PCR - Reação em Cadeia da Polimerase Purificação do DNA:

Introdução: PCR é um método de amplificação (de  Remoção dos componentes celulares:

criação de múltiplas cópias) de DNA ou cDNA (DNA proteínas e organelas e restos celulares;
complementar) in vitro  Proteinase K: Desnaturação das proteínas
 Fenol: Remove proteínas e outros
 A técnica foi apresentada pela primeira vez em contaminantes da solução aquosa do DNA;
1985;  Clorofórmio: Ajuda a desnaturar proteínas e
 Tornou-se o procedimento básico de todo a remover o fenol residual;
laboratório de biologia molecular no mundo;  NaCI2: O sal ajuda a manter as proteínas
 Várias variações da PCR têm sido criadas e dissolvidas no líquido extraído, impedindo
adaptadas para múltiplos fins que elas precipitem com o DNA.

Precipitação do DNA:
 DNA é solúvel em água, mas é insolúvel em
álcool;
 Usa-se etanol para precipitar o DNA;
 Quanto mais gelado o etanol, menos solúvel
o DNA vai estar;
 Retira-se o álcool para a formação do pellet.

Reidratação do DNA:
 Após a retirada do álcool, o DNA precisa se
solubilizar em algum solvente: H2O ultra-
pura ou TE;
 O solvente de reidratação servirá para
Extração de DNA: A extração de DNA de uma dada armazenamento do DNA extraído;
amostra pode ser feita por métodos laboratoriais  Deve ser livre de contaminantes e enzimas
caseiros ou kits comerciais. capazes de destruir o DNA (DNASE-free);
 Armazenar o DNA a -20°C.
No geral, toda extração de DNA se baseia em 4
etapas: Após a extração, é necessário determinar a
concentração DNA extraído;
 Lise das membranas
 Purificação do DNA
 Precipitação do DNA
 Reidratação do DNA

Método Caseiro:

Lise das membranas:

 Membranas: fosfolipídios + proteínas
 Rompimento da membrana celular e dos
compartimentos membranosos ( organelas);
 Provocada por solução detergente. Ex: dodecil
sulfato de sódio (SDS).
Método Kit: SOLUÇÃO:

A DNA polimerase de E. coli foi substituída por uma

DNA polimerase de uma bactéria termo-tolerante,
o Thermus aquaticus: a Taq polimerase.

A Taq polimerase é termoestável e sua temperatura

ótima de funcionamento é 72°C. Com isso, os
problemas ficaram automaticamente resolvidos:
O rendimento e a qualidade do DNA extraído
dependem muito da técnica de extração utilizada e a) não havia mais necessidade de adicionar
pode interferir no resultado de testes realizados enzima no tubo a cada ciclo;
posteriormente.
b) a menor temperatura do ciclo era a de
Por isso a obtenção de DNA de alta qualidade é hibridização, que podia ser mantida acima de
essencial, garantindo assim o sucesso das etapas 50°C, evitando hibridizações errôneas.
seguintes.
AMPLIFICAÇÃO DO DNA DURANTE A PCR: a
Reação de PCR: polimerização ocorre no sentido 5´- 3´
 DNA molde
 Oligonucleotídeos (primer)
 dNTP’s (desóxinucleotídeos)
 DNA Polimerase (E. coli)
 Magnésio
 Tampão
 Água anelamento dos primers

PROBLEMAS:

 A DNA polimerase da [Link] utilizada era

termoinstável (como a maioria das proteínas dos
seres vivos) e se tornava inativa
irreversivelmente a 94ºC;
 Era preciso adicionar mais DNA polimerase de E.
coli no tubo a cada ciclo de extensão;
polimerização ou extensão
 A baixa temperatura de funcionamento da DNA
polimerase de E. coli propiciava o aparecimento
de pareamentos inespecíficos (errôneos) no
sistema, gerando ao final produtos de PCR
(Amplicons) inesperados.
AS FASES DA PCR: exponencial - linear - platô As causas do efeito platô:

 Perda da atividade da enzima;

 Todas as enzimas disponíveis estão ocupadas
com síntese de DNA;
 Acúmulo de produtos amplificados que tendem a
parear entre si, em detrimento do pareamento
com os primers;
 Gasto de reagentes, especialmente primers, mas
também de desoxinucleotídeos;
 Acúmulo de Pirofosfato, resultante das ligações
fosfodiésteres;
 Competição com outros produtos que vinham
AMPLIFICAÇÃO EXPONENCIAL DAS MOLÉCULAS sendo amplificados com eficiência menor, mas
DURANTE A PCR: a partir de 105 moléculas de DNA também foram se acumulando.
molde.

EFICIÊNCIA REAL DA PCR Otimização da PCR: aumentar o fornecimento de

amplicons da reação, aumentar a especificidade e
melhorar a reprodutibilidade.

Aspectos importantes a serem analisados:

25 – 30
CICLOS 1) Desenho dos Primers;
2) Temperatura de anelamento;
3) Concentrações dos reagentes;
4) Condições dos ciclos;

1) DESENHO DOS PRIMERS:

 Os primers de DNA devem conter de 15-25
nucleotídeos;
 Terminar com C ou G;
Na prática, a produção típica é de 80-85% de  Evitar sequências repetidas (A+T) e (C+G);
eficiência.  Os primers devem ter de 40%- 50% de C ou G
distribuídos;
AMPLIFICAÇÃO EXPONENCIAL DAS MOLÉCULAS
 3´ do primer deve ser 100% complementar ao
DURANTE A PCR: a partir de uma molécula de DNA
molde;
molde.
 5´ do primer pode não ser complementar;
 Evitar complementariedade entre os primers
(senso e anti-senso) e estruturas secundárias,
principalmente envolvendo a extremidade 3´;
 A diferença de temperatura de anelamento
entre os primers senso e anti-senso devem ser
no máximo 2-3°C;
 Fazer BLAST.
 Inibição da PCR: contaminantes da amostra de
de DNA podem inibir fortemente a reação da
PCR, por dificultarem a ação da Taq DNA
polimerase.

Evitar estruturas secundárias e dímeros: podem se

formar em temperaturas que a PCR não atinge, Controle de qualidade para a realização da PCR:
portanto, nesses casos, podem ser
desconsiderados.  Ponteiras e tubos estéreis, livres de DNA,
DNase e RNase;
2) TEMPERATURA DE ANELAMENTO  Tratamento com UV;
(TEMPERATURA MELTING)  Ponteiras com filtro anti-aerossol;
 Presença obrigatória de controle negative
 Temperatura Melting (Tm): A temperatura na
qual metade das fitas e DNA está na forma de
fitas simples (desnaturada) e a outra metade na
forma de dupla hélice;
 O Tm é dependente da composição do DNA, de
modo que o aumento do conteúdo de C+G no
DNA gera um incremento na Tm, devido ao fato
de C e G no DNA terem um poder de
empilhamento maior dos pares de bases
adjacentes e também pelo maior número de  Uso de jalecos específicos para a preparação
ligações de H entre essas bases. do MIX do PCR;
 Reagentes e, principalmente, água de alta
3) CONCENTRAÇÃO DOS REAGENTES: MASTER MIX
pureza;
DA PCR
 Áreas separadas para o preparo das reações.

ELETROFORESE: a Eletroforese em gel baseia-se

em separar moléculas biológicas a partir das suas
propriedades elétricas (carga positiva e negativa)
e tamanho.

4) CONDIÇÕES DOS CICLOS

 30 ciclos a [ Amplicon]
é muito próxima da dos
ciclos 30-40;
 Se o produto não for
feito em 30 ciclos,
reamplificar (20-30
 ciclos) 1 uL, com novo
mix.

DIFERENTES TAMANHOS DE MOLÉCULAS: diferentes

taxas de migração no gel

ELETROFORESE DE DNA: