Resumo - PSPB
PCR (Reação em Cadeia da Polimerase)
● Trata-se do isolamento e ampliação de uma sequência específica de DNA,
buscando a produção de diversas cópias em um tubo de ensaio, como uma
replicação in vitro
● Pode ser utilizada para:
○ Diagnóstico de doenças (Genéticas,infecciosas, câncer)
○ Medicina forense (especialidade médica que aplica o conhecimento da
medicina para ajudar em investigações criminais)
○ Estudo da expressão gênica
○ Clonagem
○ Diagnóstico pré-natal (Realizado durante a gestação para monitorar a
saúde da mãe e detectar precocemente condições que possam afetar
o feto )
○ Estudo da evolução
● A localização da sequência alvo no DNA é feita por primers
○ Primers: Pequenos pedaços de DNA de fita simples, com cerca de 15
a 30 letras bases (Número seletivo o bastante para localizar um sítio
humano em um genoma complexo). Determinam os limites do
○ fragmento que será amplificado
○ Existem os primers sense e antisense
A. Sense: Projetado para se ligar à fita molde antisense (3' - 5').
Ao fazer isso, a sequência de DNA que ele gera é uma cópia
idêntica à fita sense original do gene (5’ - 3’)
B. Antisense: Se liga diretamente à fita sense original (5' - 3'). A
sequência estendida por este primer será complementar à fita
sense.
● Reagentes da PCR
○ DNA: Molde para reação
○ Primers: Início da polimerização
○ dNTPs: Nucleotídeos livres
○ Cofatores enzimáticos
■ MgCl2: Liga-se ao sítio ativo da Taq DNA Polimerase para
catalisar a ligação fosfodiéster, Forma complexos de dNTPs,
para que a enzima os reconheça como substrato, além de
estabilizar o DNA para o pareamento dos primers,
■ Tampão: Utiliza-se Tris-HCl para garantir a estabilidade do pH
ao longo dos ciclos.
○ Taq DNA Polimerase: Enzima responsável pela extensão
(desnaturação) da fita de DNA
● Como Funciona a PCR
○ Utiliza-se um termociclador para tornar o processo contínuo e criar as
milhares de cópias
○ Adiciona-se a solução com todos os reagentes ao termociclador e
inicia-se o processo de aquecimento.
○ Aos 95° a alta temperatura faz com que ocorra a desnaturação do
DNA
○ Aos 55° ocorre o anelamento dos primers as suas respectivas fitas
○ Aos 72° Ocorre a Extensão da DNA Polimerase, onde os dNTPs
entram (com auxílio da enzima) e criam a nova fita, duplicando o DNA
○ Realiza-se 35 ciclos, garantindo a criação de 60BI de cópias
○ Após a PCR, realiza-se uma eletroforese para detectar os resultados
a partir de uma banda de interesse
ELETROFORESE
● Técnica de separação de moléculas orgânicas(DNA e RNA) e
proteínas de acordo com sua carga elétrica e peso molecular
● Baseia-se na migração diferencial dos fragmentos de acordo com
tamanh (moléculas maiores demoram mais) para áreas de carga
específica de acordo com a carga da molécula (ex: DNA possui carga
negativa → polo positivo)
● Utiliza uma matriz de gel, podendo ser feito de:
○ Agarose(moléculas maiores): Suporta até 20 mil pares de base
(KB)
○ Poliacrilamida(moléculas menores): Suporta até 1000 pares de
base (pb)
● Etapas da eletroforese:
1- Preparação do gel: Utiliza-se uma cuba de eletroforese. Inicia-se
com a dissolução da matriz escolhida em um Tampão TAE
○ TAE: Possui tris HCl (para manter o pH 7), EDTA (inibe DNase)
e ácido acético.
O gel é vertido na Cuba e com um molde, fura-se o gel para criar
cavidades para inoculação da amostra
2- Ampliação da amostra
● A amostra é composta por PCR, azul de bromofenol(Da
coloração azul para visualização da corrida eletroforética, alem
de possuir glicerol para dar plasticidade a amostra) e gel Red
(Da fluorescência para visualização da resultado no
transluminador)
3- Corrida eletroforética
● Aplica-se a amostra no campo elétrico gerando um fluxo de ions
através da solução tampão. O campo possuis terminais
positivos e negativos
4- Visualização
● Observa-se os resultados pelo transluminador. Moléculas
negativas vão para o polo positivo (vice-versa). Moléculas
menores chegam 1° no polo. Para comparação, utiliza-se uma
banda molde, sinalizada como M
● Tipos de Eletroforese
○ DNA: Apresenta carga constante por unidade de massa, assim esta
molécula pode ser separada em ambos os geis somente em função do
seu tamanho e o mesmo para RNA
○ Proteínas: As cargas variam de acordo com o conjunto de AACs.
Dependendo do pH do meio em relação ao ponto isoelétrico das
proteínas, elas podem ser positivas, negativas ou neutras, sendo
separadas pelo campo elétrico.
● Tipos de PCR
○ Long PCR
■ PCR cuja extensão é mais longa que a convencional (> 5Kb)
■ Enzima amplifica alvos maiores (alta fidelidade)
■ Utilizado para clonagem de cDNA de longos transcritos e PCR
de genoma mitocondrial
○ Multiplex PCR
■ PCR com dois ou mais conjuntos de primers para amplificação
de diferentes fragmentos de uma mesma amostra
■ Utilizado para identificação viral (papiloma
■ vírus), deleções gênicas (Distrofia muscular de Duchenne,
talassemias) e teste de paternidade
■ O PCR multiplex que amplifica um fragmanto de 450 pares de
base - HPV em geral e um outro de 250 referente aos vírus
oncogênicos
○ RT-PCR
■ Esta reação é composta de 2 partes: a transcrição reversa e a
amplificação propriamente dita
■ A reação parte de um molde de RNA, que é convertido em
cDNA (DNA complementar)
■ Ferramenta útil em estudos de expressão gênica, pois
avaliando o mRNA, podemos detectar quais proteínas estão
sendo expressas
○ Nested PCR
■ É uma variação da PCR convencional, onde o segmento
genômico é amplificado primeiro de forma abrangente, e depois,
utilizando este primeiro produto, a amplificação da real
sequência-alvo.
■ Duas PCR: primeira com a fita parental e, em seguida, uma
segunda PCR com o produto da 1ª amplificação
■ Objetivo: aumentar a especificidade
○ Real Time PCR
■ É uma amplificação normal de PCR, porém com detecção do
resultado ao longo dos ciclos
■ Conforme a amplificação vai ocorrendo, um sinal fluorescente é
emitido no final de cada ciclo, captado e convertido em um
gráfico de amplificação
■ É possível determinar exatamente quanto do produto foi
amplificado (análise da expressão gênica)