Fundamentos de Biotecnologia e Práticas em

Diagnóstico Molecular

Conteudista: Prof. Dr. Fabio Mitsuo Lima

Revisão Textual: Prof.ª Dra. Selma Aparecida Cesarin

Objetivos da Unidade:

Apresentar ao aluno as bases da Biotecnologia, o avanço histórico e como ela se

relaciona com as demais Áreas da Ciência;

Apresentar características gerais dos principais organismos alvos;

Abordar as principais técnicas relacionadas a processos-chave dentro da

Biotecnologia;

Apresentar ao aluno as ferramentas biotecnológicas mais relevantes e eficientes

empregadas para o diagnóstico de doenças;

Evidenciar os conceitos chaves da Biotecnologia que embasam os métodos

diagnósticos utilizados atualmente.

📄 MATERIAL TEÓRICO
Introdução à Biotecnologia
Biotecnologia Diagnóstica

📄 Referências
Página 1 de 3

Introdução à Biotecnologia

Aspectos Históricos da
Biotecnologia
Antes de iniciarmos um estudo mais aprofundado sobre essa
importante Disciplina, é importante definirmos o que se entende,
atualmente, por “Biotecnologia” e abordarmos brevemente sua
história e evolução, sua abrangência e possíveis aplicações.

Existem diversas definições para o termo e ficaremos com duas.

Segundo a Enciclopédia Britânica, Biotecnologia é o uso da

Biologia para solucionar problemas e desenvolver produtos úteis.

Já o Ministério da Saúde do Brasil estabeleceu, em 2010, a

seguinte definição: “Qualquer aplicação tecnológica que usa
sistemas biológicos, organismos vivos ou seus derivados para
criar ou modificar produtos e processos para usos específicos”.

A Biotecnologia é, portanto, uma Área Multidisciplinar, contando

com importantes contribuições da Genética, Biologia Molecular,
Microbiologia, Bioquímica, Química e Engenharias.

Desde a Antiguidade, muitos anos antes da Era Cristã, há

registros do uso de microrganismos em processos fermentativos
para a produção de bebidas alcoólicas a partir de cereais e para a
produção de pão.

Os sumérios, os babilônicos e os egípcios realizavam tal tarefa,

contudo, sem um conhecimento estritamente científico sobre o
tema.

Na maioria das vezes, não era um processo em larga escala e

controlado, e sim um conhecimento familiar, passado de geração
a geração, baseado na observação.
 Figura 1
Fonte: Getty Images

#ParaTodosVerem: imagem apresenta um meio de cultura celular em ambiente

controlado, evidenciando o intenso metabolismo e a expansão volumétrica de
uma biomassa por meio da formação de bolhas de CO2. No contexto da
biotecnologia e embriologia aplicada à reprodução humana, essa estrutura
microscópica mimetiza a arquitetura de um blastocisto em desenvolvimento,
onde a integridade das membranas e a atividade bioquímica são fundamentais
para o sucesso da implantação. O registro ilustra o dinamismo biológico
necessário para a manutenção da viabilidade celular e o suporte nutricional
exigido em processos de manipulação de gametas e cultivo embrionário in
vitro. Fim da descrição.

Somente em 1876, com os estudos de Louis Pasteur, foi revelada a

real causa das fermentações: a ação de microrganismos.
Pasteur comprovou que cada tipo de fermentação era realizado
por um tipo específico de microrganismo.

Mais tarde, dois químicos alemães, chamados Hans e Eduard

Buchner, mostraram que extratos de levedura, na ausência de
células vivas, eram capazes de converter glicose em etanol.
Concluíram, portanto, que se trata de um processo enzimático.

Esses achados foram fundamentais para o estabelecimento da

Bioquímica moderna, que é um dos pilares da Biotecnologia, que
teve um avanço significativo no século XX, consequência da
evolução científica característica desse momento.

Um dos primeiros marcos biotecnológicos desse período foi a

descoberta da Penicilina, em 1928, por Alexander Fleming.

O impacto do uso desse antibiótico na saúde pública foi enorme,

reduzindo drasticamente a mortalidade da população, inclusive
durante a Segunda Guerra Mundial.

A partir de então, outros antibióticos foram desenvolvidos, como

a Estreptomicina e muitos outros.

A Biotecnologia da primeira metade do século XX foi baseada,

principalmente, no uso de enzimas e reações químicas
controladas em Laboratório, como os exemplos citados
anteriormente.
Saiba Mais
O grande marco do século XX foi a descoberta da estrutura
tridimensional do DNA, por James Watson e Francis Crick, em
abril de 1953. Por esse motivo, ambos foram agraciados com o
Prêmio Nobel de Medicina em 1962.

Watson e Crick propuseram a base genética da hereditariedade

baseada na estrutura do DNA e isso foi extremamente importante
para se chegar aos estudos de terapia gênica e à manipulação
genética de microrganismos observados nos dias atuais.

A descoberta da estrutura do DNA mudou a história da Ciência e,

em especial, da Biotecnologia. A partir de 1953, houve uma
explosão no número de estudos visando a conhecer melhor o
comportamento da molécula de DNA e meios para manipulá-la.
Outro marco muito importante foi estabelecido pelo bioquímico
americano Arthur Kornberg, que foi capaz de sintetizar uma
molécula de DNA em Laboratório, a partir da enzima DNA
polymerase, isolada de bactéria. Esses estudos renderam a
Kornberg o Prêmio Nobel de Medicina, em 1959.

A segunda metade do século XX termina com avanços nunca antes

pensados, como a produção de insulina em bactérias, o Projeto
Genoma Humano, a clonagem de animais e plantas, a
manipulação genética de células vivas, a terapia gênica e muitas
outras aplicações que veremos futuramente.

Atualmente, as aplicações da Biotecnologia podem ser vistas nas

mais diferentes áreas e não somente para a saúde humana:
incluem-se as áreas Agrícola, Pecuária, Industrial e do Meio
Ambiente.

Tecnologia do DNA Recombinante

Antes de aprendemos como modificar a molécula de DNA, é
necessário relembrar como é sua estrutura. O DNA é uma
macromolécula formada por nucleotídeos. Esse, por sua vez, são
constituídos de três partes: base nitrogenada, açúcar do tipo
pentose (desoxirribose) e grupamento fosfato.
 Figura 2
Fonte: Adaptada de ZAHA, 2014

#ParaTodosVerem: a Figura detalha a estrutura química de um nucleotídeo,

unidade fundamental do DNA, exibindo suas três partes constituintes: um
grupamento fosfato, uma base nitrogenada e um açúcar do tipo pentose, sendo
possível observar a diferença estrutural entre a ribose e a desoxirribose. Fim da
descrição.

Estrutura de um nucleotídeo. O grupamento fosfato está ligado ao

carbono 5 da pentose, enquanto a base nitrogenada está ligada ao
carbono 1. As diferenças entre as pentoses que compõem os
nucleotídeos do DNA e do RNA estão marcadas em rosa na Figura
B: a pentose do RNA possui uma hidroxila na posição 2, enquanto
a do DNA não a possui. Por isso, a pentose do DNA chama-se
desoxirribose. Além da diferença da ribose, o RNA possui a base
nitrogenada uracila e não a timina.

Os nucleotídeos se ligam entre si por meio de ligações

fosfodiéster, estabelecidas entre o grupo fosfato situado no
carbono 5’ da pentose de um nucleotídeo com a hidroxila situada
no carbono 3’ do nucleotídeo vizinho.

Figura 3
Fonte: Adaptada de WATSON, 2015

#ParaTodosVerem: imagem detalha a estrutura molecular de uma fita de DNA,

o pilar fundamental da biotecnologia aplicada à reprodução humana e ao
diagnóstico genético pré-implantacional. A ilustração evidencia o esqueleto de
açúcar-fosfato unido por ligações fosfodiéster, que conferem a direcionalidade
das extremidades 5' para 3', essencial para os processos de replicação e
transcrição celular. Estão representadas as quatro bases nitrogenadas –
Adenina, Citosina, Guanina e Timina – cujo sequenciamento preciso detém a
 informação genética necessária para o desenvolvimento embrionário. A
compreensão dessa arquitetura química permite a manipulação de gametas e a
identificação de variantes genéticas, garantindo a viabilidade e a saúde do
embrião em procedimentos de reprodução assistida. Fim da descrição.

Nucleotídeos ligados por ligações fosfodiéster em uma fita

simples de DNA. As extremidades 5’ e 3’ da cadeia estão
assinaladas. As pentoses dos nucleotídeos adenina, citosina,
guanina e timina estão mostradas por losangos roxos e os
grupamentos fosfato estão dentro de círculos cinza. A ligação
fosfodiéster ocorre entre a hidroxila do carbono 3’ da pentose
com o grupamento fosfato ligado ao carbono 5’ da pentose do
nucleotídeo seguinte.

Muitos nucleotídeos são ligados, um após o outro, formando a

molécula de DNA. À extremidade na qual se iniciou a
polimerização dá-se o nome de extremidade 5’, por haver um
grupamento fosfato livre nela. Chamamos a extremidade oposta
de 3’, pois há hidroxila livre nesse local.

Note que, independentemente do número de nucleotídeos que são

incorporados à molécula de DNA, sempre haverá uma
extremidade 5’ e outra 3’, com os grupamentos fosfato e
hidroxila, respectivamente.
Importante!
O crescimento da fita de DNA sempre ocorre do sentido 5’ em
direção à extremidade 3’. Essa direção é importantíssima no
estudo e na manipulação do DNA.

A estrutura de Watson e Crick revelou, ainda, que a forma mais

estável do DNA na natureza é formando uma dupla hélice. Assim,
duas moléculas de DNA interagem entre si por meio de ligação do
tipo ponte de hidrogênio entre as bases nitrogenadas das duas
fitas.

As duas fitas ficarão dispostas de modo antiparalelo, ou seja, a

extremidade 5’ de uma fita se ligará à extremidade 3’ da fita
complementar.
Figura 4
Fonte: Adaptada de WATSON, 2015

#ParaTodosVerem: imagem apresenta a estrutura molecular do DNA, base

fundamental da hereditariedade e do desenvolvimento embrionário. No
esquema à esquerda, observa-se o modelo de dupla hélice com fitas
antiparalelas em direções opostas, unidas por pontes de hidrogênio entre as
bases nitrogenadas complementares – Adenina, Guanina, Citosina e Timina – e
sustentadas por um esqueleto externo de açúcar-fosfato. À direita, o modelo
tridimensional de preenchimento espacial destaca as dimensões físicas
essenciais para a biotecnologia reprodutiva, como o diâmetro da hélice e a
alternância entre as fendas maior e menor, que permitem a interação com
proteínas reguladoras durante a expressão gênica e a replicação celular. O
detalhamento atômico diferencia os elementos químicos constituintes, como
hidrogênio, oxigênio, carbono, nitrogênio e fósforo, enfatizando a organização
precisa necessária para a manutenção da integridade genômica nos processos
de fecundação e clivagem embrionária. Fim da descrição.
Estrutura do DNA em formato de dupla-hélice (helicoidal). As
bases nitrogenadas estão voltadas para a parte central da
molécula, sendo que as bases complementares de cada fita estão
ligadas por pontes de hidrogênio. O esqueleto da fita é formado
pelos grupamentos fosfato e pelas pentoses.

Endonuclease
As endonucleases são enzimas que reconhecem uma sequência
específica no DNA (sítios de restrição) e cortam a dupla fita,
rompendo as ligações fosfodiéster.

Essas enzimas, em geral, têm origem bacteriana e funcionam na

defesa desses microrganismos contra infecções por bacteriófagos.
Na Biotecnologia, elas são utilizadas para cortar fragmentos de
DNA de interesse. Pode ser um gene inteiro, parte de um gene,
apenas um éxon etc.

Uma determinada endonuclease reconhece apenas um único sítio

de restrição. Portanto, dizemos que ela é sítio-específica. Uma
outra característica importante é que esse sítio é palindrômico.
Vamos entender esse conceito.

Observe a palavra ARARA. Se você ler da esquerda para direita ou

da direita para a esquerda, tem o mesmo significado. Um sítio de
restrição funciona de modo semelhante.
Veja, por exemplo, o sítio reconhecido pela enzima EcoRI.
Fazendo a leitura, no sentido 5’ > 3’, lemos GAATTC. Se
realizarmos a leitura, no mesmo sentido, na fita complementar,
temos o mesmo: GAATTC.

As enzimas de restrição reconhecem apenas sítios palindrômicos.

Isso é muito importante quando estamos analisando um
fragmento de DNA que desejamos manipular.

Figura 5

#ParaTodosVerem: imagem ilustra uma sequência de DNA de fita dupla que

exemplifica a ação de enzimas de restrição, ferramentas fundamentais na
biotecnologia aplicada à reprodução humana e engenharia genética. A
sequência representada é uma estrutura palindrômica composta pelas bases
nitrogenadas Guanina, Adenina, Timina e Citosina, organizada em direções
opostas entre as extremidades cinco linha e três linha. Duas setas pretas
indicam os pontos específicos de clivagem onde a enzima realiza o corte no
esqueleto de açúcar-fosfato, geralmente entre a Guanina e a Adenina. Esse
 processo é essencial para a criação de fragmentos de DNA que podem ser
recombinados em técnicas de diagnóstico genético pré-implantacional ou na
edição de genes, permitindo a manipulação precisa do material genético para o
estudo e tratamento de condições hereditárias no desenvolvimento
embrionário. Fim da descrição.

Sítio reconhecido pela enzima EcoRI. Note que o sítio é

palindrômico, ou seja, se você fizer a leitura da fita superior no
sentido 5’- 3’ lerá GAATTC. Se fizer a leitura da fita
complementar no sentido 5’- 3’ também lerá GAATTC. A enzima
EcoRI corta entre o G e o primeiro A tanto na fita superior como
na fita complementar gerando extremidades coesivas.

Quando uma enzima de restrição reconhece seu sítio em

determinada molécula de DNA ela pode realizar dois tipos de
corte. Um corte simétrico ou um corte assimétrico.

Veja três exemplos na Figura a seguir:

 Figura 6

#ParaTodosVerem: imagem ilustra uma sequência de DNA de fita dupla que

exemplifica a ação de enzimas de restrição, ferramentas fundamentais na
biotecnologia aplicada à reprodução humana e engenharia genética. A
sequência representada é uma estrutura palindrômica composta pelas bases
nitrogenadas Guanina, Adenina, Timina e Citosina, organizada em direções
opostas entre as extremidades cinco linha e três linha. Duas setas pretas
indicam os pontos específicos de clivagem onde a enzima realiza o corte no
esqueleto de açúcar-fosfato, geralmente entre a Guanina e a Adenina. Esse
processo é essencial para a criação de fragmentos de DNA que podem ser
recombinados em técnicas de diagnóstico genético pré-implantacional ou na
edição de genes, permitindo a manipulação precisa do material genético para o
estudo e tratamento de condições hereditárias no desenvolvimento
embrionário. Fim da descrição.

A seta vermelha mostra o local do corte que será realizado pelas

enzimas. Perceba que as três reconhecem sítios compostos por 6
nucleotídeos (mas que são diferentes entre si).

A enzima da direita, chamada PvuII, reconhece a sequência 5’-

CAGCTG-3’ e corta entre o terceiro e quarto nucleotídeos,
exatamente no meio do sítio de restrição. Note que, após o corte,
temos duas extremidades simétricas, também chamadas de
extremidades cegas.

Agora, veja o que acontece com a enzima EcoRI. Como destacado

acima, ela reconhece um sítio 5’-GAATTC-3’. No entanto, ela
corta entre o primeiro e o segundo nucleotídeos na fita de cima e
entre o primeiro e o segundo nucleotídeos na fita de baixo
(oriente-se pelo sentido 5’ > 3’ da fita).
Observe que, após o corte, temos extremidades diferentes
daquelas geradas pela enzima PvuII. As extremidades EcoRI ficam
com quatro nucleotídeos simples fita. Damos a esse tipo de
extremidade o nome de coesiva.

O mesmo fenômeno acontece quando usamos, por exemplo, a

enzima PstI, que reconhece o sítio de restrição 5’-CTGCAG-3’ e
corta entre o quinto e sexto nucleotídeos em ambas as fitas.
Perceba que, semelhante à EcoRI, a PstI também forma
extremidade coesiva, embora em sentido oposto.

É importante ressaltar que o sítio e a forma de cortar são

características de cada enzima.

A enzima EcoRI sempre irá reconhecer 5’-GAATTC-3’ e sempre

irá cortar na mesma posição, bem como qualquer enzima de
restrição.

Dessa forma, conhecendo o comportamento de cada enzima, é

possível planejar a manipulação de uma molécula de DNA de
interesse.
 Figura 7
Fonte: Adaptada de [Link]

#ParaTodosVerem: imagem ilustra o funcionamento da enzima de restrição

EcoRI em uma molécula de DNA. Na parte superior, é mostrado o sítio de
reconhecimento com uma sequência específica de bases nitrogenadas que se
leem da mesma forma em ambas as direções. Abaixo, a enzima é representada
por uma forma verde que envolve o DNA, indicando com setas os pontos exatos
onde ocorre o corte químico. À direita, o esquema finaliza exibindo o DNA
fragmentado em duas partes, revelando extremidades defasadas conhecidas
como pontas coesas, que permitem que esses pedaços se liguem futuramente a
outros segmentos cortados da mesma maneira. Fim da descrição.

O sítio reconhecido pela enzima EcoRI está presente em uma

determinada região do DNA (acima), quando a enzima entra em
contato com essa sequência (a seguir à esquerda), a enzima cliva
entre os nucleotídeos G e A tanto da fita senso como da fita
antisenso (fita complementar).

No Laboratório, em experimentos de manipulação do DNA,

alguns fatores influenciam na atividade dessas enzimas, visto ser
uma condição in vitro, tais como: composição dos tampões,
concentração da enzima, temperatura e metilação do DNA alvo.
Todos esses fatores devem ser considerados conjuntamente,
antes da realização de um experimento.

Saiba Mais
O nome da enzima de restrição se refere ao gênero e a espécie da
bactéria de onde foi isolada da enzima. Algumas vezes, essa sigla
é seguida pela linhagem da bactéria.

Tabela 1

E Escherichia (gênero)

co coli (espécie)

R RY13 (estirpe)

Primeira (ordem de identificação

I
identificada da bactéria)
 Tabela 2

Sítio de
Estrutura dos
Organismo restrição de
Enzimas produtos
fonte DNA
cortados
bifilamentar

(a) Escherichia
EcoRI coli

Providencia
Pstl
stuartii

Serratia
Smal
marcescens

(b) Haemophilus
Haelll aegyptius

DNA Ligase
DNA Ligase é uma enzima com função oposta à das enzimas de
restrição, ou seja, como o nome sugere, elas “ligam” duas
moléculas de DNA pelo estabelecimento de ligação fosfodiéster
entre o grupo fosfato de uma molécula com a hidroxila de outra.
Essa é a condição básica para a ação de uma DNA Ligase.
Diferentemente das enzimas de restrição, elas não são sítio-
específicas.

Figura 8
Fonte: Adaptada de [Link]

#ParaTodosVerem: imagem apresenta o processo de união de fragmentos de

DNA por meio da enzima DNA ligase. À esquerda, dois segmentos de cores
diferentes, um azul e um rosa, aparecem com suas extremidades pegajosas
encaixadas através do emparelhamento de bases nitrogenadas, embora ainda
existam lacunas físicas entre os esqueletos das fitas. À direita, a enzima DNA
ligase é representada por uma forma oval cinza que envolve a junção, indicando
o momento em que ela sela quimicamente essas aberturas. O resultado final é
uma fita de DNA contínua e integrada, unindo permanentemente os dois
fragmentos originais. Fim da descrição.

Enzima ligase promove a restauração das ligações fosfodiéster

quebradas pela enzima EcoRI. Note que as extremidades coesivas
geradas pela enzima EcoRI possuem nucleotídeos
complementares que se ligam por pontes de hidrogênio. Mas a
complementaridade de bases não restaura a ligação fosfodiéster,
sendo necessária a ação da enzima ligase.
Essas enzimas estão presentes em todas as células vivas,
participando de importantes processos, como a replicação do
DNA durante a fase “S” do ciclo celular e em mecanismos de
reparo de DNA, quando esse sofre algum dano.

No Laboratório, costuma-se utilizar a DNA Ligase isolada do vírus

T4. Como toda enzima, é necessário cuidado na manipulação,
obedecendo rigorosamente as condições de temperatura, tempo e
pH, para maximizar sua atividade.

DNA Polimerase
A DNA Polimerase é outra enzima muito importante para a
Biotecnologia. Veremos mais detalhadamente sua ação no
Módulo II, quando estudaremos a técnica de PCR (Polymerase
Chain Reaction), muito utilizada na clínica, mas também
fundamental na manipulação gênica.

Essa enzima, como o nome sugere, polimeriza o DNA ao

incorporar novos nucleotídeos à cadeia pré-existente. Para que
ela consiga exercer adequadamente sua função, é necessária uma
fita simples de DNA como molde.

Assim, ela “lê” o molde e incorpora, na nova fita de DNA, um

nucleotídeo complementar obedecendo à Regra de Chargaff, que
diz que uma Adenina (A) pareia com Timina (T) e uma Citosina
(C) pareia com Guanina (G).
Em outras palavras, quando houver um G no DNA molde, a DNA
polimerase incorporará um C na molécula a ser replicada, e assim
por diante.

Importante!
Regra de Chargaff – em uma dupla fita, Adenina (A) pareia com
Timina (T) por duas pontes de hidrogênio e Citosina (C) pareia
com Guanina (G) por ter pontes de hidrogênio. Quando você
encontrar a representação “A. T”, significa que a Adenina está
pareada com a Timina e a ligação ocorre pela presença de duas
pontes de hidrogênio, cada uma simbolizada por um ponto.

Quando você encontrar a representação “C...G”, significa que a

Citosina está pareada com a Guanina e a ligação ocorre pela
presença de três pontes de hidrogênio, cada uma simbolizada por
um ponto.
Outro requisito importante para a atividade dessa enzima é a
presença obrigatória de uma pequena sequência iniciadora.

Nas nossas células, quando o DNA é replicado, essa sequência é de

RNA. Entretanto, in vitro, utilizamos um iniciador de DNA, o qual
também chamamos de primer. Ele é necessário, pois a DNA
polimerase é incapaz de iniciar a polimerização sem uma região
de dupla fita de DNA. Ela precisa reconhecer tal estrutura e,
assim, “andar” sobre a fita molde.

Figura 9
Fonte: Adaptada de [Link]

#ParaTodosVerem: imagem demonstra o processo de replicação do DNA

realizado pela enzima Polimerase de DNA. Na parte principal, vemos uma fita
antiga cinza servindo de molde para a criação de uma nova fita. O processo
começa com um pequeno segmento laranja chamado primer, a partir do qual a
polimerase, representada por uma forma oval clara, adiciona novos blocos de
construção em azul. Um destaque ampliado na parte inferior detalha o
emparelhamento das bases nitrogenadas, onde a enzima identifica as letras na
fita molde e encaixa as letras correspondentes na nova fita, garantindo que a
 informação genética seja copiada com precisão enquanto avança no sentido
indicado pela seta. Fim da descrição.

Por fim, é fundamental entender que a DNA polimerase age em

apenas uma única direção, que é da extremidade 5’ para a
extremidade 3’, isto é, haverá ligação fosfodiéster entre o fosfato
do nucleotídeo livre com a hidroxila do DNA pré-existente.

Isso se dá até o final do molde de DNA a ser replicado.

Figura 10
Fonte: Divulgação

#ParaTodosVerem: imagem é uma tirinha da personagem Mafalda, conhecida

por seu humor crítico e reflexivo. Nela, o personagem Felipe faz uma pergunta
existencial: "Mafalda, às vezes me pergunto: Qual o sentido da vida?". Mafalda
 responde de forma rápida e inesperada, utilizando um trocadilho técnico: "É na
direção 5' para 3', Felipe!!!". A resposta brinca com o conceito biológico da
síntese do DNA e RNA, que ocorre obrigatoriamente nessa orientação química,
transformando uma dúvida filosófica em uma regra literal da biologia
molecular. Fim da descrição.

Como Gerar uma Molécula de DNA

Recombinante?
Agora que aprendemos a função de algumas enzimas
modificadoras do DNA, seremos capazes de entender como gerar
uma molécula recombinante.

Esse conhecimento é fundamental para as aplicações que veremos

adiante, tais como: clonagem gênica, produção heteróloga de
proteínas recombinantes, produção de vacina e imunobiológicos
recombinantes e terapia gênica.

Iniciaremos com o raciocínio mais simples possível para depois

entendermos os mais complexos. Para isso, precisamos relembrar
o conceito de plasmídeo, encontrados largamente nas bactérias.

Os plasmídeos são moléculas de DNA circular, extracromossomal,

que carregam genes que conferem resistência a um determinado
antibiótico.

Na Natureza, esse evento é fundamental para que as bactérias

sobrevivam na presença desses antimicrobianos. Esses
plasmídeos podem ser transferidos de bactéria a bactéria por
meio do processo conhecido como conjugação bacteriana. Eles
são reconhecidos pela célula receptora e exercem a mesma função
nesse novo hospedeiro.

A Biotecnologia, ou mais especificamente, a Biologia Molecular,

utiliza essas moléculas como vetores, ou seja, como carreadores
de um DNA de interesse.

O primeiro caso de sucesso foi a produção de insulina humana

recombinante em bactérias, em 1978. No tubo de ensaio, os
pesquisadores introduziram o gene da insulina humana em um
plasmídeo bacteriano.

Posteriormente, essa molécula recombinante (composta por

parte de DNA bacteriano e parte de DNA humano) foi introduzida
em uma bactéria, que expressou o gene humano de interesse. A
esse processo, dá-se o nome de clonagem gênica.

A Figura a seguir mostra um gene de interesse (azul) sendo

introduzido em um plasmídeo:
 Figura 11
Fonte: Adaptada de [Link]

#ParaTodosVerem: imagem ilustra a criação de uma molécula de DNA

recombinante a partir de um plasmídeo. À esquerda, vemos o plasmídeo
representado por uma estrutura circular branca com segmentos coloridos em
verde e rosa, apresentando uma abertura onde as extremidades estão cortadas
em degraus. Logo acima dessa abertura, um fragmento de DNA azul,
identificado como gene, possui extremidades correspondentes que se encaixam
perfeitamente no espaço aberto. Uma seta central aponta para a direita,
mostrando o resultado final do processo: o círculo agora está completo e
fechado, com o gene azul perfeitamente integrado ao anel original, formando o
que o texto central identifica como DNA recombinante. Fim da descrição.

O racional dessa metodologia é cortar o gene humano com uma

enzima de restrição para isolá-lo em um tubo de ensaio à parte.
Paralelamente, cortamos um plasmídeo com a mesma enzima,
por exemplo a EcoRI.

Na Figura a seguir, é possível observar que tanto o gene quanto o

plasmídeo apresentam sítios de restrição para a referida enzima:
 Figura 12
Fonte: Adaptada de [Link]

#ParaTodosVerem: imagem detalha os componentes necessários para a

clonagem molecular, focando no gene de interesse e no vetor. No canto
superior direito, um quadro destaca o gene-alvo, representado por uma fita
azul ladeada por dois sítios de reconhecimento da enzima de restrição EcoRI em
roxo, que contêm sequências específicas de bases. Abaixo, à esquerda, vemos
um plasmídeo circular cinza com um zoom que revela um único sítio de
reconhecimento para a mesma enzima em sua estrutura. O diagrama mostra
que tanto o fragmento de DNA que se deseja copiar quanto o plasmídeo
possuem as mesmas sequências de reconhecimento, o que permitirá que ambos
sejam cortados pela mesma enzima para que suas extremidades se encaixem
perfeitamente. Fim da descrição.

Após a ação da enzima Eco RI, teremos extremidades compatíveis

entre o gene alvo e o plasmídeo:
 Figura 13
Fonte: Adaptada de [Link]

#ParaTodosVerem: imagem mostra o resultado do corte de uma enzima de

restrição no gene-alvo e no plasmídeo. No quadro superior, o gene-alvo
aparece fragmentado, exibindo extremidades em formato de degrau com bases
nitrogenadas expostas em roxo, conhecidas como pontas coesas. Abaixo, o
plasmídeo circular cinza é mostrado com uma abertura em sua estrutura,
revelando o mesmo padrão de corte escalonado em destaque no zoom. O
diagrama deixa claro que, ao serem cortados pela mesma enzima, tanto o gene
quanto o plasmídeo desenvolveram terminações complementares que se
encaixam como peças de um quebra-cabeça, preparando o cenário para a união
dos dois fragmentos. Fim da descrição.

O próximo passo é adicionar, em um tubo novo, o produto da

digestão enzimática do gene alvo, o produto da digestão do
plasmídeo e a enzima DNA Ligase. As extremidades compatíveis
serão unidas covalentemente pela enzima. Veja a seguir:
 Figura 14
Fonte: Adaptada de [Link]

#ParaTodosVerem: imagem ilustra a etapa de hibridização no processo de

clonagem molecular. No centro, um plasmídeo circular cinza apresenta um
segmento inserido em sua estrutura. O quadro em destaque detalha essa união:
o gene-alvo, representado pela cor azul, está posicionado entre as aberturas do
plasmídeo. As extremidades de ambos, destacadas em roxo com letras pretas,
mostram um encaixe perfeito devido à complementaridade das bases
nitrogenadas. Esse alinhamento demonstra como os fragmentos de DNA,
cortados pela mesma enzima, se reconhecem e se aproximam para formar uma
única molécula integrada. Fim da descrição.

Se houver a ligação do plasmídeo (em cinza, na Figura acima)

com o gene da insulina, por exemplo (em azul, na Figura acima),
teremos um plasmídeo recombinante:
 Figura 15
Fonte: Adaptada de [Link]

#ParaTodosVerem: imagem apresenta a etapa final da construção de um

plasmídeo recombinante. No canto inferior esquerdo, um diagrama circular
cinza mostra o gene-alvo azul completamente integrado à sua estrutura. O
quadro ampliado no topo detalha essa união, exibindo o gene-alvo conectado
de forma contínua às fitas do plasmídeo. As regiões de junção, destacadas em
roxo, mostram que as sequências de bases nitrogenadas estão agora
perfeitamente ligadas e seladas, formando uma molécula de DNA circular única
e funcional, pronta para ser utilizada em processos de biotecnologia. Fim da
descrição.

Na Figura a seguir, é possível ter a visão geral de todo o processo:

 Figura 16
Fonte: Adaptada de [Link]

#ParaTodosVerem: imagem apresenta um fluxograma do processo de

tecnologia do DNA recombinante. Na parte superior, vemos os dois
componentes iniciais: um plasmídeo circular e um fragmento de DNA isolado,
chamado gene-alvo. Uma seta indica que o plasmídeo passa por uma digestão
com enzima de restrição, o que abre sua estrutura circular. Em seguida, o gene-
alvo é inserido nessa abertura, e a ação da enzima DNA ligase sela as conexões
entre os fragmentos. O resultado final, exibido no canto inferior direito, é o
plasmídeo recombinante, que agora contém o novo gene perfeitamente
integrado à sua estrutura original. Fim da descrição.

Para finalizar o processo de clonagem, faz-se necessário

introduzir esse plasmídeo recombinante em um hospedeiro
adequado.
Pode-se utilizar diferentes hospedeiros, tais como bactérias,
fungos, células de insetos e células de mamíferos, dentre outros.

Para cada aplicação, há um hospedeiro preferencial e, com ele,

modificações no plasmídeo devem ocorrer para que a célula-alvo
possa reconhecê-lo.

As bactérias são, sem dúvida, os hospedeiros mais utilizados na

clonagem. Isso se deve à facilidade de manipulação dessa célula,
boa taxa de crescimento celular, diversas cepas e plasmídeos
comercialmente disponíveis e sistema de expressão e purificação
da proteína recombinante bem conhecidos.

Entretanto, é importante ter em mente que há vantagens e

desvantagens na utilização dos outros organismos citados acima.
Tudo vai depender do interesse e da aplicação do pesquisador.
Aqui, continuaremos nosso estudo focando nas bactérias.

Para introduzir o plasmídeo recombinante na bactéria, é

necessário submetê-la a um processo denominado
transformação.

Nele, bactérias competentes são misturadas ao plasmídeo

recombinante e incubadas em gelo por alguns minutos. Em
seguida, essa mistura é submetida a um choque térmico (de zero a
42°C), que promoverá uma desestabilização da membrana celular
bacteriana, formando poros transitórios, suficientes para
permitirem a entrada do plasmídeo na célula.

Uma vez interiorizado, esse plasmídeo passa a conferir

resistência a um determinado antibiótico por carregar um gene
que codifica para tal característica (ampicilina, por exemplo).

Figura 17
Fonte: Adaptada de [Link]

#ParaTodosVerem: imagem ilustra o processo de transformação bacteriana e

produção de proteínas por meio de DNA recombinante. O diagrama começa com
a introdução de plasmídeos em um tubo com bactérias, que passam por um
choque térmico para permitir a entrada do material genético. Em seguida, as
bactérias transformadas são selecionadas em uma placa de Petri contendo
antibiótico, onde apenas as que incorporaram o plasmídeo correto sobrevivem
e formam colônias. Por fim, uma dessas colônias é transferida para um frasco
de cultivo em larga escala para a multiplicação das bactérias, resultando na
 extração final dos plasmídeos replicados e das proteínas de interesse expressas
por elas. Fim da descrição.

É importante notar que o processo de transformação não é

totalmente eficiente, de forma que poucas bactérias recebem o
plasmídeo recombinante em comparação ao número inicial de
células.

Para selecionar as bactérias que contêm o plasmídeo daquelas que

não contêm, semeia-se todo o conteúdo da transformação em
placas de Petri contendo meio de cultura com o antibiótico para
quem o plasmídeo confere resistência (Ampicilina, nesse
exemplo).

Após algumas horas sob temperatura adequada, é possível

identificar colônias bacterianas no meio de cultura. Elas são
provenientes de uma única bactéria resistente, ou seja, que
recebeu o plasmídeo no processo de transformação, que se
multiplicou e formou um aglomerado de células geneticamente
idênticas.

As bactérias que não receberam o plasmídeo morreram durante

esse período de incubação em meio contendo antibiótico e não
crescem na placa de cultura.

Assim, é possível selecionar as bactérias que contêm o plasmídeo

recombinante e utilizá-las para a produção de proteínas
recombinantes (insulina, por exemplo) ou para multiplicar esses
plasmídeos que serão utilizados posteriormente na terapia
gênica, por exemplo.

Agora que você aprendeu como funciona o processo de clonagem

gênica, vamos citar e explicar as 3 características essenciais de
um plasmídeo:

Origem da replicação que seja reconhecida pela DNA

polimerase da célula hospedeira. Por exemplo, um plasmídeo
que vai ser inserido em uma bactéria, deve ter um sítio que
seja reconhecido pela DNA polimerase da bactéria. Afinal,
quando a bactéria vai replicar o próprio DNA, precisa também
replicar o DNA plasmidial contendo o gene de nosso interesse.
O mesmo raciocínio é aplicado quando a célula hospedeira é
uma levedura ou outra célula eucariótica;

Múltiplo sítio de clonagem: esse local contém diversos sítios

que são reconhecidos por diferentes enzimas de restrição.
Quanto mais sítios, mais fácil é utilizar o plasmídeo no
processo de clonagem. Lembre-se de que você deve escolher
uma enzima de restrição para clivar o DNA de interesse e uma
enzima para clivar o plasmídeo:

Quando você escolhe uma enzima que gera extremidades

cegas para clivar o DNA de interesse, pode-se utilizar
qualquer enzima que gere extremidades cegas para clivar
o plasmídeo;
 Quando você escolhe uma enzima que gera extremidades
coesivas, as extremidades geradas devem ser compatíveis
e complementares para que ocorra a ligação.

Método de seleção das bactérias que incorporaram o

plasmídeo. O método mais utilizado é a existência de um gene
que confere resistência a algum antibiótico. Dessa forma,
basta acrescentar o antibiótico no meio de cultura que é
possível selecionar as bactérias que incorporaram o
plasmídeo.

Expressão e Purificação de
Proteínas Recombinantes
Após a clonagem gênica, com o plasmídeo recombinante no
interior da bactéria, pode-se induzir a expressão do gene de
interesse para a produção da proteína recombinante.

Antes de avançarmos nesse tema, é importante voltarmos na

estrutura do plasmídeo utilizado na clonagem para entendermos
como é possível “fabricar” proteínas humanas, por exemplo, em
Sistema Bacteriano.

Anteriormente, havíamos falado que os plasmídeos das 3

características de um vetor de clonagem.
Além dessas características, um VETOR DE EXPRESSÃO também
precisa ter:

Sequência promotora que seja reconhecida pela RNA

polimerase da célula. Essas sequências promotoras
determinam onde deve ser iniciada a transcrição, ou seja,
onde a RNA polimerase deve iniciar a leitura do DNA para
transcrever a molécula de RNA e, geralmente, estão
localizadas na região 5’ dos genes. Promotores influenciam a
taxa com que esse RNA é replicado;

Sítio de ligação ao ribossomo: é a região do RNAm que é

reconhecida no ribossomo para início da tradução.

Importante!
Nem sempre o objetivo do pesquisador ao fazer uma clonagem é
expressar proteínas. Muitas vezes, deseja-se conhecer alguma
região do genoma cujo produto não seja uma proteína, por
exemplo, clonagem de sequências regulatórias, regiões
intergênicas (entre genes), promotores, sequências de DNA
repetitivo e genes ribossomais. Nesse caso, o pesquisador não
deve utilizar um vetor de expressão e sim um vetor de clonagem
sem as características adicionais encontradas em um vetor de
expressão.

Figura 18
Fonte: Adaptada de [Link]

#ParaTodosVerem: imagem apresenta o diagrama de um plasmídeo

recombinante, destacando os componentes essenciais para a engenharia
genética em um formato circular. No topo, à esquerda, há uma seção verde
identificada como o promotor, responsável por conduzir a expressão do gene de
interesse. Logo à frente, no sentido horário, uma faixa azul representa o gene-
alvo, que contém a sequência de DNA a ser expressa. Na parte inferior, uma
faixa rosa indica o gene de resistência ao antibiótico, um marcador de seleção
fundamental que permite identificar quais bactérias incorporaram o plasmídeo
 com sucesso durante o processo de transformação em laboratório. Fim da
descrição.

É importante entender, portanto, que o Sistema de Clonagem e

expressão baseado em plasmídeos e bactérias é sempre fixo. O que
deve variar, de acordo com o interesse do pesquisador, é o gene
que é inserido no plasmídeo.

Assim, se quisermos produzir a proteína insulina para tratamento

de diabéticos, devemos isolar o gene que a codifica e inseri-lo no
plasmídeo.

Se, em outro momento, quisermos produzir eritropoietina para

tratamento de anemia associada à falência renal crônica ou da
anemia em pacientes com câncer tratados com quimioterapia,
devemos isolar o gene que codifica para eritropoietina humana e
inseri-lo no plasmídeo. O mesmo raciocínio deve ser seguido para
a clonagem de qualquer gene.

O mRNA gerado é traduzido pelos ribossomos bacterianos,

levando à síntese proteica.

A Figura a seguir mostra esse processo, desde a colônia contendo

o plasmídeo com o gene de interesse (à esquerda na Figura) até a
produção da proteína (à direita na Figura).
 Figura 19
Fonte: Adaptada de [Link]

#ParaTodosVerem: imagem detalha a etapa final da produção biotecnológica,

focando na expressão gênica em larga escala. O esquema mostra uma colônia de
bactérias selecionada sendo transferida para um frasco de cultivo, onde é
desenvolvida para se tornar uma grande cultura. Após o crescimento, as
bactérias são induzidas a expressar o gene inserido, processo ilustrado no
interior de uma célula bacteriana à direita: o DNA do plasmídeo é transcrito em
RNAm (representado por ondas azuis) e, em seguida, esse RNAm é traduzido
em proteína (representada por hexágonos rosa), completando o ciclo de síntese
da substância de interesse. Fim da descrição.

Perceba que nos dois casos exemplificados acima, produção de

insulina ou eritropoietina em larga escala, há necessidade de
remover as proteínas recombinantes do interior da célula
bacteriana.

É preciso purificá-las para o uso biotecnológico. Portanto, o

próximo passo é lisar a bactéria para termos acesso à proteína
recombinante. Isso é realizado por meio do uso de soluções
adequadas e sonicação (uso de ultrassom para lisar células).
O rompimento das células provoca o extravasamento de todo o
conteúdo celular e esse lisado contêm, além da proteína
recombinante, todas as macromoléculas e proteínas bacterianas.
O desafio seguinte é purifica-la dessa “sopa” de proteínas.

Note que, para o uso terapêutico dessas moléculas, essa

purificação deve ser próxima da perfeição. Não se pode
administrar insulina ou eritropoietina, ou qualquer outra
proteína, contaminada com proteína bacteriana.

A maneira mais eficiente para a purificação é a utilização da

técnica conhecida por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
(CLAE).

Esse é um método físico de separação no qual os componentes a

serem separados estão distribuídos entre duas fases que estão em
íntimo contato. Uma das fases permanece estacionária, enquanto
a outra se move através dela.

A fase estacionária, geralmente, é formada por partículas sólidas

ou semirrígidas, esféricas, nas quais se podem acoplar compostos
químicos como uma hidroxila, cadeias carbônicas apolares e
anticorpos específicos, dentre muitos outros.

Ao fazer isso, é possível conferir uma característica química à

partícula. À essa fase estacionária, dá-se o nome de coluna
cromatográfica.
A fase móvel, por sua vez, é o solvente no qual as proteínas
estarão dissolvidas e que tem a função de carregá-las ao longo de
toda a coluna cromatográfica.

A intensidade com que as proteínas interagem com a fase

estacionária vai determinar o tempo que elas ficarão retidas na
coluna. Quem interage mais, fica mais tempo. Quem interage
menos, fica menos tempo.

As proteínas provenientes do extrato bacteriano apresentarão

diferentes características de polaridade, carga, tamanho,
afinidade e essas características é que permitem a purificação da
proteína recombinante daquelas todas outras proteínas da
bactéria.

Existem diferentes tipos de cromatografia, sendo as mais

comuns: adsorção, troca iônica, exclusão por tamanho e
afinidade. Cada uma delas apresenta diferenças na maneira pela
qual a proteína interage com a fase estacionária (coluna
cromatográfica).

Veja a seguir:

Adsorção: a fase estacionária pode conter sítios de adsorção

polares ou apolares. Portanto, a purificação da proteína se
dará por sua polaridade;
 Exclusão por tamanho: a fase estacionária contém “poros”.
Moléculas pequenas entram e saem dos poros
constantemente, enquanto moléculas maiores sequer entram.
Dessa forma, as moléculas maiores migram mais
rapidamente pela coluna cromatográfica e saem primeiro;

Troca iônica: a fase estacionária apresenta carga (positiva ou

negativa). Assim, em uma cromatografia de troca iônica com
fase estacionária positiva, as proteínas “negativas” irão
interagir mais fortemente com a coluna e ficarão mais tempo
retidas, separando-se das proteínas “positivas”. O inverso se
observa quando se utiliza coluna com fase estacionária
negativa;

Afinidade: a fase estacionária possui moléculas por quem a

proteína recombinante apresenta afinidade. Por exemplo: se
for produzida uma enzima recombinante, pode-se acoplar à
coluna cromatográfica o substrato para essa enzima. Se a
proteína recombinante tiver afinidade a um metal (níquel ou
cobalto, por exemplo), pode-se acoplar à coluna
cromatográfica esse metal. Se houver um anticorpo específico
contra a proteína recombinante, pode-se acoplar à coluna
cromatográfica esse anticorpo.

A utilização de anticorpos específicos é a forma mais eficiente

para purificar uma proteína recombinante. Na Figura a seguir,
temos um esquema desse processo.
No nosso exemplo, insulina ou eritropoietina seriam purificadas
após o rompimento das bactérias que as produziram. Todo o
extrato proteico seria submetido à separação cromatográfica em
coluna de afinidade com anticorpos anti-insulina ou
antieritropoietina.

Todas as proteínas que não têm afinidade pelo anticorpo não se

ligam à coluna e passam direto. Segue-se a eluição da proteína
recombinante, que é o ato de desligá-la do anticorpo e recolhê-la
em um tubo a parte.

Figura 20
Fonte: Adaptada de [Link]

#ParaTodosVerem: imagem descreve o processo de purificação de proteínas

após a produção bacteriana. Inicialmente, as células são rompidas para liberar
seu conteúdo, que é então passado por uma coluna de cromatografia de
afinidade. Dentro dessa coluna, anticorpos específicos se ligam à proteína-alvo
(representada pelos hexágonos rosa), retendo-a enquanto as demais
impurezas são eliminadas. Na etapa final, a proteína é liberada da coluna,
resultando na obtenção da proteína pura pronta para uso. Fim da descrição.
Em Síntese
Nesta Unidade, vimos o que é Biotecnologia, sua história e
algumas áreas onde pode ser utilizada. Demos maior enfoque à
Tecnologia do DNA Recombinante, que é a ferramenta básica para
muitas dessas aplicações.

Aprendemos o processo de clonagem gênica, como expressar e

purificar uma proteína recombinante. Lembre-se de que essa
metodologia pode ser aplicada a uma variedade de genes. Tudo
vai depender do interesse e aplicação do pesquisador.

A transição entre os fundamentos da biotecnologia e suas

aplicações práticas no diagnóstico clínico marca a evolução do
conhecimento teórico para a competência técnica necessária ao
profissional biomédico. Conforme explorado anteriormente, a
compreensão da estrutura da dupla-hélice do DNA e o domínio
das ferramentas da tecnologia do DNA recombinante – como as
enzimas de restrição e a DNA ligase – fornecem o arcabouço
necessário para manipular o material genético de forma precisa
em laboratório. Esse domínio das "ferramentas de corte e
colagem" biológicas é o que permite agora avançar para
metodologias que mimetizam os processos celulares para fins de
identificação e análise.

Aprofundando essa perspectiva, a Reação em Cadeia da

Polimerase (PCR) surge como uma aplicação direta desses
conceitos, utilizando a lógica da replicação semiconservativa do
DNA para amplificar sequências de interesse em escalas
exponenciais. Enquanto na abordagem anterior o foco recaiu
sobre como isolar e recombinar genes, agora o objetivo central é a
detecção e a quantificação. A transição para a Biotecnologia
Diagnóstica exige que o estudante aplique seus conhecimentos
sobre as propriedades físico-químicas do DNA – como a
especificidade do pareamento de bases – para interpretar
resultados obtidos por meio de técnicas como a eletroforese em
gel de agarose.

Nesse sentido, a integração desses saberes revela-se fundamental

para a prática biomédica moderna, onde a capacidade de
diferenciar o material genético humano do de agentes
patogênicos, como bactérias e vírus, define a precisão de um
diagnóstico. O domínio da técnica de PCR e de suas variantes não
é apenas um exercício acadêmico, mas a base para a identificação
de doenças genéticas, neoplásicas e infecciosas com uma
agilidade que os métodos tradicionais de cultivo não conseguem
oferecer. Assim, o conhecimento consolidado sobre a
manipulação do DNA torna-se o instrumento essencial para a
inovação e eficácia no cuidado à saúde.
Página 2 de 3

Biotecnologia Diagnóstica

Introdução
Nesta Unidade, estudaremos uma das aplicações mais
importantes da Biotecnologia: o diagnóstico de doenças
genéticas, neoplásicas e infecciosas.

Espero que aproveite ao máximo este material.

A partir do conhecimento da estrutura do DNA, abriu-se a

possibilidade de estudar a molécula de forma mais profunda e,
logo, diversos pesquisadores se ocuparam da tarefa de tentar
manipulá-la em Laboratório.

Uma das primeiras técnicas desenvolvidas, e hoje uma das mais

utilizadas, é a chamada Reação em Cadeia da Polimerase, cuja
sigla é PCR (do inglês Polymerase Chain Reaction).

A PCR consiste na multiplicação de um fragmento de DNA, em um

tudo de ensaio, mimetizando o processo de replicação que ocorre
em nossas células durante a fase S do ciclo celular.
Nas células, diversas enzimas e outras proteínas participam do
processo, tais como: proteínas SSB, helicase, primase,
topoisomerase, ligase e DNA polimerase, dentre outras.
Entretanto, na replicação in vitro, como é o caso da PCR,
necessita-se apenas da DNA polimerase.

Como o nome sugere, essa enzima é responsável por polimerizar

a nova cadeia de DNA adicionando nucleotídeos livres à cadeia
nascente. Esse processo é semiconservativo, o que significa que a
dupla fita de DNA se separa e cada fita serve como molde para a
síntese de uma nova fita de DNA complementar à fita original.

Após a ação da DNA polimerase, tem-se duas moléculas de DNA,

sendo que cada uma possui uma fita original e uma fita nova. Essa
conclusão foi obtida a partir do experimento clássico dos
cientistas Matthew Meselson e Franklin Stahl, utilizando o
isótopo pesado do nitrogênio (15N) em meio de cultura para
bactérias E. coli.

Com isso, os pesquisadores refutaram, definitivamente, outras

duas hipóteses que existiam na época, chamadas de hipótese
conservativa e hipótese dispersiva.

Na hipótese conservativa, uma molécula de DNA resultante da

replicação seria composta pelas duas fitas originais e a outra
molécula seria composta por fitas totalmente novas (mas,
também idênticas à molécula original em relação à sequência de
DNA).

Na hipótese dispersiva, as moléculas de DNA resultantes da

replicação seriam misturas aleatórias das fitas parentais, sendo
que cada molécula de DNA seria um mosaico composto por
fragmentos de origens distintas.

Veja a Figura a seguir, que ilustra essa questão.

Figura 21 – Possíveis mecanismos da replicação do DNA

propostos por diversos autores antes da comprovação por
Meselson e Stahl de que a replicação acontece de forma
semiconservativa
Fonte: Adaptada de WATSON, 2015, p. 31.
 #ParaTodosVerem: imagem apresenta os três modelos hipotéticos de
replicação do DNA, diferenciando como as fitas originais e as novas se
distribuem após a divisão. No modelo dispersivo, as fitas resultantes são uma
mistura fragmentada de DNA antigo e novo em ambas as cadeias. No modelo
semiconservativo, cada molécula filha preserva uma fita original completa (em
vermelho) e uma fita recém-sintetizada (em azul), sendo este o mecanismo
biológico real. Já no modelo conservativo, a molécula de DNA original
permanece intacta, enquanto uma molécula inteiramente nova é produzida.
Fim da descrição.

Leitura
Modelo de Replicação do DNA: Experimento de
Meselson-Stahl
Leia mais detalhes do experimento de Meselson e Stahl.

Clique no botão para conferir o conteúdo.

ACESSE

Mimetizando o que ocorre dentro da célula, na reação de PCR

ocorre a denaturação do DNA, anelamento de primers e
polimerização da nova fita.

Novas fitas de DNA são formadas in vitro pela sucessão de

múltiplos ciclos, em geral de 20 a 40, dependendo do interesse do
investigador.

Cada ciclo da PCR é dividido em três etapas distintas, variando

entre si em tempo e temperatura (Figura 22):

A primeira etapa, chamada de desnaturação, compreende a

elevação da temperatura a 95°C por cerca de 20 segundos. A
alta temperatura quebra as pontes de hidrogênio que ligam as
bases nitrogenadas e, consequentemente, separa a dupla fita
de DNA em duas fitas simples (Figura 22A);

A etapa seguinte é chamada de etapa de alinhamento dos

primers (Figura 22B). A temperatura é reduzida para permitir
que os primers anelem na sequência molde previamente
desnaturada e forme uma região de dupla fita. O anelamento
se dá pela complementariedade de bases entre o primer e a
sequência molde, obedecendo a Regra de Chargaff, ou seja,
Adenina pareando com Timina e Citosina pareando com
Guanina.

Após o anelamento, eleva-se novamente a temperatura, agora

para 72°C, que é a temperatura ótima para a enzima Taq DNA
polimerase incorporar os nucleotídeos livres à nova cadeia
(Figura 22C). A essa etapa, dá-se o nome de Amplificação:
 Figura 22 – As etapas da Reação em Cadeia da Polimerase
(PCR)
Fonte: Adaptada de [Link]

#ParaTodosVerem: imagem detalha o mecanismo molecular da Reação em

Cadeia da Polimerase (PCR) em três etapas principais. Na etapa A, observa-se o
DNA-molde de fita dupla com suas sequências de bases nitrogenadas e
direcionalidade 5' para 3'. Na etapa B, ocorre o anelamento dos primers
(iniciadores): o Primer 1 se liga à fita inferior e o Primer 2 à fita superior,
delimitando a região que será amplificada. Por fim, na etapa C, demonstra-se a
extensão, onde novas bases são adicionadas a partir dos primers no sentido 5' →
3', sintetizando fitas complementares ao molde original para duplicar a
sequência de DNA alvo. Fim da descrição.

Com o fim dessa etapa, encerra-se o primeiro ciclo da PCR. As

moléculas presentes no tubo servirão como molde para o segundo
ciclo, no qual haverá a repetição das etapas de desnaturação,
alinhamento dos primers e amplificação.
As moléculas presentes no tubo após a finalização do segundo
ciclo servirão de molde para o terceiro, e assim sucessivamente.

Como citado acima, a reação completa ocorre entre 20 e 40 ciclos,

o que pode ser finalizado em até três horas. A cada ciclo, ocorre
um aumento exponencial no número de novas moléculas de DNA.

Vídeo
Aula PCR e Animação 3D

Aula PCR e animação 3D

Yáskara Freire

Watch on
Para entendermos o poder de amplificação dessa técnica, temos
que compreender que, a partir de uma única cópia de DNA molde,
obtém-se, após 30 ciclos, mais de 1 bilhão de cópias da sequência
alvo.

Em geral, para a maioria das amostras biológicas, iniciamos a

reação com muito mais do que uma única cópia.

Assim, a técnica de PCR pode ser utilizada para diversas

aplicações, tais como o diagnóstico molecular de agentes
patogênicos, identificação de mutações em doenças genéticas e
neoplásicas, isolamento de genes para o Processo de Clonagem,
Medicina Forense e Sexagem Fetal, dentre outras.

Como Visualizar o Resultado da

Reação de PCR
Para visualizar o resultado da amplificação, é necessário realizar
uma eletroforese em gel de agarose.

Essa técnica consiste na separação de moléculas de DNA em uma

matriz inerte, formada pela polimerização da agarose, por meio
de um campo elétrico.
A agarose é um polissacarídeo extraído de algas. No Laboratório,
apresenta-se na forma de pó que, ao ser hidratado, aquecido até a
fervura e resfriado, forma um gel semelhante à gelatina
comestível.

Por ação desse campo elétrico, as moléculas de DNA, que são

negativas devido à presença de fosfato em sua cadeia, são
“puxadas” em direção ao polo positivo da cuba de eletroforese.

Como o gel de agarose forma uma espécie de rede, essa separação

se dá por tamanho das moléculas. Em outras palavras, moléculas
grandes migram menos no gel, por terem mais dificuldade em
migrar por entre a malha da agarose. Já moléculas pequenas,
migram mais.
Reflita
Em um gel de agarose, onde se localizam as moléculas maiores e
as menores?

Como as moléculas menores conseguem migrar mais facilmente,

conseguem se deslocar da região superior onde está o poço para a
parte inferior do gel.

Já as moléculas maiores ficam retidas na região superior do gel.

Todas as moléculas de mesmo tamanho migram exatamente na
mesma região, formando uma banda que pode ser visualizada
após coloração com corante chamado brometo de etídeo.

Como Podemos Saber o Tamanho

das Bandas
O tamanho das bandas é medido em número de pares de base da
molécula de DNA e pode ser medido por comparação com padrões
conhecidos de DNA.

Esses padrões são como “escadas de DNA”, em que cada degrau

possui uma quantidade conhecida de pares de bases. Dessa forma,
basta que o pesquisador compare os tamanhos das bandas
geradas pela reação de PCR com esse padrão, que é vendido
comercialmente.

Veja a representação esquemática a seguir:

Figura 23 – Representação esquemática de eletroforese em

gel de agarose
Fonte: Adaptada de [Link]

#ParaTodosVerem: imagem ilustra o funcionamento da eletroforese em gel,

uma técnica utilizada para separar fragmentos de DNA. No topo, o diagrama
mostra a "escada de DNA" (marcador de peso molecular) e as amostras sendo
carregadas em poços na extremidade negativa do gel. Ao ligar a corrente
elétrica, os fragmentos de DNA migram em direção ao polo positivo; o resultado
final, exibido na parte inferior, revela a separação por tamanho: os fragmentos
maiores encontram-se mais próximos ao topo, pois encontram mais
 resistência na malha do gel, enquanto os fragmentos menores migram mais
rapidamente para a base. Fim da descrição.

A Figura 24 mostra uma imagem real da separação de um produto

de PCR por eletroforese em gel de agarose.

A visualização é possível graças à incorporação de um corante

fluorescente na cadeia de DNA, chamado brometo de etídeo.

Figura 24 – Representação esquemática de eletroforese em

gel de agarose
Fonte: Adaptada de [Link]

#ParaTodosVerem: imagem apresenta o resultado real de uma eletroforese em

gel de agarose após uma reação de PCR. À esquerda, a coluna "Escada" funciona
 como um padrão de referência, exibindo diversas bandas com tamanhos
conhecidos em pares de bases (pb), como 500 pb, 1.500 pb e 5.000 pb. À direita,
a coluna "Reação de PCR" mostra uma banda única e intensa, indicando a
amplificação bem-sucedida de um fragmento específico de DNA. Ao comparar
com a escada, nota-se que o produto da reação possui um tamanho
ligeiramente superior a 500 pb. Fim da descrição.

Aplicações da PCR
Agora que entendemos como funciona a reação, vamos estudar
sobre algumas de suas aplicações. Em um Laboratório Clínico, as
aplicações da PCR são diversas. Tudo depende da sequência que se
deseja amplificar.

No diagnóstico de doença causada por uma bactéria, por exemplo,

deve-se escolher amplificar uma sequência de DNA que seja
exclusiva do microrganismo.

Imagine a seguinte situação: um paciente procura por auxílio

médico por apresentar tosse com secreção espessa, falta de ar,
cansaço excessivo, perda de peso e falta de apetite.

O médico suspeita de tuberculose, coleta uma amostra da

secreção e envia a um Laboratório de Análises Clínicas.

Como o M. tuberculosis leva cerca de 14 dias para crescer em meio

de cultura, o médico também solicita o teste molecular por PCR.
Quando o analista realizar a extração de DNA da amostra, esta
conterá DNA de origem humana e DNA de origem bacteriana, se o
paciente estiver infectado. Mas como saber se há DNA bacteriano
na amostra?

A resposta para essa pergunta é: utilizar primers que reconheçam

especificamente uma sequência de DNA exclusiva da bactéria,
como, por exemplo, o gene que codifica o rDNA 16S.

Os primers específicos anelam por complementaridade apenas

com o rDNA 16S da bactéria e com nenhuma sequência de DNA
humano.

Lembre-se de que para a DNA polimerase iniciar a polimerização

é necessária uma pequena região de dupla fita formada pela fita
de DNA e pelo primer!

Quais são os Possíveis Resultados?

Realizando a reação com esses primers específicos e todos os
outros componentes, teremos dois resultados possíveis:

Se identificarmos uma banda no gel de agarose com tamanho

esperado para aquele gene, o diagnóstico é positivo para a
bactéria. Isso significa que havia DNA de [Link] na
amostra suficiente para sua amplificação;
 Se não houver bandas formadas, significa que não houve
amplificação por não haver molde de DNA bacteriano na
amostra.

Outra aplicação muito importante na clínica é a utilização da PCR

na identificação humana, seja em teste de paternidade, seja na
Ciência Forense.

Em nossos cromossomos, existem regiões variáveis chamadas

microssatélites. Elas consistem de repetições de nucleotídeos
uma ao lado da outra, como contas em um colar.

São também chamadas de VNTR (do inglês, Variable Number of

Tandem Repeats) e, como o nome sugere, há variações no número
de repetições entre indivíduos.

Agora, imagine o seguinte caso: a perícia científica faz a análise

de uma cena de crime. Encontram vestígios de amostra biológica
e fazem a coleta para posterior análise em Laboratório. Decidem
amplificar a região de microssatélites da amostra encontrada no
local do crime e comparam com o mesmo lócus de três suspeitos
diferentes.

Para realizar tal análise, é necessário utilizar primers específicos

que são complementares especificamente para essa região
cromossômica.
Como essa região é polimórfica em tamanho, ou seja, cada
indivíduo possui um lócus de tamanho diferente, supõe-se que é
possível comparar o perfil dos suspeitos com a amostra isolada na
cena do crime.

Analise a figura a seguir e tire suas conclusões:

Figura 25 – Análise de lócus de microssatélite por PCR

seguido de eletroforese em gel de agarose
Fonte: Adaptada de [Link]

#ParaTodosVerem: imagem apresenta o resultado real de uma eletroforese em

gel de agarose após uma reação de PCR. À esquerda, a coluna "Escada" funciona
como um padrão de referência, exibindo diversas bandas com tamanhos
conhecidos em pares de bases (pb), como 500 pb, 1.500 pb e 5.000 pb. À direita,
a coluna "Reação de PCR" mostra uma banda única e intensa, indicando a
amplificação bem-sucedida de um fragmento específico de DNA. Ao comparar
 com a escada, nota-se que o produto da reação possui um tamanho
ligeiramente superior a 500 pb. Fim da descrição.

Analisando o DNA da cena do crime, é possível observar que o

fragmento possui, aproximadamente, 200pb de tamanho.

Quando analisamos o tamanho desse mesmo lócus nos suspeitos,

observamos que somente o indivíduo 3 possui perfil idêntico ao
DNA da cena do crime.

Assim, descarta-se a o envolvimento dos indivíduos 1 e 2 e se

conclui que o indivíduo 3 é o responsável pelo crime. Na prática,
diversos loci de microssatélites são necessários para chegar a tal
conclusão com alto índice de confiabilidade.

Um outro exemplo de aplicação da técnica de PCR na clínica é sua

utilização na sexagem fetal. Sabe-se que, muitas vezes, os
exames de imagem não são capazes de determinar o sexo do feto
pela posição em que ele se encontra no útero materno ou pelo
número reduzido de semanas da gestação.

A demora no diagnóstico pode causar alguma ansiedade e

atrapalhar o planejamento da família.

Desde 1997, sabe-se que, já durante as primeiras semanas de

gestação, o DNA do feto é encontrado na circulação sanguínea da
mãe.
Com oito semanas, é possível ter concentração de DNA fetal em
concentrações adequadas para a realização do teste, porém, na 11ª
semana, ele atinge seu pico.

Assim, retirando-se sangue da circulação periférica da mãe,

extraindo-se o DNA, pode-se buscar por sequências específicas
do cromossomo Y, utilizando primers específicos.

Se houver amplificação desse DNA, conclui-se que o bebê é um

menino, pois a mãe é XX e não possui cromossomo Y. Caso não
haja amplificação, conclui-se que é menina, pois não apresenta
cromossomo Y, tal como a mãe.

Evidentemente, existem muitas outras aplicações para a técnica

de PCR na rotina clínica.

Variantes da Técnica de PCR

Como vimos, a técnica de PCR é muito poderosa, pois permite a
amplificação exponencial de um fragmento de DNA de interesse.

Com o passar do tempo, muitos cientistas desenvolveram

variações na Técnica de modo a contemplar suas necessidades.
PCR da Polimerase Reversa
Uma variação muito importante é chamada RT-PCR (do inglês,
Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction).

Na RT-PCR utiliza-se a enzima transcriptase reversa, que é uma

DNA polimerase que utiliza RNA como molde, ou seja, sintetiza
uma cadeia de DNA a partir de uma fita simples de RNA.

O DNA sintetizado a partir de um molde de RNA é chamado DNA

complementar (cDNA).

As vantagens em se utilizar essa técnica são: realizar estudos de

genes expressos, estudos de íntros, éxons e splicing.

Na rotina clínica, é especialmente útil no diagnóstico e

acompanhamento de doenças causadas por retrovírus, cujo
genoma é composto por RNA, como é o caso do HIV.

Importante!
cDNA é uma molécula de DNA copiada a partir de um molde de
RNA pela enzima Transcriptase Reversa. Como os íntrons
presentes no DNA genômico são removidos durante o
processamento do RNA, o cDNA não contém íntrons.

Figura 26 – Compreensão das etapas de transcrição de RNA

pela célula até a produção de molécula de cDNA em um tubo
de ensaio pela técnica de PCR pela transcriptase reversa
Fonte: Adaptada de TORTORA; FUNKE; CASE

#ParaTodosVerem: imagem explica as etapas de síntese do DNA complementar

(cDNA) a partir de um gene eucariótico. O processo começa no núcleo, onde o
DNA contendo éxons e íntrons é transcrito em um transcrito primário de RNA;
em seguida, enzimas de processamento removem os íntrons, unindo apenas os
éxons para formar o mRNA maduro. Fora da célula, em um tubo de ensaio, a
enzima transcriptase reversa utiliza esse mRNA como molde para sintetizar a
 primeira fita de DNA. Após o mRNA ser clivado, a DNA-polimerase entra em
ação para produzir a segunda fita, resultando em uma molécula de cDNA de fita
dupla que representa apenas as sequências codificantes (sem os íntrons) do
gene original. Fim da descrição.

PCR em Tempo Real

Outra variante de PCR muito importante que precisamos conhecer
é a reação de PCR em Tempo Real, algumas vezes simbolizada
pela mesma sigla RT-PCR (do inglês Real Time PCR).

Para diferenciar, alguns pesquisadores chamam essa técnica de

qPCR (“q” de quantitativo).

Importante!
Não confundir:

RT-PCR-, do inglês Reverse Transcriptase PCR: PCR com

utilização da enzima Transcriptase Reversa;

RT-PCR-, do inglês Real Time PCR: PCR em tempo real.

Preferencialmente, não utilize essa sigla quando quiser fazer

referência a uma dessas técnicas. Utilize o nome completo para
não causar confusão.

A qPCR é considerada a técnica padrão-ouro para o diagnóstico

molecular quantitativo em casos de infecções bacterianas e virais.

Ela permite o acompanhamento, em tempo real, da síntese das

novas cadeias de DNA por meio da adição de compostos
fluorescentes no momento da preparação da amostra. Esses, por
sua vez, serão excitados por uma fonte de luz adequada e a
fluorescência emitida será captada por um detector ao final de
cada ciclo de PCR.

Cada vez que uma molécula de DNA é sintetizada, emite

fluorescência, ou seja, a fluorescência aumenta a cada ciclo, já que
novas moléculas são sintetizadas a cada ciclo.

Em outras palavras, a intensidade de fluorescência será

proporcional à quantidade de DNA sintetizado, a qual será
representada em um Gráfico, como o da Figura 27.
 Figura 27 – Cinética da produção de DNA pela técnica de
PCR
Fonte: Reprodução

#ParaTodosVerem: gráfico apresenta a curva de amplificação característica de

um exame de biologia molecular em tempo real. No início, há uma linha de base
estável com sinal baixo, seguida por uma fase exponencial onde a detecção do
material genético cresce rapidamente. O ponto de cruzamento com a linha de
corte, identificado como limiar de ciclo, indica o momento em que o sinal se
torna positivo. Por fim, a curva atinge um platô, estabilizando-se quando os
recursos da reação chegam ao fim. Fim da descrição.

Perceba que, nos primeiros ciclos, especificamente nesse

exemplo, até o ciclo 15, não há a detecção de fluorescência acima
da linha de base.

Essa é a chamada fase linear, na qual há excesso de reagentes,

mas a quantidade de produto ainda é muito baixa para que a
fluorescência seja detectada.
Depois do ciclo 15, vemos um crescimento exponencial da
fluorescência. Há acúmulo do fragmento de DNA desejado pelo
pareamento facilitado, vez que há várias cópias das sequências
alvo.

Segue-se, a partir do ciclo 28, a fase de platô, na qual a

amplificação já é subótima devido à limitação dos reagentes e à
competição dos produtos gerados com os primers.

Como Analisar um Resultado Obtido pela

Técnica de PCR em Tempo Real
Observe no Gráfico (Figura 27) um ponto na curva exponencial
chamado CT (Ciclo Threshold).

O CT é ciclo em que a fluorescência ultrapassa o limite de detecção

pré-estabelecida pelo equipamento (threshold).

O ciclo em que a curva de determinada amostra ultrapassa o

threshold depende da quantidade de DNA presente, isto é, cada
amostra analisada vai ultrapassar a threshold em momentos
distintos e, consequentemente, ter diferentes Ct, se houver
diferentes quantidades de DNA.

A Figura a seguir mostra um pesquisador analisando o resultado

de qPCR de diferentes amostras antes da determinação da linha
threshold.

A amostra cuja curva exponencial está à esquerda possui mais

DNA que as demais amostras, enquanto a amostra cuja curva
exponencial está à direita possui menos DNA que as demais.

Em outras palavras, em ensaios de quantificação, quanto maior a

quantidade de moléculas de DNA alvo no início da reação, menos
ciclos serão necessários para ultrapassar o threshold.

Da mesma forma, quanto menor a quantidade de sequência alvo,

mais ciclos serão necessários para produzir DNA suficiente para
ultrapassar esse limite.

Assim temos que, quanto menor o CT, mais DNA alvo existe na

amostra original.

Quais as aplicações da técnica de PCR em tempo real? Entre os

diversos exemplos, podemos citar a quantificação de genes
expressos em determinado tecido, quantificação de carga viral,
detecção de agentes infecciosos e reação do organismo a
determinado tratamento terapêutico entre outros.

Por exemplo, fazer o diagnóstico de pacientes infectados pelo

vírus HIV para determinar a carga viral presente no sangue do
paciente e, consequentemente, orientar o médico para saber se
precisa fazer tratamento quimioterápico e qual o tipo de
tratamento.

Figura 28
Fonte: Getty Images

#ParaTodosVerem: imagem mostra um gráfico impresso de uma análise de

laboratório que compara a variação do sinal fluorescente em relação ao número
de ciclos em uma reação de biologia molecular. O gráfico contém múltiplas
curvas de amplificação, representando diferentes amostras ou diluições, que
começam com ruídos na base e sobem de forma acentuada em momentos
distintos. Uma mão segura uma caneta prateada e aponta para uma das curvas
localizadas à direita, destacando o momento em que o sinal de uma amostra
específica começa a ser detectado de forma relevante em relação ao tempo da
reação. Fim da descrição.
Caso o paciente inicie um tratamento, amostras são colhidas de
tempos em tempos para verificar se a carga viral está diminuindo
ou não, ou seja, se o medicamento está funcionando na terapia ou
se é necessário alterar a medicação.

Evidentemente, existem vantagens e desvantagens para o uso de

uma ou outra técnica de PCR.

Em um Laboratório Clínico, é importante ter em mente o custo-

efetividade do método para escolher a opção que atenda à
demanda.

Sem dúvida, se há a necessidade de um resultado quantitativo, a

qPCR é a melhor opção. Entretanto, se o interesse é apenas
qualitativo, a PCR convencional deve ser escolhida.

A Tabela a seguir apresenta uma breve comparação entre ambas

as técnicas.

Tabela 3 – Comparação entre a técnica de PCR convencional e a

qPCR

PCR convencional PCR em Tempo Real

Qualitativo Qualitativo
 Analisa durante a fase
Analisa o platô da curva
exponencial

Processamento pós PCR para

Análise em tempo real
análise

Menor sensibilidade Maior sensibilidade

Menor custo para realização Maior custo para realização

Proteômica no Diagnóstico de
Agentes Patogênicos
Um dos maiores desafios da Microbiologia Clínica é o tempo para
a liberação do resultado.

Isso ocorre porque é necessário que o microrganismo cresça em

meio de cultura e que testes bioquímicos sejam realizados para a
identificação do patógeno de forma inequívoca.

Por mais que a Tecnologia avance, a taxa de crescimento é

característica e peculiar do microrganismo. A utilização das
Técnicas baseadas em PCR tem sido muito importante para a
redução do tempo de liberação de um laudo clínico e se tornou
realidade em muitos Laboratórios do país.
Uma proposta mais recente é a utilização da espectrometria de
massas para a identificação rápida de patógenos. Esta é uma
técnica de química analítica, que vem sendo aplicada na
microbiologia. Ela funciona como uma “balança molecular”,
sendo capaz de medir, com alta resolução, a massa de um
composto químico que contenha carga.

Existem diferentes formas de ionizar um composto e analisá-lo.

Por essa razão, temos diferentes equipamentos de espectrometria
de massas, os quais se adaptam melhor a diferentes aplicações.

Na Microbiologia, a forma mais utilizada é conhecida por MALDI-

ToF, uma sigla para “dessorção/ionização a laser assistida por
matriz-tempo de voo” (do inglês Matrix-Assisted Laser
Desorption/Ionization-Time of Flight).

MALDI refere-se à forma de ionizar, ou seja, de doar prótons para

que a molécula fique carregada positivamente.

Na Figura a seguir, é possível entender o princípio da técnica de

ionização. Um analito que se queira medir (pontos em laranja) é
misturado com uma matriz orgânica (pontos em verde), com
quem é co-cristalizado numa superfície sólida (em cinza).

Um feixe de laser de alta frequência incide sobre o cristal e

desorve da placa (retira) o analito com matriz. Este absorve a
energia do laser e transporta as moléculas do analito para a fase
gasosa, transferindo prótons à ela e, consequentemente,
ionizando-o.

Agora, a massa do analito carregado positivamente poderá ser

medida pelo analisador de massas chamado ToF.

Figura 29 – Ionização de analitos por MALDI

Fonte: Reprodução

#ParaTodosVerem: imagem ilustra o funcionamento da técnica de

espectrometria de massa por dessorção e ionização a laser. O processo começa
em uma placa de metal onde uma mistura de matriz e analito é atingida por um
feixe de laser, provocando a dessorção da amostra. Em seguida, ocorre a
ionização por meio da transferência de prótons entre as moléculas da matriz e
do analito. Por fim, as partículas carregadas são direcionadas para o analisador
de massa, que permite a identificação e o estudo dos componentes da
substância original. Fim da descrição.
Uma vez ionizado, o analito “voa” em direção à diferença de
potencial (ddp) que existe ao longo de um tubo (tubo tempo de
voo) e é detectada ao final.

Moléculas pequenas levam menos tempo para atingir o detector,

enquanto moléculas maiores o atingem em mais tempo.

Um software acoplado ao Sistema transforma a informação de

tempo em massa e gera um gráfico chamado espectro de massas.
A Figura 30 ilustra esse processo.

Figura 30 – Princípio da medição de massa por tempo de

voo (ToF)
Fonte: Reprodução

#ParaTodosVerem: imagem detalha o funcionamento de um espectrômetro de

massa com analisador por tempo de voo. O processo se inicia com um laser
incidindo sobre uma matriz, liberando íons de diferentes tamanhos. Esses íons
são impulsionados por um gerador de campo elétrico e entram em um tubo de
vácuo, onde percorrem uma distância fixa. As partículas menores e mais leves
 viajam mais rápido e atingem o detector primeiro, enquanto as maiores levam
mais tempo. Essa diferença na velocidade de chegada permite separar os
componentes da amostra, gerando um espectro de massa final que identifica
cada substância com base em seu peso e carga. Fim da descrição.

A aplicação dessa técnica na Microbiologia para a detecção de

patógenos segue o seguinte raciocínio, representado também na
Figura 30:

Realiza-se a cultura bacteriana em placas de Petri contendo

meio de cultura;

Uma parte da colônia é misturada à matriz (ácido orgânico

capaz de absorver energia do laser) e aplicada à placa para co-
cristalização;

Incide-se o laser sobre o ponto em que há bactérias e matriz;

Diferentes moléculas da bactéria são dessorvidas, ionizadas e,

em seguida, entram no tubo tempo de voo para que suas
massas sejam medidas;

Um espectro de massa, característico dessa amostra, é

determinado;

Compara-se o espectro gerado na amostra com um banco de

espectros presente no software de análise.
 Figura 31 – Aplicação de MALDI-ToF em Microbiologia
Fonte: Reprodução
#ParaTodosVerem: imagem ilustra a preparação de amostras para a
identificação de microrganismos via tecnologia MALDI-ToF. O processo
demonstra a coleta de uma colônia a partir de uma cultura bacteriana em placa
de Petri e sua aplicação em uma placa metálica de múltiplos poços.
Simultaneamente, uma matriz líquida é adicionada sobre a amostra bacteriana
para auxiliar na cristalização e posterior ionização. À direita, feixes de laser
atingem os poços preparados, disparando o processo de análise que permite a
identificação rápida e precisa da espécie bacteriana presente. Fim da descrição.

Imagine a seguinte situação: suspeita-se que determinado

paciente esteja infectado por uma E. coli produtora de β-
lactamase de espectro estendido.
Realiza-se o protocolo descrito acima e se obtém o espectro de
peptídeos de proteínas específicas dessa bactéria suspeita.

Ao comparar com os espectros contidos no banco de dados, tem-

se a seguinte imagem:

Figura 32 – Comparação de espectros de massas gerados

por MALDI-ToF
Fonte: Reprodução

#ParaTodosVerem: imagem apresenta um gráfico de espectrometria de massa,

comumente utilizado para identificação molecular. O eixo vertical indica a
intensidade do sinal, enquanto o eixo horizontal representa a relação entre a
massa e a carga das partículas detectadas. O gráfico exibe um padrão de
"espelho": na parte superior, em azul, observam-se diversos picos que
representam a assinatura molecular da amostra analisada; na parte inferior, em
vermelho, os picos invertidos servem como uma referência ou comparação para
validar a identidade das substâncias. Essa distribuição de picos permite
 determinar com precisão a composição química e a pureza de proteínas ou
outros compostos biológicos. Fim da descrição.

Perceba que o espectro obtido (vermelho) se sobrepõe quase que

perfeitamente ao espectro do Banco de Dados (azul).

Quando há tal correspondência, pode-se concluir que são a

mesma espécie. Assim, é possível realizar a identificação desse
patógeno de forma inequívoca, comparando o conteúdo proteico
espécie-específica.

Um ponto importante a se ressaltar é que todo o procedimento,

desde a co-cristalização da bactéria com matriz até a comparação
de espectros é muito rápido, necessitando de poucos minutos
para ter o resultado final.

Muitos Laboratórios de Microbiologia já têm implantado essa

Técnica em sua rotina, principalmente, dentro de hospitais, onde
a velocidade na liberação do laudo é fundamental.

Em Síntese
Nesta Unidade, vimos como algumas Técnicas de Biotecnologia podem ser utilizadas
no diagnóstico de doenças genéticas e infecciosas.
Lembre-se de que, para a técnica de PCR, é fundamental um bom desenho dos primers
e este deve reconhecer uma sequência de DNA específica.

A técnica é a mesma (mesmo nas variantes), tudo dependerá qual sequência se deseja

analisar.
📄 Referências
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ALBERTS, B. et al. Biologia Molecular da Célula. Porto Alegre:

Artmed, 2011.

BRUNO, A. N. Biotecnologia I: Princípios e Métodos – Série Teken

– Capítulo 1 – Tendências e perspectivas da Biotecnologia.

COOPER, G. M. A célula: uma abordagem molecular. 3. ed. Porto

Alegre: Artmed, 2007.

DE ROBERTIS, E. M. F.; HIB, J. Biologia Celular e Molecular. 16.

ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2014.

JUNQUEIRA, L. C.; CARNEIRO, J. Biologia Celular e Molecular. 9.

ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2012.

KARP, G. Biologia celular e molecular: conceitos e experimentos.

Barueri: Manole, 2005.

LODISH, H. et al. Biologia Molecular da Célula. 7. ed. Porto Alegre:

Artmed, 2014.
WATSON, J. D. et al. Biologia Molecular do Gene. Porto Alegre:
Artmed, 2015.