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0 visualizações7 páginasProtocolo Urease
O documento descreve um protocolo para estimar a atividade da urease no solo, utilizando a hidrólise da ureia em CO2 e NH3. O método envolve a incubação do solo com ureia, extração do amônio e dosagem colorimétrica do NH4+. O protocolo inclui a preparação de reagentes, curva de calibração e procedimento analítico detalhado.
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Vanessa FreitasDireitos autorais
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O documento descreve um protocolo para estimar a atividade da urease no solo, utilizando a hidrólise da ureia em CO2 e NH3. O método envolve a incubação do solo com ureia, extração do amônio e dosagem colorimétrica do NH4+. O protocolo inclui a preparação de reagentes, curva de calibração e procedimento analítico detalhado.
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE VIÇOSA
DEPARTAMENTO DE SOLOS
Laboratório de Isótopos Estáveis
Atividade da Urease no Solo
Visão geral:
A urease é a enzima que catalisa a hidrólise da ureia em CO2 e NH3.
Este protocolo descreve o método desenvolvido por Kandeler e Gerber (2010)
para estimar a atividade da urease no solo. Consiste, basicamente, na incubação
do solo com uma solução aquosa de ureia, extração do amônio com solução de
KCl 1 mol L-1 contendo HCl 0,01 mol L-1 e dosagem colorimétrica do NH4+.
DATA DA EMISSÃO: 10/10/2019 EDIÇÃO/REVISÃO: 1/1 Nº FOLHA: 1/7
Instrumentação e Materiais:
• Espectrofotômetro de absorção molecular com capacidade de leitura de
absorvâncias a 690 nm
• Balança com com pelo menos três casas decimais (0,001 g)
• pHmetro
• Erlenmeyer de 125 mL
• Banho Maria
• Agitador horizontal
• Vidrarias de laboratório para preparação de reagentes e recolhimento de
resíduos
• Rótulos para identificação das soluções
• Papel filme
• Ácido clorídrico P.A. (HCl; MM = 36,46 g mol-1)
• Cloreto de potássio P.A. (KCl; MM = 74,55 g mol-1)
• Hidróxido de sódio P.A. (NaOH; MM = 40,00 g mol-1)
• Ureia P.A. (CO(NH2)2; MM = 60,06 g mol-1)
• Nitroprussiato de sódio P.A. (Na2(Fe(CN)5NO).2H2O; MM = 297,95 g mol-1)
• Ácido dicloroisocianúrico sal sódico P.A. (C3Cl2N3NaO3.2H2O; MM = 255,98 g mol-1)
• Cloreto de amônio P.A. (NH4Cl; MM = 53,49 g mol-1)
• Salicilato de sódio P.A. (C7H5NaO3; MM = 160,10 g mol-1)
DATA DA EMISSÃO: 10/10/2019 EDIÇÃO/REVISÃO: 1/1 Nº FOLHA: 2/7
I. Preparo de reagentes:
1. Ácido clorídrico (HCl) 1,0 mol L-1
Pipetar, utilizando pipeta automática 8,28 mL de HCl concentrado (37 %) e diluir
em aproximadamente 50 mL de água deionizada. Tranferir a solução para balão
volumétrico de 100 mL e completar o volume com água deionizada.
2. Cloreto de potássio (KCl) 1,0 mol L-1
Dissolver 74,55 g de KCl em 600 mL de água deionizada e adicionar 10 mL de
HCl 1,0 mol L-1. Completar o volume para 1.000 mL.
3. Hidróxido de sódio (NaOH) 0,3 mol L-1
Em um becker de 1.000 mL, dissolver 12 g de NaOH em, aproximadamente, 800
mL de água deionizada. Completar o volume para 1.000 mL com auxílio de um
balão volumétrico. Acondicionar em recipiente plástico.
4. Solução de uréia (CO(NH2)2 0,08 mol L-1
Pesar 2,4 g de uréia e dissolver em 400 mL de água deionizada. Verter a solução
em balão volumétrico de 500 mL e completar o volume. Esta solução deverá
ser preparada no dia da análise.
5. Solução de salicilato de sódio e nitroprussiato de sódio
Misturar 100 mL da solução de salicilato de sódio 17 % (17 g para 100 mL de
água deionizada), com 100 mL da solução de nitroprussiato de sódio 0,12% (0,12
g para 100 mL de água deionizada) e mais 100 mL de água deionizada. Preparar
no dia da análise.
DATA DA EMISSÃO: 10/10/2019 EDIÇÃO/REVISÃO: 1/1 Nº FOLHA: 3/7
6. Ácido dicloroisocianúrico sal sódico - DCIA (C3Cl2N3NaO3.2H2O) 0,1% (m/v)
Dissolver 0,1 g de ácido dicloroisocianúrico sal sódico em 90 mL de água
deionizada e completar o volume para 100 mL. Preparar no dia da análise.
7. Solução de Trabalho
Misturar em um becker, 50 mL da solução de salicilato de sódio e nitroprussiato
de sódio, 50 mL de NaOH 0,3 mol L-1 e 50 mL de água deionizada. Preparar no
dia da análise.
II. Preparo da curva de calibração
1. Solução padrão de 100 mg L-1 de N
Dissolver 0,382 g de cloreto de amônio (NH4Cl) em água deionizada e completar
o volume para 1.000 mL. (Armazenar em refrigerador).
2. Cloreto de potássio (KCl) 2,0 mol L-1 – KCl 2x
Dissolver 14,91 g de KCl em 60 mL de água deionizada e adicionar 2 mL de HCl
1,0 mol L-1. Completar o volume para 100 mL.
DATA DA EMISSÃO: 10/10/2019 EDIÇÃO/REVISÃO: 1/1 Nº FOLHA: 4/7
3. Pontos da curva de calibração para leitura de N-NH4+ em Espectrômetro
de Absorção Molecular
Concentração - - - - - - - - - - - - Alíquota - - - - - - - - - - -
Total
de N SP(1) H2O KCl 2x(2) H2O ST(3) DCIA(4)
mg L-1 - - - - - - - - - - - - mL - - - - - - - - - - - - - -
0,000 0,00 0,25 0,25 4,50 2,50 1,00 8,50
0,588 0,05 0,20 0,25 4,50 2,50 1,00 8,50
1,176 0,10 0,15 0,25 4,50 2,50 1,00 8,50
1,765 0,15 0,10 0,25 4,50 2,50 1,00 8,50
2,353 0,20 0,05 0,25 4,50 2,50 1,00 8,50
2,941 0,25 0,00 0,25 4,50 2,50 1,00 8,50
(1)
Solução padrão contendo 100 mg L-1 de N; (2) KCl 2,0 mol L-1; (3) Solução de trabalho; (4)
Solução de Ácido dicloroisocianúrico sal sódico 0,1% (m/v).
Obs1: A curva de calibração deve ser preparada no momento da leitura das
amostras.
IV. Procedimento analítico:
Amostras de solo recém coletadas devem ser destorroadas e peneiradas
em peneira de 2 mm. As amostras devem ser acondicionadas em saco de
polietileno a 4 °C, podendo ser armazenadas para análise por até 3 semanas.
Pesar 5 g de solo (˂ 2 mm) em erlenmeyer de 125 mL, adicionar 2,5 mL
de ureia 0,08 mol L-1. Fechar os erlenmeyers com filme plástico e levá-los ao
banho maria a 37°C.
Após 2 horas, remover o filme plástico, adicionar 2,5 mL de água
deionizada e mais 50 mL da solução de KCl 1,0 mol L-1 contendo HCl a 0,01 mol
L-1. Fechar novamente os erlenmeyers com filme plástico e levá-los a mesa
agitadora por 30 min, a 130 rpm.
Após agitação, filtrar a suspensão, utilizando filtro de papel qualitativo
(filtração lenta), recolhendo o filtrado em tubos de ensaio.
DATA DA EMISSÃO: 10/10/2019 EDIÇÃO/REVISÃO: 1/1 Nº FOLHA: 5/7
Com auxílio de uma pipeta, transferir 0,5 mL do filtrado para tubos de
ensaio de 12 mL, adicionando 4,5 mL de água deionizada, 2,5 mL de solução de
trabalho e 1,0 mL da solução de DCIA.
Agitar os tubos de ensaio em vortex e aguardar 30 min para realizar a
leitura em espectrômetro de absorção molecular (EAM), devidamente calibrado,
utilizando o comprimento de onda de 690 nm. A cor da solução se mantem
estável por até 8 horas.
Para cada amostra, deve-se fazer um controle, como descrito
anteriormente, substituindo 2,5 mL da solução de ureia por 2,5 mL de água
deionizada. Nessas amostras controle, após a incubação e antes da adição da
solução de KCl/HCl, adiciona-se os 2,5 mL da solução de ureia.
Limpeza e Descarte
(Em elaboração...)
DATA DA EMISSÃO: 10/10/2019 EDIÇÃO/REVISÃO: 1/1 Nº FOLHA: 6/7
Referências:
KANDELER E.; GERBER, H.; 1988. Short-term assay of soil urease activity using
colorimetric determination of ammonium. Biol. Fertil. Soils 6:68-72.
TABATABAI, M. A. Soil Enzymes. In: METHODS of soil analysis: part 2:
microbiological and biochemical properties. Madison: SSSA,1994. p. 775-833.
(SSSA Book Series: 5).