ROBERTO SILVA

DETECÇÃO DO FATOR CORDA: UTILIZAÇÃO DE DIFERENTES

METODOLOGIAS COM E SEM COLORAÇÃO PARA UMA RÁPIDA
IDENTIFICAÇÃO PRESUNTIVA DO COMPLEXO MYCOBACTERIUM
TUBERCULOSIS

UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM INFECTOLOGIA E
MEDICINA TROPICAL
BELO HORIZONTE – MG
2012
 ROBERTO SILVA

DETECÇÃO DO FATOR CORDA: UTILIZAÇÃO DE DIFERENTES

METODOLOGIAS COM E SEM COLORAÇÃO PARA UMA RÁPIDA
IDENTIFICAÇÃO PRESUNTIVA DO COMPLEXO MYCOBACTERIUM
TUBERCULOSIS

Dissertação apresentada ao programa de Pós-

Graduação em Ciência da Saúde: Infectologia e
Medicina Tropical da Universidade Federal de
Minas Gerais, como requisito parcial para
obtenção do título de Mestre em Ciências da
Saúde (área de concentração em Infectologia e
Medicina Tropical).

Orientadora: Profª Silvana Spindola de Miranda

Co-orientadora: Profª Wânia da Silva Carvalho

Belo Horizonte
2012
 Silva, Roberto
S586D Detecção do fator corda [manuscrito]: utilização de diferentes
metodologias com e sem coloração para uma rápida identificação
presuntiva do complexo Mycobacterium tuberculosis. / Roberto Silva. - -
Belo Horizonte: 2012.
50f: il.
Orientadora: Silvana Spíndola de Miranda
Co-Orientadora: Wânia da Silva Carvalho.
Área de concentração: Infectologia e Medicina Tropical.
Dissertação (mestrado): Universidade Federal de Minas Gerais,
Faculdade de Medicina.

1. Tuberculose. 2. Fatores Corda. 3. Mycobacterium tuberculosis. 4.

Dissertações Acadêmicas. I. Miranda, Silvana Spindola de. II. Carvalho,
Wânia da Silva. III. Universidade Federal de Minas Gerais, Faculdade de
Medicina. IV. Título.
NLM: WF 200

Ficha catalográfica elaborada pela Biblioteca J. Baeta Vianna - Campus Saúde UFMG
FOLHA DE APROVAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS

Reitor
Clélio Campolina Diniz
Vice-Reitora
Rocksane de Carvalho Norton

Pró-Reitor de Pós-Graduação
Ricardo Santiago Gomez

Pró-Reitor de Pesquisa
Renato de Lima Santos

FACULDADE DE MEDICINA

Diretor
Francisco José Penna

Programa de Pós-Graduação em Ciência da Saúde: Infectologia e Medicina

Tropical

Coordenador
Vandack Alencar Nobre Jr.
Sub-Coordenador
Manoel Otávio da Costa Rocha

Colegiado
Manoel Otávio da Costa Rocha
Vandack Alencar Nobre Jr.
Antônio Luiz Pinho
Denise Utsch Gonçalves
Antônio Lúcio Teixeira Jr.
Paula Souza Lage Carvalho
Gláucia Helena Martinho
 Dedico este trabalho à minha família pelo
apoio incondicional, sempre sacrificando em
prol do meu objetivo, que se concretizou com
muita luta e perseverança, em especial à minha
amada esposa que com sua paciência me
proporcionou tranquilidade e confiança para
chegar até o fim deste trabalho.

À minha mãe pelas orações que ela sempre faz

pedindo para Deus iluminar o meu caminho e
me dar sabedoria.
 AGRADECIMENTOS

À Profª Silvana Spíndola de Miranda, pelo apoio, confiança e incentivo à

pesquisa.
À Profª Wânia da Silva Carvalho, pelo carinho e atenção.
Ao Prof. José Renan e Prof. Marcos pela sua confiança em ceder o uso de
equipamento em seu laboratório de pesquisa.
Ao Prof. Geraldo Brasileiro Filho, pelo empréstimo de equipamento, que foi
fundamental para realização deste estudo.
Ao Dr. Marcos Almeida (Jabuti), por ter sempre contribuído com a sua
experiência.
Ao bioquímico João Paulo, pela sua contribuição, enquanto funcionário do setor
de Micobactérias.
Ao Alan e Cláudio da Fundação Ezequiel Dias (FUNED), pelo grande suporte.
À minha amiga Júlia, pelo incentivo para que eu fizesse pós-graduação.
À minha colega de mestrado Dra. Nayane por toda sua paciência e contribuição
na finalização deste trabalho.
Aos funcionários do Setor de Micobactérias e Microbiologia.
Aos estagiários do Setor de Micobactéria.
Ao Centro de Pós-Graduação da Faculdade de Medicina/UFMG.
À FUNED, pelo trabalho de identificação das micobactérias.
Ao Laboratório de Micobactérias da Unidade Funcional - Patologia Medicina
Laboratorial.
Ao grupo de pesquisa em micobactérias da Faculdade de Medicina,
principalmente a Lethicia.
À minha esposa pela sua paciência e compreensão, e aos meus filhos pelo
apoio e carinho que sempre tiveram por mim, estando sempre dispostos a me
ajudar nos momentos mais difíceis.
“O sucesso nasce do querer, da determinação e
persistência em se chegar a um objetivo”. “Mesmo
não atingindo o alvo, quem busca e vence
obstáculos, no mínimo fará coisas admiráveis.”
José de Alencar.
 RESUMO

A diferenciação rápida entre M. tuberculosis e micobactérias não tuberculosa é

essencial para o tratamento adequado dos pacientes, principalmente coinfectados
com o vírus da imunodeficiência humana ou pacientes com doenças respiratórias de
base, tais como: fibrose cística e sequelas pulmonares prévias. A identificação por
métodos básicos e moleculares pode ser usada, porém necessita de uma
identificação presuntiva primária para saber qual protocolo deverá ser seguido.
Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar diferentes metodologias com e sem
coloração na detecção do Fator Corda para uma rápida identificação presuntiva do
complexo mycobacterium tuberculosis. Esfregaços de escarro após processados e
centrifugados foram corados pelo método de Ziehl-Neelsen e avaliados quanto à
presença do Fator Corda. Dois esfregaços de colônias isoladas do meio de
Lowenstein Jensen foram corados em lâminas pelo método de Ziehl-Neelsen e
Auramina “O” e visualizadas em microscópio à luz branca e fluorescente,
respectivamente, e um esfregaço foi visualizado diretamente em microscópio em luz
invertida sem coloração para a detecção do Fator Corda. Para a identificação das
espécies foi utilizada, como padrão ouro, os testes bioquímicos básicos. Dois
observadores realizaram todas as metodologias de maneira cega. Em 10/21
esfregaços de escarro (47,6%) foram detectados o Fator Corda, o que correspondeu
a 100% de sensibilidade e especificidade. Em 88/101 culturas de micobactérias
coradas pela técnica de Zielh-Neelsen (87,1%) foram detectadas o Fator Corda, o
que correspondeu a uma sensibilidade de 100%; especificidade 81,3%; valor
preditivo positivo 96,6%; valor preditivo negativo 100%; acurácia de 97,0% e Kappa
= 0,88 (muito boa concordância - IC95%). Pela coloração de Auramina 89/101
(88,1%) foi visualizado o Fator Corda o que correspondeu a uma sensibilidade de
100%; especificidade 75,0%; valor preditivo positivo 95,5%; valor preditivo negativo
100%; acurácia de 96,0% e Kappa = 0,83 (muito boa concordância - IC95%). Sem
coloração e visualizaão direta e microscópio à luz invertida em 90/101 (89,1%) foi
visualizado o Fator Corda o que correspondeu uma sensibilidade de 100%;
especificidade 68,8%; valor preditivo positivo 95,5%; valor preditivo negativo 100%;
acurácia de 95% e Kappa = 0,79 (boa concordância - IC95%) sem coloração com
microscópio à luz invertida. A especificidade alcançou 100% quando associada à
observação das características das colônias em meio de cultura. Houve alta
concordância dos resultados entre os dois observadores. A detecção do Fator Corda
para a identificação presuntiva do complexo mycobacterium tuberuclosis tem
excelente acurácia tanto pela coloração direta do escarro, quanto em colônias
positivas pelas metodologias de Ziehl-Neelsen, Auramina ou sem coloração,
visualizada em microscópio à luz branca, fluorescente e de luz invertida,
respectivamente, e pode ser utilizada para direcionar as metodologias de
identificação definitiva em laboratórios de micobactérias. A metodologia sem
coloração é mais rápida, mas depende de treinamento técnico efetivo. É importante
ressaltar que não há trabalhos descritos na literatura que comparem metodologias
de detecção do Fator Corda, porém é necessário que outros laboratórios
desenvolvam suas próprias experiências, para que se possa realizar novas
pesquisas e comparações.

Descritores: Tuberculose; Identificação de Micobactérias; Fator Corda.

 ABSTRACT

The quick differentiation between M. tuberculosis and Nontuberculous Mycobacteria

is essential for the adequate treatment of patients, mainly those that are coinfected
with the Human Immunodeficiency Virus or patients with basal respiratory diseases,
such as: cystic fibrosis and previous pulmonary sequels. The identification by basic
and molecular methods can be used; however, such a use requires primary
presumptive identification to know which protocol should be followed. Hence, the
purpose of this study was to evaluate different methodologies, with and without
coloration, in the Cord Factor detection, to enable a quick presumptive identification
of Mycobacterium tuberculosis Complex. Sputum smears were colored by the Ziehl-
Neelsen method after processing and centrifugation, being then evaluated for
presence of Cord Factor. Two smears from colonies isolated from Lowenstein
Jensen medium were colored on slides by the Ziehl-Neelsen method and Auramine
“O”, and viewed in the microscope at white and fluorescent light, respectively; and a
smear was viewed directly in the microscope under uncolored inverted light, for the
Cord Factor detection. For the species identification, basic biochemical tests were
utilized as golden standard. Two observers developed all methodologies in a blinded
manner. Out of the 21 sputum smears, 10 (47.6%) were detected as having the Cord
Factor, corresponding so to 100% of sensitivity and specificity. Out of the 101
cultures of mycobacteria colored by the Zielh-Neelsen technique, 88 (87.1%) were
detected as having the Cord Factor; which corresponds to a sensitivity of 100%;
specificity of 81.3%; positive predictive value of 96.6%; negative predictive value of
100%; accuracy of 97.0% and Kappa = 0.88 (very good concordance - CI95%). By
the Auramine coloration, 89 (88.1%) out of 101 smears exhibited the Cord Factor,
corresponding so to a sensitivity of 100%; specificity of 75.0%; positive predictive
value of 95.5%; negative predictive value of 100%; accuracy of 96.0% and Kappa =
0.83 (very good concordance - CI95%). Without coloration, by direct viewing, and
using the microscope under inverted light, 90 (89.1%) out of 101 smears have shown
the Cord Factor, corresponding so to a sensitivity of 100%; specificity of 68.8%;
positive predictive value of 95.5%; negative predictive value of 100%; accuracy of
95% and Kappa = 0.79 (good concordance - CI95%). The specificity achieved 100%
when associated to observation of colonies characteristics within the culture medium.
There was a high results agreement between both observers. The Cord Factor
detection for presumptive identification of mycobacterium tuberculosis complex has
an excellent accuracy, as in case of direct coloration of sputum, as in case of positive
colonies colored by Ziehl-Neelsen and Auramine methodologies, or even without any
coloration, if viewed in the microscope at white, fluorescent, or inverted light,
respectively; e could be utilized to guide the definitive identification methodologies in
mycobacteria laboratories. The uncolored methodology is quicker, but depends on
effective technical training. It is important to highlight that there are no works
described in the literature, comparing Cord Factor detection methodologies; however,
it is necessary that other laboratories develop their own experiences, in order to
enable new researches and comparisons.

Key words: Tuberculosis; Mycobacteria Identification; Cord Factor.

 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLA

AIDS .................... Síndrome da Imunodeficiência Humana

ATS ..................... American Thoracic Society
ATSC ................... Ácido tuberculosteárico
AU ....................... Auramina
B.A.A.R ............... Bacilo Álcool Ácido Resistente
BCG .................... Bacilo Calmette-Guérin
CDC .................... Centers for Disease Control and Prevention (Centros para
Controle e Prevenção de Doenças)
CMTB .................. Complexo Mycobacterium tuberculosis
CS ....................... Cicloserina
FC ....................... Fator Corda
FC ....................... Fibrose Cística
HIV ...................... Vírus da Imunodeficiência Humana
HPLC ................... High Performance Chomatography líquida
LAM ..................... Lipoarabinomanano
LJ ........................ Löwenstein-Jensen
LRP ..................... Ensaio Phage luciferase Reporter
M. tuberculosis .... Mycobacterium tuberculosis
MG ...................... Minas Gerais
MGIT ................... Mycobacteria Growth Indicator tube
MNT .................... Micobactéria Não Tuberculosa
MS ....................... Ministério da Saúde
OADC .................. Oleic acid, Albumin, Dextrose and Catalase
OMS .................... Organização Mundial da Saúde
PCR ..................... Reação em cadeia da polimerase
PCTB ................... Programa de Controle da Tuberculose
Pha B MAB .......... Phage Essay amplificado
PNB ..................... p-nitrobenzoíco
PRA-hsp65 .......... Polimerase Chain Reaction Restriction Analysis of the gene
hsp65
PZAse ................. Piramidase
S .......................... Estreptomicina
SUS ..................... Sistema Único de Saúde
TB ........................ Tuberculose
TCH ..................... Ácido tiofeno 2- carboxílico
TDM .................... Trehalose-6,6’-dimycolato
TLC ..................... Thin-layer chromatography
UFMG .................. Universidade Federal de Minas Gerais
WHO ................... World Health Organization
ZN ....................... Zielh-Neelsen
 LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Detecção do fator corda de 101 cepas isoladas em meio de

Loweinstein-Jensen no período de 2009-2011 pelo método de
coloração de Ziehl Neelsen ........................................................... 35
Tabela 2 Detecção do FC em 101 cepas isoladas em meio de
Loweinstein-Jensen no período de 2009-2011 pelo método de
coloração pela Auramina “O”......................................................... 35
Tabela 3 Detecção do fator corda de 101 cepas isoladas em meio de
Loweinstein-Jensen no período de 2009-2011 sem coloração e
visualizados em microscópio de luz invertida ................................ 36
 LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Fator corda observado em meio sólido de Lowenstein Jensen.

Coloração pelo método de Ziehl-Neelsen aumento de (1000x) ........ 23

FIGURAS ARTIGO

Figura 1 Observação do fator corda, coloração de Ziehl Neelsen,

microscópio óptico (aumento de 1000x) em meio Lowensteins
Jensen ............................................................................................. 37
Figura 2 Observação do fator corda, coloração de Auramina “O”,
microscópio à fluorescência (aumento de 400x) em meio de
Lowensteins Jensen ........................................................................ 37
Figura 3 Observação do fator corda em microscópio à luz invertida
(aumento de 400x) em meio Lowensteins Jensen (LJ).................... 37
 SUMÁRIO

1 CONSIDERAÇÕES INICIAIS .......................................................... 15

1.1 Introdução ....................................................................................... 15
1.1.1 Epidemiologia .................................................................................. 16
1.1.2 Agente etiológico ............................................................................. 18
1.1.3 Identificação de micobactérias ........................................................ 18
[Link] Identificação fenotípica .................................................................... 19
[Link] Identificação bioquímica. ................................................................. 20
[Link] Identificação molecular .................................................................... 20
[Link] Método imunocromatográfico .......................................................... 21
[Link] Método cromatográfico .................................................................... 21
[Link] Método fagotípico ............................................................................ 22
1.2 Fator corda....................................................................................... 23
2 JUSTIFICATIVA ............................................................................... 26
3 OBJETIVOS .................................................................................... 27
3.1 Objetivo geral. ................................................................................. 27
3.2 Objetivos específicos....................................................................... 27
4 NOTA EXPLICATIVA ...................................................................... 28
5 ARTIGO........................................................................................... 29
6 CONSIDERAÇÕES FINAIS ............................................................ 43
7 PERSPECTIVAS ............................................................................... 44
REFERÊNCIAS GERAIS ................................................................ 45
ANEXOS
Anexo A - Folha de Aprovação do Comitê de Ética ........................ 47
Anexo B - Fluxograma esquemático utilizado na metodologia para
a observação do fator corda em meio Lowenstein Jensen com e
sem coloração ................................................................................. 48
 15

1 CONSIDERAÇÕES INICIAIS

1.1 Introdução

A tuberculose (TB) é uma doença causada pelo Mycobacterium

tuberculosis (M. tuberculosis) que faz parte do Complexo Mycobacterium
tuberculosis (CMTB) com outras espécies como: Mycobacterium africanum (M.
africanum), Mycobacterium bovis (M. bovis), Mycobacterium bovis-BCG (M. bovis-
Bacilo Calmette-Guérin), Mycobacterium microtti (M. microtti), Mycobacterium caprae
(M. caprae) (ARANAZ et al., 2003) e Mycobacterium pinnipedii (M. pinnipedii)
(COUSINS et al., 2003).

O M. tuberculosis infecta principalmente seres humanos e primatas; M.

africanum é um grupo heterogêneo de isolados encontrados principalmente na África
equatorial com propriedades intermediária entre M. tuberculosis e M. bovis; O M.
bovis é predominantemente a causa da tuberculose em bovinos, mas causa a
doença em uma ampla variedade de outros animais inclusive o homem; M. Bovis -
BCG é derivado de uma cepa do M. bovis que, após passagem por várias vezes em
meio de cultura, pode também causar doença em humanos e apresentar
características que o diferenciam da cepa de origem; M. microti é um patógeno raro
de ratazanas e outros mamíferos de pequeno porte, mas recentemente, foi
identificado como a causa de doença em humanos imunocomprometidos (COLE,
2002; LEÃO et al., 2005).

O M. tuberculosis tem infectado aproximadamente 1/3 da população

mundial, com três milhões de morte por ano (WHO, 2011). Portanto, a diferenciação
rápida entre M. tuberculosis e micobactérias não tuberculosas (MNT) é essencial
para o tratamento adequado dos pacientes, principalmente coinfectados com o Vírus
da Imunodeficiência Humana (HIV) ou pacientes com doenças respiratórias de base,
tais como: fibrose cística, doenças pulmonares prévias, entre outras (SIMEÃO et al.,
2009).

O tratamento específico imediato e o isolamento dos pacientes dependem

da identificação rápida e precisa das micobactérias envolvidas. Isso não raro
 16

representa um grande desafio para os profissionais do laboratório. A identificação do

CMTB por meio de métodos tradicionais demanda muito tempo. Tais métodos
baseiam-se no crescimento bacteriano em vários substratos e exigem até 15 dias
para a identificação definitiva, após o crescimento em cultura (SIMEÃO et al., 2009).

As MNT podem ser encontradas no solo e água (água natural e tratada).

As micobactérias, Mycobacterium kansasii (M. kansasii), Mycobacterium xenopi (M.
xenopi) e Mycobacterium simiae (M. simiae) são recuperadas quase que
exclusivamente a partir de fontes de água tratada e, raramente, de outras fontes
ambientais. Não há nenhuma evidência de transmissão de animal para humano ou
de humano para humano de MNT, mesmo em pacientes com fibrose cística (FC),
uma população altamente susceptível (GRIFFITH et al., 2007).

Atualmente, a identificação por métodos moleculares pode ser usada,

porém necessita de uma identificação presuntiva primária para saber qual protocolo
molecular será seguido. Alguns autores referem-se a esses métodos como caros
para serem utilizados em países onde a identificação rápida seria necessária,
principalmente onde concentram a maioria dos casos de coinfectados TB/HIV (WHO,
2011). A avaliação de custo efetividade não tem sido feita para avaliar os
verdadeiros gastos em países em desenvolvimento (SIMEÃO et al., 2009).

1.1.1 Epidemiologia

De acordo com a Organização Mundial de Saúde (OMS), a estimativa

global de doentes por TB em 2009 foi de 9,4 milhões de casos incidentes, 14
milhões de casos prevalentes, 1,3 milhões de mortes, sendo que 0,38 milhões de
mortes foram entre pessoas com HIV positivo. Aproximadamente um bilhão de
indivíduos estará infectado pelo M. tuberculosis, 200 milhões desenvolverão doença
ativa e 70 milhões morrerão até 2020 (WHO, 2010).

Em 2009, o Brasil notificou 72.000 casos novos de TB correspondendo a

um coeficiente de incidência de 38/100.000 habitantes. Destes, 41.117 casos novos
foram bacilíferos (casos com baciloscopia de escarro positiva), apresentando um
coeficiente de incidência de 41/100.000 habitantes. Estes indicadores colocam o
 17

Brasil na 19ª posição em relação ao número de casos e na 104a posição em relação

ao coeficiente de incidência. A distribuição dos casos está concentrada em 315 dos
5.564 municípios do país, correspondendo a 70% da totalidade dos casos. Em 2008
a TB no Brasil foi a quarta causa de morte por doenças infecciosas e a primeira
causa de morte dos pacientes com Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (AIDS)
(WHO, 2010). No Estado de Minas Gerais, foram constatados aproximadamente
6.000 casos de TB nos últimos seis anos com coeficiente de incidência de 23/100
mil habitantes, o que representa o quarto menor coeficiente de incidência da região
sudeste, e a quarta maior carga de TB no país. Em sua maioria, os óbitos ocorrem
nas regiões metropolitanas e em unidades hospitalares. O coeficiente de
mortalidade foi de 1,3/100 mil.

Em 2010, foram notificados cerca de 840 casos de tuberculose, em

moradores de Belo Horizonte. Destes, 692 são casos novos (coeficiente de
incidência de 28/100 mil). Cerca de 50% dos casos ainda são descobertos em
hospitais, serviços de urgência e ambulatórios de referência (BELO HORIZONTE,
2011). A capital atende também casos de tuberculose em moradores de outras
cidades, principalmente da sua Região Metropolitana, o que significa um acréscimo
de 30% no número total de casos atendidos em Belo Horizonte (BELO HORIZONTE,
2011).

Para que haja redução da incidência de TB é necessário que se

descubram, no mínimo, 70% dos casos estimados de tuberculose pulmonar
bacilífera (a forma transmissível da doença) e destes, pelo menos 85% sejam
curados, com índices de abandono toleráveis de até 5% (WHO, 2010).

Estudos mostram que há uma variabilidade geográfica marcante tanto na

prevalência quanto na distribuição das espécies responsáveis pelas doenças
causadas por MNT amplamente distribuídas no ambiente com altas taxas de
isolamento em todo o mundo (GRIFFITH et al., 2007).

Observa-se que, nos países desenvolvidos, a incidência de TB diminuiu e

a ocorrência de MNT em doenças pulmonares aumentou. A pandemia da AIDS foi o
que mais contribuiu para este aumento (GRIFFITH et al., 2007).
 18

Nos países em desenvolvimento, pouco se sabe sobre a ocorrência das

MNT em indivíduos HIV negativos e positivos. No Brasil, verifica-se um aumento da
doença por MNT após a epidemia da AIDS, mas os dados sobre a frequência das
espécies e a prevalência da doença ainda não são exatamente conhecidos (BONA
et al., 2011).

1.1.2 Agente etiológico

O gênero Mycobacterium consiste em bastonetes aeróbios imóveis, não

esporulados e que ocasionalmente formam filamentos ramificados. Sua classificação
é baseada na sua ácido-resistência, presença de ácidos micólicos contendo 60 a 90
carbonos clivados por pirólise para formar ácidos graxos metil ésteres C22 a C26 e
alta quantidade de guanina mais citosina (G + C) 61% a 71% constitui o seu DNA. A
estrutura básica da parede celular das micobactérias é mais complexa que a de
outras bactérias; proteínas, manosídios de fosfatidilinositol e lipoarabinomanano
(LAM) se encontram ancorados na membrana plasmática. A camada de
peptidoglicanos forma a base sobre a qual se ligam arabinogalactanos, que são
polissacarídeos ramificados formados por D-arabinose e D-galactose. O resíduo
terminal de D-arabinose é esterificado, formando ácidos micólicos hidrofóbicos de
alto peso molecular, com moléculas glicolipídicas e peptidoglicolípidios. Os
componentes lipídicos compõem 60% do peso da parede celular. Proteínas e
porinas de transporte estão distribuídas pelas camadas da parede celular,
constituindo 15% de seu peso. As proteínas são antígenos biologicamente
importantes, estimulando a resposta imune celular do paciente contra a infecção.
Outros fatores de virulência também estão associados, como o fator corda (FC):
glicopeptídio tóxico para as células mamíferas capaz de inibir a migração de
leucócitos polimorfonucleares (MURRAY et al., 2009).

1.1.3 Identificação de micobactérias

As culturas para micobactéria que crescem em meio sólido Lowenstein-

Jensen (LJ), são analisadas macroscopicamente quanto à cor das colônias; sua
morfologia, o tempo de crescimento e microscopicamente quanto à sua capacidade
de formar FC (BRASIL, 2008).
 19

Para a identificação do CMTB em LJ, as colônias devem ser

acromógenas, de aspecto rugoso, formar corda, ter o crescimento inibido em
presença ácido p-nitrobenzóico (PNB) e o teste de niacina ser positivo. Para a
definição da espécie M. tuberculosis deve haver crescimento em LJ acrescido de
ácido tiofeno 2-carboxílico (TCH); inibição em PNB; crescimento em presença de
estreptomicina (S); crescimento acrescido de cicloserina (CS); teste da preferência
de oxigênio (crescimento na superfície do meio); teste da Piramidase (PZAse)
negativo; teste de redução do nitrato positivo; teste combinado da produção de
niacina e redução de nitrato positivos (BRASIL, 2008) .

O diagnóstico de doença por MNT exige muita cautela, pois o seu

isolamento, a partir de espécimes clínicos não estéreis, pode significar colonização
transitória ou contaminação. A American Thoracic Society recomenda que o
diagnóstico dessas doenças seja feito com base em uma série de critérios
bacteriológicos, clínicos e radiológicos. Por essa razão, a correlação clínico-
laboratorial é de fundamental importância para o estabelecimento do diagnóstico de
doença por MNT e para determinação da estratégia terapêutica (GRIFFITH et al.,
2007).

Nos últimos anos, o número MNT isoladas de espécimes clínicos vem

aumentando, em parte devido a infecções oportunistas que acompanham a
imunossupressão. Tradicionalmente, o diagnóstico definitivo de infecções por
micobactérias depende do isolamento e identificação dos agentes causadores e
requer uma série de testes bioquímicos específicos. Em razão das espécies de
micobactérias apresentarem diferentes sensibilidades aos fármacos, a identificação
precisa é crucial para a adoção adequada da terapia medicamentosa (SENNA et al.,
2011).

[Link] Identificação fenotípica

A identificação fenotípica das micobactérias inclui um conjunto de testes

baseados em características das culturas tais como tempo e temperatura de
crescimento. A temperatura pode variar de 25 a 45ºC de acordo com a espécie e
produção de pigmentos. As características bioquímicas também são de grande
 20

importância na identificação das espécies de MNT, como a capacidade de

crescimento em meios seletivos e testes enzimáticos. O tempo de crescimento
inferior a sete dias é considerado como um tempo rápido e é um parâmetro
importante de identificação para as MNT (BRASIL, 2008).

[Link] Identificação bioquímica

Métodos bioquímicos utilizados para diferenciação das espécies de MNT

são: crescimento em meio de cultura LJ com adição de NaCl a 5%, diferencia M.
Tuberculosis e Mycobacterium fortuitum (M. fortuitum); hidrólise do tween 80 entre
M. kansasii e Mycobacterium avium (M. avium); arilsulfatase 3 e 14 dias entre M.
fortuitum e M. avium; β-galactosidase entre M. chelonae e M. avium; redução do
telurito de potássio entre M. tuberculosis e M. avium; teste da urease entre M. bovis
(BCG), M. kansasii e M. avium; inibição de crescimento em meio com adição de
citrato de sódio; inibição de crescimento em meio com adição de manitol e inibição
de crescimento em meio com adição de inositol entre M. fortuitum, M. smegmatis, M.
chelonae, M. peregrinum e M. abcessus (ARANAZ et al., 2003).

[Link] Identificação molecular

Plikaytis et al. (1992 citado por TELENTI et al., 1993), utilizando regiões
distintas do gene, descreveram a identificação bem sucedida de micobactérias por
meio da análise de restrição por digestão de fragmentos amplificados do gene hsp
65 ― hsp65 PCR-Restriction enzyme analysis (PRA, análise por enzimas de
restrição por PCR do gene hsp 65). A maioria dos padrões de DNA gerados para a
análise dos produtos amplificados por meio da PCR do Mycobacterium é específica
para cada espécie (TELENTI et al., 1993).

O método consiste na amplificação pela reação em cadeia da polimerase

(PCR) de um fragmento de 439 pb do gene hsp65, que depois é digerido usando-se
duas enzimas de restrição, BstII e HaeIII. A determinação da espécie é possível
comparando os padrões de restrição com um algorítimo. Essa metodologia pode
 21

diferenciar a maioria das espécies de MNT, mas não as do CMTB (TELENTI et al.,
1993).

[Link] Método imunocromatográfico

A MPT64 é uma proteína secretora de 24 kDa e é um dos principais

antígenos da bactéria da TB. Recentemente, a MPT64 foi utilizada para diferenciar
as micobactérias pertencentes ao CMTB de outras espécies micobacterianas
(TOMIYAMA et al., 1997). A Diagnostics, Inc. (SD) (Yongin, Coréia) desenvolveu o
SD BIOLINE TB AgMPT64 teste RAPID®, um ensaio simples e rápido que utiliza
anticorpos monoclonais de rato anti-MPT64 capaz de discriminar por
imunocromatografia quais micobactérias pertencem ao CMTB das MNT.

Este teste, comparado à identificação em meio de cultura por método

convencional, considerado padrão ouro, teve sensibilidade e especificidade de
100%. É um teste extremamente simples e não exige qualquer preparação da
amostra ou de instrumentação, pode ser realizado por crescimento em meios de
cultivos líquido ou sólido.

[Link] Método cromatográfico

Cromatografia em camada delgada

A Thin-layer chromatography (TLC), cromatografia em camada fina tem

sido utilizada por vários laboratórios para confirmação rápida de identificação
micobacteriana de acordo com o seus perfis de ácidos micólicos. A TLC é uma
técnica útil devido à sua simplicidade e requer pequenas quantidades de material.
Esta técnica consiste de uma fase estacionária imobilizada em uma placa de vidro
ou de plástico e um solvente. A amostra pode ser líquida ou dissolvida em um
solvente volátil e, então, depositada como um ponto na fase estacionária. Os
constituintes da amostra podem ser identificados com a execução simultânea de
padrões e da amostra desconhecida. Uma borda da placa é então colocada num
reservatório de solvente e o solvente migra para a placa por capilaridade. Quando a
frente do solvente atinge a outra borda da fase estacionária, a placa é removida do
 22

reservatório de solvente. Os diferentes componentes da mistura que migraram até a

placa com diferentes taxas e as manchas separadas são visualizadas. Estas
manchas são comparadas em uma tabela que mostra os perfis das espécies das
micobactérias mais comumente isoladas. A desvantagem está em não se utilizar
espécimes clínicos diretos (LEÃO et al., 2005).

Cromatografia líquida de alta eficiência

O método é baseado na detecção de ácidos micólicos por High

Performance Chomatography líquida (HPLC), em que todas as espécies de
micobactérias têm um ácido micólico padrão em particular. O método consiste em
várias etapas que resumidamente são: a colheita das células a partir de cultura de
LJ, a evaporação do extrato e a derivatização de ácidos graxos com brometo de
bromophenacyl, clarificação das amostras por UV-HPLC. O método consiste na
análise de ácidos micólicos, em interpretação do padrão de ácido micólico e
identificação das espécies (LEÃO et al., 2005).

As vantagens deste método é que ele pode ser completado em poucas

horas, não é caro (sendo que o custo de cada identificação é calculado em 3,00
USD), e pode identificar uma grande variedade de espécies, bem como revelar
espécies ainda desconhecidas. As desvantagens são o custo inicial do equipamento,
a necessidade de um bom crescimento de bactérias para se ter um padrão de ácido
micólico e um profissional com grande experiência em laboratório e na proficiência
em interpretação dos padrões de ácidos micólicos (LEÃO et al., 2005).

[Link] Método fagotípico

Durante a última década uma série de bacteriófagos específicos com

afinidade por micobactérias tem aparecido para o diagnóstico rápido da TB. Desde
1947, mais de 250 tipos diferentes de micobacteriófagos têm sido isolados e
descritos, e eles constituíram importantes ferramentas para a manipulação genética
de micobactérias. No entanto, um grau de utilidade clínica só foi mostrado por duas
das abordagens baseadas em fago desenvolvido até o momento, ou seja, o Ensaio
Phage luciferase Reporter (LRP) e Phage Essay amplificado (ou Pha B MAB).
 23

A diferença mais importante entre esses métodos diz respeito à detecção

de fagos infectados com células micobacterianas. A LRP depende da luz emitida
que é codificada pelo gene de luciferase (fflux), que é inserido no fago genoma. Já a
Pha B ou MAB é baseado na presença de M. tuberculosis viável de células
complexas após a amplificação do fago (Mycobacteriophage D29) em cultura do M.
smegmatis e é utilizado principalmente em testes de sensibilidade a isoniazida e
rifampicina. O PhaB ou MAB tem sido comercializado (FAST Plaque TB ou a
variante PhageTeK MB, Biotec Laboratories Ltda, Ipswich, Suffolk, Reino Unido)
para o diagnóstico de TB em amostras respiratórias (ALCAIDE; COLL, 2011).

1.2 Fator corda (FC)

A formação de corda ou o chamado FC ou grumos aglomerados lineares

pode ser observada em esfregaços de cultura em meio sólido ou líquido, corado pelo
método de Zielh-Neelsen. Geralmente, os bacilos apresentam–se em paliçada
adquirindo um aspecto de corda. Outras vezes apresentam–se como grumos
compactos assemelhando-se a borrão de corantes (FIG. 1) (BRASIL, 2008).. Em
vários estudos tem sido avaliada a utilidade de se detectar a formação de corda
presente em cepas de M. tuberculosis, para a identificação presuntiva do CMTB,
uma vez que a maioria das espécies de MNT não apresenta essa característica
(ATTORRI et al., 2000).

FIGURA 1: Fator corda observado em meio sólido de Lowenstein Jensen

Coloração pelo método de Ziehl-Neelsen aumento de (1000x)

Fonte: Acervo do autor (out/2011)

 24

O FC é um efeito causado por uma molécula contendo ácido micólico, a

trealose 6,6-dimicolato (TDM), um componente da parede celular das micobactérias
envolvido em importantes mecanismos imunomoduladores responsáveis pela
virulência das micobactérias. Acredita-se também que o FC desempenhe um papel
fundamental na patogênese e na persistência de lesões crônicas e granulomatosas
causadas por micobactérias (SILVA et al., 1985). A presença do FC pode ser um
determinante no sucesso da infecção por M. tuberculosis e na sua sobrevida nos
macrófagos por meio da inibição de eventos de fusão de fagossomos e lisossomos
durante a infecção (INDRIGO et al., 2003). A maioria das MNT não forma corda,
exceto algumas espécies como M. kansasii, M. fortuitum e M. chelonae. No entanto,
o aspecto microscópico da MNT é de bacilos isolados e de tamando menor que 2µm
(cocobacilo) ou maiores que 5µm. A diferenciação entre a formação da corda das
espécies do CMTB e MNT pode também ser feita pela observação do tamanho do
bacilo isolado no esfregaço (BRASIL, 2008).

A detecção do FC associada à avaliação morfológica de colônias de

micobactérias em meio sólido tem grande utilidade para caracterizar as espécies. As
colônias de M. tuberculosis têm o formato de migalhas de pão ou de couve-flores,
são secas, acromógenas e branco-acinzentadas ou amarelo-acastanhadas. Já as
MNT têm um aspecto liso e úmido característico podendo ser alaranjadas ou mesmo
amareladas (BRASIL, 2008).

O acometimento pelas MNT em pacientes imunossuprimidos, como os

portadores do HIV, é bem descrito na literatura. O aumento de MNT em pacientes
não portadores HIV/AIDS é descrito na fibrose cística, doenças pulmonares prévias,
sequelas pós-cirurgias, entre outras. Entre as diferentes MNT, o complexo
Mycobacterium chelonae-abscessus representa um grupo que consiste de três
espécies proximamente relacionadas: Mycobacterium chelonae ([Link]),
Mycobacterium abscessus ([Link]) e Mycobacterium immunogem (M.
immunogem), que frequentemente podem estar associadas à contaminação de
reservatórios de água hospitalar, de equipamentos hospitalares e das tubulações do
sistema hídrico municipal (GRIFFITH et al., 2007).
 25

Segundo um estudo dos Centros para Controle e Prevenção de Doenças

dos Estados Unidos (CDC), M. abscessus e M. chelonae são espécies
proximamente relacionadas e frequentemente associadas a surtos de infecção
hospitalar (GRIFFITH et al., 2007).

O que tem contribuído para aumentar a importância das MNT como

patógenos humanos foi a melhora na metodologia de identificação nos laboratórios
de micobactéria (GRIFFITH et al., 2007). Alguns isolados de MNT, especialmente
aqueles de crescimento rápido, podem, entretanto, exibir características
morfológicas semelhantes às da M. tuberculosis, porém essas são diferenciadas do
CMTB que têm crescimento lento (FAIRHUST et al., 2002).
 26

2 JUSTIFICATIVA

A observação da formação do FC tem sido considerada um teste rápido

na identificação presuntiva do CMTB. A diferenciação entre o CMTB e a MNT é
essencial para o tratamento adequado. As MNTs podem acometer pacientes com
doenças respiratórias prévias, como fibrose cística, sequelas pulmonares, pós-
cirurgias torácicas, além dos coinfectados pelo HIV (SIMEÃO et al., 2009).

Em laboratórios onde não se dispõe de técnicas de identificação mais

sofisticadas, a identificação presuntiva do CMTB por meio da observação do FC
servirá também para direcionar a realização de diferentes metodologias empregadas
na identificação definitiva das micobactérias e teste de sensibilidade (SIMEÃO et al.,
2009)..

Não há trabalhos descritos na literatura que comparem metodologias de

detecção do FC para a identificação presuntiva do CMTB, nas fontes pesquisadas
(Medline, Lilacs e Scopus).
 27

3 OBJETIVOS

3.1 Objetivo geral

Avaliar diferentes metodologias para detectar a presença do Fator Corda

(FC) na identificação presuntiva do CMTB.

3.2 Objetivos específicos

Utilizar:
a. coloração pelo método de Ziehl-Neelsen (ZN) para a detecção do FC a partir
de esfregaços positivos diretamente de amostra clínica;
b. coloração pelo método de ZN e Auramina “O” (AU) para a detecção do FC a
partir de colônias de micobactérias;
c. observação direta dos esfregaços de colônias de micobactérias sem coloração
utilizando microscopia de luz invertida para detecção do FC.

Comparar as metodologias citadas acima.

 28

4 NOTA EXPLICATIVA

Seguindo a orientação do Programa de Pós-Graduação em Ciência da

Saúde Infectologia e Medicina Tropical a dissertação de mestrado deve conter um
artigo a ser submetido em revista indexada.

Artigo a ser submetido para publicação no Brazilian Journal of

Mycrobiology (Qualis B3) intitulado:
“Detecção do fator corda: utilização de diferentes metodologias com e sem
coloração para uma rápida identificação presuntiva do complexo
mycobacterium tuberculosis”
 29

5 ARTIGO

DETECÇÃO DO FATOR CORDA: UTILIZAÇÃO DE DIFERENTES

METODOLOGIAS COM E SEM COLORAÇÃO PARA UMA RÁPIDA
INDENTIFICAÇÃO PRESUNTIVA DO COMPLEXO MYCOBACTERIUM
TUBERCULOSIS

Roberto Silva1
Wânia da Silva Carvalho2
Nayanne Teixeira Dantas3
Silvana Spíndola de Miranda4

Autor correspondente:
Nome: Roberto Silva
Endereço: Rua Aristides Nonato dos Santos, N° 53, apto. 301
E-mail: roberto@[Link]

1
Setor de Micobactérias/Hospital das Clínicas/Universidade Federal de Minas Gerais
2
Professora Associada I - Faculdade de Farmácia/Departamento de Farmácia Social/Universidade
Federal de Minas Gerais
3
Mestre pela Universidade Federal de Minas Gerais/Médica
4
Professora Associada III da Faculdade de Medicina/Universidade Federal de Minas
Gerais/Coordenadora do Grupo de Pesquisa em Micobacterioses CNPq/FM/UFMG/REDE-TB
 30

RESUMO

A diferenciação rápida entre M. tuberculosis e micobactérias não

tuberculosa é essencial para o tratamento adequado dos pacientes, principalmente
coinfectados com o Vírus da Imunodeficiência Humana ou pacientes com doenças
respiratórias de base, tais como: fibrose cística e sequelas pulmonares prévias.
Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar diferentes metodologias com e sem
coloração na detecção do Fator Corda (FC) para uma rápida identificação presuntiva
do Complexo Mycobacterium tuberculosis (CMTB). Um esfregaço de escarro foi
corado pelo método de Ziehl-Neelsen (ZN), dois esfregaços de colônias de
micobactérias foram corados pelo método de ZN e Auramina “O” (AU) e um
esfregaço foi visualizado diretamente em microscópio à luz invertida (MLI) sem
coloração para a detecção do FC. Dois observadores realizaram as metodologias de
maneira cega. Em 10/21 esfregaços de escarro (47,6%) foi detectado o FC, o que
correspondeu a 100% de sensibilidade e especificidade. Das 88/101 culturas de
micobactérias coradas pela técnica de ZN (87,1%) foi detectado o FC, o que
correspondeu a uma sensibilidade de 100%; especificidade 81,3%; acurácia de
97,0% e Kappa = 0,88 (muito boa concordância). Pela coloração de AU 89/101
(88,1%) foi visualizado o FC, o que correspondeu a uma sensibilidade de 100%;
especificidade 75,0%; acurácia de 96,0% e Kappa = 0,83 (muito boa concordância).
Sem coloração e visualização direta em MLI 90/101 (89,1%) foi visualizado o FC, o
que correspondeu uma sensibilidade de 100%; especificidade 68,8%; acurácia de
95% e Kappa = 0,79 (boa concordância) sem coloração com MLI. A especificidade
alcançou 100% quando associada à observação das colônias em LJ. Houve alta
concordância entre os observadores. A detecção do FC para a identificação
presuntiva do CMTB tem excelente acurácia tanto pela coloração direta do escarro,
quanto em colônias positivas pelas metodologias de ZN, AU e MLI, sendo esta
última mais rápida, e pode ser utilizada para direcionar as metodologias de
identificação definitiva em laboratórios de micobactérias.

Descritores: Tuberculose; Identificação de Micobactérias; Fator Corda.

 31

INTRODUÇÃO

As doenças produzidas pelas espécies do gênero Mycobacterium são

importantes causas de morbidade e mortalidade em todo o mundo; elas acometem
vários indivíduos e principalmente os pacientes imunossuprimidos como os
portadores do Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV). As micobactérias podem
pertencer ao Complexo Mycobacterium tuberculosis (CMTB) ou as Micobactérias
não tuberculosas (MNT)(8).

A maioria dos indivíduos tem doença ativa causada pelo Mycobacterium

tuberculosis (M. tuberculosis). A diferenciação entre o CMTB e a MNT é essencial
para o tratamento adequado e conduta de isolamento dos pacientes. O
acometimento por MNT em pacientes portadores do HIV é bem descrito na literatura,
mas pode acometer pacientes com outras patologias tais como os portadores de
fibrose cística, doenças pulmonares crônicas, sequelas, pós-cirurgias, entre outras (7).

Técnicas alternativas para a detecção das espécies micobacterianas têm

sido utilizadas, como: cromatografia em camada fina, cromatografia gás-líquida,
cromatografia líquida de alta performance (HPLC) e técnicas moleculares baseadas
em hibridização, amplificação ou sequenciamento de ácidos nucléicos, mas todas
estas técnicas são mais acessíveis em laboratórios de países desenvolvidos que as
utilizam principalmente em seus laboratórios de pesquisa(3). Alguns estudos
avaliaram a utilidade da observação da formação do Fator Corda (FC) em meio
sólido para a identificação presuntiva do CMTB, principalmente em laboratórios que
não dispõem de técnicas de identificação mais sofisticada (2, 5, 10, 11)
. Além disso, a
observação do FC pode servir para direcionar a realização de metodologias básicas
empregadas na identificação das espécies micobacterianas, ou identificação das
MNT por amplificação de ácidos nucléicos e teste de sensibilidade. Assim, este
estudo tem como objetivo avaliar diferentes metodologias com e sem coloração na
detecção do FC para uma rápida identificação presuntiva do CMTB. É importante
ressaltar que não há trabalhos descritos na literatura que comparem metodologias
de avaliação de FC para a identificação presuntiva do CMTB.
 32

MATERIAIS E MÉTODOS

O presente estudo foi realizado no Laboratório de Micobactérias da

Faculdade de Medicina/Hospital das Clínicas da Universidade Federal de Minas
Gerais (HC/UFMG) e foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da
UFMG/ETIC 621/08. Foram avaliados consecutivamente no ano de 2009 a 2011 os
esfregaços de amostras clínicas e colônias de micobactérias crescidas em meio de
Lowensteins Jensen (LJ), para a detecção do FC.

Foram definidos como FC os bacilos que se apresentaram em paliçada

adquirindo um aspecto de corda ou em grumos compactos (4).

Para a detecção do FC foram incluídos 21 esfregaços realizados de

amostras clínicas (escarro) somente quando as baciloscopias eram de 2+ ou mais,
101 culturas positivas de micobactérias, sendo 85 M. tuberculosis e 16 MNT que
tiveram a identificação fenotípica realizada no Laboratório de Referência do Estado
de Minas Gerais/Fundação Ezequiel Dias (FUNED), sendo considerado padrão-
ouro. A morfologia das colônias e o tempo de crescimento micobacteriano em meio
de LJ também foram avaliados. Culturas com colônias crescidas na superfície do
meio, de cor creme, rugosa foram consideradas como prováveis do CMTB, enquanto
colônias lisas, úmidas, cor creme, amareladas ou alaranjadas foram consideradas
como MNT (12).

A leitura das lâminas foi realizada por dois observadores sem o

conhecimento prévio da identificação das espécies micobacterianas. Cada amostra
clínica de paciente foi incluída apenas uma única vez no estudo. As metodologias de
coloração e semeio em meio sólido seguiram as Normas Laboratoriais do Ministério
da Saúde (4).

Os cálculos estatísticos foram realizados pelo programa Cálculos

Estatísticos Básicos para Testes Diagnósticos (6).
 33

Metodologia I

Os esfregaços das amostras clínicas (escarro) foram corados pela

metodologia de Ziehl Nelseen (ZN) para observação do FC(8). Não foi realizada a
coloração pela Auramina.

Metodologia II

Foram realizados três esfregaços de forma circular em uma lâmina

utilizando-se uma gota de água destilada estéril das colônias de micobactérias.
Estas colônias foram avaliadas quanto às características morfológicas, coloração e
tempo de crescimento. Um esfregaço após seco e fixado foi corado pelo método de
ZN e outro pela auramina “O” (AU), os quais foram observados em microscópio de
campo claro e de fluorescência, respectivamente (Carl Zeiss Axiolab)®. O terceiro foi
observado diretamente sem coloração em microscópio de luz invertida (MLI) (Carl
Zeiss Jena)®.

RESULTADOS

Fator corda realizado em esfregaços das amotras clínicas

Dos 21 esfregaços o FC foi detectado (identificação presumível do CMTB)

em 47,6% (10/21), correspondendo a 100% de sensibilidade e especificidade
quando comparado ao padrão-ouro. Portanto, muito boa concordância e 100% de
acurácia.

Fator corda de colônias isoladas em meio de LJ

Dos 101 esfregaços corados pelo método de ZN foi possível constatar

que 88/101 (87,1%) apresentaram o FC e 13/101 (9,9%) não apresentaram o FC, o
que correspondeu a uma sensibilidade de 100%; especificidade 81,3%; VPP 96,6%;
VPN 100%; acurácia de 97,0% e Kappa = 0,88 (muito boa concordância - IC95%)
(tabela 1 e figura 1).
 34

Dos 101 esfregaços corados pelo método de AU foi possível constatar

que 89/101 (88,1%) apresentaram o FC e 12/101 (11,9%) não apresentaram o FC, o
que correspondeu a uma sensibilidade 100%; especificidade 75,0%; VPP 95,5%;
VPN 100%; acurácia de 96,0% e Kappa=0,83 (muito boa concordância- IC95%)
(tabela 2 e figura 2).

Dos 101 esfregaços sem coloração e visualizados em MLI foi possível

constatar que 90/101 (89,1%) apresentaram o FC e 11/101 (10,8%) não
apresentaram o FC, o que correspondeu a uma sensibilidade de 100%;
especificidade 68,8%; VPP 95,5%; VPN 100%; acurácia de 95% e Kappa = 0,79
(boa concordância - IC95%) (tabela 3 e figura 3).

Quando a avaliação das características das colônias, coloração e tempo

de crescimento foram avaliadas conjuntamente à observação do FC a especificidade
alcançou 100% em todas as metodologias (ZN, AU e MLI).

Fator corda realizado em esfregaços das amotras clínicas versus fator corda
de colônias isoladas em meio de LJ

Dos 10 esfregaços em que foi visualizado o FC, quando comparados com

suas respectivas culturas, essas também tinham a presença do FC (concordância de
100%). Houve alta concordância dos resultados entre os dois observadores.
 35

TABELA 1 – Detecção do fator corda de 101 cepas isoladas em meio de

Loweinstein-Jensen no período de 2009-2011 pelo método de coloração de Ziehl
Neelsen

No. cepas MS (ZN)

Espécies isoladas
LRE FC+ FC-
Complexo Mycobacterium tuberculosis 85 85 0
M. kansasii 2 1 1
Complexo M. avium intracellulare 2 0 2
M. abscessus 3 1 2
M. pregrinum 1 1 0
M. fortuitun 1 0 1
Outras MNT 7 0 7
Total 101 88 13

MS = Meio sólido; FC (+) = Fator corda positivo; FC (-) = Fator corda negativo
n° cepas LRE = Número de cepas identificadas no Laboratório de Referência Estadual de Minas
Gerais/FUNED

TABELA 2 – Detecção do FC em 101 cepas isoladas em meio de Loweinstein-

Jensen no período de 2009-2011 pelo método de coloração pela Auramina “O”
No. cepas MS (AU)
Espécies isoladas
FUNED FC+ FC-
Complexo Mycobacterium tuberculosis 85 85 0
M. kansasii 2 1 1
Complexo M. avium intracellulare 2 1 1
M. abscessus 3 1 2
M. pregrinum 1 1 0
M. fortuitun 1 0 1
Outras MNT 7 0 7
Total 101 88 12

MS = Meio sólido; FC (+) = Fator corda positivo; FC (-) = Fator corda negativo
n° cepas LRE = Número de cepas identificadas no Laboratório de Referência Estadual de Minas
Gerais/FUNED
 36

Tabela 3 – Detecção do fator corda de 101 cepas isoladas em meio de Loweinstein-

Jensen no período de 2009-2011 sem coloração e visualizadas em microscópio de
luz invertida

No. cepas MS (LI)

Espécies isoladas
LRE FC+ FC-
Complexo Mycobacterium tuberculosis 85 85 0
M. kansasii 2 1 1
Complexo M. avium intracellulare 2 0 2
M. abscessus 3 1 2
M. pregrinum 1 1 0
M. fortuitun 1 0 1
Outras MNT 7 2 5
Total 101 90 11

MS = Meio sólido; FC (+) = Fator corda positivo; FC (-) = Fator corda negativo
n° cepas LRE = Número de cepas identificadas no Laboratório de Referência Estadual de Minas
Gerais/FUNED
 37

A = presença do fator corda B = ausência do fator corda

Figura 1: Observação do fator corda, coloração de Ziehl Neelsen, microscópio óptico
(aumento de 1000x) em meio Lowensteins Jensen
Fonte: Acervo do autor (junho 2011)

B = ausência do fator corda (bacilos difusos)

A = presença do fator corda (seta maior artefatos; seta menor grumos de
bacilos (fator corda)
Figura 2: Observação do fator corda, coloração de Auramina “O”, microscópio à
fluorescência (aumento de 400x) em meio de Lowensteins Jensen
Fonte: Acervo do autor (junho 2011)

A = presença do fator corda (grumos) B = ausência do fator corda.

Figura 3: Observação do fator corda em microscópio à luz invertida (aumento de 400x) em
meio Lowensteins Jensen (LJ)
Fonte: Acervo do autor (junho 2011)
 38

DISCUSSÃO

A identificação rápida de pacientes portadores de micobactérias do CMTB ou

MNT tem grande importância epidemiológica, além da indicação terapêutica mais
adequada e na conduta de isolamento, principalmente em hospitais de alta
complexidade.

Apesar da detecção de bacilo álcool ácido resistente no escarro possuir

baixa sensibilidade, este permanece como um dos exames mais utilizados para o
diagnóstico da TB pulmonar(14), e uma identificação presuntiva do CMTB pode
auxiliar em tomadas de decisões, em casos de pacientes imunossuprimidos
(pacientes portadores do HIV, neoplasias, transplantes, entre outras patologias).
Estudos realizados em Hospitais Gerais relatam a presença de MNT em 15% dos
isolados de pacientes internados, demonstrando a importância da presunção
diagnóstica (13).

No Japão pesquisadores descreveram um resultado pouco expressivo na

avaliação de esfregaços de escarro para a identificação presuntiva do CMTB quando
as amostras tinham uma positividade de 2+ ou mais, corados pela técnica de ZN(1).
No presente estudo foi observada alta sensibilidade, especificidade e acurácia, o
que discorda deste estudo. Não foi possível observar o FC no esfregaço das
amostras clínicas corado pela AU após um estudo piloto, pois os bacilos sempre se
apresentaram de forma isolada, motivo pelo qual esta técnica não foi realizada neste
trabalho.

Alguns estudos avaliaram a utilidade da formação do FC em meio líquido

ou sólido para a identificação presuntiva do CMTB(9). Nesse estudo foi avaliado em
meio sólido a presença do FC pelos métodos de coloração de ZN e AU, e sem
coloração em MLI. A sensibilidade (100%, 100%, 100%), o VPP (96,6%, 95,5%,
95,5%) e o VPN (100%, 100%, 100%), respectivamente, foram superiores aos
encontrados por outros autores no que se refere ao método de coloração pelo ZN.
Esses autores demonstraram uma variação de 63,5 a 85,0%, 90,0 a 99,2% e 69,7 a
98,8%, para sensibilidade, VPP e VPN, respectivamente. A especificidade de 81,3%
para o ZN foi menor do que os trabalhos encontrados na literatura. Em relação à AU
 39

75% e MLI 68,8% também apresentaram baixa especificidade, mesmo que dados
não tenham sido encontrados para comparação. Porém, a observação morfológica
das culturas tais como: aspecto, cor das colônias e o tempo de crescimento,
associado à observação do FC, possibilitaram corrigir estas discordâncias. Este fato
tem sido descrito por outros autores que também tiveram identificações equivocadas
quando utilizaram o FC como teste de identificação presumível do CMTB sem a
avaliação prévia das colônias (15).

Não há estudos que relatam a utilização da metodologia de AU e MLI na

observação do FC em colônias de micobactérias para a identificação presuntiva do
CMTB. Os resultados mostram que houve uma excelente acurácia e concordância
na comparação entre as metodologias de ZN, AU e MLI (97%, 96%, 95% e 0,88,
0,83, 0,79, respectivamente).

Na comparação entre os métodos de coloração a vantagem do método de

ZN em relação à AU pode ser a formação de borrões que podem confundir a
visualização do FC na fluorescência, por outro lado a AU não emite vapores tóxicos
por não necessitar de aquecimento. A visualização utilizando a MLI que não utiliza
coloração e se observa diretamente ao microscópio foi, portanto, mais rápida.

Apesar da baixa prevalência em nosso meio de MNT e o alto VPN

encontrado nesse estudo demonstra a fundamental importância em descartar as
MNT para que haja uma condução adequada de procedimentos, como descrito
anteriormente. Porém, o número de cepas de MNT foi pequeno e muitas espécies
podem não estar representadas neste estudo, sendo necessários então que outros
laboratórios desenvolvam as suas próprias experiências, para se possam realizar
novas pesquisas e comparações.

Um maior número de esfregaços de amostras clínicas coradas pelo método

de ZN deverá ser realizado para melhor avaliação, pois somente 21 amostras foram
testadas, mesmo sendo observada uma excelente concordância.

A observação independente dos dois observadores teve alta concordância

entre os métodos demonstrando a facilidade dos métodos, porém, são necessários
 40

treinamentos técnicos para a realização das metodologias, principalmente para a AU

e MLI.

Assim, pode-se concluir que é possível fazer a identificação presuntiva do

CMTB utilizando a análise visual diretamente de esfregaço de escarro com 2+ ou
mais e dos esfregaços das colônias em meio sólido com ou sem coloração. Estes
métodos podem ser utilizados em laboratórios onde se dispõe de microscópio de
fluorescência e luz invertida. A presença ou não do FC pode ser útil para guiar
decisões, definir condutas em laboratórios que realizem os testes mais complexos
como testes bioquímicos e moleculares e na realização de testes de sensibilidade,
gerando menor custo e diminuindo o tempo.

Apoio financeiro: Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais

(FAPEMIG) e do Progarama de Pós-Graduação em Infectologia e Medicina Tropical
da Faculdade de Medicina da Universidade Federal de Minas Gerais.
 41

REFERÊNCIAS

1. Abe, K.; Ohtani, S.; Hara, M.; Rinsho, Byori. (2006). Cord formation in smear
specimen prepared from sputum for a more rapid method of presumptive
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 43

6 CONSIDERAÇÕES FINAIS

Esse trabalho propõe a melhoria e agilidade na identificação do M.

tuberculosis e de MNT em um laboratório de rotina de micobactérias, onde são
recebidas amostras clínicas de pacientes provenientes de um hospital e de seus
anexos ambulatoriais de média e alta complexidade. Dentre os pacientes que
frequentam o HC/UFMG pode-se destacar os transplantados, portadores de HIV,
pacientes com diabetes e portadores de outras patologias que predispõem a
infecção e/ou doença pelo M. tuberculosis, e por outras micobactérias.

O treinamento da metodologia deve ser feito por um profissional

experiente, com capacidade para percepção dos detalhes na morfologia dos bacilos,
pois, apesar da observação do FC ser uma característica peculiar nas micobactérias
do CMTB podem-se observar fatores de confusão.

Foi realizada a observação da presença do FC em amostras clínicas

cultivadas em meio líquido, porém houve grande contaminação, impossibilitando a
análise dos resultados, sendo então necessária a melhor padronização desta
metodologia.
 44

7 PERSPECTIVAS

Utilização em rotina da observação do FC, diretamente dos esfregaços de

amostras clínicas e das colônias com e sem coloração.

Treinamento da equipe do laboratório de micobactérias.

Utilização de meio líquido para a observação do FC na identificação

presuntiva do CMTB.
 45

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 47

ANEXO A
FOLHA DE APROVAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA
 48

ANEXO B
FLUXOGRAMA ESQUEMÁTICO UTLILIZADO NA METODOLOGIA PARA A
OBSERVAÇÃO DO FATOR CORDA EM MEIO LOWENSTEIN JENSEN COM E
SEM COLORAÇÃO