BACTERIOLOGIA
CLÍNICA
Margarida Neves Souza
Técnicas de coloração em
Bacteriologia Clínica
Objetivos de aprendizagem
Ao final deste texto, você deve apresentar os seguintes aprendizados:
Caracterizar bactérias gram-positivas e gram-negativas.
Diferenciar propriedades celulares das bactérias álcool-acidorresistentes.
Listar as diferentes colorações de uso na Bacteriologia Clínica.
Introdução
A identificação de espécies bacterianas faz parte da rotina de laboratórios
de bacteriologia clínica. Dessa forma, diferentes técnicas de coloração são
utilizadas para que seja possível observar as bactérias em microscopia
de campo claro, já que os corantes aumentam o contraste e facilitam a
visualização.
Neste capítulo, você vai aprender a caracterizar e diferenciar as bac-
térias gram-positivas e gram-negativas e entender como elas são cora-
das pela técnica coloração de Gram, além de saber o que são bactérias
álcool-acidorresistentes, por que elas não são coradas pela coloração de
Gram e qual é a técnica de coloração utilizada para essas bactérias. Você
ainda vai aprender, neste capítulo, outras técnicas de coloração que são
utilizadas na bacteriologia clínica.
Bactérias gram-positivas e gram-negativas
A maioria das bactérias tem uma parede celular, composta por peptidoglicano
(também chamado de mureína ou mucopeptídeo), que circunda a membrana
plasmática. Além de conferir rigidez e a forma da célula, a parede celular
também tem como funções a proteção, o que evita que a célula se rompa (lise
celular) quando a pressão osmótica dentro da célula é maior que a do meio
externo, e a ancoragem para os flagelos (LEVINSON, 2016).
2 Técnicas de coloração em Bacteriologia Clínica
As bactérias podem ser classificadas como gram-positivas ou gram-
-negativas. Essa classificação é feita de acordo com a resposta à coloração de
Gram em diferenças estruturais nas paredes celulares (TORTORA; FUNKE;
CASE, 2017). É muito importante que você saiba as diferenças estruturais entre
as bactérias gram-negativas e gram-positivas, as quais estão representadas na
Figura 1 e serão explicadas ao longo do capítulo.
GRAM-NEGATIVA GRAM-POSITIVA
Membrana externa
Lipoproteínas
Peptidoglicano
Espaço
periplásmico
Membrana
citoplasmática
Lipopolissacarídeos Porina Proteína
Figura 1. Diferenças estruturais entre bactérias gram-negativas e gram-positivas. Uma das
diferenças mais marcantes é a quantidade de camadas de peptidoglicano (uma ou poucas
nas bactérias gram-negativas e várias nas gram-positivas). Outra diferença importante é que
somente as bactérias gram-negativas têm uma membrana externa, a qual é constituída
de lipopolissacarídeos (LPSs).
Fonte: Adaptada de Designua/[Link].
Bactérias gram-negativas
As paredes celulares das bactérias gram-negativas têm uma ou poucas cama-
das de peptidoglicano, mas são mais complexas estrutural e quimicamente em
relação às gram-positivas. Somente as gram-negativas têm uma membrana
externa, que é constituída de LPSs, lipoproteínas e fosfolipídios. As funções
da membrana externa incluem manter a estrutura bacteriana, conferir defesa
celular e funcionar como uma barreira de permeabilidade a grandes moléculas
Técnicas de coloração em Bacteriologia Clínica 3
(p. ex., metais pesados, enzimas digestórias, como a lisozima, e antibióticos)
e moléculas hidrofóbicas (p. ex., detergentes). A membrana externa, porém,
permite uma permeabilidade seletiva por intermédio das proteínas da mem-
brana — chamadas de porinas —, as quais formam canais que permitem
a passagem de determinadas moléculas, como nucleotídeos, dissacarídeos,
peptídeos, aminoácidos, vitamina B12 e ferro.
O espaço periplásmico das bactérias gram-negativas compreende a área
entre a superfície externa da membrana citoplasmática e a superfície interna
da membrana externa e é constituído pelo periplasma, um fluido semelhante
a um gel que contém várias enzimas de degradação e proteínas de transporte.
Algumas espécies de bactérias gram-negativas têm enzimas β-lactamases no
espaço periplásmico, que degradam antibióticos da classe β-lactâmicos, como,
por exemplo, a penicilina, podendo ser, portanto, naturalmente resistentes
a essa classe de antibióticos. O LPS, constituinte da membrana externa, é
uma molécula grande, anfipática (extremidades hidrofóbicas e hidrofílicas) e
complexa. O LPS é uma endotoxina extremamente tóxica, sendo considerado
um potente estimulador de respostas imunológicas no hospedeiro, podendo
causar febre, choque e outros sintomas graves. O LPS é constituído por três
unidades distintas:
lipídio A — responsável pelos efeitos tóxicos;
cerne polissacarídeo — formado por cinco açúcares ligados ao lipídio
A, tem a função estrutural de estabilidade;
polissacarídeo O (ou antígeno O) — composto por moléculas de
açúcar, tem a função de antígeno, sendo útil para diferenciar espécies
bacterianas gram-negativas, já que existe grande variabilidade entre
espécies e cepas bacterianas.
Algumas bactérias gram-negativas, como Neisseria meningitidis, N. go-
norrhoeae, Haemophilus influenzae e H. ducreyi, não têm LPS na membrana
externa, mas têm uma molécula semelhante, o lipo-oligossacarídeo, que é um
importante fator de virulência causador de febre e outros sintomas. Outros
exemplos de bactérias gram-negativas são Escherichia coli, Salmonella ente-
rica e Pseudomonas aeruginosa (BROOKS et al., 2014; LEVINSON, 2016;
MURRAY et al., 2004; TORTORA; FUNKE; CASE, 2017).
4 Técnicas de coloração em Bacteriologia Clínica
Bactérias gram-positivas
As paredes celulares das bactérias gram-positivas são mais espessas e rígidas
em comparação às das gram-negativas, pois têm várias camadas de peptidogli-
cano. O espaço periplásmico também está presente, porém, nas bactérias gram-
-positivas, há uma camada granular composta por ácido lipoteicoico. Apenas
as bactérias gram-positivas contêm ácidos teicoicos (presente na maioria das
espécies de bactérias gram-positivas), que são polímeros hidrossolúveis de
poliol fosfatos situados na camada externa da parede celular. Quando estão
ligados à camada de peptidoglicano, são classificados como ácidos teicoicos
da parede, porém, quando atravessam a camada de peptidoglicano, ligando-
-se aos lipídios da membrana citoplasmática, são classificados como ácidos
lipoteicoicos (têm um ácido graxo).
Os ácidos teicoicos são antígenos de superfície das bactérias gram-positivas
que favorecem a ligação com outras bactérias e receptores específicos de
células de mamíferos (fenômeno patogênico chamado de aderência), podendo
ser utilizados na diferenciação de sorotipos bacterianos. Além disso, os ácidos
teicoicos são importantes fatores de virulência, pois são capazes de induzir
choque séptico no hospedeiro. Alguns exemplos de bactérias gram-positivas
são: Streptococcus agalactiae, Staphylococcus aureus, Corynebacterium
diphtheriae e Bacillus anthracis (BROOKS et al., 2014; LEVINSON, 2016;
MURRAY et al., 2004; TORTORA; FUNKE; CASE, 2017).
Coloração de Gram
Agora que já estudou as características e as diferenças estruturais das paredes
celulares das bactérias gram-positivas e gram-negativas, você irá aprender
sobre a técnica de coloração de Gram, a qual é amplamente utilizada para
visualizar e classificar as bactérias nesses dois grupos. A coloração de Gram
leva o nome do seu descobridor: Hans Christian Gram — um médico his-
tologista dinamarquês que tentava corar bactérias em tecidos infectados.
Em 1884, ele desenvolveu a técnica ao perceber que, de acordo com o corante
utilizado, as bactérias adquiriam cores diferentes, o que permitia classificá-
-las em dois grupos diferentes: as que se coravam de azul/roxo e as que se
coravam de vermelho/rosa (gram-positivas e gram-negativas, respectivamente)
(BROOKS et al., 2014).
Técnicas de coloração em Bacteriologia Clínica 5
Durante as primeiras etapas da coloração, o corante cristal de violeta e
o iodo são incorporados ao citoplasma das bactérias, entretanto, ao adicionar
um descorante, algumas bactérias se tornam incolores, sendo então denomi-
nadas gram-negativas, enquanto outras permanecem coradas de azul/púrpura,
sendo estas chamadas de gram-positivas. Tendo em vista que as bactérias
gram-negativas se tornam incolores depois da descoloração, é necessário que
elas sejam, então, coradas para que possam ser visualizadas no microscópio de
campo claro, para isto, utilizam-se os corantes vermelho safranina ou fucsina
(TORTORA; FUNKE; CASE, 2017).
Para corar as bactérias pelo método de Gram, inicialmente se confecciona um esfregaço
em lâmina do material clínico, que deve ser fixado pelo calor ou pela utilização de
metanol ou de etanol, após, realiza-se a técnica de coloração de Gram, que consiste
nas seguintes etapas:
1. Adição do corante básico cristal de violeta, que cora as células de azul/púrpura.
2. Lavagem da lâmina com água de torneira ou solução de iodo.
3. Adição de solução de iodo (mordente), que forma um complexo cristal violeta-
-iodo, mantendo as células coradas de azul.
4. Descoloração da lâmina com um solvente orgânico (álcool ou solução álcool-
-acetona), que remove a coloração azul das bactérias gram-negativas (as quais
ficam incolores), mas mantém a coloração azul nas bactérias gram-positivas.
5. Lavagem da lâmina com água de torneira.
6. Adição do corante básico vermelho safranina ou fucsina, que cora as bactérias
gram-negativas de rosa/vermelho.
7. Lavagem com água de torneira e secagem da lâmina.
Fonte: Brasil (2013) e Levinson (2016).
A retenção, ou não, do corante cristal de violeta é explicada devido a algu-
mas diferenças estruturais das paredes celulares das bactérias gram-positivas
e gram-negativas. As bactérias gram-positivas têm uma parede celular mais
espessa em relação às gram-negativas, a qual é composta por várias camadas
de peptidoglicano, enquanto somente as bactérias gram-negativas têm LPSs
na parede celular. O cristal de violeta e o iodo penetram facilmente nas cé-
lulas das bactérias, formando um complexo insolúvel de cristal violeta-iodo,
que é maior do que a molécula de cristal que entrou na célula (TORTORA;
6 Técnicas de coloração em Bacteriologia Clínica
FUNKE; CASE, 2017). Quando as células são lavadas com álcool ou solução
álcool-acetona, podem ocorrer duas situações:
as bactérias gram-negativas conseguem eliminar o complexo cristal
violeta-iodo, que atravessa uma camada fina de peptidoglicano, uma
vez que o álcool penetra e rompe a camada externa de LPSs;
as bactérias gram-positivas retêm o complexo cristal violeta-iodo,
já que esse complexo não consegue ultrapassar a espessa camada de
peptidoglicano.
A coloração de Gram é, portanto, considerada uma técnica diferencial, haja
vista que as bactérias gram-positivas são coradas de azul/púrpura, enquanto
as gram-negativas ficam na tonalidade rosa/vermelho (LEVINSON, 2016;
MADIGAN et al., 2016).
Bactérias álcool-acidorresistentes
Algumas bactérias, como as dos gêneros Mycobacterium, Corynebacterium
e Nocardia (este último gênero compreendendo somente as espécies patogê-
nicas), têm algumas peculiaridades em suas paredes celulares. As paredes
celulares dessas bactérias contêm alta concentração (60%) de um lipídio céreo
hidrofóbico, denominado ácido micólico, o qual é unido ao peptidoglicano
por um polissacarídeo (TORTORA; FUNKE; CASE, 2017). A micobactéria
causadora da tuberculose (Mycobacterium tuberculosis) tem grandes quanti-
dades de ácido micólico, e sua parede celular está representada na Figura 2.
A consistência cerosa e com propriedade hidrofóbica causada pelo ácido
micólico torna essas bactérias resistentes a muitos produtos químicos, como
detergentes, ácidos fortes e alguns corantes, por essa razão, os corantes utili-
zados na coloração de Gram não conseguem penetrar e corar essas bactérias
(a não ser que a parede de ácido micólico seja removida, corando-se, então,
pelo método de Gram como gram-positivas). Apesar disso, elas podem ser
coradas por carbol-fucsina, um corante de cor vermelha que penetra facilmente
na parede celular depois do aquecimento. Após a penetração do corante carbol-
-fucsina, essas bactérias não são descoloradas por adição de álcool-ácido,
já que esse corante tem mais solubilidade no ácido micólico. Devido a essa pro-
priedade, essas bactérias são chamadas de bactérias álcool-acidorresistentes
(BROOKS et al., 2014; LEVINSON, 2016).
Técnicas de coloração em Bacteriologia Clínica 7
Figura 2. Estrutura da parede celular da Mycobacterium tuberculosis. Uma das principais
peculiaridades é a presença de ácido micólico.
Fonte: Barros, Machado e Sprinz (2013, p. 67).
As micobactérias (p. ex., M. tuberculosis e M. leprae) têm forma de ba-
cilo, sendo comumente denominadas como bacilos álcool-acidorresistentes
(BAARs). As micobactérias crescem lentamente, duplicando-se a cada 18 h.
O crescimento lento das micobactérias dificulta a cultura de amostras clínicas,
pois é necessário que elas sejam incubadas em meio especial (p. ex., meio
de Löwenstein-Jensen) por 6 a 8 semanas, para só então serem consideradas
negativas, se não houver crescimento bacteriano durante esse tempo. Dessa
forma, é essencial realizar um esfregaço da amostra clínica (exame direto) antes
de esperar as bactérias crescerem e, em seguida, corar a lâmina para observar
a presença e contar os BAARs em microscópio óptico (exame chamado de
baciloscopia), pois isto auxilia o diagnóstico clínico de micobactérias de forma
mais rápida, o que demonstra a importância da etapa de coloração (BROOKS
et al., 2014; LEVINSON, 2016).
8 Técnicas de coloração em Bacteriologia Clínica
Coloração de Ziehl-Neelsen
Você acabou de aprender sobre as peculiaridades das bactérias álcool-acidorre-
sistentes e entendeu o porquê elas não são usualmente coradas pela coloração
de Gram, então, a partir de agora, você vai aprender, com mais detalhes,
como as bactérias álcool-acidorresistentes são coradas para que possam ser
visualizadas em microscopia de campo claro.
A técnica mais utilizada em laboratórios de bacteriologia clínica para
corar as bactérias álcool-acidorresistentes é a coloração de Ziehl-Neelsen.
A primeira etapa dessa coloração consiste na adição do corante vermelho
carbol-fucsina na lâmina contendo o esfregaço previamente fixado, sendo ne-
cessário aplicar calor para aumentar a penetração e a retenção do corante. Após
a lavagem com água, a lâmina é descolorada com álcool-ácido, nessa etapa, as
bactérias álcool-acidorresistentes permanecem coradas com o corante verme-
lho, no entanto, as outras bactérias que não têm o ácido micólico em sua parece
celular acabam sendo descoloridas. Dessa forma, um contracorante (coloração
de contraste) deve ser adicionado (geralmente o azul de metileno) para corar
as bactérias que se não são álcool-acidorresistentes. No microscópio óptico,
as bactérias álcool-acidorresistentes se apresentam com cor rosa/vermelha,
enquanto o fundo da lâmina e os outros microrganismos não acidorresistentes
apresentam a cor do contracorante (geralmente azul) (BROOKS et al., 2014;
MADIGAN et al., 2016; TORTORA; FUNKE; CASE, 2017).
Para corar as bactérias álcool-acidorresistentes, inicialmente se confecciona um esfre-
gaço em lâmina do material clínico, que deve ser fixado pelo calor. Após, realiza-se a
técnica de coloração de Ziehl-Neelsen, que consiste nas etapas descritas a seguir.
1. Adição de carbol-fucsina (ou fucsina fenicada) na lâmina e aquecimento em
chama até a emissão de vapores.
2. Após a lâmina esfriar, lavagem com água corrente ou deionizada.
3. Descoloração da lâmina com álcool-ácido 3% (etanol 95% e ácido clorídrico
3,0%), até que haja uma coloração rosa suave.
4. Lavagem com água corrente ou deionizada.
5. Adição do azul de metileno.
6. Lavagem com água corrente ou deionizada e secagem natural.
Técnicas de coloração em Bacteriologia Clínica 9
Esta é uma coloração diferencial, já que coram somente as bactérias que contêm
ácido micólico nas paredes celulares. Os patógenos com maiores demandas laborato-
riais que necessitam ser corados por essa técnica são as micobactérias M. tuberculosis
e a M. leprae, que são os agentes causadores das doenças tuberculose e hanseníase,
respectivamente (TORTORA; FUNKE; CASE, 2017).
Fontes: Brasil (2013) e Brooks et al. (2014).
Outras técnicas de colorações de bactérias
Além das colorações Gram e Ziehl-Neelsen, que são as mais rotineiramente
realizadas, existem outras que também são utilizadas para corar bactérias em
situações específicas.
A coloração de Kinyoun é usada para diferenciar as espécies álcool-
-acidorresistentes (Mycobacterium, Corynebacterium e Nocardia) das não
álcool-acidorresistentes, sendo uma opção quando se coram fracamente pelo
método de Ziehl-Neelsen. Na realidade, a coloração de Kinyoun é uma modi-
ficação do teste de Ziehl-Neelsen, no qual se acrescenta uma etapa prévia ao
adicionar uma fórmula contendo fucsina básica, fenol, etanol e água destilada
(BROOKS et al., 2014).
Os corantes podem ser utilizados individualmente em soluções aquosas
ou alcoólicas para visualizar as bactérias de forma destacada e determinar a
morfologia e arranjo. Como exemplos, destacamos os corantes azul de metileno,
carbol-fucsina, cristal violeta e safranina (TORTORA; FUNKE; CASE, 2017).
Algumas bactérias (p. ex., Klebsiella pneumoniae) produzem cápsula
externamente à parede celular, o que é considerado um fator de virulência.
A coloração negativa para cápsulas é um método utilizado para verificar se
a bactéria em análise tem cápsula. O princípio da técnica é que a maioria dos
corantes não consegue corar as cápsulas bacterianas, pois estas são solúveis
em água, mas cora o restante do material, dessa forma, o fundo fica escuro e
as cápsulas são visualizadas como halos incolores. É possível utilizar o corante
tinta da Índia, ou nigrosina, mas existem outros protocolos possíveis (p. ex.,
método de Welch, que utiliza cristal violeta e sulfato de cobre) (BROOKS et
al., 2014; TORTORA; FUNKE; CASE, 2017).
10 Técnicas de coloração em Bacteriologia Clínica
Algumas bactérias (p. ex., Bacillus cereus) produzem endósporos, que
são estruturas dormentes intracelulares que conferem resistência bacteriana
em condições ambientais adversas, como calor extremo, radiação, produtos
químicos fortes, dessecamento e carência nutricional. A maioria dos corantes
(como os utilizados no Gram) não consegue penetrar na parede dos endóspo-
ros, não sendo, portanto, corados por eles, porém, existe uma técnica capaz
de corar e detectar se a bactéria analisada tem endósporo, a qual é chamada
de coloração de endósporo (Schaeffer-Fulton). Nessa técnica, aplica-se o
corante verde malaquita com fixação em calor, o que ajuda a sua penetração
na parede do endósporo, além de um contracorante (safranina) que cora as
porções celulares que não são endósporos. Assim, o endósporo adquire uma
cor verde, enquanto o restante adquire cor vermelho/rosa (MADIGAN et al.,
2016; TORTORA; FUNKE; CASE, 2017).
Os flagelos, estruturas que conferem motilidade celular, são encontrados
em algumas bactérias (p. ex., Salmonella enterica). A detecção da presença
de arranjos flagelares pode auxiliar no diagnóstico, entretanto, os flagelos
são muitos finos, o que impede que sejam visualizadas no microscópio óp-
tico sem uma coloração adequada. Existe um protocolo para coloração do
flagelo, no qual se utiliza um mordente (suspensão coloidal de sais de ácido
tânico) que aumenta o diâmetro do flagelo, seguido da aplicação do corante
carbol-fucsina, sendo então possível a sua visualização em microscópio óptico
(BROOKS et al., 2014).
O Quadro 1 traz um resumo das diferentes técnicas de coloração utilizadas
na área da Bacteriologia Clínica.
Leitores do material impresso, para visualizar as figuras
deste capítulo em cores, acessem o link a seguir ou o
código QR ao lado.
[Link]
Quadro 1. Principais colorações utilizadas na Bacteriologia Clínica
Coloração Classificação Corantes utilizados Principais aplicações Aparência da coloração
Gram Diferencial Cristal violeta e Diferenciar a maioria das Gram-negativa e gram-
safranina (ou fucsina) espécies bacterianas, -positiva, respectivamente
classificando-as como
gram-positivas (cor azul/
púrpura) ou gram-negativas
(cor rosa/vermelha)
Fonte: Schira/[Link].
Ziehl-Neelsen Diferencial Carbol-fucsina (ou Diferenciar espécies
fucsina fenicada) e álcool-acidorresistentes
azul de metileno (Mycobacterium,
Corynebacterium e Nocardia)
(cor rosa/vermelha) das
espécies não álcool-
-acidorresistentes (cor azul)
Fonte: Sudarma/[Link].
(Continua)
Técnicas de coloração em Bacteriologia Clínica
11
12
(Continuação)
Quadro 1. Principais colorações utilizadas na Bacteriologia Clínica
Coloração Classificação Corantes utilizados Principais aplicações Aparência da coloração
Kinyoun Diferencial Fucsina e azul Diferenciar espécies álcool-
de metileno -acidorresistentes
(cor rosa/vermelha) das
espécies não álcool-
-acidorresistentes (cor azul)
Técnicas de coloração em Bacteriologia Clínica
Fonte: Schira/[Link].
Azul de metileno, Simples Utilizados Determinar a morfologia e Cristal violeta
carbol-fucsina, individualmente em os arranjos bacterianos
cristal violeta soluções aquosas
e safranina ou alcoólicas
Fonte: Jacob Player/[Link].
(Continua)
(Continuação)
Quadro 1. Principais colorações utilizadas na Bacteriologia Clínica
Coloração Classificação Corantes utilizados Principais aplicações Aparência da coloração
Negativa para Especial Normalmente tinta da Detectar a presença
cápsulas Índia ou nigrosina de cápsula bacteriana
(halo incolor)
Fonte: Brooks et al. (2014, p. 33).
Endósporo Especial Verde malaquita Detectar a presença
(Schaeffer-Fulton) e safranina de endósporo na
bactéria (cor verde)
Fonte: Tortora, Funke e Case (2017, p. 67).
(Continua)
Técnicas de coloração em Bacteriologia Clínica
13
14
(Continuação)
Quadro 1. Principais colorações utilizadas na Bacteriologia Clínica
Coloração Classificação Corantes utilizados Principais aplicações Aparência da coloração
Flagelo Especial Carbol-fucsina e Detectar a presença de
Técnicas de coloração em Bacteriologia Clínica
um mordente flagelos e seus arranjos
Fonte: Tortora, Funke e Case (2017, p. 67).
Fonte: Adaptado de Tortora, Funke e Case (2017).
Técnicas de coloração em Bacteriologia Clínica 15
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