INSTITUTO FEDERAL DE EDUCAÇÃO, CIÊNCIA E TECNOLOGIA BAIANO
Engenharia Agronômica
Profª Sara Menezes
CURSO: TURMA:
DISCIPLINA: DATA: / /
DISCENTE:
ROTEIRO DE AULA PRÁTICA:
Introdução ao trabalho de microscopia
INTRODUÇÃO
A vista humana não é capaz de perceber objetos com diâmetros inferiores a um décimo do milímetro (0,1mm
ou 100µm). Assim, as estruturas biológicas podem agrupar-se em dois grandes grupos: 1) macroscópicas, isto é, visíveis
ao olho humano; e 2) microscópica, isto é, invisíveis ao olho humano.
O microscópio (do grego, micros = pequeno e scopein = observar) é utilizado para a observação de objetos
microscópicos, por exemplo, células vivas ou mortas (preferencialmente após fixação e coloração) cujas medidas
encontram-se abaixo de 0,1mm. Entre elas temos células dos organismos eucariotos, as bactérias, os ovos de vermes e
muitas estruturas dos seres vivos.
Os microscópios ópticos ou fotônicos (do grego, photos = luz) usam a luz visível (radiação eletromagnética com
comprimento de onda entre 400 e 800 nm) para formar as imagens ampliadas dos objetos que queremos ver. São
compostos de três conjuntos de lentes ópticas: as lentes que compõem o condensador (condensa a luz no objeto em
observação); as lentes objetivas (formam a imagem); as lentes oculares (projetam a imagem no olho humano).
Para medir estruturas microscópicas, como as células e suas estruturas internas, precisamos empregar unidades
de medida especiais, menores que as utilizadas no dia-a-dia. O sistema métrico emprega múltiplos e submúltiplos do
metro, e os mais utilizados são:
Micrometro (µm): 1 µm = 10-6 m = 10-3 mm (0,001mm)
Nanômetro (nm): 1 nm = 10-9m = 10-6 mm
(0,000001mm)
Angstrom (Å): 1 Å = 10-10 m = 10-7mm (0,0000001 mm)
Picometro (pm): 1pm = 10-12m = 10-9 mm
(0,000000001mm)
1. O microscópio óptico
Todo microscópio se compõe de uma parte mecânica e uma óptica. A parte mecânica do microscópio é composta
por base ou pé, estativo, mesa ou platina, tubos de encaixe ou canhão, parafusos macrométrico e micrométrico, revólver
ou mecanismo para troca de objetivas. A parte óptica, por sua vez, é composta por oculares, objetivas, condensador com
diafragma, espelho para orientar o feixe luminoso ou luz embutida.
1.1 Parte Mecânica (Estrutura e Focagem)
Base (ou Pé): Suporte que assenta e dá estabilidade a todo o microscópio.
Braço (ou Coluna): Estrutura vertical que conecta a base ao sistema de lentes e suporta as demais partes. É usado para
segurar o microscópio ao transportá-lo.
Platina: Plataforma plana onde se coloca a lâmina (porta-objetos) com a amostra a ser observada. Possui uma abertura
central por onde a luz passa.
Charriot: Mecanismo (pinça ou mesa) que segura a lâmina na platina e permite movê-la com precisão nos eixos X e Y
(para frente/trás e para os lados).
Parafuso Macrométrico: Botão maior que permite movimentos rápidos e amplos da platina (ou do tubo) para
aproximar ou afastar a objetiva da amostra, auxiliando no foco grosseiro.
Parafuso Micrométrico: Botão menor, geralmente coaxial ao macrométrico, que permite movimentos lentos e precisos
da platina (ou do tubo) para o ajuste fino da imagem e obtenção da nitidez (foco fino).
Tubo (ou Canhão): Estrutura cilíndrica que sustenta a ocular e, em alguns casos, as objetivas, mantendo a distância
focal correta entre as lentes.
1.2 Parte Óptica (Sistema de Lentes e Iluminação)
Ocular: Lente localizada na parte superior, próxima ao olho do observador. Ela amplia a imagem já formada pela
objetiva. O aumento mais comum é de 10x.
Objetivas: Conjunto de lentes situadas perto da amostra (lâmina). São responsáveis pela maior parte da ampliação e
resolução. Geralmente, há 4 lentes objetivas no revólver com diferentes aumentos (ex.: 4x, 10x, 40x e 100x – sendo a
de 100x a que requer óleo de imersão).
Revólver: Disco giratório onde as lentes objetivas estão acopladas. Permite mudar de forma rápida e segura o aumento,
selecionando a objetiva desejada.
Fonte de Luz: Lâmpada ou LED (ou espelho em modelos antigos) que ilumina a amostra.
Condensador: Sistema de lentes que concentra os feixes de luz provenientes da fonte luminosa sobre a amostra que
está na platina.
Diafragma: Geralmente localizado abaixo do condensador, controla a quantidade e a abertura do cone de luz que
atravessa a amostra, influenciando no contraste e na resolução da imagem.
2. Ampliação
A ampliação do microscópio é dada pela ação das objetivas e oculares sobre a luz que atravessa o material. A
ampliação nominal é dada pelo valor gravado na lateral da objetiva multiplicado pelo valor gravado no aro da ocular.
As oculares normalmente apresentam aumentos de 5x, 8x, 10x, 20x. As ampliações das objetivas geralmente são de 4x,
10x, 20x, 40x, 60x e 100x. Assim, as ampliações máximas que nossos microscópios apresentam são de cerca de 1.200x.
Ampliações maiores podem ser obtidas com o uso de lentes intermediárias, chamadas optovares, as quais ficam entre a
ocular e a objetiva e podem aumentar 1,5 ou 2 vezes, de maneira que a maior ampliação em microscopia óptica é ao
redor de 2.000x. Ampliações maiores são obtidas em microscópio eletrônico. Quanto maior a ampliação, menor é o
diâmetro da objetiva, consequentemente, menor é a quantidade de luz que passa; portanto, com ampliações maiores, a
observação é mais escura.
3. Limite de resolução (LR)
A resolução mínima de um microscópio ótico é de aproximadamente 0,2 µm. Esse valor representa a menor
distância entre dois pontos que o microscópio consegue distinguir como separados. Abaixo disso, os pontos parecem se
fundir. Ou seja, se estivermos visualizando duas bactérias e a distância entre elas for menor do que isso, veremos uma
sobre a outra, como se fossem uma única bactéria; se a distância for igual ou superior, seremos capazes de enxergar as
duas bactérias no plano da lâmina.
4. Uso objetiva de imersão
Para o uso da objetiva de 100x (também chamada de objetiva de imersão) há a necessidade de se colocar uma
gota de óleo de cedro entre a lamínula e a objetiva e, por esse motivo ela não deve ser usada em preparações provisórias.
Também por esse motivo ela será pouco utilizada em nossas aulas, pois o óleo deve ser removido das lentes com
solventes orgânicos após o uso ([Link]. álcool anidro, éter, xilol ou clorofórmio) ou a lente poderá ser danificada.
Finalidade do uso do óleo de imersão: evitar arranhar a objetiva, já que ela fica muito próxima ao vidro da lâmina ou
lamínula, e corrigir a direção da luz que passa através da amostra analisada, já que o óleo possui o mesmo índice de
refração do vidro (lâmina, lamínula e lentes do microscópio). Dessa forma, a luz não é desviada quando passa entre os
diferentes materiais e a imagem não fica distorcida
5. Observação ao microscópio
I. Ligue a fonte de luz do microscópio.
II. Coloque a lâmina na platina, centralizando a amostra no orifício.
III. Comece com a objetiva de menor aumento (por exemplo, 4x).
IV. Ajuste o foco inicial usando o parafuso macrométrico, aproximando a objetiva da lâmina e depois
afastando lentamente até a imagem ficar visível.
V. Mude para as objetivas de maior aumento (10x e 40x) e use o parafuso micrométrico para fazer os
ajustes finos e obter o foco nítido em cada ampliação.
ATIVIDADE
1. Identifique e nomeie as partes do microscópio óptico numeradas de 1 a 15:
2. Observação de letras ao microscópio:
- Limpe uma lâmina com um pedaço de papel absorvente.
- Escreva e recorte a letra desejada em um pedaço de papel de cerca de 1 cm².
- Coloque uma gota de água sobre a lâmina.
- Posicione a letra sobre a gota de água.
- Se necessário, remova o excesso de água com papel absorvente ou papel de filtro.
- Cubra a lâmina com uma lamínula, inclinando-a a 45° e deixando-a cair lentamente para evitar bolhas de ar.
Observe e compare as imagens obtidas em cada ampliação:
Objetiva: 4X Objetiva: 10X Objetiva: 40X
Ocular: 10X Ocular: 10X Ocular:10X
Ampliação: Ampliação: Ampliação:
3. Anote as informações importantes e responda:
a) Como é a imagem observada no microscópio óptico?
b) Qual a relação entre aumento versus detalhe?
c) Quais detalhes não visíveis a olho nu são identificados?
d) Como é calculada a ampliação total da imagem?
e) Qual a resolução mínima de um microscópio óptico. O que isso significa? Por que esse limite existe?
f) Na observação de uma preparação com o microscópio utilizado nesta atividade laboratorial, verifica-se
__________.
(A) que, quanto maior for a ampliação utilizada, maior será o campo de observação.
(B) que a imagem é simétrica e invertida em relação à imagem real.
(C) a imagem obtida é igual à imagem real.
(D) que a luz fornecida pela fonte luminosa é dispersada pelo condensador.
g) Relativamente ao processo de focagem foram feitas as seguintes afirmações. Selecione a alternativa que as
avalia corretamente.
1. Para efetuar a focagem o diafragma deve estar completamente fechado.
2 A primeira focagem deverá ser efetuada com o parafuso macrométrico, que permite movimentos lentos da
platina.
3. O parafuso micrométrico, permite corrigir a focagem até obter uma imagem nítida.
(A) 1 e 2 são verdadeiras; 3 é falsa.
(B) 2 e 3 são verdadeiras; 1 é falsa.
(C) 1 e 3 são verdadeiras; 2 é falsa.
(D) 1 é verdadeira; 2 e 3 são falsas.