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Índice
[Link]ção ...................................................................................................................... 2
[Link] Geral ........................................................................................................ 2
2.1 Objectivos específicos ............................................................................................ 2
3. Revisão bibliográfica .................................................................................................... 3
3.1 Parede celular. ......................................................................................................... 4
3.2 Propriedades da parede celular ............................................................................... 4
3.3 Coloração-Gram ...................................................................................................... 4
3.4 Bactérias gram-positivas ......................................................................................... 5
3.4.1 Gram-negativas ................................................................................................ 5
3.5 Meios de cultura...................................................................................................... 5
3.5.1 Meios não seletivos .......................................................................................... 5
3.6 Testes bioquímicos/ teste da catálase. ..................................................................... 5
3.7 Testes de sensibilidade antimicrobiana. .................................................................. 6
3.7.1 Métodos qualitativos ........................................................................................ 6
3.7.2 Mecanismos de ação dos antimicrobianos ....................................................... 6
3.7.3Toxicidade Seletiva ........................................................................................... 6
[Link] e técnicas usadas ...................................................................................... 7
4.1 Materiais e reagentes .............................................................................................. 7
5. Procedimentos experimentais. ...................................................................................... 8
5.1 Descrição morfológica da colonia de bactérias. ..................................................... 9
6. Testes bioquímicos ..................................................................................................... 10
6.1 Teste de sensibilidade antimicrobiana .................................................................. 11
6.2 Procedimentos:...................................................................................................... 11
[Link]ões ................................................................................................................... 12
[Link]ão .................................................................................................................... 14
[Link] bibliográficas ........................................................................................... 15
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[Link]ção
Apresenta-se aqui o relatório da aula prática de Microbiologia realizada no laboratório
de microbiologia da Faculdade de Ciências Naturais e Matemática da universidade
Pedagógica. Durante a aula prática foram feitas observações em culturas artificiais,
estas observações tinham como objectivo a análise macroscópica de colonias de
bactérias cultivadas em meios artificiais usando meios de cultura nutritivos como Ágar
triptona e Àgar sangue usados para o cultivo de microrganismos não
fastidiosos.(BROOKS et al 2014)

As colonias de bactérias apesentam diversas formas desde a textura até a elevação estas
características serão descritas ao longo do relatório, para além das observações
macroscópicas também foram feitos testes bioquímicos como o teste da catálase, para a
confirmação da presença da enzima catálase que decompõe o peroxido de hidrogénio
produzindo o oxigénio, as bactérias usadas para o teste bioquímico foram extraídas da
mucosa nasal com o auxilio de um Swab.. O teste da catálase foi precedido pelo teste de
sensibilidade antimicrobiana, que visa compreender o quão susceptível estas bactérias
são quando expostos a determinados fármacos como a amoxicilina e o
fenoxmetilpenocilina.

[Link] Geral
 Ser capaz de identificar e caracterizar colonias de bactérias, elaborar testes
bioquímicos e de sensibilidade antimicrobiana

2.1 Objectivos específicos

 Identificar características macroscópicas das colónias de bactérias
 Proceder com os testes bioquímicos e de sensibilidade antimicrobiana
 Efectuar a coloração diferencial
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3. Revisão bibliográfica
Bactérias são organismos procariontes e unicelulares , podem ser encontrados em todas
regiões do globo terrestre algumas vivem de forma simbiótica com outros organismos e
outro são parasitas. Algumas bactérias constituem a microflora do solo e também fazem
parte da microbiota bacteriana normal dos seres humanos como é o caso da
Staphylococcus aureus que pode ser encontrada no trato nasofaríngeo, na pele e no trato
gastrointestinal .

A microbiota residente no copo humano desempenha um papel imprescindível na

manutenção da saúde, a título de exemplo temos os membros residentes da microbiota
do trato intestinal. Estes indivíduos participam na síntese da vitamina K e auxiliam na
absorção de nutrientes. Nas mucosas e na pele, a microbiota residente pode impedir a
colonização por patógenos invasores presentes no ambiente e possível desenvolvimento
de doenças .( BROOKS et al 2014).

De acordo com sua morfologia as bactérias podem apresentar diversos formatos, uma
célula bacteriana pode se apresentar com os seguintes formatos:

 Formato esférico-geralmente chamados de coccus

 Formato cilíndrico formando bacilos, algumas bactérias apresentam um formato
cilíndrico espiralado formando os espirilos
 Algumas bactérias também apresentam formato cilíndrico encurvado com
formato de uma vírgula que formam vibriões.
Ex: Vibrio cholarae

Após a divisão celular certas bactéria formam grupos, e podem se dispor da seguinte
forma:

 Cadeias longas com disposição celular regular- Ex:Streptococcus, Streptobacilos

 Cadeias longas com arranjos irregulares- Ex: Staphylococcus
 Organizados aos pares- Ex: Diplococos
 Grupos de 4 bactérias com formato esférico - Tétrades
 Grupos de 8 bactérias com formato esférico- Sarcina

Para além das características morfológicas é possível identificar diversas bactérias de

acordo com a espessura da parede celular e capacidade de reação para a coloração gram
(MADIGAN et al 2015)
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3.1 Parede celular.

A parede celular é uma estrutura celular bacteriana, que Previne a expansão e
eventualmente o rompimento da célula devido a entrada de água. A pressão osmótica
interna da maioria das bactérias varia de 5 a 20 atm devido à concentração de solutos
obtida através do transporte ativo. Na maioria dos ambientes, esta pressão seria
suficiente para provocar a ruptura da célula, se não fosse a presença de uma parede
celular com elevada força de tensão.(BROOKS et al 2014)

3.2 Propriedades da parede celular

 Não são estruturas homogéneas mas são estruturas compostas por diferentes
substâncias que variam de acordo com o tipo de bactéria.
 Elas diferem em espessura, assim como em composição, estas diferenças ajudam
a identificar bactérias.
 Também ajudam a explicar alguns traços e características das bactérias como a
resposta para coloração-gram e habilidades para causar doenças
 Entre as eubactérias a expessura diverge entre as bactérias gram-positivo e
gram-negativo.
 Os componentes da parede celular muitas vezes determina a sua forma,
geralmente a componente é o peptidioglicano(também chamado de mureína)

3.3 Coloração-Gram
Os corantes comumente utilizados são os sais. Os corantes básicos consistem em um
cátião dotado de cor com um anião incolor (p. ex., azul de metileno+ cloreto- ). Durante
o processo de coloração gram as células são tratadas com violeta cristal (corante
primário) e em seguida numa solução de iodo que é um mordente. Isto resulta na
formação de um violeta iodo dentro das células.

Quando uma bactérias gram positivas é tratada com etanol o lipídeo na sua membrana
externa é dissolvido e removido. Isto aumenta a sua permeabilidade, assim o corante
pode ser removido descorando a bactéria que pode então ser tingida com a safranina

Em bactérias gram-positivas o etanol faz com que os poros no peptidioglicanos se

contraiam, retendo o corante no interior da célula.
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3.4 Bactérias gram-positivas

Normalmente apresentam uma quantidade maior de de peptidioglicanos em relação as
bactérias gram-negativas o que torna a parede mais espessa, possuem também o ácido
teicóico que ajuda no transporte de iões positivos para dentro e fora da célula Em
bactérias gram-positivas o etanol faz com que os poros no peptidioglicanos se
contraiam, retendo o corante no interior da célula.( PELCZAR et al 1996)

3.4.1 Gram-negativas
Possuem duas membranas uma externa e uma interna É a membrana externa e não a
camada de peptidioglicanos, que distinguem as bactérias gram positivas das bactérias
gram negativas. A membrana externa também serve como uma barreira selectiva que
controla a passagem de substancias para dentro a célula.

3.5 Meios de cultura

Microrganismos como bactérias ou até mesmo fungos podem ser cultivados in vitro,
isto é, em meios de cultura artificiais., desde que todas condições físicas e químicas
estejam presentes para que favoreçam a sua sobrevivência.

O cultivo geral da maior parte das bactérias requer meio enriquecido em nutrientes
metabólicos. Esses meios geralmente incluem ágar, uma fonte de carbono e um ácido
hidrolisado ou enzimaticamente degradado de uma fonte de material biológico (p. ex.,
caseína. Os meios podem ser não seletivos ou seletivos e são usados para a distinção
entre várias bactérias em uma amostra que contenha muitos microrganismos diferentes.
(BROOKS 2016)

3.5.1 Meios não seletivos

O ágar-sangue o ágar-chocolate e o agar triptona são exemplos de meios complexos,
não seletivos, que sustentam o crescimento de diferentes bactérias. Esses meios são
destinados ao isolamento de diferentes espécies tantas quanto possíveis, produzindo
inúmeras colônias bacterianas.

3.6 Testes bioquímicos/ teste da catálase.

A enzima Catalase faz a conversão do peróxido de hidrogênio em água e oxigênio.
Quando uma colônia bacteriana é misturada com o peróxido de hidrogênio, a liberação
do oxigênio pode ser observada pelo aparecimento de bolhas de gás. O teste é
particularmente útil na diferenciação dos estafilococos (positivos) dos estreptococos
(negativos), porém também tem aplicação taxonômica para bactérias gram-negativas.
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3.7 Testes de sensibilidade antimicrobiana.

Teste de sensibilidade determinam a vulnerabilidade de um microrganismo para uma
determinada concentração de um fármaco..

Testes de sensibilidade podem ser qualitativos, semiquantitativos, ou métodos com

base nos ácidos nucleicos. Os testes também podem determinar o efeito combinado de
diferentes antimicrobianos

3.7.1 Métodos qualitativos

Os resultados geralmente são relatados como um dos seguintes:

 Suscetível (S)

 Intermediário (I)

 Resistente (R)

3.7.2 Mecanismos de ação dos antimicrobianos

Os antimicrobianos atuam em uma ou várias vias: por toxicidade seletiva, inibição da
síntese da membrana celular e de sua função, inibição da síntese proteica ou da síntese
dos ácidos nucleicos.

3.7.3Toxicidade Seletiva
Um agente antimicrobiano ideal deve exibir toxicidade seletiva. Essa expressão
significa que o fármaco deve ser prejudicia para o patógeno, mas não para o hospedeiro.
Com frequência, a toxicidade seletiva é mais relativa que absoluta, significando um
fármaco, em uma concentração tolerada pelo hospedeiro, pode lesar um microrganismo
infectante.

A toxicidade seletiva pode ser função de um receptor específico necessário para a

ligação do fármaco ou depender da inibição dos eventos bioquímicos essenciais para o
patógeno, mas não para o hospedeiro.(BOOKS et al 2014)
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[Link] e técnicas usadas

Para realização das atividades no laboratório usamos métodos como:

 Testes bioquímicos
 Coloração diferencial
 Esfregaço
 Inoculações em meios de cultura sólidos por esgotamento.

4.1 Materiais e reagentes

 Materiais
 Microscópio óptico
 Pipetas
 Agulha de inoculação
 Laminas
 Lamparina
 Alças
 Copo de Becker
 Furador
 Antibióticos ( amoxicilina e Fenoxmetilpenicilina)
 Fósforo
 Agua destilada.
 Àgar sangue e Àgar triptona.
 Swab

Reagentes

 Azul de metileno
 Safranina
 Álcool
 Óleo de imersão
 Peróxido de hidrogénio
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5. Procedimentos experimentais.
Inoculação de bactérias em meio de cultura sólido.

Estas bactérias inoculadas no meio de cultura solido foram coletados da mucosa nasal
de um dos colegas .

Primeiro devemos tratar da desinfeção do local de trabalho e organização do

mesmo local, só assim é que procedemos com a inoculação.
É de extrema importância que a inoculação seja feita ao redor da lamparina
acesa.

Etapas:

 Primeiramente tivemos que acender a lamparina.

 Com auxilio de um Swab foi retirada uma amostra a mucosa nasal de um uns
dos colegas do grupo.
 Extraímos o material biológico e cuidadosamente abrimos a placa ao redor da
chama e em zig-zag inoculamos a nossa amostra.
 Depois de inoculada a amostra fechar a placa .
 Levamos o meio de cultura para o forno com a temperatura ideal de 37

Imagens.

Tabela 1:
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5.1 Descrição morfológica da colonia de bactérias.

Aspectos Característica
macroscópicos
Forma Pontiformes
Elevação Com elevação
Consistência Solida/gelatinosa
Pigmentação Sem pigmetação
Tamanho meio e pequeno
Transparência Opaca
Tabela 2:

Resultados : Passadas 72horas as bactérias se multiplicaram e formaram uma colonia

no meio de cultura sólido.

2ª Etapa: coloração diferencial.

1º passo: esfregaço

 Ao redor da lamparina acesa removemos uma amostra do material biológico e

esfregamos cuidadosa e meticulosamente na lamina .

2º passo: Fixação

 Levamos a lamina até a parte superior da chama da lamparina e fixamos a

amostra a ser observada.

3º passo: coloração

 Colocamos duas gotas do azul de metileno na lamina de deixamos por 5 minutos

 Em seguida lavamos a lamina com álcool e adicionamos a Safranina e deixamos
por 3 minutos.
 Em seguida lavamos com água destilada e deixamos a lamina secar por 10
minutos.
 10

4º passo: Observação Microscópica

 Depois da lamina secar adicionamos duas gotas de óleo de imersão e levamos ao

microscópio óptico e usamos a objectiva de maior ampliação.

Resultados: Apos a submissão destas bactérias a coloração gram notou-se que

adquiriram um tonalidade azulada ou azul escurecido.

Imagens

6. Testes bioquímicos
Logo apos as observações microscópicas procedemos com o teste da catálase.

Procedimentos.

 Pegamos em uma placa de petri e colocmos sob a mesa

 Extraímos uma porção do inóculo no nossa cultura e colocamos na placa
 Com auxilio de uma pipeta extraímos uma gota de peroxido de hidrogénio e
colocamos sob a placa com a amostra.

Resultado: 1 segundo depois notou-se uma efervescência da amostra no com peroxido

de hidogenio.

Figura 1 teste da catálase.

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6.1 Teste de sensibilidade antimicrobiana

Como referido nos parágrafos anteriores o teste de sensibilidade antimicrobiana é feito
para medir a susceptibilidade de uma bactéria para uma determinado fármaco.

Para proceder com o teste precisamos dos seguintes materiais:

 Furador de papel
 Papel
 Antibióticos
 água destilada
 Meios de cultura (agar triptona)
 Alça
 Copo de Becker
 Cultura de bactérias em meio solido.

6.2 Procedimentos:
 Dissolvemos 500gramas de fenoxmetilpenicilina em 1 ml de água destilada
 Homogeinizar a solução
 Com auxilio de um furador fazemos 5 discos de papel e mergulhamos na
solução com antibióticos.
 Inoculamos a nossa amostra em um novo meio de cultura.
 Em seguida colocamos os discos de papel por cima da placa de petri e fechamos.
 Levamos a nossa amostra para o forno a 37º

Resultados: passadas 48h notamos que não houve evolução ou crescimento micobiono
na meio de cultura com ágar sabouraud dextrose.

Tabela 1 meio de cultura sem crescimento microbiano.

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[Link]ões
Como foi referido anteriormente algumas bactérias fazem parte da microbiota normal
do ser humano, isso é sugestivo ao facto de termos encontrado bactérias na mucosa
nasal, estes microorganismos um papel na manutenção da nossa saúde, de acordo com
as nossas pesquisas bactérias da mucosa nasal podem impedir a proliferação de outras
bactérias invasoras invasores, por um processo chamado de interferência microbiana o
mecanismo pode envolver a competição por nutrientes , então a depleção da microbiota
normal pode dar espaço para outros microprganismos provenientes do ambiente ou até
mesmo de outras bactérias provenientes do ambiente.

Cultivamos estes microrganismos in vitro disponibilizando suplemento nutricional para

sua sobrevivência, o meio nutritivos contendo agar sangue foi suficiente para a
proliferação celular destras bactérias, logo sugerimos que a população em estudo não
apresenta exigências nutricionais especiais para o seu desenvolvimento, quanto a
morfologia da colónia, sua elevação pode ser explicado pelo método usado para
inoculação, que concentrou indivíduos em áreas especificas da placa de petri. Tendo em
conta também que uma única célula deu origem a centenas e até milhares de indivíduos
idênticos entre si.

Teste da catálase.

As bactérias encontradas na mucosa nasal são catalase-positivo pois elas apresentam a

enzima catálase capaz de catalizar o peroxido de hidrogénio. O efervescência é o
resultado da de composição do peróxido de hidrogénio, as balhas foram formadas pelo
oxigénio dissociado da molécula de H2O2. Esta substancia é toxica para muitos
organismos incluindo bactérias, por isso ela deve ser removida antes que cause danos
para a célula.

O teste da catálase foi feito logo apos a submissão da colónia a coloração-gram.

Submetemos estas bactérias a coloração gram para saber se eram gram-positivo ou
gram-negativo. A amostra recolhida da mucosa nasal continha bactérias gram-positiva
pois foram capazes de reter o corante primário no interior da célula.

Durante o procedimento para coloração com a técnica de gram, as células bacterianas

conseguiram absorver o corante primário, entretanto só conseguiram reter o corante
quando foram tratadas com álcool, pois o álcool diminui a porosidade da parede celular
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espessa das bactérias gram-positivo fazendo com que a célula fique impermeável, e só
assim conseguem reter o corante.

Teste de sensibilidade antimicrobiana

Concluídos os testes anteriores fizemos também um teste para medir a sensibilidade das
bactérias a alguns fármacos como a penicilina e amoxicilina, todavia não conseguimos
obter o resultado esperado. Sugerimos algumas hipóteses

 Primeiramente não houve crescimento celular devido ao meio de cultura usado

para o cultivo. Segundo as nosssas pesquisas o meio de cultura contendo agar
sabouraud dextrose usado para o cultivo in vitro de fungos e bactérias
filamentosas.
 Logo a exigência nutricional das bactérias não foi suprida, por não foi possível
saber se o medicamento teria efeito bacteriostático ou bactericida.
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[Link]ão
Com o culminar do trabalho por possível tomar notas importantes sobre o cultivo de
microrganimos no laboratório, como por exemplo as exigências nutricionais, a
temperatura ideal para o seu crescimento, técnicas usadas para inoculação e coloração
diferencial. Também podemos conhecer a diversidade de microrganismos presente no
ambiente em organismos vivos como o ser humano.
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[Link] bibliográficas
 MADIGAN M. Et al; Brock Biology of microorganisms;14th ed;person
education; San Francisco, 2015
 [Link]
bact%C3%A9rias-e-exemplos.
 BROOKS G: et al;Microbiologia medica de jewetz, melick e Adeberg;
26ed;MacGrawhill education;2014.
 PELCZAR, M.J., et al. Microbiologia. Conceitos e Aplicações. 2ª ed. Vol.I,
1996