ELISA: DEFINIÇÃO, VARIAÇÕES E PROTOCOLOS PRÁTICOS

1° Edição

ADALBERTO ALVES PEREIRA FILHO

Editora Amplla
Campina Grande, setembro de 2023
2023 - Editora Amplla
Copyright da Edição © Editora Amplla
Copyright do Texto © Os autores
Editor Chefe: Leonardo Pereira Tavares
Design da Capa: Editora Amplla
Diagramação: Juliana Ferreira
Revisão: Os autores

ELISA: definição, variações e protocolos práticos está licenciado sob CC BY 4.0.

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ISBN: 978-65-5381-153-9
DOI: 10.51859/amplla.edv539.1123-0

Editora Amplla
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2023
Alexander Josef Sá Tobias da Costa – Universidade do Estado do Rio de Janeiro
Andréa Cátia Leal Badaró – Universidade Tecnológica Federal do Paraná
Andréia Monique Lermen – Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Antoniele Silvana de Melo Souza – Universidade Estadual do Ceará
Aryane de Azevedo Pinheiro – Universidade Federal do Ceará
Bergson Rodrigo Siqueira de Melo – Universidade Estadual do Ceará
Bruna Beatriz da Rocha – Instituto Federal do Sudeste de Minas Gerais
Bruno Ferreira – Universidade Federal da Bahia
Caio Augusto Martins Aires – Universidade Federal Rural do Semi-Árido
Caio César Costa Santos – Universidade Federal de Sergipe
Carina Alexandra Rondini – Universidade Estadual Paulista
Carla Caroline Alves Carvalho – Universidade Federal de Campina Grande
Carlos Augusto Trojaner – Prefeitura de Venâncio Aires
Carolina Carbonell Demori – Universidade Federal de Pelotas
Cícero Batista do Nascimento Filho – Universidade Federal do Ceará
Clécio Danilo Dias da Silva – Universidade Federal do Rio Grande do Norte
Dandara Scarlet Sousa Gomes Bacelar – Universidade Federal do Piauí
Daniela de Freitas Lima – Universidade Federal de Campina Grande
Darlei Gutierrez Dantas Bernardo Oliveira – Universidade Estadual da Paraíba
Denilson Paulo Souza dos Santos – Universidade Estadual Paulista
Denise Barguil Nepomuceno – Universidade Federal de Minas Gerais
Dinara das Graças Carvalho Costa – Universidade Estadual da Paraíba
Diogo Lopes de Oliveira – Universidade Federal de Campina Grande
Dylan Ávila Alves – Instituto Federal Goiano
Edson Lourenço da Silva – Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Piauí
Elane da Silva Barbosa – Universidade Estadual do Ceará
Érica Rios de Carvalho – Universidade Católica do Salvador
Fernanda Beatriz Pereira Cavalcanti – Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”
Fredson Pereira da Silva – Universidade Estadual do Ceará
Gabriel Gomes de Oliveira – Universidade Estadual de Campinas
Gilberto de Melo Junior – Instituto Federal do Pará
Givanildo de Oliveira Santos – Instituto Brasileiro de Educação e Cultura
Higor Costa de Brito – Universidade Federal de Campina Grande
Hugo José Coelho Corrêa de Azevedo – Fundação Oswaldo Cruz
Isabel Fontgalland – Universidade Federal de Campina Grande
Isane Vera Karsburg – Universidade do Estado de Mato Grosso
Israel Gondres Torné – Universidade do Estado do Amazonas
Ivo Batista Conde – Universidade Estadual do Ceará
Jaqueline Rocha Borges dos Santos – Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro
Jessica Wanderley Souza do Nascimento – Instituto de Especialização do Amazonas
João Henriques de Sousa Júnior – Universidade Federal de Santa Catarina
João Manoel Da Silva – Universidade Federal de Alagoas
João Vitor Andrade – Universidade de São Paulo
Joilson Silva de Sousa – Instituto Federal do Rio Grande do Norte
José Cândido Rodrigues Neto – Universidade Estadual da Paraíba
Jose Henrique de Lacerda Furtado – Instituto Federal do Rio de Janeiro
Josenita Luiz da Silva – Faculdade Frassinetti do Recife
Josiney Farias de Araújo – Universidade Federal do Pará
Karina de Araújo Dias – SME/Prefeitura Municipal de Florianópolis
Katia Fernanda Alves Moreira – Universidade Federal de Rondônia
Laís Portugal Rios da Costa Pereira – Universidade Federal de São Carlos
Laíze Lantyer Luz – Universidade Católica do Salvador
Lindon Johnson Pontes Portela – Universidade Federal do Oeste do Pará
Lisiane Silva das Neves – Universidade Federal do Rio Grande
Lucas Araújo Ferreira – Universidade Federal do Pará
Lucas Capita Quarto – Universidade Federal do Oeste do Pará
Lúcia Magnólia Albuquerque Soares de Camargo – Unifacisa Centro Universitário
Luciana de Jesus Botelho Sodré dos Santos – Universidade Estadual do Maranhão
Luís Paulo Souza e Souza – Universidade Federal do Amazonas
Luiza Catarina Sobreira de Souza – Faculdade de Ciências Humanas do Sertão Central
Manoel Mariano Neto da Silva – Universidade Federal de Campina Grande
Marcelo Alves Pereira Eufrasio – Centro Universitário Unifacisa
Marcelo Williams Oliveira de Souza – Universidade Federal do Pará
Marcos Pereira dos Santos – Faculdade Rachel de Queiroz
Marcus Vinicius Peralva Santos – Universidade Federal da Bahia
Maria Carolina da Silva Costa – Universidade Federal do Piauí
Maria José de Holanda Leite – Universidade Federal de Alagoas
Marina Magalhães de Morais – Universidade Federal do Amazonas
Mário Cézar de Oliveira – Universidade Federal de Uberlândia
Michele Antunes – Universidade Feevale
Michele Aparecida Cerqueira Rodrigues – Logos University International
Milena Roberta Freire da Silva – Universidade Federal de Pernambuco
Nadja Maria Mourão – Universidade do Estado de Minas Gerais
Natan Galves Santana – Universidade Paranaense
Nathalia Bezerra da Silva Ferreira – Universidade do Estado do Rio Grande do Norte
Neide Kazue Sakugawa Shinohara – Universidade Federal Rural de Pernambuco
Neudson Johnson Martinho – Faculdade de Medicina da Universidade Federal de Mato Grosso
Patrícia Appelt – Universidade Tecnológica Federal do Paraná
Paula Milena Melo Casais – Universidade Federal da Bahia
Paulo Henrique Matos de Jesus – Universidade Federal do Maranhão
Rafael Rodrigues Gomides – Faculdade de Quatro Marcos
Reângela Cíntia Rodrigues de Oliveira Lima – Universidade Federal do Ceará
Rebeca Freitas Ivanicska – Universidade Federal de Lavras
Renan Gustavo Pacheco Soares – Autarquia do Ensino Superior de Garanhuns
Renan Monteiro do Nascimento – Universidade de Brasília
Ricardo Leoni Gonçalves Bastos – Universidade Federal do Ceará
Rodrigo da Rosa Pereira – Universidade Federal do Rio Grande
Rubia Katia Azevedo Montenegro – Universidade Estadual Vale do Acaraú
Sabrynna Brito Oliveira – Universidade Federal de Minas Gerais
Samuel Miranda Mattos – Universidade Estadual do Ceará
Selma Maria da Silva Andrade – Universidade Norte do Paraná
Shirley Santos Nascimento – Universidade Estadual Do Sudoeste Da Bahia
Silvana Carloto Andres – Universidade Federal de Santa Maria
Silvio de Almeida Junior – Universidade de Franca
Tatiana Paschoalette R. Bachur – Universidade Estadual do Ceará | Centro Universitário Christus
Telma Regina Stroparo – Universidade Estadual do Centro-Oeste
Thayla Amorim Santino – Universidade Federal do Rio Grande do Norte
Thiago Sebastião Reis Contarato – Universidade Federal do Rio de Janeiro
Tiago Silveira Machado – Universidade de Pernambuco
Virgínia Maia de Araújo Oliveira – Instituto Federal da Paraíba
Virginia Tomaz Machado – Faculdade Santa Maria de Cajazeiras
Walmir Fernandes Pereira – Miami University of Science and Technology
Wanessa Dunga de Assis – Universidade Federal de Campina Grande
Wellington Alves Silva – Universidade Estadual de Roraima
William Roslindo Paranhos – Universidade Federal de Santa Catarina
Yáscara Maia Araújo de Brito – Universidade Federal de Campina Grande
Yasmin da Silva Santos – Fundação Oswaldo Cruz
Yuciara Barbosa Costa Ferreira – Universidade Federal de Campina Grande
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Catalogação na publicação
Elaborada por Bibliotecária Janaina Ramos – CRB-8/9166

P436e

Pereira Filho, Adalberto Alves

ELISA: definição, variações e protocolos práticos / Adalberto Alves Pereira

Filho. – Campina Grande/PB: Amplla, 2023.

Livro em PDF

ISBN 978-65-5381-153-9
DOI 10.51859/amplla.edv539.1123-0

1. Imunologia humana. 2. Farmácia. 3. Pesquisa científica. I. Pereira Filho,

Adalberto Alves. II. Título.

CDD 616.079

Índice para catálogo sistemático

I. Imunologia humana

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2023
AGRADECIMENTO

Ao prof. Nelder Gontijo que permitiu adquirir o conhecimento

de técnicas imunológicas ao longo da trajetória universitária, e a
técnica de laboratório Rosálida Estevam Nazar Lopes por
compartilhar seus valiosos conhecimentos a respeito do
assunto.
 O teste ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) é uma metodologia
imunológica amplamente usada para o diagnóstico de doenças infecto-parasitárias.
Essa abordagem é baseada na interação específica entre antígeno e anticorpo,
encontrando aplicação em diversos campos, como diagnóstico médico, pesquisa
biológica e controle de qualidade na indústria farmacêutica. O ELISA possui
diferentes tipos, tais como: direto, indireto, sanduíche e competitivo. O ELISA direto,
por exemplo, se baseia em um anticorpo específico que é diretamente ligado a uma
enzima, enquanto no indireto, é usado um anticorpo secundário ligado à enzima, em
geral chamada de peroxidase. No formato sanduíche, dois anticorpos distintos são
utilizados para capturar o antígeno.
Essa técnica se torna importante uma vez da sua alta sensibilidade,
especificidade e capacidade de analisas várias amostras simultaneamente. No
entanto, ela apresenta algumas desvantagens, como o custo elevado de reagentes
específicos, a necessidade de um técnico altamente treinado e a possibilidade de
resultados falsos positivos e negativos. O ELISA é uma ferramenta essencial na
pesquisa científica, principalmente no diagnóstico de doenças infecto-parasitárias.
Neste e-book iremos apresentar conceitos, exemplificar os tipos de ELISA e mostrar
protocolos para a realização de um ELISA de forma prática, eficiente e que gere
resultados coesos.
1. INTRODUÇÃO AO ELISA
O ELISA (do inglês Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) é uma técnica imunológica
empregada para identificar a presença de: proteínas, anticorpos, hormônios e outras moléculas
em uma determinada amostra e fundamenta-se na interação altamente específica e sensível
entre antígeno e anticorpo. No início dos anos 70, os cientistas Engvall e Perlmann foram os
responsáveis pelo estabelecimento da técnica, e desde então, essa metodologia tem sido
amplamente utilizada em diagnósticos clínicos e pesquisas cientificas (Engvall & Perlmann
1971; Aydin et al. 2015; Hayrapetyan et al. 2023).
A base fundamental do ELISA é detectar moléculas podendo ser antígenos ou anticorpos
por meio de reações enzimáticas. A análise é normalmente conduzida em uma placa de
microtitulação com revestimento de antígenos específicos que se conectam ao anticorpos de
interesse através dos seguintes passos: Sensibilização da placa com o antígeno, Bloqueio dos
espaços não preenchidos por proteínas não reativas como albumina ou caseína provinda do
leite, lavagem com PBS + Tween 20 para retirada do excesso do bloqueio, incubação do soro
contendo o anticorpo (caso este soro for de um paciente positivo para a doença a ser pesquisada
terá o anticorpo contra o antígeno, caso contrário não terá anticorpos que se ligarão ao antígeno
de interesse e consequentemente a reação de revelação não acenderá), lavagem com PBS +
Tween 20 mais uma vez, incubação do anticorpo secundário ligado a uma enzima (ex.:
peroxidase, ou fosfatase alcalina), lavagem com PBS + Tween 20 mais uma vez, e por fim
incubação com o substrato (OPD + H2O2 30% + Solução Citrato) (Figura 1). A depender da
enzima ligada ao anticorpo secundário e ao substrato a reação final terá cor verde, laranja ou
azul. De maneira geral, o ELISA pode ser categorizado em quatro formatos principais: ELISA
direto, ELISA indireto, ELISA sanduíche e ELISA competitivo.
 Figura 1 – Representação esquemática de ELISA utilizando soro de paciente para pesquisa de anticorpos para
uma determinada doença

2. ELISA DIRETO
O ELISA direto é a forma mais prática do ELISA e tem como objetivo verificar a presença
ou até mesmo a dosagem de anticorpo, permitindo reconhecer se o indivíduo ou animal foi
exposto a um determinado patógeno (vírus, bactéria, parasita). Nesse ensaio, componentes
antigênicos oriundos do soro são imobilizados em Placa 96 Poços de Poliestireno apropriada
para a reação de ELISA. A seguir é adicionado o anticorpo em cada poço é adicionada para
reagir. Neste caso, o anticorpo primário direcionado para a pesquisa daquele determinado
antígeno já é comprado comercialmente e já vem ligado a uma enzima (esta enzima pode ser a
peroxidase ou a fosfatase alcalina), que vai permitir promove a reação e mudança de cor ao
contato com o substrato (Lin el al. 2015a).
Durante a etapa seguinte, ocorre o reconhecimento do antígeno pelo anticorpo e, após
procedimentos intermediários, como incubação e lavagem, os componentes não fixados são
removidos. Em seguida, a reação positiva é visualizada ao adicionar um substrato específico da
enzima usada, causando uma mudança de cor na solução devido à catálise enzimática. A
intensidade da cor é estimada colorimetricamente e é proporcional à concentração do
anticorpo pesquisado, ou seja, quanto maior a quantidade de anticorpo pesquisado, maior a
coloração oriunda da reação entre substrato e enzima ligada ao anticorpo (Figura 2).
 Figura 2 – Representação esquemática de ELISA Direto.

3. ELISA INDIRETO
No teste ELISA Indireto, o antígeno (oriundo da maceração e quebra de moléculas do
patógeno) é adicionado a Placa 96 Poços de Poliestireno apropriada para a reação de ELISA.
Posteriormente é adicionado anticorpos ou soro do paciente (que pode conter o anticorpo de
interesse caso o soro contenha anticorpos direcionados para aquela doença a ser pesquisado
(Kohi & Ascoli 2017; Tabatabaei et al. 2022). Após isso é acrescentado um segundo anticorpo,
denominado anticorpo secundário (conjugado a uma enzima), o qual é específico para o
anticorpo primário e que está conjugado ou ligado a uma determinada enzima e, após
procedimentos intermediários, como incubação e lavagem, os componentes não fixados são
removidos. Após a realização das lavagens, é adicionado o substrato, e a enzima gera o sinal de
detecção resultante da reação química: Enzima, Peróxido de Hidrogênio e Substrato (Figura 3).
O ELISA Indireto tem como vantagens: 1 – Versatilidade - pois um único anticorpo
primário pode ser usado para detectar diferentes antígenos. Isso é útil quando se deseja
investigar a presença de várias substâncias em uma única amostra; 2 – Sensibilidade: O ELISA
indireto é geralmente mais sensível do que o ELISA direto, pois permite a detecção de múltiplos
anticorpos secundários ligados a um único anticorpo primário. Isso amplifica o sinal de
detecção, tornando-o útil quando se trabalha com amostras que contêm baixas concentrações
de antígeno (Lin et al. 2015b; Tabayabaei et al. 2022).
 Figura 3 – Representação esquemática de ELISA Indireto.

4. ELISA SANDUÍCHE
A técnica ELISA Sanduíche é largamente utilizada para detectar antígenos específicos em
baixas concentrações. Nesse método, são empregados dois anticorpos específicos diferentes:
um anticorpo de captura e um anticorpo detector. O anticorpo de captura é imobilizado na placa
e, em seguida, a amostra é adicionada. Caso o antígeno esteja presente, ocorrerá a ligação com
o anticorpo de captura. Em sequência, é adicionado o anticorpo detector, o qual está ligado a
uma enzima, formando assim um complexo antígeno-anticorpo-anticorpo detector. Após a
realização das lavagens, é adicionado o substrato, e a enzima produz o sinal de detecção
(Hayrapetyan et al. 2023).
O ELISA Sanduíche tem como vantagens: a alta especificidade, pois utiliza dois
anticorpos diferentes que se ligam a epítopos diferentes do antígeno. Essa abordagem
"sanduíche" permite uma detecção mais específica e menos suscetível a interferências e
reatividade cruzada. Além disso, o ELISA sanduíche pode ser tido como frequentemente mais
sensível do que o ELISA direto e o indireto. A combinação de dois anticorpos de ligação ao
antígeno permite uma amplificação do sinal, tornando-o particularmente útil quando se
trabalha com amostras que contêm baixas concentrações de antígeno (Figura 4).
 Figura 4 – Representação esquemática de ELISA Sanduíche

5. ELISA COMPETITIVO
No ELISA competitivo o antígeno é previamente incubado com um anticorpo específico
marcado com uma enzima. Em seguida, a mistura antígeno-anticorpo é adicionada à placa
revestida com um anticorpo capturador. O antígeno marcado competirá com o antígeno da
amostra pela ligação ao anticorpo capturador na superfície da placa. Quanto maior a
quantidade de antígeno na amostra, menor será a quantidade de antígeno marcado que se ligará
ao anticorpo capturador. Após a lavagem para remover o excesso de reagentes, a atividade
enzimática é medida, sendo inversamente proporcional à quantidade de antígeno presente na
amostra. (Hayrapetyan et al. 2023)
Embora o ELISA competitivo seja menos comum do que outras formas de ELISA, ele
apresenta algumas vantagens específicas: 1 – Ampla aplicabilidade: O ELISA competitivo pode
ser usado para a detecção de antígenos pequenos e de baixa imunogenicidade, onde outros
formatos de ELISA podem não ser adequados; 2 – Sensibilidade: Devido ao princípio de
competição, o ELISA competitivo pode ser altamente sensível na detecção de antígenos
específicos (Figura 5).
 Figura 5 – Representação esquemática de ELISA Competitivo

6. VARIAÇÕES DO ELISA
Diversas variações do ELISA foram criadas para atender diferentes exigências. Alguns
exemplos abrangem o ELISA de fase sólida, ELISA de ponto final, ELISA de doseamento, ELISA
de captura reversa, ELISA fluorescente, ELISA enzimático de imunoabsorção (EIA), entre
outras. Cada adaptação apresenta suas vantagens e desvantagens, sendo escolhida conforme o
propósito do ensaio e os recursos disponíveis (Hayrapetyan et al. 2023).

7. APLICAÇÕES DO ELISA
O teste ELISA possui uma extensa variedade de aplicações em diversas áreas,
abrangendo o diagnóstico médico (por exemplo, detecção de infecções virais, auto-imunidade
e marcadores tumorais), pesquisa biomédica (como estudos de imunologia e biologia
molecular) e o controle de qualidade na indústria farmacêutica.
O teste ELISA é uma metodologia imunológica de grande importância, versátil e que se
tornou indispensável tanto na pesquisa científica quanto no diagnóstico clínico. A contínua
evolução e aprimoramento dessa técnica têm expandido ainda mais suas aplicações e
aprimorado sua sensibilidade e especificidade. Embora apresente algumas limitações, os
benefícios e a relevância do ELISA superam suas desvantagens, posicionando-o como uma das
principais abordagens analíticas em laboratórios em todo o mundo.
Como já dito anteriormente, o princípio do funcionamento do ELISA (Enzyme-Linked
Immunosorbent Assay) é baseado na interação específica entre antígenos e anticorpos, que são
componentes fundamentais do sistema imunológico. O teste ELISA é realizado em uma placa de
microtitulação, onde anticorpos específicos são fixados nas paredes da placa, criando um
"revestimento" para capturar os antígenos de interesse.
A quantidade do produto formado está diretamente relacionada à quantidade de
antígeno presente na amostra original, permitindo a quantificação do antígeno e sua detecção
em diferentes concentrações em um leitor chamado de espectrofotômetro, como ilustrado na
Figura 6. Dessa forma, em poços onde houve maior interação entre antígeno-anticorpo
primário e consequentemente o anticorpo secundário, maior haverá a quebra de peróxido de
hidrogênio (por conta da enzima peroxidase ligada ao anticorpo secundário), liberando O - que
se reagira ao substrato no caso abaixo representado pelo OPD, e consequentemente haverá
maior valor de Absorvância.

Figura 6 – Representação esquemática do princípio de quantificação do ELISA em espectrofotômetro

8. ANALISES DOS RESULTADOS – UTILIZANDO O CUT-OFF E O ÍNDICE

DE REATIVIDADE
O ponto de corte, também conhecido como cut-off, é um valor limite empregado em
exames diagnósticos, como o ELISA, para determinar se um resultado é positivo ou negativo.
Esse valor é estabelecido com base em estudos prévios, buscando maximizar a sensibilidade e
especificidade do teste. No ELISA, o cut-off é calculado utilizando as leituras de amostras dos
soros sabidamente negativos incluídos no ensaio. Denomina-se de amostras de soros negativas
aquelas que previamente já foram testadas e são oriundas de pacientes que não foram expostos
a determinado patógeno.
A média das leituras dos controles negativos mais três vezes o desvio padrão é utilizada
para determinar cut-off. Ao testar uma determinada amostra no ELISA, sua leitura é comparada
com o cut-off. Se a leitura da amostra for maior que o cut-off, o resultado é considerado positivo,
indicando a presença do anticorpo para aquele patógeno ou parasita de interesse. Caso a leitura
seja menor ou igual ao cut-off, o resultado é considerado negativo, sinalizando a ausência do
anticorpo para aquele patógeno ou parasita de interesse naquela amostra.
O cut-off é fundamental para a interpretação dos resultados dos testes diagnósticos,
ajudando a distinguir entre verdadeiros positivos e falsos positivos, bem como verdadeiros
negativos e falsos negativos. A correta definição do ponto de corte é essencial para garantir a
precisão e confiabilidade dos resultados dos testes. Para calcular o O cut-off pode-se utilizar a
seguinte fórmula: Média dos Valores das leituras de absorvância dos soros negativos + 3
vezes o desvio padrão dessas amostras negativas.
Já o Índice de Reatividade, também conhecido como Índice de Positividade é um valor
calculado a partir dos resultados obtidos do teste ELISA, com o objetivo de quantificar a
reatividade de uma amostra em relação a um determinado antígeno ou marcador.
O Índice de Reatividade funciona como um calibrador e agente confirmatório
verificando se aquela determinada amostra é positiva ou não. O Índice de Reatividade é
calculado dividindo a leitura da amostra pelo valor de cut-off (ponto de corte). Se o Índice de
Reatividade for maior que 1, significa que a amostra em questão é positiva. Se o Índice de
Reatividade for menor que 1 indica que a presente amostra é negativa. Quando o Índice de
Reatividade for igual a 1 ou bem próximo de 1 cabe refazer o teste visto que o soro do dado
paciente pode estar saindo da janela imunológica e o nível de anticorpo ainda não ser suficiente
ao ponto de ultrapassar esse valor de 1 ou ser bem superior ao nível do cut-off.
O Índice de Reatividade auxilia na interpretação dos resultados, fornecendo uma medida
quantitativa da resposta do sistema imunológico à presença do anticorpo gerado pela presença
do patógeno. Além disso, facilita a comparação de resultados entre diferentes amostras e
experimentos, complementando o valor de referência que é o cut-off. A seguir a representação
matemática simplificada da definição de Cut-off e Índice de Reatividade (Figura 7).
 Figura 7 – Representação esquemática da definição de Cut-off e Índice de Reatividade

A seguir exemplos práticos e comentários de como se calcular o cut-off e o Índice de

reatividade. A seguir na tabela 1 temos os valores das amostras da absorvância de amostras de
soros negativos. Sabendo que o cut-off é a Média dos Valores das leituras de absorvância dos
soros negativos + 3 vezes o desvio padrão dessas amostras negativas, ao realizarmos o calculo
dessas amostras temos como cut-off = 0,059.

Tabela 1 – Representação dos Valores das leituras de absorvância dos soros negativos

Na presente tabela 2 temos as leituras de dez amostras como exemplo. Considerando

que o cut-off das amostras de soros negativos é 0,059 já calculado anteriormente, podemos
verificar que as amostras 1, 3, 4, 5 e 10 são positivas (em destaque de amarelo) uma vez que as
médias das leituras das absorbâncias destas amostras são maiores que o cut-off = 0,059.

Tabela 2 – Representação dos Valores das leituras de absorvância de amostras de soros de pacientes

Ainda utilizando o presente exemplo anterior e a definição de índice de Reatividade, que

é a divisão do valor da média dos valores de absorvância da amostra pesquisada pelo cut-off, na
presente tabela temos as leituras de dez amostras como exemplo (Tabela 3). Considerando que
o cut-off das amostras de soros negativos é 0,059 e dividindo o valor da média dos valores de
absorvância de cada amostra confirmamos as amostras 1, 3, 4, 5 e 10 mais uma vez como
positivas.

Tabela 3 – Representação dos Valores das leituras de absorvância de amostras de soros de pacientes com a
inclusão do Índice de Reatividade calculado
9. A SEGUIR A DESCRIÇÃO DE PROTOCOLOS PRÁTICOS PARA A
REALIZAÇÃO DE UM ELISA:

PREPARO DE ANTÍGENO DE Leishmania PARA ELISA (ULTRA-SOM)

01. Uma cultura de promastigotas de Leishmania infantum em fase estacionária da curva

de crescimento será submetida à contagem de células. Para isso 100 μL dessa cultura
será retirada para diluir em 900 µL de isoton (10,5 g de ácido cítrico, 7 g de cloreto de
sódio, 15 mL de formol P.A 40 % em 1 L de água destilada). Após contagem deverá ser
pego um volume da cultura cujo número de células no microtubo será final de 1x108
células.

02. As promastigotas serão lavadas duas vezes por centrifugação (3000g/4ºC/10min)

com 200 µL de tampão PBS pH 7,4 gelado. Após a última lavagem o sedimento de
células será ressuspendido num volume de 1000 µL de tampão PBS. A concentração de
células nessa suspensão será final de 1x108 células/mL;

03. Tomar uma preparação de aproximadamente de 1x108 promastigotas suspensos em 2

ml de PBS pH 7,2 em tubo Falcon. Sonicar à 20 hertz (em banho de gelo) 5 à 7 vezes
durante 45 segundos (Ultrasonic Homogeneizer – 4710; Coler-Palmer Instrument Co.
ou outro aparelho similar). Acompanhar o rompimento dos parasitas em microscópio
entre lamina e lamínula.

04. Dosar a concentração de proteínas pelo método de Lowry ou pelo método de bradford.

Dosagem de proteína (Método de Lowry)

Soluções:
Tartarato de Sódio e Potássio 4% em H2O (manter à -20C)

Sulfato de Cobre 2% em H2O

Na2CO3 - Carbonato de Sódio 3% em NaOH 0,1N

Reagente Fenol (Folin) (manter em geladeira e protegido da luz)

1- Reagente de Cobre:
Tartarato de Na e K 0,1ml
Sulfato de Cobre 0,1ml
Na2CO3 4,8ml
Total 5,0ml
**Preparar no momento de uso. O Tartarato de Na e K deve ser descongelado no momento do uso. Usar 1ml por
tubo.
 2- Reagente de Fenol (Folin):
Reagente de Folin deve ser diluído 1:3 em H O no momento do uso. Usar 0,1ml por tubo.

Reagente
Reagente Agitar
H 2O Volume Agitar Agitar Fenol
Tubo Amostra de Imediatamen-
Destilada Amostra Vortex Vortex 1:3 em
cobre te
H2O

1 100µl -- 1 ml Imediata- 100µl leitura após

Branco
mente
2 Padrão 90µl 10µl 1 ml 100µl
1mg/ml
3 Amostra 90µl 10µl 1 ml Repouso 100µl 10 minutos
(Bruta)
4 Amostra 90µl 10µl 1 ml 10 100µl
(diluida1 minutos
:2)
5 *Amostra 90µl 10µl 1 ml 100µl
(diluida1
:5)
6 *Amostra 90µl 10µl 1 ml 100µl
(diluida1
:10)
* Dilua a sua amostra em H2O destilada em outro tubo.

Leitura à 655 nm no espectrofotômetro (ou leitor de microplacas - ELISA).

Exemplo de cálculo da concentração de proteína:
1. Com um único valor do padrão:
Ex.: Amostra (X) ........................0,130 de absorb.
Padrão (1000µg/ml)...........................0,062
X=2097µg/ml
2. Com vários valores do padrão:
Regressão linear.
Obs.: O padrão deve ser preparado dissolvendo 1mg de albumina bovina (BSA) em 1ml
de H2O destilada [Padrão] = 1 mg/ml. Manter a -20°C. Se estiver muito concentrada, a amostra

analisada deve ser diluída e testada novamente.

10. ELISA
1. Sensibilizar a placa overnight (4°C) com 100l/well do antígeno diluído (de acordo com
a concentração padronizada: 0,5 ug/well) em tampão apropriado (Coating buffer).
Validade + 1 semana.
No dia do experimento:
2. Desprezar a solução do antígeno, lavar 2 vezes com solução de lavagem e secar por
inversão em papel absorvente (ou Perfex). Bloquear com PBS-Caseína 2% por 30
minutos a 37°C e logo em seguida lavar 2 vezes com solução de lavagem, secar e colocar
os soro)

3. Diluir o soro na diluição definida previamente em PBS-Tween 20 à 0,5% + CASEÍNA

0,25% (PBS-T/Caseina 0,25%). Usar 2 soros controle positivos e 6 soros controle
negativo para calcular o cut off.
Colocar 100l das amostras de soro diluído/well. (esta diluição poderá ser feita no dia
anterior se conservada a 4ºC, até a hora da distribuição na placa).
Colocar 100l de PBS-T/Caseina 0,25% (sem soro) em alguns poços. Estes serão: o
Branco para zerar o aparelho. Incubar por 45 min. a 37°C.

Se for avaliar avidez de IgG, seguir para o item 4.

Se for realizar elisa indireto convencional, lavar por 2 x, secar em papel
absorvente e pular para item 05.

4. Avaliação da avidez de IgG (lavagem adicional com Uréia 6M em PBS-T20-0,5%)

Preparo: 36,03g de Uréia em 100 mL de PBS-T20-0,5% (qsp) – (Para se dissolver a
uréia, usar PBS-T20-0,5% aquecido, adicionar a Uréia e agitar).
a) Lavar 1 vez com solução de lavagem e secar por inversão em papel
absorvente
b) Adicionar 100l/well de PBS-T/Caseina 0,25% nas colunas de 1 a 5 e
100l/well de PBS-T/Caseina 0,25%/Uréia 6M nas colunas de 7 a 8, por 5
minutos com agitação (em temperatura ambiente).
c) Descartar e lavar acrescentando 100l de PBS-T/Caseina 0,25% em todas
as colunas trabalhadas (2 ciclos de 5 minutos cada) sob agitação.

5. Adicionar 100l/well do conjugado (anti IgG de Camundongo) diluído em PBS-

T/Caseina 0,25% conforme titulação prévia e deixar à 37°C por 45 min. Obs.: O
conjugado é marcado com peroxidase e específico ao animal e imunoglobulina pesquisado.
 6. Desprezar e lavar 4 vezes com solução de lavagem e secar por inversão.

7. Preparar a solução substrato-reveladora (feito na hora), 15 ml por placa.

Preparo do substrato: Para 1 placa: em 15 ml de solução de ácido cítrico (tampão)
adicionar 3mg de o-fenilenodiamino (OPD) e 3l de H2O2 (30 vol.) acrescentar na hora do uso

(sensível a luz).
OBS.: O OPD É CANCERÍGENO À INALAÇÃO E AO CONTATO. Descartar todo material
usado com OPD em uma solução de NAOH 0,2% em água comum por no mínimo 2 horas: o NAOH
neutraliza o OPD.

8. Colocar 100l/well da solução de substrato por 20 minutos no escuro à 37°C. Ligar o

leitor de microploacas.

9. Interromper a reação com 25l/well de ácido sulfúrico 4N [Preparo da solução estoque

de H2SO4 /4N (+ 1L): 1/20 em H2O destilada.

(Para se diluir um ácido sempre se coloca o ácido sobre a água) PARA 200 mL
COLOCA-SE 190 mL DE ÁGUA DESTILADA E 10 mL DE ÁCIDO SULFÚRICO – ESCORRENDO
LENTAMENTE NA PAREDE DA PROVETA).

10. Ler imediatamente após interromper a reação com filtro de 490nm, limpando a placa
por baixo com papel embebido em álcool antes da leitura.

11. Cut off.

Usar 6 soros negativos em cada placa para calcular o Cut Off.
Cut off = (media da absorbância dos 6 negativos) + 3DP.
Índice de Reatividade (IR) = Abs. Amostra/cut off.
IR<0,9 = Soro negativo. 0,9>IR<1,1 = Soro duvidoso/ indeterminado. IR>1,1 = Soro
Positivo.
Obs.: Pode ser congelados seguintes itens: Solução de bloqueio, Solução diluidora de
anticorpo (BSA ou caseína); Solução de Ácido Cítrico , antígeno, solução de ligação (cut-buffing);
E as soluções que se deve fazer a diluição na hora e NÃO devem ser congeladas: solução de
antígeno, solução do conjugado, e substratos (opd, peróxido de hidrogênio).
 12. Índice de Avidez de IgG
Calcular o Índice de Avidez (IA) de cada soro amostra com IR positivo: razão do valor em
absorbância com úreia pelo valor em absorbância sem úreia X 100.

11. PROTOCOLOS PRÁTICOS DE REAGENTES DO ELISA

11.1. Preparo dos Reagentes do ELISA

• Coating Buffer (ou Soluçao de Ligação de Antígeno/proteína) pH 9,6

Na2CO3 1,59g 0,80g
NaHCO3 2,93g 1,47g
H2O destilada (qsp) 1,00 L 0,50 L

• Caseína
Aquecer 400ml de PBS pH 7,2 no microondas, (em becker de vidro de 1L). Acrescentar
20,0g de caseína sob agitação por 30 min. até dissolver toda a caseína. Completar o volume para
1 Litro (A caseína só deve ser acrescentada após o PBS estar aquecido).

• Solução de Lavagem
NaCl 9g
Tween 20 0,5ml
H20 destilada(qsp) 1L

*Adicionar o Tween20 após dissolver o NaCl.

• Solução de Ácido Cítrico (tampão substrato) pH 5,0

Na2HPO4 7,19g 3,6g
Ou
Na2HPO4 .12 H2O 18,0g 9,0g
Ácido Cítrico 5,19g 2,6g
H2O destilada (qsp) 1L 0,5L
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