UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA

INSTITUTO DE QUÍMICA
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ANALÍTICA
QUI B36 - Química Analítica IIA

Espectrofotometria de Absorção
Molecular nas Regiões do
Ultravioleta e Visível (UV-Vis)

Profª. Daniele Muniz

- Métodos ópticos: são métodos que se baseiam na interação da luz (radiação
eletromagnética) com a matéria para se obter uma informação analítica.

Espectrofotometria de Absorção Molecular no UV/Visível

Espectrometria de Absorção Atômica

Fenômenos...
Introdução
Termos:
- Espectroscopia: Termo geral para a ciência que trata da interação da matéria
com vários tipos de radiação.
- Espectrometria / Métodos Espectrométricos: Amplo grupo de métodos
analíticos que são baseados em espectroscopia molecular e atômica.
- Espectro eletromagnético: Imagem resultante da decomposição da luz através
de um prisma

Radiação eletromagnética, ou luz, é uma forma de

energia cujo comportamento é descrito por
propriedades tanto de onda quanto de partícula.
 Modelo Ondulatório
✓ Radiação eletromagnética: consiste em campos elétricos e magnéticos
oscilantes e perpendiculares entre si e se propagam no vácuo (não necessita
de nenhum suporte para se propagar)
Parâmetros ondulatórios:

• Amplitude: medida escalar negativa e positiva da magnitude

de oscilação de uma onda.
• Comprimento de onda () : distância linear entre dois
máximos ou mínimos sucessivos de uma onda.
• Período (p, 1/) : tempo, em segundos, necessário para a
passagem de máximos sucessivos ou dois mínimos por um
ponto fixo no espaço
• Frequência (): número de oscilações do campo que
ocorrem por segundo.

Falha no modelo ondulatório!!!

Não explica os fenômenos de absorção e
emissão da energia radiante
 Modelo Corpuscular
➢ Planck demonstrou que a cada onda
Radiação eletromagnética: pode ser
eletromagnética, definida por uma
tratada como pacotes discretos de determinada frequência e comprimento de
energia ou partículas chamadas fótons onda, estava associado um quantum de
ou quanta. energia dado pela equação:

A energia de um fóton (modelo

corpuscular) é diretamente proporcional
à sua frequência* (modelo ondulatório)
E = energia (joule= J)
A dualidade onda-partícula não é h = 6,624x10-34 J/s
excludente e sim complementar.
 = frequência
 = comprimento de onda
* Frequência (): número de oscilações do campo que
ocorrem por segundo. c = velocidade da luz (2,998 . 108 m s-1)
 Espectro Eletromagnético
É o arranjo ordenado das radiações conforme seus comprimentos de onda ().

MAIOR ENERGIA COMPRIMENTO DE ONDA (nm) MENOR ENERGIA

 Cores da luz visível

Região
IV médio
25 a 2,5mm

Energia crescente ➔
 Cores da Luz Visível
A percepção de cor resulta da absorção seletiva de certos comprimentos de onda. Os
demais comprimentos são transmitidos ou refletidos e percebemos como cor do objeto.

 (nm) COR ABSORVIDA COR COMPLEMENTAR

800
650-780 vermelho azul-verde

700 595-650 laranja azul-esverdeado

560-595 amarelo-verde roxo

600

500-560 verde vermelho púrpura

500
490-500 verde azulado vermelho

400 435-490 azul laranja

380-435 violeta amarelo-verde

BRANCO PRETO ??????

Região do Visível
 Comprimento de onda e Energia

Baixa energia Alta energia

Unidades de comprimento de onda:

• Ǻ = angstrom = 10-10 metro = 10-8 centímetros = 10-4 micrômetros

• nm = nanômetro = 10-9 metro = 10 angstrons = 10-3 micrômetros

• mm = micrômetro = 10-6 metro = 104 angstrons

Absorção Molecular no UV/Vis
• Absorção da radiação eletromagnética de comprimentos de onda na faixa de 180 a 780 nm (UV/Vis).

• Comprimentos de onda inferiores a 180 nm são altamente energéticos que levam à ruptura de ligações
químicas.

• Acima de 780 nm atinge-se o infravermelho próximo, onde a energia, já relativamente baixa, começa apenas a
promover a vibração molecular e não mais transições eletrônicas.

- Ondas de Rádio: promovem alteração de spin.

- Micro-ondas: estimulam o movimento rotacional das
moléculas quando ela são absorvidas.
- Infravermelho: estimula as vibrações das moléculas.
- Luz visível e radiação ultravioleta: provocam a
promoção dos elétrons para orbitais de maior energia.
- Raios X: quebram as ligações químicas e ionizam as
moléculas.
Espectro Eletromagnético
 Absorção da Radiação – Princípio
• Quando a radiação atravessa um meio (a amostra), certas frequências podem ser absorvidas no
processo em que a energia eletromagnética (luz) se transfere para os átomos ou moléculas. Esta
absorção faz com que estas partículas passem do seu estado fundamental para o excitado.

TEORIA QUÂNTICA
• Átomos, íons ou moléculas têm somente um número
limitado de níveis de energia discretos.
• A energia do fóton deve ser exatamente igual a diferença
de energia entre o estado fundamental e um estado
excitado da espécie absorvedora.
• As diferenças de energias são características para cada
espécie; o estudo da radiação absorvida proporciona
caracterizar os componentes da amostra.
Absorção Molecular
As moléculas sofrem três tipos diferentes de transições quantizadas quando excitadas pela
radiação ultravioleta e visível.
- Eletrônica: energia associada com os elétrons nos vários orbitais externos da molécula
- Vibracional: energia devido às vibrações interatômicas
- Rotacional: energia associada com a rotação da molécula em torno do seu centro de gravidade

Eeletrônica + Evibracional + Erotacional

Eeletrônica > Evibracional > Erotacional

 Espectros de absorção
• É utilizado para definir qual o comprimento de onda da radiação incidente que causará o máximo de
absorção pela espécie a ser determinada e assim obter-se a melhor sensibilidade na sua quantificação

Devido ao grande número de estados vibracionais e rotacionais, um espectro de absorção no UV/Vis apresenta um
formato alargado (banda).

Espectro do complexo Cobre-NH3 • ESPECTRO DE BANDAS

• ESPECTRO DE LINHAS
0,4
0,35
0,3
Absorbância

0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
0
350 450 550 650 750
Comprimento de onda (nm)
 Espectros de absorção

Absorção de Radiação Eletromagnética

Espectro de Absorção
 Absorção Molecular no UV/Vis
• Medidas de absorção da radiação eletromagnética na região do UV/Visível encontram vasta
aplicação para identificação e determinação de milhares de espécies inorgânicas e orgânicas.

• Os métodos de absorção molecular talvez sejam os mais amplamente usados dentre todas as
técnicas de análise quantitativa em laboratórios químicos e clínicos em todo mundo.

As diferenças de energias são características para cada espécie; o estudo da radiação

absorvida proporciona caracterizar os componentes da amostra.

FÁRMACOS CLASSE TERAPÊUTICA  (nm)

ÁCIDO ACETILSALICÍLICO Anti-inflamatório 505

ALBENDAZOL Aminoácido 309

Doseamento por ATENOLOL Anti-hipertensivo 275
Espectrofotometria de BENZOILMETRONIDAZOL Antiprotozoário e antibacteriano 308
Absorção Molecular
CLORIDRATO DE FLUOXETINA Antidepressivo 227
19
 Absorção Molecular no UV/Vis
Como melhorar a absorção da radiação eletromagnética?
- Se o analito não for uma espécie absorvente ou que tenha uma baixa absorção, deve-se
buscar reagentes que reajam seletiva e quantitativamente com este formando produtos
que absorvam no UV ou no visível.
- Uma série de agentes complexantes são usados para determinação de espécies
inorgânicas. Exemplos: SCN- para Fe3+; I- para Bi3+.
Absorção Molecular no UV/Vis
O que é medido?
Qual a relação entre a absorção e a concentração?

• Transmitância

• Absorvância (absorbância)

• Natureza do solvente, pH, temperatura, concentração de eletrólitos e presença de

substâncias interferentes são as variáveis comuns que influenciam o espectro de absorção e,
evidentemente, seus efeitos precisam ser conhecidos.
O que é medido?
✓ Quando um feixe de radiação monocromática (Po) atravessa
uma solução contendo uma espécie absorvente, uma parte
dessa energia é absorvida, enquanto a outra é transmitida (P).

✓ Devido às interações entre os fótons e as espécies P

absorventes, a potência radiante do feixe decresce de Po para P. Po

b
✓ A transmitância T da solução é a razão da radiação incidente e transmitida pela solução:

P
T= portanto, T está entre 0 e 1.
Po
✓ A transmitância percentual é simplesmente 100T e fica entre 0 e 100%.
P
% T= x 100%
Po
O que é medido?
 
A = log Po  = − log T
P 
 
P
A = -log T Po

b
✓ A absorvância (A) de uma solução está relacionada com a transmitância de forma
logarítmica.
✓ Quando a absorvância de uma solução aumenta, a transmitância diminui.
✓Se nenhuma luz é absorvida, P = Po e A = 0.
✓ Se 90% da luz são absorvidos, 10% são transmitidos e A= 1.
 Lei de Lambert e de Beer

Lei de Lambert: " A intensidade da luz Lei de Beer: " A intensidade da luz absorvida
absorvida cresce proporcionalmente à medida cresce proporcionalmente à medida que a
que a espessura do meio absorvente aumenta concentração da substância absorvente aumenta
aritmeticamente ". aritmeticamente ".
 Relação entre A e T com a concentração

2,0
A = -log T
Absorbância

1,5

1,0

0,5 1,0

0,0 0,8
0,0 2,5 5,0 7,5 10,0

Transmitância
Concentração
0,6

0,4

0,2

0,0
0 2 4 6 8 10
Concentração
 Lei de Lambert-Beer
✓ A absorvância é diretamente proporcional à concentração, c, de espécies absorventes e
ao caminho óptico, b.

A= abc
ou

A= ebc
A = absorvância (adimensional)
a = absortividade (característica de cada espécie absorvente)
b = caminho óptico (cm)
c = concentração da espécie absorvente (g/L ou mol /L)
e = absortividade molar (quando a concentração, c, da espécie é dada
em mol L-1)
 Análise Quantitativa
Procedimento

✓ A espécie a ser analisada deve absorver luz em  conhecido. Normalmente seleciona-se  onde
absorvância é máxima: maior sensibilidade, menor incerteza.

✓ O  de absorção deve ser diferenciado de outras substâncias presentes na amostra.

✓ Conhecimento das variáveis que influenciam o espectro de absorção: pH, solvente, interferentes,
quantidade de reagentes, etc.

✓Preparo do “branco”: contém todos os reagentes presentes na solução da espécie a ser analisada,
menos a espécie a ser determinada. Normalmente, subtrai-se a absorbância do branco das
absorbâncias das soluções padrões e da amostra antes de realizar-se os cálculos.

✓ Construção da curva analítica de calibração: medida da absorbância de várias soluções de

concentração conhecida da espécie a ser determinada.
Análise Quantitativa • Curva analítica
• Solução padrão/estoque
• Planejamento da curva
• Linearidade
• Equação da curva
• Coeficiente angular
• Sensibilidade
• Coeficiente de correlação
• Interpolação
• Branco da curva / origem no gráfico

• Fator de calibração

O fator de calibração (FC) é um artifício utilizado rotineiramente e seu cálculo é feito de acordo com
o que se segue:
De posse do fator de calibração (FC), é possível obter-se a concentração
da amostra:
Exemplo
Complete a tabela a seguir, calculando os valores que faltam.

Transmitância Percentual de Absorvância

transmitância
0,156
35,8
0,251
0,689
78,0
1,25
Exemplo:
A 452 nm, uma solução com 1,68 x 10-3 g/L de clorofila B em etanol, apresentou
transmitância igual a 49,7%. Sabendo que sua absortividade molar nesse comprimento de
onda é de 1,63 x 105 L/[Link], calcule a massa molar da clorofila B, considerando b=
1,00 cm.
Exemplo
Calcular a absorvância de uma solução com concentração 0,00240 mol/L, e 2,00 cm de
caminho óptico e supondo:
a) absortividade molar e = 1,00.102 L. [Link]-1;
b) absortividade molar e = 2,00.102 L. [Link]-1.
Comentar a coerência dos resultados.
Exemplo: O berílio(II) forma um complexo com a acetilacetona (166,2 g/mol). Calcular a absortividade
molar do complexo, dado que uma solução 1,34 mg L-1 apresenta uma absorvância de 0,250 quando

medida em um caminho óptico de 1,00 cm e  = 295 nm, o comprimento de onda de máxima

absorção.
Um analista decidiu realizar a determinação do teor de KMnO4 empregando análise
espectrofotométrica (λmax = 520 nm). A curva de calibração obtida para o procedimento foi:
Y = 0,0089x + 0,031, R2 = 0,9991. Para determinação do teor de KMnO4 em uma solução
amostra, tomou-se 25,00 mL desta e levou-se para balão volumétrico de 100,0 mL. Esta
solução resultante apresentou T(%) = 38,7. Calcule a concentração em mg/L da solução de
KMnO4. Considere a diluição realizada.
Exemplo:
Para a determinação da concentração de uma solução de KMnO4, foi efetuada uma análise
espectrofotométrica. Foi tomada uma alíquota de 10 mL da amostra para diluição da mesma
em um balão volumétrico de 100 mL. Soluções padrão foram devidamente preparadas para
a construção de uma curva analítica e o resultado da análise das amostras é descrito na
tabela a seguir. Sabendo que a equação da reta correspondente à curva de calibração
encontrada foi: y = 0,0148x – 0,004. Qual a concentração média da amostra de KMnO4 em
mg/L e em mol /L?
Amostras 1 2 3
Absorvância 0,346 0,351 0,343
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DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ANALÍTICA
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Espectrofotometria de Absorção
Molecular nas Regiões do
Ultravioleta e Visível (UV-Vis)

Continuação...

Profª. Daniele Muniz

Resumo... Transmitância Absorvância

A = -log T T = 10-A
Lei de Lambert-Beer
1,0

ou
P 0,8

Po A= abc

Transmitância
0,6

b ou 0,4

A= ebc 0,2

0,0
0 2 4 6 8 10
Concentração

Se uma amostra para análise espectrofotométrica for colocada numa célula

de 10 cm, a absorbância será 10 vezes maior do que a absorbância numa
2,0
célula de 1 cm. A absorbância da “solução branco” também aumentará em
um fator de 10?

Absorbância
1,5

1,0
Sim será, pois a lei de Beer prevê uma relação linear entre a absorbância e a
0,5
concentração. Portanto, aumento a concentração por um fator de 10 a
0,0
0,0 2,5 5,0 7,5 10,0
absorbância também será alterada por este fator Concentração
 Desvios da Lei de Beer
Desvios notáveis da proporcionalidade linear entre a absorvância e a concentração
são encontrados na lei de Beer.

Desvio
positivo

Absorvância
Desvio
negativo

CONSIDERAÇÕES:
1- É válida para baixas concentrações
concentração
do analito, abaixo de 0,01 mol L-1.
A distância entre os analitos individuais torna-se pequenas o que faz com que
a absorção da luz seja dificultada à medida que a concentração aumenta
2- A lei de Beer é válida para uma radiação monocromática, ou seja, para um único
λ.

Na prática deve-se isolar uma banda simétrica selecionando um comprimento de

onda próximo ao máximo de absorção.
3- Ocorrem desvio se o analito estiver envolvido em uma reação de equilíbrio.

• Espécie absorvente sofre associação, dissociação ou reação com o solvente

para gerar produtos que absorvem de forma diferente do analito isolado.

✓Equilíbrio ácido-base

HIn(aq) H+(aq) + In-(aq)

Cor 1 Cor 2
λ = 430 nm λ = 570 nm

• ⇩ pH → ⇧ [HIn] e vice-versa ➔ ⇧ A ou ⇩ A.
 Instrumentação

Os instrumentos espectroscópicos comuns têm cinco componentes,

incluindo:
• Uma fonte estável de energia radiante
• Um recipiente transparente para conter a amostra
• Um dispositivo que isole uma região restrita do espectro para a medida
• Um detector de radiação, que converta a energia radiante para um sinal útil
(normalmente elétrico)
• Um processador e um dispositivo de saída que apresenta o sinal transduzido em
uma escala de medida, em um medidor digital ou registrador gráfico.
 Espectrofotômetro
Diagrama de blocos

SELETOR DO
FONTE COMPRIMENTO AMOSTRA DETECTOR REGISTRADOR
DE ONDAS

Processador e
leitor de saída do
sinal ou

Registrador
 Espectrofotômetro
SELETOR DO
FONTE COMPRIMENTO AMOSTRA DETECTOR REGISTRADOR
DE ONDAS

Fontes de Radiação - Requisitos

✓ Intensidade de radiação elevada.

✓ Emitir em uma ampla faixa de comprimento de onda.

✓ Intensidade constante com o tempo.

✓Além disso deve ter um tempo de vida longo

• São constituídas por filamentos de materiais que são excitados por descargas
elétricas com elevada voltagem ou aquecimento elétrico.
 Fontes de Radiação
- Lâmpada de tungstênio: fonte de radiação visível e infravermelho próximo. Opera
numa temperatura de 3000 K e produz radiação útil na faixa de 320 a 2500 nm.

- Lâmpada de deutério, arco de xenônio ou vapor de mercúrio: emitem radiação

de 180 a 370 nm.

Lâmpada de Lâmpada de arco Lâmpada de D2

Vapor de Hg de Xenônio
 Espectrofotômetro
SELETOR DO
FONTE COMPRIMENTO AMOSTRA DETECTOR REGISTRADOR
DE ONDAS

Monocromadores: seleção do comprimento de onda em que se tem interesse para a

análise
Tipos Ii
Requisitos: Ir
✓ Pureza espectral
✓ Monocromadores
✓ Dispersão - Prisma
✓ Resolução - Redes Ii Ir
✓ Poder de coleta

Constituição: fenda de entrada, fenda de saída e sistema de dispersão (prisma ou rede).

Monocromadores - Prismas
A radiação policromática vinda da fonte de radiação
passa pela fenda de entrada e incide sobre a face de
um prisma, sofrendo um desvio.

Os vários comprimentos de onda terão diferentes direções após a incidência no prisma. Se for
realizado um ajuste rigorosamente controlado da fenda de saída, pode-se selecionar o
comprimento de onda desejado
Monocromadores – Redes de difração

Redes de difração: comprimentos de ondas diferentes são difratados em ângulos

diferentes. A rotação da rede permite que somente uma faixa estreita de comprimentos de
onda passe a frente da fenda de saída.

Dispositivo constituído de uma série de

ranhuras muito próximas, paralelas e
equidistantes traçadas sobre uma placa
de vidro, metálica ou de um polímero.
 Lentes
Fonte
luminosa

Fenda

Rede de
difração
Detector

Cubeta Fenda Lentes

 Espectrofotômetro
SELETOR DO
FONTE COMPRIMENTO AMOSTRA DETECTOR REGISTRADOR
DE ONDAS

Recipientes para amostras

São geralmente denominados células

ou cubetas, devem ter janelas que
sejam transparentes na região
espectral de interesse.
 Recipientes para amostras
As células de melhor qualidade têm janelas que são perpendiculares
à direção do feixe de forma a minimizar as perdas por reflexão.
Perdas por reflexão ou espalhamento
- Ocorrerem nas paredes das células

• Para compensar esses efeitos, a potência do feixe, transmitida através de uma célula com a solução
do analito, é comparada com a potência que atravessa uma célula idêntica contendo somente o
solvente ou o branco dos reagentes.
 Espectrofotômetro
SELETOR DO
FONTE COMPRIMENTO AMOSTRA DETECTOR REGISTRADOR
DE ONDAS

• Todos os detectores de fótons são baseados na interação da radiação com uma

superfície reativa para produzir elétrons (fotoemissão).
• Convertem radiação eletromagnética em sinal elétrico, se baseiam na interação desta
com uma superfície para produzir elétrons.
Requesitos: Tipos:

• Resposta em faixa ampla de comprimento de onda • Fototubo

• Respostas rápidas a baixos níveis de energia radiante • Fotomultiplicador
• Baixo nível de ruído
• Sinal elétrico proporcional a potência radiante do feixe
Detectores - Fototubo
Radiação provoca emissão de elétrons de uma superfície sólida fotossensível

✓ Cátodo fotoemissivo (metal alcalino ou

óxido metálico) que emite elétrons quando
irradiado com luz.

✓ Fotocorrente  Radiação do feixe

Detectores - Fotomultiplicador
✓ Resposta baseada no efeito fotoelétrico.
✓ Mais sensível que o fototubo.
✓ Apresenta uma série de dínodos.

Os elétrons emitidos são acelerados

Anodo
Isolante
para os dínodos mantidos a potencial
Dinodos
Fotocatodo e-- - -
e -e -ee- (9-13) de 90v e mais positivo que o outro
e e e-
e-e-
e- e- dínodo até finalmente ser coletado no
e-
Energia ânodo
luminosa Janela de
quartzo
1 fóton  105 a 107 elétrons
*Aplificação do sinal em um
fator de 100 milhões
Detector – Olho humano

O olho humano também é um detector; ele converte a radiação visível em

sinais elétricos, que são transmitidos ao cérebro via uma cadeia de neurônios
presentes no nervo óptico e que produzem a visão.
 Espectrofotômetro

SELETOR DO
FONTE COMPRIMENTO AMOSTRA DETECTOR REGISTRADOR
DE ONDAS

Processador de dados

Atualmente os processadores de dados são realizados no equipamento por sistemas

elétricos/computacionais, a fim de medir a quantidade de corrente elétrica e transformar
em gráficos, ou dados de tabelas.
Arranjos Instrumentais
 Arranjos Instrumentais
Feixe simples

• Coloca-se o branco no caminho óptico e

mede-se a intensidade da energia radiante em
seguida o substitui pelo recipiente com a
amostra.

• Não é adequado para medir absorbâncias em

função do tempo
 Arranjos Instrumentais
Feixe duplo

•Dois feixes de radiação são formados no espaço, por

um espelho que divide o feixe vindo do
monocromador em dois. Um feixe passa através da
solução referência (branco) até o transdutor e outro,
ao mesmo tempo, passa através da amostra até o
segundo transdutor.
Espectrometria de absorção molecular no UV/Vis – Resumo...
• Aplicável na região de comprimento de onda entre 180 e 780nm.
• Está baseada na medida de transmitância ou absorbância.
• Espécies que absorvem no ultravioleta ou no visível (espécies coloridas).
• Espécies que não absorvem: reação com cromóforo (grupo funcional que tem um
espectro de absorção característico na região do UV-Vis).
• Lei de Beer
• Aplicação da lei de Beer a misturas:
Atotal = A1 + A2 + A3 +...+An = ε1bc1 + ε2bc2 + ε3bc3+...+ εnbcn

Absorvância
- Cada centro atua de modo independente sobre a radiação.
- A lei de Beer pode ser estendida a mistura de vários componentes.
- Cada espécie possui absortividade diferente e as absorvâncias se adicionam.
- Para uma mistura de dois componentes I e II em certo : 1 2
Os valores do quadro abaixo são pertinentes a um determinado cromóforo. Complete as
lacunas em branco, admitindo que o sistema obedece a lei de Lambert-Beer. Se for impossível
calcular, assinale a lacuna correspondente com um “X”. Demonstre todos os cálculos
 e a Massa C C b A %T
(nm) (L/[Link]) (L/[Link]) molar (g/L) (mol/L) (cm)
(g/mol)
640 4000 40,0 1,5 x 10-5 50,0
500 2000 2,5 x 10-5 2,0
20,0 168 1,5 0,600
Os valores do quadro abaixo são pertinentes a um determinado cromóforo. Complete as
lacunas em branco, admitindo que o sistema obedece a lei de Lambert-Beer. Se for impossível
calcular, assinale a lacuna correspondente com um “X”. Demonstre todos os cálculos

Massa
 e a C C b
molar A %T
(nm) (L/[Link]) (L/[Link]) (g/L) (mol/L) (cm)
(g/mol)

640 4000 40,0 100 1,5 x 10-3 1,5 x 10-5 5,0 0,301 50,0

500 2000 X X X 2,5 x 10-5 2,0 0,100 79,4

X 3333 20,0 168 2,0 x 10-2 1,2 x 10-4 1,5 0,600 25,1