PCR
Polymerase Chain Reaction is a technique used in molecular biology to create several copies of
a certain DNA segment.
is based on the enzymatic replication of DNA. In PCR, a short segment of DNA is amplified using
primer mediated enzymes
Components Of PCR :
[Link] Template– The DNA of interest from the sample.
[Link] Polymerase– Taq Polymerase is used. It is thermostable and does not denature at very
high temperatures.
[Link] Primers- These are the short stretches of single-stranded DNA
complementary to the 3’ ends of sense and anti-sense strands.
[Link] triphosphate– These provide energy for polymerization and are the
building blocks for the synthesis of DNA. These are single units of bases.
[Link] System– Magnesium and Potassium provide optimum conditions for DNA
denaturation and renaturation. It is also important for fidelity, polymerase activity, and
stability.
PCR Steps :
[Link]
Denaturation occurs when the reaction mixture is heated to 94℃ for about 0.5 to 2 minutes.
This breaks the hydrogen bonds between the two strands of DNA and converts it into a single-
stranded DNA.
The single strands now act as a template for the production of new strands of DNA. The
temperature should be provided for a longer time to ensure the separation of the two strands.
[Link]
The reaction temperature is lowered to 54-60℃ for around 20-40 seconds. Here, the primers
bind to their complementary sequences on the template DNA.
Primers are single-strand sequences of DNA or RNA around 20 to 30 bases in length.
They serve as the starting point for the synthesis of DNA.
The two separated strands run in the opposite direction and consequently there are two
primers- a forward primer and a reverse primer.
[Link]
At this step, the temperature is raised to 72-80℃. The bases are added to the 3’ end of the
primer by the Taq polymerase enzyme.
This elongates the DNA in the 5’ to 3’ direction. The DNA polymerase adds about
1000bp/minute under optimum conditions.
Taq Polymerase can tolerate very high temperatures. It attaches to the primer and adds DNA
bases to the single strand. As a result, a double-stranded DNA molecule is obtained.
These three steps are repeated 20-40 times in order to obtain a number of sequences of DNA
of interest in a very short time period.
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PCR A Reação em Cadeia da Polimerase é uma técnica utilizada em biologia molecular para
criar várias cópias de um determinado segmento de DNA. é baseada na replicação enzimática
do DNA. Na PCR, um segmento curto de DNA é amplificado usando enzimas mediadas por
primers Componentes do PCR : [Link] de DNA – O DNA de interesse da amostra. [Link]
Polimerase – Taq Polimerase é usado. É termoestável e não desnatura a temperaturas muito
altas. [Link]ídeos Primers- Estes são os trechos curtos de DNA de fita simples
complementares às 3' extremidades das fitas sensoriais e anti-sentido.
[Link]ídeo trifosfato – Estes fornecem energia para a polimerização e são os
blocos de construção para a síntese de DNA. São unidades únicas de bases. [Link] System –
Magnésio e potássio fornecem condições ideais para a desnaturação e renaturação do DNA.
Também é importante para fidelidade, atividade da polimerase e estabilidade. Etapas do PCR:
[Link]ção A desnaturação ocorre quando a mistura de reação é aquecida a 94°C por
cerca de 0,5 a 2 minutos. Isso quebra as ligações de hidrogênio entre as duas cadeias de DNA e
o converte em um DNA de fita simples. As fitas simples agora funcionam como um modelo
para a produção de novas fitas de DNA. A temperatura deve ser fornecida por um tempo maior
para garantir a separação dos dois fios. [Link] A temperatura de reação é reduzida
para 54-60°C por cerca de 20-40 segundos. Aqui, os primers se ligam às suas sequências
complementares no DNA modelo. Primers são sequências de fita simples de DNA ou RNA com
cerca de 20 a 30 bases de comprimento. Eles servem como ponto de partida para a síntese do
DNA. As duas cadeias separadas correm na direção oposta e, consequentemente, existem dois
primers - um primer para frente e um primer reverso. [Link]ção Nesta etapa, a temperatura
é elevada para 72-80°C. As bases são adicionadas à extremidade 3' do primer pela enzima Taq
polimerase. Isso alonga o DNA na direção de 5' a 3'. A DNA polimerase adiciona cerca de
1000bp/minuto em condições ótimas. Taq Polimerase pode tolerar temperaturas muito altas.
Ele se liga ao primer e adiciona bases de DNA à fita simples. Como resultado, uma molécula de
DNA de fita dupla é obtida. Essas três etapas são repetidas de 20 a 40 vezes para obter um
número de sequências de DNA de interesse em um período de tempo muito curto.