PCR
How cells read and use genetic information.
Conceito
PCR = técnica de amplificação de
DNA/RNA para detectar agente infeccioso
ou alterações genéticas.
PCR Convencional
• Resultado qualitativo
• Visualização em gel
• Menor custo
• Uso ainda comum em laboratórios de rotin
Sensibilidade e Especificidade
Dependem principalmente de:
• Qualidade do primer
• Pureza da amostra
• Ausência de inibidores (ex: hemoglobina, heparina)
Na rotina veterinária isso é fundamental.
Exemplo prático:
• Sangue colhido em tubo com heparina pode inibir
PCR.
• EDTA é preferível.
Limitações da PCR
convencional
• Não quantifica carga viral
• Maior risco de contaminação
(abre tubo pós-amplificação)
• Sensibilidade menor que qPCR
• Interpretação depende de gel
Aplicação
Exemplos:
• Ehrlichia canis
• Canine distemper virus
• Feline leukemia virus
• Leishmania infantum
Principalmente quando:
• Fase aguda
• Sorologia inconclusiva
• Coinfecção suspeita
Erros comuns na interpretação
• PCR positivo ≠ doença ativa
• DNA residual pode permanecer após
tratamento
• Contaminação cruzada gera falso positivo
• Falha de extração gera falso negativo
Raciocínio
PCR responde: "O material genético está
presente?"
O clínico precisa responder: "Isso explica o
quadro clínico?"
qPCR (PCR em tempo real)
• Quantitativa ⟶ Monitoramento de carga viral p.e.
• Detecta carga viral
• Mais sensível
• Mais rápida
• Padrão ouro atual
Conceitos
Permite:
• Detectar
• Monitorar
• Quantificar
A amplificação do DNA em tempo real, durante
os ciclos.
Diferente da PCR convencional, ela não
depende de gel.
O que muda estruturalmente?
Na PCR convencional:
→ Só vemos o produto no final.
Na qPCR:
→ A amplificação é acompanhada ciclo a ciclo
por fluorescência.
Como?
O termociclador possui:
• Fonte de luz
• Detector óptico
• Software de análise
Durante cada ciclo, o equipamento mede a
fluorescência emitida pela reação.
Quanto mais DNA amplificado → maior
fluorescência.
Aplicações
Exemplos importantes:
• FeLV
• Leishmania infantum
• Babésia spp.
• Anaplasma spp.
Permite:
• Diagnóstico precoce
• Monitoramento de carga viral
• Avaliação de resposta ao tratamento
• Identificação de animais persistemente infectados
Convencional x qPCR
PCR convencional responde:
Está presente?
qPCR responde:
Quanto está presente?
RT-PCR
RT-qPCR = Reverse Transcription + quantitative PCR
Ela permite:
• Converter RNA em DNA complementar (cDNA)
• Amplificar e quantificar esse cDNA em tempo real
RT-PCR
A PCR tradicional amplifica DNA, não RNA.
Muitos vírus importantes na veterinária possuem
genoma de RNA, como:
• Cinomose
• Coronavirus felino
• Vírus da influenza aviária
• Diarréia viral bovina
• Newcastle
Sem a etapa de transcrição reversa, eles não
poderiam ser detectados por PCR.
Transcrição reversa
A enzima utilizada é: Transcriptase reversa
(derivada de retrovírus)
Ela converte:
RNA → cDNA
Esse cDNA será então amplificado na etapa
de qPCR.
Atenção!
RNA é extremamente sensível à degradação por:
• RNases ambientais
• Manipulação inadequada
• Temperatura inadequada
Por isso:
• Coleta deve ser rápida
• Armazenamento refrigerado ou congelado
• Uso de tubos apropriados
• Evitar múltiplos ciclos de congelamento
Aplicação
Cinomose (fase neurológica)
RT-qPCR em líquor ou swab conjuntival:
• Alta sensibilidade
• Detecta antes da soroconversão
Coronavírus felino (FCoV)
RT-qPCR em fezes:
• Detecta eliminação viral
• Mas não diferencia FECV de FIPV apenas pela presença
PCR positiva para coronavírus significa PIF?
Vantagens e Limitações
Vantagens:
• Alta sensibilidade
• Alta especificidade (com sonda TaqMan)
• Diagnóstico precoce
• Quantificação de carga viral
Limitações:
• Detecta RNA viral mesmo sem doença ativa
• Não diferencia vírus viável de fragmento viral
• Ct limítrofe exige interpretação cuidadosa
• Dependência da qualidade da amostra
Atenção!
RT-qPCR detecta replicação viral ativa melhor do
que sorologia, porque:
• Sorologia → resposta do hospedeiro
• RT-qPCR → presença do genoma viral
Nenhum exame substitui o raciocínio clínico.
Quando não pedir PCR
• Doença crônica já soropositiva
• Pós-tratamento recente (DNA residual)
• Amostra mal armazenada
• Quando o resultado não muda a conduta clínica
Caso clinico: Cão, SRD, 3 anos, macho,
acesso a sítio, histórico de infestação por
carrapatos.
Histórico
• Apatia há 4 dias
• Febre (40°C)
• Mucosas pálidas
• Urina escura (coloração “coca-cola”)
• Hiporexia
Você observa mucosas pálidas e solicita
exames sanguíneos
Hemograma:
• He: 2,80 /mm³ ⟶ 5,5 - 8,5 /mm³
• Ht: 21,2 % ⟶ 37 - 55 %
• Hb: 7,1 g/dL ⟶ 12,0 - 18 g/dL
• LT: 17.900 /mm³ ⟶ 6.000 - 17.000 /mm³
Suspeita: Hemoparasitose - Babesiose
Agente etiológico
• Principais espécies em cães:
⚬ Babesia canis
⚬ Babesia gibsoni
• Classificação
⚬ Filo: Apicomplexa
⚬ Parasita intracelular obrigatório
⚬ Infecta hemácias
• Transmissão principal:
⚬ Carrapato (principalmente Rhipicephalus
sanguineus)
Suspeita: Hemoparasitose - Babesiose
Ciclo da doença
• No hospedeiro (cão)
1. Carrapato inocula esporozoítos
[Link] invade hemácias
[Link]ção assexuada (merozoítos)
[Link] da hemácia
[Link]ção de novos parasitas
[Link] infecção de hemácias
Consequência:
Hemólise intravascular e extravascular
Fisiopatologia
A doença não é só o parasita.
Ocorre:
• Destruição direta de hemácias
• Resposta imunomediada
• Liberação de hemoglobina
• Inflamação sistêmica
Formas clínicas:
• Aguda
• Subaguda
• Crônica
• Hiperaguda (choque)
Exames:
• Sorologia?
• PCR? Quais?
Caso clinico: Gata, SRD, 8 meses, vive em gatil
com 6 animais.
Histórico
• Hiporexia há 10 dias
• Perda de peso progressiva
• Febre intermitente (40,2°C)
• Letargia
• Abdome discretamente distendido
• Vacinação incompleta.
• Sem acesso à rua.
Suspeita: PIF
Agente: Corona vírus felino
• Família: Coronaviridae
• Gênero: Alphacoronavirus
• Vírus envelopado
• Genoma: RNA fita simples positivo (ssRNA +)
• Alta taxa de mutação (característica dos vírus RNA)
Duas formas biológicas principais:
1- FECV – Feline Enteric Coronavirus
• Forma entérica
• Replicação em enterócitos
• Transmissão fecal-oral
• Geralmente assintomático ou causa diarreia leve
• Altamente prevalente em gatis
2- FIPV – Variante associada à PIF (Não é um vírus adquirido
externamente)
Surge por: Mutação do FECV dentro do próprio animal
Características:
• Tropismo por macrófagos
• Capacidade de disseminação sistêmica
• Induz vasculite imunomediada
O que muda na mutação?
Principalmente mutações no gene da proteína Spike.
Consequência:
• Alteração na entrada celular
• Capacidade de infectar macrófagos
• Disseminação via sistema mononuclear fagocitário
Não existem “dois vírus circulando” no ambiente. Existe:
• Coronavírus entérico comum
• Mutação individual que pode levar à PIF
A PIF não é considerada altamente contagiosa.
⟶ Sorotipos:
Existem dois sorotipos principais: Tipo I e II
Suspeita: PIF
Fase 1 – Infecção primária
• Agente: Feline coronavirus
• Transmissão fecal-oral.
→ Replicação intestinal
→ Eliminação viral nas fezes
Na maioria dos gatos:
Doença leve ou assintomática
Fase 2 – Mutação interna
Em alguns animais:
• O vírus sofre mutação dentro do hospedeiro
→ Ganha tropismo por macrófagos
Agora temos a forma associada à PIF.
Fase 3 – Resposta imunomediada
O problema da PIF não é apenas o vírus.
É a:
• Vasculite imunomediada
• Formação de complexos imunes
• Inflamação granulomatosa
Existem duas formas clínicas:
• Efusiva (úmida)
• Não efusiva (seca)
Nosso caso sugere forma efusiva.
Exames iniciais solicitados Ultrassonografia abdominal
Hemograma Detecta:
Possível: • Líquido livre
• Anemia não regenerativa • Linfonodos aumentados
• Linfopenia
• Neutrofilia ** Confirmado: presença de ascite.
Bioquímica Análise do líquido cavitário
• Hiperglobulinemia Aspecto:
• Relação albumina:globulina < • Amarelo palha
0,8 • Viscoso
• Proteína total elevada • Proteína > 3,5 g/dL
• Baixa celularidade
** Esse dado é muito sugestivo.
Sorologia: PCR? Qual?
Alta prevalência RT-qPCR
Em gatis: Amostra?
• 70–90% dos gatos são
soropositivos Líquido ascítico.
• A maioria nunca terá PIF Resultado: POSITIVO.
• Sorologia positiva ≠ PIF
• Sorologia negativa Isso confirma PIF?
praticamente exclui PIF (mas
não 100%)
• A sorologia não diferencia:
⚬ FECV (forma entérica
comum)
⚬ FIPV (forma associada à PIF)
Por que PCR positiva não fecha diagnóstico?
Porque:
1- Muitos gatos saudáveis eliminam coronavírus
2- A PCR detecta RNA viral, não mutação específica
3- Pode haver coronavírus sistêmico sem PIF
4- A presença viral não confirma doença imunomediada
Quando a PCR ganha maior valor?
PCR em líquido cavitário tem maior especificidade que:
• PCR em fezes
• PCR em sangue
Mas ainda assim deve ser interpretada com:
• Clínica compatível
• Alterações laboratoriais típicas
• Exames de imagem