Universidade Tecnológica Federal do Paraná 3. Enriquecimento seletivo.
Campus Campo Mourão Princípio: Baseia-se na utilização de meios que contêm
Curso de Engenharia de Alimentos substâncias de ação impediente do crescimento para a
Disciplina de Microbiologia dos Alimentos maioria dos microrganismos interferentes e na incubação
Profa. Leila Larisa M. Marques em temperatura seletiva.
A partir do procedimento de pré- enriquecimento,
PESQUISA DE Salmonella inocular, simultaneamente, nos meios líquidos
seletivos conforme abaixo:
OBJETIVO Inoculação em caldo Rappaport Vassiliadis: Pipetar
Estabelecer metodologia analítica para a detecção de alíquotas de 0,1 mL das amostras pré-enriquecidas
Salmonella sp em amostras de alimentos. para tubos contendo 10 mL de caldo Rappaport
Salmonellas são bacilos gram-negativos, não esporulados, Vassiliadis. Incubar os tubos a 41 ± 0,5ºC, em
maioria móveis, patogênicas e que não fermentam a lactose. banho-maria, preferencialmente com agitação ou
Pertencem à família Enterobacteriaceae. Podem estar circulação contínua de água, por 24 a 30 horas.
presentes no solo, no ar, na água, em águas residuais, nos Inoculação em caldo selenito cistina: Pipetar
animais, nos seres humanos, nos alimentos, nas fezes e nos alíquotas de 1 mL das amostras pré-enriquecidas e
equipamentos. Entretando, o seu hábitat natural é o trato transferir para tubos contendo 10 mL de caldo
intestinal dos seres humanos e animais. selenito cistina. Incubar os tubos a 41 ± 0,5ºC em
banho-maria, por 24 a 30 horas.
TÉCNICA DE ANÁLISE 4. Isolamento e seleção.
Baseia-se na seleção de colônias de Salmonella em, pelo
1. Preparo de amostra. menos, dois meios sólidos: o ágar verde brilhante vermelho
Produtos sólidos: de fenol lactose sacarose (BPLS) ou (BG) obrigatoriamente
Antes da abertura da amostra, proceder à assepsia da e outro ágar de maior impediência. Utilizaremos (o
embalagem usando algodão embebido em solução Rambach) o XLD e Hectoen.
desinfetante e etanol 70% ou etanol 70º GL. a) Isolamento: a partir dos caldos de
Produtos Líquidos: enriquecimento (Rappaport e selenito-cistina),
Agitar ou inverter a amostra por 25 vezes. Antes da repicar em placas com meio sólido seletivo, por
abertura da embalagem, proceder à assepsia da mesma esgotamento. Incubar todas as placas, invertidas, a
usando algodão embebido em etanol 70% . Quando não 36 ± 1ºC por 18 a 24 horas.
houver espaço livre suficiente para homogeneização da b) Selecionar de 3 a 10 colônias suspeitas por
amostra, aspirar o conteúdo deste por 10 vezes. amostra e repicá-las em ágar não seletivo e incubar
Produtos em pó e granulados: a 36 ± 1ºC por 18 a 24 horas.
Agitar ou inverter o produto por 25 vezes. Antes da abertura Características das colônias típicas ou suspeitas de
da embalagem, proceder à assepsia da mesma usando Salmonella nos diferentes meios sólidos:
algodão embebido em etanol 70%. Em Ágar BPLS, as colônias apresentam-se incolores ou de
Ovos com casca: Lavar a casca de 5 a 7 ovos com escova e cor rosada, entre translúcidas a ligeiramente opacas.
secar bem. Colocá-los de molho em solução de ácido Quando rodeadas por microrganismos fermentadores de
peracético 0,02% por 15 min. Após, secar com algodão lactose, podem apresentar-se de cor verde-amarelada.
embebido em etanol 70%. Quebrar a casca Em Ágar Rambach, apresentam-se de cor vermelha,
assepticamente, transferindo a gema para recipiente estéril. enquanto S. Typhi e S. Paratyphi A, Proteus spp, e Shigella
Descartar as claras. Misturar as gemas com bastão estéril. spp., apresentam-se incolores. Os coliformes desenvolvem
Pesar 25 ± 0,2 g ou pipetar 25 ± 0,2 mL de cada colônias azul-esverdeadas (E. coli, Citrobacter) ou violeta-
amostra, homogeneizar por aproximadamente 60 azuladas (Klebsiella).
segundos e deixar 1 hora em temperatura Em Ágar XLD, as colônias são transparentes e às vezes
ambiente. com centro negro, sendo que a S. Typhi tem colônias
2. Pré-enriquecimento. alaranjadas, ligeiramente opacas.
Retirar assepticamente 25g ou mL da amostra e Em Agar Hectoen, as colônias são verdes ou verdes com
adicionar 225 mL do diluente específico para cada centro preto.
caso. Incuba-se de 16 a 20 horas, a 36 ± 1ºC. 5. Provas bioquímicas (próxima aula) – a partir do ágar não
Diluentes: seletivo (Agar nutriente)- 3 colônias típicas: 3 séries
Para leite em pó e soro de leite em pó, utilizar como bioquímicas.
diluente água destilada e adicionar 5 mL de verde
brilhante solução aquosa 0,1%. Referências Bibliográficas
Para produtos gordurosos (creme e manteiga) 1. SIQUEIRA, Regina Silva de. Manual de microbiologia de
utilizar como diluente solução salina peptonada 1% alimentos. Rio de Janeiro: Embrapa, 1995.
tamponada com 1% de Tween 80. 2. Instrução Normativa nº 62/2003 do Ministério da
Para os demais alimentos, utilizar solução salina Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA) - Análises
peptonada 1% tamponada. microbiológicas para alimentos de origem animal e água.
25 g amostra Homogeneizar
Pré-enriquecimento
+
225 mL de diluente
Estufa, 16- 20 h, a 36 ºC
0,1 mL 1mL
mL mL
mL
Enriquecimento seletivo: em
Enriquecimento seletivo: em 10mL
10mL caldo Rappaport
caldo selenito cistina
Vassiliadis
BM, 41ºC, por 24-30 h
BPLS (Rambach XLD Hectoen BPLS (Rambach) XLD Hectoen
) Rambach
Estufa, 36ºC , 18 a 24h h
Colônias suspeitas (3 a 10/amostra) AN (Agar nutriente, 24h, 36 ºC) Provas bioquímicas e
confirmação sorológica
Urease Açúcares Descarboxilação Meio SIM (Prova da Desaminação da VP Citrato de
da lisina (Sulphide oxidase) fenilalanina e Simmons
Indol VM
Motility)