,
Citrobacter, Hafnia).

NOTA Procedimentos alternativos podem ser usados para confirmar que o isolado pertence ao gênero Salmonella,
desde que a adequação do procedimento alternativo seja verificada (ver ISO 7218).

Cada fornecedor de antissoros produz seus próprios conjuntos de antissoros, com suas próprias instruções de
uso exclusivas. Portanto, não é possível fornecer aqui um conjunto geral de instruções para sorotipagem, pois é
sempre importante seguir as instruções do fornecedor para obter resultados ideais. Alguns fabricantes fornecem
pools de antissoros (misturas de vários antissoros O ou antissoros H), que são muito úteis no início da
sorotipagem de um tipo desconhecido. Quando a cepa se aglutina com um conjunto de antissoros, ela pode ser
testada posteriormente com antissoros de grupo e/ou antissoros de fator único relevantes para o soropositivo.
Quando o foco está na tipagem apenas de certos sorovares e é suficiente indicar os outros sorovares como
Salmonella spp., a aglutinação pode ser realizada imediatamente apenas com os antissoros monofatores
específicos dos sorovares relevantes.

No Anexo B, é fornecido o procedimento geral para sorotipagem de um isolado desconhecido de Salmonella.

9.2 Exemplo de procedimento para sorotipagem de cinco sorovares de Salmonella relacionados à saúde pública

9.2.1 Em geral
No exemplo a seguir, é descrito o procedimento para sorotipagem de cinco importantes sorovares de
Salmonella relacionados à saúde pública (ver Anexo l>). Na Tabela 4 essas cepas são mostradas com sua
fórmula antigênica.

Nas seções a seguir, é descrita a aglutinação em lâminas de isolados de Salmonella, que é o procedimento
mais frequentemente realizado. Entretanto, também existem outros métodos, como o método da microplaca (ver

[Link] direitos reservados 7

 ISO/TR6579-3:2014(E)

Anexo E).

[Link] direitos reservados 8

ISO/TR6579-3:2014(E)

Tabela 4 — Fórmula antigênica de cinco importantes sorovares de Salmonella relacionados à saúde pública
Antígenos H
Nome O-antígenosb
fase 1 fase II
Salmonela Typhimurium 14,(5] 12 eu 1.2
Salmonella Enteritidisa 1.9.12 g,m -
Salmonella em crianças é 6,7,14 r 1.5
Salmonela Virchow 6,7J4 r 1.2
Salmonela Hadar 6,8 z10 e,n,x
a Além de fatores algumas cepas podem ter fator H:p ou H:f ou Hit. Cepas excepcionais podem ter o antígeno
H:1.7 como
segunda fase (Referência [91).
h
Os fatores 0 sublinhados são determinados pela conversão do fago. Eles estão presentes somente se a cultura for lisogenizada
pelo fago conversor correspondente (Referência [2)).

9.2.2 Seleção de uma colônia suspeita de Salmonella

Cultive uma colônia a partir de uma cultura pura que seja suspeita de Salmonella de acordo com a
caracterização bioquímica. Utilize os meios de cultura e métodos conforme prescrito pelo fabricante dos
antissoros utilizados. Se nenhuma informação for fornecida, um meio de ágar não seletivo, como ágar nutriente
(por exemplo, veja A.2), pode ser usado. Incube a(s) placa(s) de ágar nutriente inoculada(s) entre 34 °C e 38 °C
(64) "durante a noite" (aproximadamente 18 h).

9.2.3 Investigação para autoaglutinação

Um exemplo do teste de autoaglutinação é descrito a seguir. Outros métodos também podem ser usados. Siga,
nesse aspecto, as instruções do fabricante.

— Adicione uma gota de solução salina (pode variar de 8,5 g/l NaCl a 35 g/1 NaCl, onde a maior concentração
pode ser mais sensível) em uma lâmina de vidro (6,4).

— Transfira uma pequena quantidade de cultura bacteriana (por exemplo, a quantidade que pode ser coletada
com uma alça descartável de 1 pl) para a lâmina de vidro e misture com a gota de solução salina.

— Incline suavemente o slide para frente e para trás. Dependendo do fabricante e/ou da concentração salina,
isso deve levar de 5 a 60 s.

— Avalie a suspensão. A presença de grânulos na suspensão indica autoaglutinação. Cepas com reação
positiva no teste de autoaglutinação são difíceis de investigar mais profundamente para sorotipagem. Para
cepas autoaglutinantes, não é possível testar os antígenos 0. No entanto, às vezes ainda pode ser possível
investigar os antígenos H.

Se uma cepa apresentar autoaglutinação, um ou ambos os procedimentos a seguir podem ser tentados na
mesma colônia e/ou em colônias adicionais.

— Suspenda a colônia em água estéril em vez de solução salina e siga o procedimento de autoaglutinação
conforme descrito acima.

— Cultive a cepa em um meio de cultura semissólido como o ágar Rappaport Vassiliadis (MSRV) semissólido
modificado (conforme especificado na ISO 6579-1) e use o material da colônia do ágar semissólido para
realizar o procedimento de autoaglutinação conforme descrito acima.

NOTA: As cepas autoaglutinantes também são chamadas de cepas "ásperas".

9.2.4 Aglutinação com O-antisoros

As instruções de uso dos antissoros podem variar de acordo com o fabricante. Portanto, é importante sempre
seguir as instruções do fabricante.

© ISO 2014 - Todos os direitos

reservados
 ISO/TR6579-3:2014(E)

A maioria dos fabricantes usa um método de aglutinação em lâminas para a detecção de antígenos O. Neste
método, □uma gota de antissoro é misturada com uma suspensão bacteriana (diretamente de uma placa, tubo
ou caldo) em uma lâmina. Incline suavemente o slide para frente e para trás. Em seguida, observe a lâmina para
aglutinação. A presença de grânulos indica uma reação positiva.

Para diferentes fabricantes, as seguintes variações no procedimento podem ser encontradas:

— o tamanho da gota no slide (por exemplo, 25 pl ou uma "gota");

— a forma como o antissoro e o material bacteriano são misturados na lâmina (material bacteriano diretamente
do ágar ou por meio de uma suspensão, antissoro diretamente na lâmina ou adicionado a uma suspensão
bacteriana);

— tempo de inclinação do slide para frente e para trás (pode variar de 5 s a 60 s);

— a forma de observação da aglutinação (aumento ou não, fundo escuro ou iluminação normal);

— interpretação dos resultados (leia as notas de rodapé com relação às limitações do procedimento).

9.2.5 Aglutinação com H-antisoros

Após a aglutinação com os antissoros O, realizar a aglutinação com os antissoros H. A salmonela geralmente
possui dois tipos de antígenos H (fase 1 e fase 2). Se uma fase H for considerada negativa para tensões
bifásicas, será necessário um método de inversão de fase. A fase H dominante é reprimida com um método de
inversão de fase. Ao reprimir a fase H dominante, a segunda fase H pode ser expressa e identificada.

Um método frequentemente usado para inversão de fase é o de Sven Gard, veja 9.2.7. Para isso, um antissoro
específico de inversão de fase é adicionado a um meio de ágar de enxameação e a cepa de Salmonella é
inoculada na placa. O meio de ágar deve ser suficientemente macio para que a Salmonella móvel possa
proliferar sobre ele. A concentração de ágar no meio pode variar de uma fração de massa de 0,5 % a 1%
(dependendo da força do gel do ágar). Exemplos de mídia de "enxame" são fornecidos em A3. Outros exemplos
de inversão de fase são fornecidos no Anexo F.

Para a investigação de aglutinação, siga as instruções do fabricante.

9.2.6 Testes de aglutinação para sorotipagem de cinco importantes sorovares de Salmonella relacionados à
saúde pública

[Link] Em geral

Para a detecção dos cinco sorovares de Salmonella mencionados na Tabela 4, são necessários os seguintes
antissoros O e H:

0:4,0:5, 0:6 (0:61 ou 0:6,7 ou 0:6,14,24), 0:7,0:8, 0:9 e 0:46.

H:i, H:2, H:G ou H:g (monovalente), H:m, H:q, H;s, H:t, H:r, H:5, H:z10 e H:x.

Para a sorotipagem das cepas de Salmonella na ordem mostrada na Tabela 4, siga o procedimento especificado
em [Link] a [Link] (veja também o esquema no Anexo D).

Para mais informações sobre testes sequenciais dos diferentes antissoros, consulte o Anexo B.

[Link] Se 0:4 for positivo

Aglutinar com 0:5. O resultado pode ser positivo ou negativo para Salmonella Typhimurium, ainda assim a
informação pode ser relevante para fins epidemiológicos.

Aglutinar com antissoros H:i e H:2 (pode ser necessária inversão de fase).

O sorovar da cepa é Typhimurium se ambas as reações forem positivas.

,F-.'CM em, *n y-jehLs reservado 9

ISO/TR6579-3:2014(E)

A aglutinação com 0:12 não é necessária para indicar que o isolado é Salmonella Typhimurium, pois a
positividade de 0:4 implica a presença de 0:12. Da mesma forma, a detecção do antígeno 11:1 não tem poder
discriminatório e não precisa ser testada adicionalmente.

[Link] Se 0:9 for positivo

Aglutinar com H:G[complexo) ou com antissoro H:g (anticorpo monovalente).

Se esta reação for positiva, aglutine posteriormente com antissoro H:m.

Se também for positivo, aglutine com antissoros H:q e H:s como controles negativos.

Se estas últimas reações forem negativas, aglutinar posteriormente com 0:46 e, se desejado, com 0:12. Se 0:46
for negativo (e 0:12 for positivo), o sorovar da cepa é Enteritidis.

NOTA Além dos fatores H:g,m, algumas cepas de Salmonella Enteritidis podem dar uma reação positiva com o
antissoro thp, ou H:f, ou H:t. No entanto, essas cepas são muito raras. Cepas excepcionais podem ter o antígeno
11:1.7 como segunda fase.

[Link] Se 0:7 for positivo

Aglutinar com antissoros H:r, H:2 e H:5 (pode ser necessária inversão de fase).

Se H:r e 11:2 forem positivos, o sorovar da cepa é: Virchow.

Se H: e H:5 forem positivos, o sorovar da cepa é: Infantis.

A detecção do antígeno H:1 não tem poder discriminatório e não precisa ser testada adicionalmente.

[Link] Se 0:8 for positivo

Aglutinar com antissoros H:z10 e H:x.

Se ambos forem positivos, aglutinar posteriormente com antissoro 0:61 ou 0:6,7 ou 0:6,14,24.

Se 0:6i ou 0:6.7 ou 0:6,14,24 for positivo, o sorovar da cepa é: Hadar.

Alguns lotes de antissoro 0:6,7 não reagem com cepas 0:6,8. Ao comprar este antissoro, certifique-se de que ele
também reage com cepas 0:6,8 (pergunte ao fabricante).

NOTA: A variação da forma colonial pode ocorrer com a expressão do antígeno 0:61 por alguns sorovares do
sorogrupo C2 (Referência [11)). Por esse motivo, nem sempre é possível indicar, por exemplo, Salmonella Hadar e
Salmonella Istanbul como sorovares distintos.

9.2.7 Exemplo de inversão de fase usando o método Sven Gard

O exemplo descrito aqui para inversão de fase é destinado à sorotipagem de Salmonella Typhimurium. Em
geral, o método também é aplicável a outros sorovares de Salmonella.

Quando 0:4 e H:i forem positivos, mas 11:2 for negativo, prepare uma placa de ágar enxame (veja A.3 ou Fl),
com anti-H:i (por exemplo, mistura de soro de inversão de fase contendo H:i). Inocule a cepa em um ponto no
centro da placa. Incubar a placa entre 34 °C e 38 °C (6,1) durante a noite (aproximadamente 18 h).

Após a incubação, aglutine novamente a cepa com antissoros H:2.

II H:2 é novamente negativo, posteriormente aglutina-se com H:i novamente.

Se H:i apresentar uma reação negativa ou fraca, a cepa não é Salmonella Typhimurium.

© ISO 2(114 - Todos os direitos

reservados
 ISO/TR6579-3:2014(E)

Se H:i der uma reação positiva (forte), repita a inversão de fase. Novamente, prepare uma placa de ágar com
anti-H:i e inocule esta placa com material bacteriano do ponto mais distante de propagação do crescimento
opaco da primeira placa de ágar de inversão de fase. Repita o procedimento de inversão de fase conforme
descrito acima.

NOTA 1 Às vezes é necessário adicionar mais antissoro H:i ao ágar de enxame (da placa de inversão de fase
revogada) para obter uma melhor reação,

NOTA 2 Também existem variantes monofásicas de Salmonella Typhimurium, por exemplo, sem ou não expressando
a segunda fase H:.,]::-. Durante a sorotipagem desta variante, a inversão de fase pode ser repetida uma ou mais
vezes, para excluir a presença da segunda fase. Alternativamente, um método molecular pode ser usado para
confirmar se a cepa é uma variante de Salmonella Typhimurium.

10 Controle de qualidade

Os soros usados para aglutinação devem ser claros (a menos que os antissoros sejam usados para testes de
látex). Sempre inspecione os soros antes de usar. Em caso de turbidez, siga as instruções do fabricante.

Os procedimentos possíveis para o controle de qualidade da sorotipagem são apresentados a seguir,

— São selecionadas duas tensões (ou o número de tensões que representa aproximadamente 2% da carga de
trabalho) do trabalho recebido por semana. Cada uma das cepas selecionadas é cultivada duas vezes. As
cepas duplicadas são então tratadas como dois novos isolados recebidos para sorotipagem. Após a
conclusão do trabalho, os resultados das duas linhagens e suas duplicatas são comparados para verificar
quaisquer discrepâncias. Se houver alguma discrepância, estas serão investigadas mais detalhadamente.

— O laboratório mantém sorovares de Salmonella totalmente caracterizados em estoque (por exemplo, de uma
coleção de culturas ou de estudos de comparação interlaboratoriais). Deste estoque, regularmente (por
exemplo, semanalmente) um ou dois sorovares dos 10 sorovares mais frequentemente identificados no
laboratório são selecionados para verificar o procedimento de sorotipagem. Os sorovares) usados para
realizar o controle de qualidade podem variar semanalmente para garantir que diferentes antissoros sejam
testados ao longo do tempo,

— É importante testar a capacidade da sorotipagem em comparação com outros laboratórios. Para isso, é
aconselhável participar regularmente de estudos de comparação interlaboratoriais, sempre que disponíveis.

11 Relatórios

Para isolados pertencentes a [Link], informe o nome (completo) e, sempre que

possível/necessário, também a fórmula antigênica. Para as outras (sub)espécies, relate a fórmula antigênica
conforme encontrada.

A notação da fórmula antigênica é a seguinte:

Antígenos O (separados por vírgulas), antígeno Vi (se presente): antígenos H da primeira fase (separados por
vírgulas): antígenos H da segunda fase (se presente; separados por vírgulas); antígenos H da terceira fase (se
presente).

Por exemplo, de acordo com o esquema White-Kauffmann-Le Minor (Referência [2]), a fórmula antigênica
completa de Salmonella Typhimurium é:1,4,[5],12:i:1,2.

Com antígenos O 0:1,4,[5],12; onde o fator 0 sublinhado é determinado pela conversão do fago e só está
presente se a cultura for lisogenizada pelo fago conversor correspondente e onde os colchetes indicam que o
fator pode estar presente ou ausente sem relação com a conversão do fago (Referência [9]); Com antígenos H
H:i para a primeira fase e H:1,2 para a segunda fase.

Para o relatório final, a fórmula antigênica de um isolado é preferencialmente fornecida sem colchetes ou
sublinhado. Relate a fórmula antigênica que foi determinada, por exemplo, 4,[Link],2.

Para outras subespécies de 5. enterica, a subespécie à qual o sorovar pertence é indicada pelo seguinte
símbolo (Referência [2]):

mienn1aan riehts reservado 11

 ISO/TR6579-3:2014(E)

II para sorovar de 5. enterica subsp. salamae;

mienn1aan riehts reservado 12

ISO/TR6579-3:2014(E)

Illa para sorovar de S. enterica subsp. arizonae;

lllb para sorovar de S. enterica subsp. diarizonae;

IV para sorovar de S. enterica subsp. houtenae;

VI para sorovar de S. enterica subsp. indica.

Um exemplo de relato para uma subespécie diferente de S. enterica subsp. enterica é: S. II 30:z10:e,n,x,z15.

© ISO 2014 - Todos os direitos

reservados
 ISO/TR 6579-3:2014(E)

Anexo A
(informativo)

Composição e preparação de meios de cultura e reagentes

Al Geral

Os meios de cultura descritos neste anexo estão relacionados a testes bioquímicos (ver Anexo. Cl- A
composição dos meios aqui descritos pode ser considerada como exemplo. Mídias com os mesmos nomes
podem ser descritas na literatura ou estar disponíveis comercialmente em composições ligeiramente diferentes.
Portanto, é importante que cada teste bioquímico verifique as reações do meio com cepas de controle positivo
e negativo bem caracterizadas.

IMPORTANTE — Se os meios ou reagentes forem preparados a partir de meios ou reagentes completos

desidratados, ou se forem utilizados meios e reagentes prontos para uso, siga as instruções do fabricante
quanto à preparação, condições de armazenamento, data de validade e uso.

Os prazos de validade dos meios indicados neste anexo foram demonstrados em alguns estudos. O usuário
deve verificar isso em suas próprias condições de armazenamento (consulte ISO 11133).

A.2 Ágar nutriente

A.2.1 Composição

Norma ISO/ TR6579-3 1

DOCUMENTO PROTEGIDO POR DIREITOS AUTORAIS 2
1 Escopo 1
2 Referências normativas 1
3 Termos e definições 1
4 Princípio 8
5 Meios de cultura e soros 8
5.1 Em geral 8
5.2 Meios de cultura e reagentes 8
5.3 Antissoros 8
6 Aparelho 8
7 Amostra 3
8 Taxonomia da Salmonella 3
8.1 Em geral 3
8.2 Nomenclatura 3
8.3 Características bioquímicas 5
8.4 Características antigênicas 6
9 Procedimento para sorotipagem de Salmonella 7
9.1 Em geral 7

[Link] riehts reservado 13

 ISO/TR 6579-3:2014(E)

9.2 Exemplo de procedimento para sorotipagem de cinco sorovares de Salmonella relacionados

à saúde pública 8
9.2.1 Em geral 8
10 Controle de qualidade 11
11 Relatórios 11
Anexo A (informativo) 13
Al Geral 13
A.2 Ágar nutriente 13
A.2.1 Composição 13
A.2.2 Preparação 15
A.3 Meio de ágar enxame — Sven Gard (exemplos) 20
A.3.1 Exemplo 1 (Referência (161) 20
A.3.2 Exemplo 2 20
A.6.2 Solução de fosfato monossódico (1,0 mol/l) 17
A.7 Caldo D-Tartrato (tartarato de ácido orgânico) 17
A.7.1 Composição 17
A.7.2 Preparação 17
AB Solução de acetato de chumbo 17
A.8.1 Composição 17
A.8.2 Preparação 17
A.9 Caldo de infusão cérebro-coração (BH1) 24
A.9.1 Composição 24
A,9,2 Preparação 24
A. 10 Solução salina formal (fração de volume de 1%) 24
A.10.1 Composição 24
A. 10.2 Preparação 24
A. 11 tubos Craigie 24
A.11.1 Composição 24
A.11.2 Preparação 25
A.12 Gelatina nutritiva 25
A.12.1 Composição 25
A.12.2 Preparação 25
Anexo B (informativo) 26
Anexo C (informativo} 30
C.1 Distinção entre subespécies de Salmonella 30
C.1.1 Geral 30
C.1.2 Teste de malonato 30

[Link] riehts reservado 14

 ISO/TR 6579-3:2014(E)

C.1.3 Teste de dulcitol 30

C.1.4 Teste ON PG 30
C.1.5 Teste de gelatinase 30
C.2 Distinção entre Salmonella Paratyphi B e Salmonella Paratyphi B bio- var Java 25
Anexo D (informativo) 32
Anexo E (informativo) 27
E.3 Placa de microtitulação 2 para antígenos O 34
E.4 Placa de microtitulação para antígenos H 34
Anexo F (informativo) 29
Método simplificado de Sven Gard 29
F.2 Método do tubo de Craigie 29
F.2.1 Geral 29
F.2.2 Preparação do tubo Craigie para inversão de fase 29
F.2.3 Procedimento para inversão de fase usando um tubo Craigie 29
F.3 Método da ponte de papel 36
ICS 07.100.30 40

(opcional)

Ágar 9g a 18gb
Água 1 000 ml

a Por exemplo, digestão enzimática de caseína.

I1
Dependendo da força do gel do ágar.

A.2.2 Preparação

Dissolva os componentes na água aquecendo.

Ajustar o pH, se necessário, para que após a esterilização corresponda a 7,0 ± 0,2 a 25 °C.

Transferir o meio de cultura para frascos (6.6) de capacidade apropriada.

Esterilizar em autoclave (6,2) mantida a 121 °C por 15 min.

Transferir aproximadamente 20 ml do meio fundido para placas de Petri estéreis com diâmetro de 90 mm (6,7).
Deixe solidificar.

Armazene as placas vazadas (de cabeça para baixo), protegidas para dessecação e no escuro, a 5 °C (6,3) por
até 2 meses.

[Link] riehts reservado 15

ISO/TR 6579-3:2014(E)

Se necessário, seque as placas antes de usar.

A.3 Meio de ágar enxame — Sven Gard (exemplos)

A.3.1 Exemplo 1 (Referência (161)

Utilização de ágar nutriente com concentração de ágar alterada

É necessário determinar a concentração do ágar nutriente destinado à inversão da fase H em uma placa de
Petri. Pode variar de uma fração de massa de 0,5% a 1% dependendo do lote de ágar utilizado. O meio de
ágar deve ser suficientemente macio para que uma Salmonella móvel inoculada pontualmente possa proliferar
sobre o meio após incubação durante a noite entre 34 °C e 38 °C (6.1). Portanto, são necessários ensaios
preliminares, sem adição de antissoro, utilizando ágar nutriente (pH 7,4) preparado para esse fim ou ágar
nutriente comum de laboratório tornado semissólido pela adição de caldo em uma proporção que permita a
enxameação durante a noite. O volume necessário para uma placa de Petri de 10 cm é de 30 ml.

A enxameação na superfície é mais fácil se desoxicolato de sódio (0,3 g/l) for adicionado ao meio (o
desoxicolato de sódio estimula a enxameação), veja A.3.2.

A.3.2 Exemplo 2

A.3.2.1 Composição

Norma ISO/ TR6579-3 1

DOCUMENTO PROTEGIDO POR DIREITOS AUTORAIS 2
1 Escopo 1
2 Referências normativas 1
3 Termos e definições 1
4 Princípio 8
5 Meios de cultura e soros 8
5.1 Em geral 8
5.2 Meios de cultura e reagentes 8
5.3 Antissoros 8
6 Aparelho 8
7 Amostra 3
8 Taxonomia da Salmonella 3
8.1 Em geral 3
8.2 Nomenclatura 3
8.3 Características bioquímicas 5
8.4 Características antigênicas 6
9 Procedimento para sorotipagem de Salmonella 7
9.1 Em geral 7
9.2 Exemplo de procedimento para sorotipagem de cinco sorovares de Salmonella relacionados
à saúde pública 8
9.2.1 Em geral 8

© ISO 2014 - Todos os direitos

reservados
ISO/TR 6579-3:2014(E)

10 Controle de qualidade 11
11 Relatórios 11
Anexo A (informativo) 13
Al Geral 13
A.2 Ágar nutriente 13
A.2.1 Composição 13
A.2.2 Preparação 15
A.3 Meio de ágar enxame — Sven Gard (exemplos) 20
A.3.1 Exemplo 1 (Referência (161) 20
A.3.2 Exemplo 2 20
A.6.2 Solução de fosfato monossódico (1,0 mol/l) 17
A.7 Caldo D-Tartrato (tartarato de ácido orgânico) 17
A.7.1 Composição 17
A.7.2 Preparação 17
AB Solução de acetato de chumbo 17
A.8.1 Composição 17
A.8.2 Preparação 17
A.9 Caldo de infusão cérebro-coração (BH1) 24
A.9.1 Composição 24
A,9,2 Preparação 24
A. 10 Solução salina formal (fração de volume de 1%) 24
A.10.1 Composição 24
A. 10.2 Preparação 24
A. 11 tubos Craigie 24
A.11.1 Composição 24
A.11.2 Preparação 25
A.12 Gelatina nutritiva 25
A.12.1 Composição 25
A.12.2 Preparação 25
Anexo B (informativo) 26
Anexo C (informativo} 30
C.1 Distinção entre subespécies de Salmonella 30
C.1.1 Geral 30
C.1.2 Teste de malonato 30
C.1.3 Teste de dulcitol 30
C.1.4 Teste ON PG 30
C.1.5 Teste de gelatinase 30

© ISO 2014 - Todos os direitos

reservados
ISO/TR 6579-3:2014(E)

C.2 Distinção entre Salmonella Paratyphi B e Salmonella Paratyphi B bio- var Java 25
Anexo D (informativo) 32
Anexo E (informativo) 27
E.3 Placa de microtitulação 2 para antígenos O 34
E.4 Placa de microtitulação para antígenos H 34
Anexo F (informativo) 29
Método simplificado de Sven Gard 29
F.2 Método do tubo de Craigie 29
F.2.1 Geral 29
F.2.2 Preparação do tubo Craigie para inversão de fase 29
F.2.3 Procedimento para inversão de fase usando um tubo Craigie 29
F.3 Método da ponte de papel 36
ICS 07.100.30 40

Ágar 5gto9ga

Água 1 000 ml

— Dependendo da força do gel do ágar. Pode ser necessário determinar experimentalmente a concentração de ágar
necessário para a proliferação ideal de Salmonella.

A.3.2.2 Preparação

Dissolva os componentes na água aquecendo, se necessário.

Ajustar o pH, se necessário, para que após a esterilização corresponda a 7,6 ± 0,2 a 25 °C.

Transferir o meio de cultura para frascos (6.6) de capacidade apropriada.

Esterilizar em autoclave (6.2) mantida a 110 °C por 20 min.

Resfrie o ágar a 47 °C a 50 °C (6.8) ou armazene em frascos fechados a 5 °C (6.3) por até 2 meses.

Imediatamente antes do uso:

— adicione uma gota de um antissoro relevante (SGI para SG6) ao meio fundido e misture cuidadosamente;

— despeje aproximadamente 10 ml em placas de Petri com diâmetro de 55 mm (6,7), ou despeje

aproximadamente 20 ml em placas de Petri com diâmetro de 90 mm.

© ISO 2014 - Todos os direitos

reservados
 ISO/TR 6579-3:2014(E)

A.4 Caldo de malonato

A.4.1 Composição (Referência [14])

Norma ISO/ TR6579-3 1

DOCUMENTO PROTEGIDO POR DIREITOS AUTORAIS 2
1 Escopo 1
2 Referências normativas 1
3 Termos e definições 1
4 Princípio 8
5 Meios de cultura e soros 8
5.1 Em geral 8
5.2 Meios de cultura e reagentes 8
5.3 Antissoros 8
6 Aparelho 8
7 Amostra 3
8 Taxonomia da Salmonella 3
8.1 Em geral 3
8.2 Nomenclatura 3
8.3 Características bioquímicas 5
8.4 Características antigênicas 6
9 Procedimento para sorotipagem de Salmonella 7
9.1 Em geral 7
9.2 Exemplo de procedimento para sorotipagem de cinco sorovares de Salmonella relacionados
à saúde pública 8
9.2.1 Em geral 8
10 Controle de qualidade 11
11 Relatórios 11
Anexo A (informativo) 13
Al Geral 13
A.2 Ágar nutriente 13
A.2.1 Composição 13
A.2.2 Preparação 15
A.3 Meio de ágar enxame — Sven Gard (exemplos) 20
A.3.1 Exemplo 1 (Referência (161) 20
A.3.2 Exemplo 2 20
A.6.2 Solução de fosfato monossódico (1,0 mol/l) 17
A.7 Caldo D-Tartrato (tartarato de ácido orgânico) 17
A.7.1 Composição 17

_mienA14.A1 direitos reservados 15

 ISO/TR 6579-3:2014(E)

A.7.2 Preparação 17
AB Solução de acetato de chumbo 17
A.8.1 Composição 17
A.8.2 Preparação 17
A.9 Caldo de infusão cérebro-coração (BH1) 24
A.9.1 Composição 24
A,9,2 Preparação 24
A. 10 Solução salina formal (fração de volume de 1%) 24
A.10.1 Composição 24
A. 10.2 Preparação 24
A. 11 tubos Craigie 24
A.11.1 Composição 24
A.11.2 Preparação 25
A.12 Gelatina nutritiva 25
A.12.1 Composição 25
A.12.2 Preparação 25
Anexo B (informativo) 26
Anexo C (informativo} 30
C.1 Distinção entre subespécies de Salmonella 30
C.1.1 Geral 30
C.1.2 Teste de malonato 30
C.1.3 Teste de dulcitol 30
C.1.4 Teste ON PG 30
C.1.5 Teste de gelatinase 30
C.2 Distinção entre Salmonella Paratyphi B e Salmonella Paratyphi B bio- var Java 25
Anexo D (informativo) 32
Anexo E (informativo) 27
E.3 Placa de microtitulação 2 para antígenos O 34
E.4 Placa de microtitulação para antígenos H 34
Anexo F (informativo) 29
Método simplificado de Sven Gard 29
F.2 Método do tubo de Craigie 29
F.2.1 Geral 29
F.2.2 Preparação do tubo Craigie para inversão de fase 29
F.2.3 Procedimento para inversão de fase usando um tubo Craigie 29
F.3 Método da ponte de papel 36
ICS 07.100.30 40

_mienA14.A1 direitos reservados 16

 ISO/TR 6579-3:2014(E)

Água 1 000 ml

A.4.2 Preparação

Dissolva os componentes na água aquecendo, se necessário.

Ajuste o pH, se necessário, para que após a esterilização seja 6,7 ± 0,2 a 25 °C.

Transfira o meio de cultura em volumes de 5 ml para tubos que permitam oxigênio suficiente para a reação do
malonato. Por exemplo, use tubos com tamanhos aproximados de 22 mm x 220 mm.

Esterilizar em autoclave (6.21 mantida a 121 °C por 15 min.

Conservar no escuro a 5 °C (6,3) até 2 meses.

A.5 Caldo de dulcitol (Referência [7])

ASL Médio completo

A.5.1.1 Composição

Norma ISO/ TR6579-3 1

DOCUMENTO PROTEGIDO POR DIREITOS AUTORAIS 2
1 Escopo 1
2 Referências normativas 1
3 Termos e definições 1
4 Princípio 8
5 Meios de cultura e soros 8
5.1 Em geral 8
5.2 Meios de cultura e reagentes 8
5.3 Antissoros 8
6 Aparelho 8
7 Amostra 3
8 Taxonomia da Salmonella 3
8.1 Em geral 3
8.2 Nomenclatura 3
8.3 Características bioquímicas 5
8.4 Características antigênicas 6
9 Procedimento para sorotipagem de Salmonella 7
9.1 Em geral 7
9.2 Exemplo de procedimento para sorotipagem de cinco sorovares de Salmonella relacionados
à saúde pública 8
9.2.1 Em geral 8
10 Controle de qualidade 11

_mienA14.A1 direitos reservados 17

 ISO/TR 6579-3:2014(E)

11 Relatórios 11
Anexo A (informativo) 13
Al Geral 13
A.2 Ágar nutriente 13
A.2.1 Composição 13
A.2.2 Preparação 15
A.3 Meio de ágar enxame — Sven Gard (exemplos) 20
A.3.1 Exemplo 1 (Referência (161) 20
A.3.2 Exemplo 2 20
A.6.2 Solução de fosfato monossódico (1,0 mol/l) 17
A.7 Caldo D-Tartrato (tartarato de ácido orgânico) 17
A.7.1 Composição 17
A.7.2 Preparação 17
AB Solução de acetato de chumbo 17
A.8.1 Composição 17
A.8.2 Preparação 17
A.9 Caldo de infusão cérebro-coração (BH1) 24
A.9.1 Composição 24
A,9,2 Preparação 24
A. 10 Solução salina formal (fração de volume de 1%) 24
A.10.1 Composição 24
A. 10.2 Preparação 24
A. 11 tubos Craigie 24
A.11.1 Composição 24
A.11.2 Preparação 25
A.12 Gelatina nutritiva 25
A.12.1 Composição 25
A.12.2 Preparação 25
Anexo B (informativo) 26
Anexo C (informativo} 30
C.1 Distinção entre subespécies de Salmonella 30
C.1.1 Geral 30
C.1.2 Teste de malonato 30
C.1.3 Teste de dulcitol 30
C.1.4 Teste ON PG 30
C.1.5 Teste de gelatinase 30
C.2 Distinção entre Salmonella Paratyphi B e Salmonella Paratyphi B bio- var Java 25

_mienA14.A1 direitos reservados 18

 ISO/TR 6579-3:2014(E)

Anexo D (informativo) 32
Anexo E (informativo) 27
E.3 Placa de microtitulação 2 para antígenos O 34
E.4 Placa de microtitulação para antígenos H 34
Anexo F (informativo) 29
Método simplificado de Sven Gard 29
F.2 Método do tubo de Craigie 29
F.2.1 Geral 29
F.2.2 Preparação do tubo Craigie para inversão de fase 29
F.2.3 Procedimento para inversão de fase usando um tubo Craigie 29
F.3 Método da ponte de papel 36
ICS 07.100.30 40

Água 1 000 ml

um Por exemplo, digestão enzimática de caseína.

A.5.1.2 Preparação

Dissolva os componentes na água.

Ajustar o pH, se necessário, para que após a esterilização corresponda a 7,0 ± 0,2 a 25 °C.

Transferir o meio de cultura em volumes de 5 ml para tubos com capacidade nominal de 15 ml.

_mienA14.A1 direitos reservados 19

ISO/TR6579-3:2014(E)

Esterilizar em autoclave (6.21 mantida a 121 °C por 15 min.

Conservar no escuro a S °C [6,31 por até 2 meses.

A.5.2 Indicador de Andrade

A.5.2.1 Composição (segundo Andrade-Penny, 1895; citado na Referência [Z))

Fucsina ácida 0,5 g

Hidróxido de sódio (1,0 mol/I) 0,5 g

Água 100 ml

A.5.2.2 Preparação

Dissolva a fucsina no waler e adicione o hidróxido de sódio. Se, após várias horas, a fucsina não estiver
suficientemente descolorida, adicione mais 1 ml ou 2 ml de hidróxido de sódio. O reagente melhora um pouco
com o envelhecimento e deve ser preparado em quantidade suficientemente grande para durar vários anos.

A.5.3 Solução de dulcitol

A.5.3.1 Composição

Dulcitol 10 g

Água 100 ml

A.5.3.2 Preparação

Dissolva o dulcitol na água.

Esterilizar por filtração através de um filtro de membrana com poro de 0,22 µm.

Armazenar a 5 °C (6-3) por até 2 meses.

A.6 Solução ONPG (0,013 3 mol/I) (Referência [2])

A.6.1 Meio completo

A.6.1.1 Composição

Norma ISO/ TR6579-3 1

DOCUMENTO PROTEGIDO POR DIREITOS AUTORAIS 2
1 Escopo 1
2 Referências normativas 1
3 Termos e definições 1
4 Princípio 8
5 Meios de cultura e soros 8
5.1 Em geral 8
5.2 Meios de cultura e reagentes 8
5.3 Antissoros 8
6 Aparelho 8

© ISO 2014 - Todos os direitos

reservados
ISO/TR6579-3:2014(E)

7 Amostra 3
8 Taxonomia da Salmonella 3
8.1 Em geral 3
8.2 Nomenclatura 3
8.3 Características bioquímicas 5
8.4 Características antigênicas 6
9 Procedimento para sorotipagem de Salmonella 7
9.1 Em geral 7
9.2 Exemplo de procedimento para sorotipagem de cinco sorovares de Salmonella relacionados
à saúde pública 8
9.2.1 Em geral 8
10 Controle de qualidade 11
11 Relatórios 11
Anexo A (informativo) 13
Al Geral 13
A.2 Ágar nutriente 13
A.2.1 Composição 13
A.2.2 Preparação 15
A.3 Meio de ágar enxame — Sven Gard (exemplos) 20
A.3.1 Exemplo 1 (Referência (161) 20
A.3.2 Exemplo 2 20
A.6.2 Solução de fosfato monossódico (1,0 mol/l) 17
A.7 Caldo D-Tartrato (tartarato de ácido orgânico) 17
A.7.1 Composição 17
A.7.2 Preparação 17
AB Solução de acetato de chumbo 17
A.8.1 Composição 17
A.8.2 Preparação 17
A.9 Caldo de infusão cérebro-coração (BH1) 24
A.9.1 Composição 24
A,9,2 Preparação 24
A. 10 Solução salina formal (fração de volume de 1%) 24
A.10.1 Composição 24
A. 10.2 Preparação 24
A. 11 tubos Craigie 24
A.11.1 Composição 24
A.11.2 Preparação 25

© ISO 2014 - Todos os direitos

reservados
ISO/TR6579-3:2014(E)

A.12 Gelatina nutritiva 25

A.12.1 Composição 25
A.12.2 Preparação 25
Anexo B (informativo) 26
Anexo C (informativo} 30
C.1 Distinção entre subespécies de Salmonella 30
C.1.1 Geral 30
C.1.2 Teste de malonato 30
C.1.3 Teste de dulcitol 30
C.1.4 Teste ON PG 30
C.1.5 Teste de gelatinase 30
C.2 Distinção entre Salmonella Paratyphi B e Salmonella Paratyphi B bio- var Java 25
Anexo D (informativo) 32
Anexo E (informativo) 27
E.3 Placa de microtitulação 2 para antígenos O 34
E.4 Placa de microtitulação para antígenos H 34
Anexo F (informativo) 29
Método simplificado de Sven Gard 29
F.2 Método do tubo de Craigie 29
F.2.1 Geral 29
F.2.2 Preparação do tubo Craigie para inversão de fase 29
F.2.3 Procedimento para inversão de fase usando um tubo Craigie 29
F.3 Método da ponte de papel 36
ICS 07.100.30 40

A.6.1.2 Preparação

Dissolva o ONPG na água a aproximadamente 37 °C. Adicione a solução de NaH2PO4 1,0 mol/I (A.6.2.1). A
solução deve ser incolor. Armazene o íon da solução a 5 °C (6,3).

Antes de usar, aqueça uma porção apropriada (suficiente para o número de testes) da solução ONPG a
aproximadamente 37 °C.

© ISO 2014 - Todos os direitos

reservados
 ISO/TR 6579-3:2014(E)

A.6.2 Solução de fosfato monossódico (1,0 mol/l)

A.6.2.1 Composição

NaH2PO4H2O 6,9 g

Solução de NaOH, 300 g/l 3 ml

Água 45 ml

A.6.2.2 Preparação

Dissolva o NaH2PO4H20 na água. Adicionar 300 g/1 de solução de NaOH e ajustar para pH 7,0 ± 0,2 (a 25
°C).
Completar o volume com água para 50 ml e armazenar a solução a 5 °C (6.3) por até 2 meses.

A.7 Caldo D-Tartrato (tartarato de ácido orgânico)

A.7.1 Composição

Peptona3 10,0 g

Tartarato de potássio e sódio (+) 10,0 g

10 g/l Azul de bromotimol aquoso 2,4 ml

Água 1 000 ml
a Por exemplo, digestão enzimática de caseína.

A.7.2 Preparação

Dissolva os componentes na água aquecendo, se necessário.

Ajustar o pH, se necessário, para que após a esterilização corresponda a 7,4 ± 0,2 a 25 °C.

Transferir o meio de cultura em volumes de 5 ml para tubos com capacidade nominal de 15 ml.

Esterilizar em autoclave (6.2) mantida a 115 °C por 10 min.

Conservar no escuro a 5 °C (6,3) por até 2 meses.

AB Solução de acetato de chumbo

A.8.1 Composição

Acetato de chumbo Aprox. 50 g

Água 10 ml

A.8.2 Preparação

Adicione a água a uma garrafa adequada com tampa de rosca. Adicione acetato de chumbo suficiente para
formar uma solução saturada (ou seja, o acetato de chumbo não dissolvido fica aparente no fundo do frasco).

Armazene em temperatura ambiente por até 6 meses.

[Link] riehts reservado 17

ISO/TR6579-3:2014(E)

A.9 Caldo de infusão cérebro-coração (BH1)

A.9.1 Composição

Sólidos Brain inFusion 12,5g

Infusão de sólidos de coração de boi 5,0

g

Proteose peptona 10,0

g

Glicose 2,0
g

Cloreto de sódio 5,0

g

Fosfato dissódico 2,5

g
Dissolva
Água os componentes na água aquecendo, seml
1 000 necessário.

Ajustar o pH, se necessário, para que após a esterilização corresponda a 7,4 ± 0,2 a 25 °C.
A,9,2 Preparação
Transferir o meio de cultura em volumes de 5 ml para tubos com capacidade nominal de 15 ml.

Esterilizar em autoclave (6.2) mantida a 121 °C por 15 min.

Armazenar no escuro a 5 °C (6,3) por até 2 meses.

A. 10 Solução salina formal (fração de volume de 1%)

A.10.1 Composição

Solução de formaldeído, 370 g/l 40,0 ml

Solução de cloreto de sódio 170 g/l 200 ml

Água Até 4 000 ml

A. 10.2 Preparação

Adicione a solução de formaldeído à solução de cloreto de sódio. Complete o volume total com água até 4 1.

A. 11 tubos Craigie

A.11.1 Composição

Caldo de nutrientes3 25,0 g

Ágar 2,75 g
Água 1.000
milhas
a Para ingredientes, veja A,2 (sem ágar].

1 Cl ©1502014-Todos os direitos reservados

 ISO/TR6579-3:2014(E)

A.11.2 Preparação

Dissolva os componentes na água aquecendo.

Ajuste o pH, se necessário, para que após a esterilização corresponda a 7,2 ± 0,2 a 25 °C.

Transfira o meio de cultura em volumes de 5 ml para tubos ou frascos largos com tampa de rosca, com
capacidade nominal de aproximadamente 15 ml e contendo tubos Craigie (tubos curtos e estreitos, abertos em
ambas as extremidades). O tubo Craigie deve se estender acima da superfície do ágar.

Esterilizar em autoclave (6.2) mantida a 115 °C por 10 min.

Armazene em temperatura ambiente por até 2 meses.

A.12 Gelatina nutritiva

A.12.1 Composição

Extrato de carne 3,0 g

Peptona3 5,0 g
Gelatina 120,0 g
Água 1 000 ml
* Por exemplo, digestão enzimática de caseína.

A.12.2 Preparação

Dissolva os componentes na água aquecendo.

Ajustar o pH, se necessário, para que após a esterilização corresponda a 6,8 ± 0,2 a 25 °C.

Transferir o meio de cultura em volumes de 5 ml para tubos com capacidade nominal de 15 ml.

Esterilizar em autoclave (6.2) mantida a 121 °C por 15 min.

Deixe o meio esfriar na posição vertical e armazene a 5 °C (6,3) por até 2 meses.

_ *11 rictus reservado

ISO/TR6579-3:2014(E)

Anexo B
(informativo)

Exemplos de procedimentos para sorotipagem de uma Salmonella

desconhecida
isolar

Na Figura Bl, estão indicadas as etapas a serem seguidas antes da sorotipagem de isolados de Salmonella.
Para sugestões sobre como tratar cepas autoaglutinantes (cepas ásperas), consulte 9.2.3.

Exemplos de procedimentos que podem ser usados para sorotipagem de um isolado desconhecido de
Salmonella estão resumidos na Tabela B1 e na Figura B.2. Na Tabela B.2 são fornecidas informações sobre a
possível composição de antissoros polivalentes (que podem diferir de acordo com o fornecedor). A Figura B.2
e a Tabela B.2 são derivadas da Referência [6].

Figura Bl — Passos a serem tomados antes da sorotipagem de Salmonella spp.

não © ISO 2014 - Todos os direitos reservados

 ISO/TR6579-3:2014(E)

Tabela B.1 — Procedimento possível para sorotipagem de isolados desconhecidos de Salmonella por
aglutinação com
antissoros polivalentes OMA e OMB
1.1 OMA 1.2 0MB
Passo 1 Utilização de antissoros
se positivo: Passo 2,1,1 se positivo: Etapa 2.2,1 se
Análise do antígeno polivalentes
O se negativo: vá para 1.2 negativo: veja nota de rodapé a
2.1.1 0:4,5
se positivo: passo 3.1.1 se
negativo: passo 2.1.2
2.2.1 0:6,7,8 ou grupo C
2.1.2 0:9 ou grupo D
se positivo: passo 3.2.1 se
Utilização de antissoros se positivo: Etapa 3.1.2
negativo: passo 2.2.2
Etapa 2 Análise do específicos de grupo — se negativo: Etapa 2.1.3
atribuição de um 2.2.2 0:13,22,23 ou 0:13
antígeno O
isolado a um serogrupo 2.1.3 0:3,10,15 ou grupo E
se positivo: passo 3.2.2 se
b se positivo: passo 3.1.3 se
negativo; passo 2,2.3
negativo: passo 2.1.4 2.2.3 0:11
2.1.4 0:21 ou grupo!,
se negativo; passo 2.1.5
2.1.5 0:1,2 ou grupo A
3.1.1 Isolado do grupo B:
3.2.1 Isolado do grupo C:
0:5, 0:27
0:7 para o grupo Ci
Uso de antissoros 3.1.2 Isolado do grupo D:
Passo 3 0:8, 0:6], 0:20 para grupo
monovalentes — - 0:46 para o grupo D2
identificação de C2-3
Análise do antígeno 0:27 para o grupo D3
O antígenos O 0:14,0:24. 0:25 para o grupo II
específicos de sorovar 3.1.3 Isolado do grupo E:
3.2.2 Isolado do grupo G
0:10,0:15,0:34 para o grupo E, 0:19
0:22,0:23
para o grupo E4

Uso de antissoros
polivalentes Poly 11 (fase 1 e 2) Poly H (fase 2)
11:1(1,2)->(H:2,H:5,H:6,H:7)d
H:a,H:b, H:c, H:d,
H:E-(H:h,H:n,H:x,H:215)d
Passo 4
H:G(g,m) - [H:f, H:g, U:m; H:p, H:q H:s, H:t, H:u) d H:i, H:k,
Análise de antígeno
flagelar Uso de antissoros H:L - (H:v, H:w, H:1,213, H:1,z28) d
monovalentes
H:y, H:z,
H:Z4 - (H:z23. H:z24, H:232) e
H:z6, H:z10, H:z29, H:z35, etc.

um No caso de uma reação negativa com ambos os antissoros polivalentes, testar o isolado com outros antissoros polivalentes
ou específicos do grupo.
antissoros que permitam a identificação até o grupo 0:67, ou enviar o isolado para um laboratório de referência.
b 1 etapa final I antissoros polivalentes de outra composição de anticorpos diferente de OMA e OMB são usados, os antissoros
específicos do grupo na etapa 2 devem ser adaptados correspondentemente.
e É possível omitir o uso de antissoros polivalentes do antígeno H e escolher antissoros monovalentes correspondentes à
incidência do isolamento de sorovares do sorogrupo estimado.

<F . "MINHAS riquezas reservadas

 ISO/TR6579-3:2014(E)

<1 Os antissoros dentro dos braquetes são necessários para identificar os antígenos do complexo H-antígeno correspondente.

<F . "MINHAS riquezas reservadas

ISO/TR 6579-3:2014(E)

OMB

Norma ISO/ TR6579-3 1

DOCUMENTO PROTEGIDO POR DIREITOS AUTORAIS 2
1 Escopo 1
2 Referências normativas 1
3 Termos e definições 1
4 Princípio 8
5 Meios de cultura e soros 8
5.1 Em geral 8
5.2 Meios de cultura e reagentes 8
5.3 Antissoros 8
6 Aparelho 8
7 Amostra 3
8 Taxonomia da Salmonella 3
8.1 Em geral 3
8.2 Nomenclatura 3
8.3 Características bioquímicas 5
8.4 Características antigênicas 6
9 Procedimento para sorotipagem de Salmonella 7
9.1 Em geral 7
9.2 Exemplo de procedimento para sorotipagem de cinco sorovares de Salmonella
relacionados à saúde pública 8
9.2.1 Em geral 8
10 Controle de qualidade 11
11 Relatórios 11
Anexo A (informativo) 13

© ISO 2014 - Todos os direitos

reservados
ISO/TR 6579-3:2014(E)

Al Geral 13
A.2 Ágar nutriente 13
A.2.1 Composição 13
A.2.2 Preparação 15
A.3 Meio de ágar enxame — Sven Gard (exemplos) 20
A.3.1 Exemplo 1 (Referência (161) 20
A.3.2 Exemplo 2 20
A.6.2 Solução de fosfato monossódico (1,0 mol/l) 17
A.7 Caldo D-Tartrato (tartarato de ácido orgânico) 17
A.7.1 Composição 17
A.7.2 Preparação 17
AB Solução de acetato de chumbo 17
A.8.1 Composição 17
A.8.2 Preparação 17
A.9 Caldo de infusão cérebro-coração (BH1) 24
A.9.1 Composição 24
A,9,2 Preparação 24
A. 10 Solução salina formal (fração de volume de 1%) 24
A.10.1 Composição 24
A. 10.2 Preparação 24
A. 11 tubos Craigie 24
A.11.1 Composição 24
A.11.2 Preparação 25
A.12 Gelatina nutritiva 25
A.12.1 Composição 25
A.12.2 Preparação 25
Anexo B (informativo) 26
Anexo C (informativo} 30
C.1 Distinção entre subespécies de Salmonella 30
C.1.1 Geral 30
C.1.2 Teste de malonato 30
C.1.3 Teste de dulcitol 30
C.1.4 Teste ON PG 30
C.1.5 Teste de gelatinase 30
C.2 Distinção entre Salmonella Paratyphi B e Salmonella Paratyphi B bio- var Java 25
Anexo D (informativo) 32
Anexo E (informativo) 27

© ISO 2014 - Todos os direitos

reservados
ISO/TR 6579-3:2014(E)

E.3 Placa de microtitulação 2 para antígenos O 34

E.4 Placa de microtitulação para antígenos H 34
Anexo F (informativo) 29
Método simplificado de Sven Gard 29
F.2 Método do tubo de Craigie 29
F.2.1 Geral 29
F.2.2 Preparação do tubo Craigie para inversão de fase 29
F.2.3 Procedimento para inversão de fase usando um tubo Craigie 29
F.3 Método da ponte de papel 36
ICS 07.100.30 40

Meu Deus —• 60 —>62 —•63 —•65 —•66 —•67

• O soro 0:1,2 pode ser usado para testar a presença do antígeno 0:1

a) Antígenos somáticos — Possíveis testes sequenciais em antissoros polivalentes e monovalentes

para detectar antígenos somáticos de Salmonella (derivados da Referência [6]) [O próximo passo na linha
horizontal é dado quando o teste anterior mostra uma reação positiva (por exemplo, se 0:4,5 for positivo,
então teste para 0:5, etc.). A composição dos antissoros polivalentes usados neste esquema
é apresentada na Tabela B.2.]

© ISO 2014 - Todos os direitos

reservados
 ISO/TR6579-3:2014(E)

HMC

b) Antígenos flagelares — Possíveis testes sequenciais em antissoros polivalentes e monovalentes

para detectar antígenos flagelares de Salmonella (derivados da Referência [6]) [O próximo passo na linha
horizontal é dado quando o teste anterior mostra uma reação positiva. A composição
dos antissoros polivalentes usados neste esquema é dada na Tabela B.2.]

Figura B.2 — Detecção de antígenos

Tabela B.2 — Composição dos antissoros polivalentes referidos na Figura B.2 (Referência [6])
Fator Antissoros polivalentes Antígenos correspondentes
OMA 1,2,12 + +.5,12 + 9,12 + 9,46 + 3,10 + 3,15 + 1,3,19 + 21
0
OMB 6,7 + 6,8 + 11 + 13,22 + 13,23 + 6,14,24 + 8,20
Olá 1,2+1,5+1,6+1,7+z

ELE eh + e,n,x + e,n,215

G.H. f,g+gp+g,m,s+g,m +m,t

O
HMA a + b + c + d + i + Z10 + Z29

BLH eh + e,n,x + e,n,z15 + G

HMC k+y+L+z4+r

[Link] riehts reservado 23

ISO/TR6579-3:2014(E)

Anexo C
(informativo}

Testes bioquímicos

C.1 Distinção entre subespécies de Salmonella

C.1.1 Geral

Para distinguir entre subespécies de Salmonella, alguns testes bioquímicos precisam ser realizados (ver
Tabela 2). Alguns exemplos de testes são fornecidos em C.1.2 a C.1.5.

C.1.2 Teste de malonato

Inocular caldo de malonato (ver A,4) de uma cultura de caldo ou de uma lâmina de ágar fresca (é preferível
uma alça de 3 mm de cultura de caldo).

Incubar o caldo inoculado entre 34 °C e 38 °C (6.1) e observar a reação após 24 h ± 3 h e após 48 h ± 3 h.

No caso de uma reação positiva, a cor do meio muda de verde para azul da Prússia.

C.1.3 Teste de dulcitol

Inocular o caldo dulcitol (ver A.5) com 1 ml de uma cultura de caldo ou de uma cultura de ágar fresca.

Incubar o caldo inoculado entre 34 °C e 38 °C (Li] e observar a reação após 24 h ± 3 h e após 48 h + 3 h.

Em caso de reação positiva (acidificação), a cor do meio torna-se rosa.

C.1.4 Teste ON PG

Cultive o isolado a ser testado em ágar inclinado nutriente (ou outro) (ver A,2) contendo 1,0% de fração de
massa de lactose. Emulsione uma grande porção de cultura em 0,25 ml de solução salina fisiológica para obter
uma suspensão "pesada". Adicione 1 gota de tolueno a cada tubo e agite bem para liberar a enzima.

Colocar os tubos entre 34 °C e 38 °C (6.1) por 5 min.

Adicionar 0,25 ml de solução 0,013 3 mol/l ON PG (A.6) a cada suspensão a ser testada. Incube os tubos
entre 34 °C e 38 °C (6.1) e examine os tubos em intervalos de até 24 h. Uma cor amarela indica um resultado
positivo.

C.1.5 Teste de gelatinase

Inocule o meio de gelatina nutriente (ver A. 12) com um inóculo de uma cultura pura “overnight”.

Incubar o tubo entre 34 °C e 38 °C (6.1) por 24 h ± 3 h.

Coloque o tubo em gelo derretido ou na geladeira por aproximadamente 30 minutos. Se a gelatina tiver sido
digerida, o meio no lubrificante não solidifica após a refrigeração, o que indica a presença de gelatinase.

Alternativamente, o tubo pode ser incubado a 25 °C por até 1 semana, verificando diariamente a liquefação da
gelatina. Como a gelatina já pode liquefazer a 28 °C, é necessário resfriar o tubo incubado para ter certeza

UM © ISO 2014 - Todos os direitos reservados

 ISO/TR6579-3:2014(E)

que a liquefação é causada pela gelatinase e não pela temperatura de incubação. Pode ser útil usar um tubo
não inoculado como controle.

C.2 Distinção entre Salmonella Paratyphi B e Salmonella Paratyphi B bio- var Java

Para distinguir entre Salmonella Paratyphi B e Salmonella Paratyphi B biovar Java, a reação no D-tartarato
deve ser testada. Alternativamente, um teste de PCR pode ser realizado, conforme descrito na Referência [15].

Para a reação de D-tartarato, o seguinte procedimento pode ser seguido (Referência [1]).

— Cultive a cepa a ser testada em meio ágar não seletivo.

— Suspender o material da colônia em uma solução salina de 8,5 g/l a uma densidade de aproximadamente
10° ufc/ml.

— inocular alíquotas de 50 pl de cada cepa em dois tubos com caldo D-tartarato (ver A.6). Inocular também
duas cepas de controle em dois caldos de D-tartarato cada. Controles: Positivo = Salmonella Paratyphi B
biovar Java, Negativo = Salmonella Paratyphi B.

— Incubar os tubos aerobicamente (sem agitação) entre 34 °C e 38 °C (6.1) por 18 h ± 2 h.

— Após a incubação, examine os tubos para verificar se há mudança de cor. No caso de uma reação positiva,
a cor do meio muda de azul para amarelo.

— Adicione a um conjunto de caldos 0,5 ml de solução saturada de acetato de chumbo (ver A.8) e deixe os
tubos em repouso por no mínimo 30 minutos para permitir que o precipitado se deite.

— Em seguida, examine os tubos para verificar a presença de precipitado (normalmente após 1 h a 2 h). No
caso de uma reação positiva, o precipitado se deposita no fundo do tubo e no caso de uma reação
negativa, o precipitado permanece suspenso no caldo. Os tubos de ensaio são comparados aos tubos de
controle positivo e negativo. Se o teste for positivo, a cepa é considerada Salmonella Paratyphi B biovar
Java e o segundo tubo de D-tartarato é descartado.

— Se o teste for negativo, o segundo tubo e seus controles são incubados por mais 6 dias (incubação total = 7
dias).

— Após a incubação prolongada, o acetato de chumbo é adicionado aos tubos como acima.

— As cepas positivas após 7 dias são consideradas Salmonella Paratyphi B biovar Java e as cepas
negativas são consideradas Salmonella Paratyphi B.

[Link] riehts reservado 25

ISO/TR 6579-3:2014(E)

Anexo D
(informativo)

Visão geral esquemática para sorotipagem de cinco importantes

sorovares de Salmonella relacionados à saúde
pública

0:4 0:9 0:7 0:7 0:8

EU EU X X X

+ + + + +

EU EU X X X

(0:5—+ou-) H:GorH:g H:r H:r H:210

EU X X X
1
EU + + + +

Oi 1 EU X X

1
Olá H:2 H:2 H:x
+
X X X X
1
+ 4. +
H:2

EU EU X X X

+ H:q, H:s H:5 H:5 0:6 (0:61,0:6,7 ou

0:6,14,24)
1 X X X
X
+
+

1 EU 1 1 1
1 0:46 1 1 1
EU
1 1 1 1

EU X X X X

Salmonela Salmonela Salmonela Salmonela Salmonela

[Link] ser. Enterite ser, Virchow ser. Infantis ser Hadar

© ISO 2014 - Todos os direitos

reservados
 ISO/TR6579-3:2014(E)

Anexo E
(informativo)

Método de microplaca para sorotipagem de Salmonella spp.

E,1 Geral
O procedimento descrito neste anexo é baseado na Referência [21].

Em laboratórios que sorotipam um grande número de cepas de Salmonella, uma técnica que utiliza placas de
microtitulação combinada com um sistema semiautomatizado de distribuição dos antissoros nas placas pode
ser vantajosa.

Visão geral do método:

— Suspensões bacterianas são preparadas para a detecção de O-amígenos (suspensões O) e H-antígenos

(suspensões H). Eles são preparados inoculando dois caldos de infusão cérebro-coração (ver A.9) para
cada cepa testada: um em um frasco universal para a suspensão 0 e um em um tubo de ensaio para a
suspensão H. Os caldos são incubados entre 34 °C e 38 °C (6 1] por 4 h a 5 h.

Após a incubação, as suspensões de O são vaporizadas por 30 min e então diluídas com um volume igual
de 8,5 g/l de solução salina.

— Após a incubação, as suspensões de H são mortas pela adição de um volume igual de solução salina
formal com fração de volume de 1% (ver AJO) e deixadas em temperatura ambiente durante a noite antes
do teste.

— Os antissoros são dispensados em placas de microtitulação de fundo redondo com 96 poços usando uma
multipipeta ou um sistema robótico. As placas preparadas podem ser seladas e armazenadas a 5 °C (6,3)
por no máximo 2 semanas.

— As suspensões de O e H preparadas são dispensadas manualmente nas placas de microtitulação

preparadas usando uma pipeta descartável (pipeta de plástico) ou uma pipeta de passo com pontas
descartáveis.

— As placas de O-aglutinação são seladas e incubadas a 50 °C (6.9) por 18 h ± 3 h>

— As placas de aglutinação de H são incubadas por 2 h em banho-maria a 50 °C (6.9). De preferência, o

banho-maria deve ter uma prateleira sem furos no mesmo nível da água.

— Após a incubação, as aglutinações são examinadas. As aglutinações se depositam no fundo dos poços e
são melhor visualizadas por baixo da placa, usando um espelho de microplaca.

Antes do uso, os antissoros são testados em placas de microtitulação para determinar o título para uso.

Os antissoros sugeridos para uso no método da microplaca são 23 O-antissoros dispostos em duas
microplacas com um controle salino na segunda placa. A primeira placa contém O-antissoro polivalente (PSO),
sete antissoros para os grupos 4,5,12: 6,7; 6,8; 9,12; 3,10; 13,22; 6,14,24 e quatro antissoros absorvidos 1, 20,
27 e 46. A segunda placa contém os antissoros absorvidos 4,5, 7, 8,9,10,14, 15, 19, 22 e 23.

E.2 Placa de microtitulação 1 para antígenos O

Coluna de prato 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Soros em cada poço da coluna OPS 4,5,12 6.7 6,8 9,12 3,10 13,22 6,14,24 1 20 27 46

Um 1en 901 ATodos os direitos reservados 27

ISO/TR6579-3:2014(E)

E.3 Placa de microtitulação 2 para antígenos O

Coluna de prato 1 2 3 4 S 6 7 8 9 10 11 12
Soros em cada poço da coluna 4 5 7 8 9 10 14 15 19 22 23 Controlar

Cada cepa é testada em relação a todos os soros em ambas as placas de microtitulação. Oito cepas podem
ser testadas em cada conjunto de duas placas de microtitulação.

Para identificar os antígenos H, cada cepa é testada contra um conjunto de 11 antissoros e um controle salino.
Os antissoros sugeridos são Salmonella H polivalente (PSH 1+2) contendo anticorpos para H = a até H = Z29
para cobrir a fase 1 e anticorpos para o complexo de fase 2 H = 1,2,5,6,7 (PSH 2). Quatro antissoros para os
complexos H = E;G;L;1,2,5,6,7 e seis antissoros absorvidos para H = b,d,i,r,z,z10.

E.4 Placa de microtitulação para antígenos H

Coluna de prato 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Soros em cada poço
da coluna PSH 1+2 E G eu PSH2 b e eu r por Zjo Controlar

A identificação da fase 1 é concluída para as cepas que se aglutinam com PSH 1+2 e um dos seis antissoros
absorvidos, não sendo necessários mais testes para a fase 1. Para cepas que se aglutinam com PSH e um
dos quatro complexos, testes adicionais são necessários para identificar os antígenos de fator único. As cepas
que aglutinam apenas com PSH são testadas contra os antissoros H = a,c,k,y,z4 26 e z29.

Após a inversão de fase, o procedimento de teste do antígeno H é repetido para determinar os antígenos da
outra fase.

32 © ISO 2014 - Todos os direitos reservados

 ISO/TR 6579-3:2014(E)

Anexo F
(informativo)

Exemplos de procedimentos para inversão de fase

Método simplificado de Sven Gard

Este método é derivado das Referências [8][13].

Preparar uma placa de Petri de 55 mm de diâmetro (6.7) com 10 ml de ágar enxame solidificado (A.3).
Adicionar 0,1 ml de anti-Salmonella H gota a gota e espalhar sobre a superfície com uma espátula estéril
(vidro). Inocule a cepa em um único ponto no centro da placa.

Incubar a placa inoculada entre 34 °C e 38 °C (6.1) por 18 h a 21 h. A tensão acumulada na placa pode ser
usada para identificar a segunda fase H não inibida.

Este método simplificado geralmente permite que a segunda fase seja identificada na primeira tentativa. Ele
também tem a vantagem de permitir que placas de ágar de enxame sejam preparadas e armazenadas com
antecedência e sejam usadas conforme necessário para melhorar a expressão dos antígenos H ou para a
indução de fase.

F.2 Método do tubo de Craigie

F.2.1 Geral

O tubo Craigie é usado para demonstrar motilidade. Este método consiste em um tubo ou frasco largo com
tampa de rosca contendo ágar semissólido (uma fração de massa de 0,2% a 0,4% de ágar) no centro do qual
é inserido um tubo curto e estreito aberto em ambas as extremidades, de tal forma que se projeta acima do
ágar (ver Figura Fl). A cepa a ser testada é inoculada cuidadosamente no tubo interno. Após a incubação, as -
subculturas retiradas do topo do ágar fora do tubo central produzem uma população de células móveis
(Referência [SI).

F.2.2 Preparação do tubo Craigie para inversão de fase

— Coloque o tubo Craigie (veja A l 11) em um vaporizador (ou outro meio apropriado) por 30 min para derreter
o ágar.

— Colocar o tubo Craigie com ágar fundido em banho-maria a 47-50 °C (6,8) para equilibrar.

— Adicione 200 pl do antissoro necessário ao tubo Craigie.

— Misture bem agitando suavemente.

— Coloque o tubo Craigie a 5 °C (6,3) para endurecer.

F.2.3 Procedimento para inversão de fase usando um tubo Craigie

— Inocule o tubo Craigie com a cultura de Salmonella usando uma agulha de plástico descartável ou um fio
reto (a cultura é inoculada dentro do tubo interno).

— Incubar o tubo Craigie entre 34 °C e 38 °C (6.1).

— Examine o tubo Craigie para crescimento após 24 h, 48 h e 72 h.

— Quando o crescimento aparecer na superfície do ágar (fora do tubo central), lave o crescimento em caldo
de infusão cérebro-coração (ver A.9).

[Link]-'rp? ■'."direitos reservados 29

ISO/TR6579-3:2014(E)

— A suspensão do caldo é então testada para seu antígeno H.

Chave 5rota da Salmonella após a fase de invasão

1 boné 6área a ser subcultivada
2 tubo de extremidade 7Tubo Craigie
aberta
3 ponto de inoculação
4 meio semissólido
Figura El — Método do tubo de Craigie

F.3 Método da ponte de papel

O procedimento descrito nesta subcláusula é retirado da Referência [4], que é um procedimento modificado
originalmente descrito na Referência [23].

Veja a Figura E2 - Uma tira de ágar triptona de soja (1 cm de largura) é removida para fazer uma ranhura no
centro de uma placa. Tiras de papel de filtro (3 mm x 3 cm) são dispostas ao longo desta ranhura. O antissoro
contra a fase identificada é aplicado no meio da ponte de papel (indicado por círculos brancos). As cepas
bacterianas são inoculadas na extremidade esquerda das tiras (indicadas pelas setas brancas). Após a
incubação, variantes de fase, que expressam um antígeno flagelar alternativo, aglomeram-se em direção à
extremidade direita da tira. Após 16 h de incubação, o crescimento bacteriano pode ser observado ao redor da
borda do papel de filtro (indicado por pontos triangulares brancos). As cepas inoculadas na placa mostrada na
Figura E2 são (A) S. Choleraesuis var. Kunzendorf (6,[Link]-J; (B) S. Typhimurium (1,4,5,12:i:1,2); e (C) S.
Stanley (4,5,[Link]l;2)

© ISO 2014 — Todos os direitos

reservados
 ISO/TR 6579-3:2014(E)

Figura F.2 — Método de ponte de papel para reversão de fase de

Salmonella

!cn->n« < _ *n direitos reservados 31

ISO/TR6579-3:2014(E)

Bibliografia

[1] ALFREDSSON GA, BARKER RM, OLD DC, DUGUID |.P. USO DE ISÔMEROS DE ÁCIDO TARTÁRICO E ÁCIDO CÍTRICO
na biotipagem de Salmonella typhimurium. J. Hyg. (Terra). 1972, 70 pp. 651-666

[2] Autoridades de Alimentos e Medicamentos dos EUA. 2001. Manual Analítico Bacteriológico. BAM RS3:
Teste ON PG. Disponível
(visualizado em 2013-06-04) em:
[Link]

[3] BRENNER FW, VILLAR RG, ANGULO FJ, TAUXE R., SWAMINATHAN B. NOMENCLATURA DE Salmonella, j.
Clínica. Microbiol. 2000, 38 PÁGS. 2465-2467

[4] CHIOU CS, HUANG JF, TSAI LH, HSU KM, LIAO CS, CHANG HL UM MÉTODO DE PONTE DE PAPEL SIMPLES E
DE BAIXO CUSTO PARA REVERSÃO DE FASE de Salmonella. Diagnóstico. Microbiologia. Infectar. Dis. 2006,
54 PÁGS. 315-317

[5] ESTUDOS DE CRAIGIE SOBRE AS REAÇÕES SOROLÓGICAS DE FLAGELOS DE B. typhosus. [Link]. 1931, 21
P.417

[6] DANAN C., FREMY S., MOURY F., BOHNERT M., BRISABDIS A. 2009. DETERMINAÇÃO DO SOROTIPO DE
cepas isoladas de Salmonella no setor veterinário utilizando o teste de aglutinação rápida em lâmina.
Cahiers de la Reference, N°.2, CR2-09M01, dezembro de 2009. Disponível (visualizado em 2013-06-
04) em: [Link]

[7] EWINGW.H. Edwards e identificação de Enterobucteriaceae por Ewing. Nova York: Elsevier, quarta
edição, 1986

[8] GARD S. DAS SCHWARMPHANOMEN IN DERSALMONELLA-GRUPPE UND SEINE PRAKTISCHE AUSNIITZUNG. [O

FENÔMENO DA ENXAMEAÇÃO NO GRUPO Salmonella E SEU USO PRÁTICO], Z. Hyg. Infektionskr. 1938, 120
PP.

[9] GRIMONT PAD, & WEILL F.-X. 2007. FÓRMULAS ANTIGÊNICAS DOS SOROVARES DE Salmonella, 9ª EDIÇÃO.3)
CENTRO COLABORADOR DA OMS PARA REFERÊNCIA E PESQUISA SOBRE Salmonella. PARIS: INSTITUTO
PASTEUR. DISPONÍVEL (VISUALIZADO EM 04/06/2013) EM: [Link]
WEBDRIVEACTIUNEVENT/OID/01S-000036-089

[10] GUIBOURDENCHE M„ Roggentin R, MIKOLEIT M., Fields PI, Bockemuhl J., Grimont PAD et al.
Suplemento 2003-2007 (nº 47) ao esquema White-Kauffmann-Le Minor. Resolução Microbiologia.
2010, 161 págs. 26-29

[11] HENDRIKSEN RS, Mikoleit Carlson VP, KARLSMOSES., VIEIRA AR, JENSEN AB, etal. Sistema de
Garantia de Qualidade Externa Global Salm-Surv da OMS para Sorotipagem de Isolados de
Salmonella de 2000 a 2007. j. Clínica. Microbiologia. 2009, 47 págs. 2729-2736

[12] KAUFFMANN E SOBRE OS PRINCÍPIOS DE CLASSIFICAÇÃO E NOMENCLATURA DE Enterobacteriaceae.

sucesso. Touro. Bacteriana. Nomenci. Táxon. 1959, 9 PP. 1-6

[113] KOEHN A. MODIFICAÇÃO TÉCNICA DO MÉTODO DE PLACA DE ENXAME SEGUNDO SVEN GARD NO DIAGNÓSTICO
DE Salmonella. Centralbl. Bakteriol. 1970, 215 PP.

[14] LEIFSON E. Fermentação de malonato de sódio como meio de diferenciação de Aerobacter e

Escherichia colt. [Link]. 1933, 26 pp. 329-330

[15] MALORNY B., BUNGE C., HELMUTH R. DISCRIMINAÇÃO DE ISOLADOS de Salmonella enterica SUBSP.
enterica fermentadores E NÃO FERMENTADORES DE D-TARTARATO POR MÉTODOS GENOTÍPICOS E
FENOTÍPICOS. Clínica J. Microbiologia. 2003, 41 PÁGS. 4292-4297

3 Suplementos ao esquema White-Kauffmann-Le Minor são publicados no Rei Microbiol, uma publicação do Institut
Pasteur (anteriormente Ann. Inst. Pasteur/Microbiol.), por exemplo Referência [10].

3. • ISO 2014 - Todos os direitos reservados

ISO/TR6579-3:2014(E)

[16] POPOFF MY Diretrizes para a preparação de antissoros de Salmonella. Centro Colaborador da OMS
para Referência e Pesquisa sobre Salmonella. Paris: Instituto Pasteur, 2001

3. • ISO 2014 - Todos os direitos reservados

 ISO/TR 6579-3:2014(E)

[17] POPOFF MY, & LE MINOR LE Gênero XXXIII. Salmonella Lignires 1900, 389. InBRENNER D.., Krieg
NR, editores Staley JT. Maná de Beryey! da bacteriologia sistemática, 2ª edição, Vol. 2, The
Proteobacteria, Parte B The Gammaproteobacteria. Nova York, NY: Springer, 2005, pp.

[18] POPOFF MY, Bockemuhl J„ Brenner FW Suplemento 1998 (nº 42) ao esquema Kauffmann-White.
Resolução Microbiologia. 2000, 154 págs. 63-65

[119] POPOFF MY, Bockemuhl ]., Gheesling LL Suplemento 2001 (nº 45) ao esquema Kauffmann-White.
Resolução Microbiologia. 2003, 151 págs. 173-174

[20] Sociedade Americana de Microbiologia. Ata da reunião do Conselho de Publicações. Nomenclatura da

Salmonella. Notícias ASM. 1999, 65 p. 769

[21] SHIPP CR, & ROWE B. UMA MICROTÉCNICA MECANIZADA PARA SOROTIPAGEM DE Salmonella. Clínica J.
Patol. 1980, 33 PÁGS. 595-597

[22] TINDALL BJ, GRIMONT PAD, GARRITY GM, EUZBY |.P. NOMENCLATURA E TAXONOMIA DO GÊNERO
Salmonella, hit. f Syst. Evolução. Microbiologia. 2005, 55 PÁGS. 521-524

[23] WANG TK, TSENG TC, LEE JH, WANG WT, TSAI JL, HO SI, PAN TM ANÁLISE DE SOROVARES DE
SALMONELLA EM TAIWAN PELO MÉTODO DE INDUÇÃO DE FASE] [ARTIGO EM CHINÊS]. Zhanghua Min Guo
Wei Shang WU Ji Mian Yi Xue Za Zhi [QUEIXO. J. MICROBIOLOGIA. IMUNOL.]. 1994, 27, PÁGS. 13-24

• 1cn01 4 .Todos os direitos reservados 33

ISO/TR6579-3:2014(E)

ICS 07.100.30
Preço com base em 33 páginas

mIen "n1 A A11-ichte-n-erved