revisão

MÉTODOS APLICADOS
À EPIDEMIOLOGIA MOLECULAR
DO Mycobacterium tuberculosis

Lorena Cristina Santos, 1 Ana Paula Junqueira Kipnis 1 e André Kipnis 1

RESUMO

Estima-se que um terço da população mundial esteja infectada com Mycobacterium tuberculosis,
resultando em dois milhões de mortes anualmente. No mundo, são registrados mais de oito milhões
de novos casos de tuberculose por ano e o Brasil é um dos principais países nos quais ocorrem tais
registros. Os fatores determinantes para o controle da tuberculose são: a detecção rápida, a terapia
adequada e os meios de se evitar futuras transmissões. A caracterização de linhagens por tipagem
molecular é um instrumento útil nessas investigações epidemiológicas. Existem vários métodos de
tipagem molecular para a caracterização destas linhagens. O IS6110-RFLP é a técnica padronizada
mundialmente. Algumas técnicas, como spoligotyping, VNTRs-MIRUs, entre outras, têm
representado alternativas para análises de isolados de M. tuberculosis geneticamente relacionados,
especialmente em casos em que a análise de IS6110-RFLP não é aplicável. Nesta revisão, foram
consultadas publicações relevantes sobre o assunto, em periódicos especializados, a fim de se obter
maior compreensão sobre as técnicas de genotipagem do Mycobacterium sp e suas respectivas
vantagens e limitações.

DESCRITORES: Mycobacterium tuberculosis. Epidemiologia. Tipagem

molecular.

INTRODUÇÃO

A tuberculose é uma das principais doenças infecciosas do mundo. Tem-se

estimado que um terço da população mundial esteja infectada com Mycobacterium
tuberculosis, o que resulta em dois milhões de mortes anualmente (3). Em 1993,
a OMS declarou a tuberculose como emergência global e, desde então, vem
desenvolvendo políticas para contê-la.

1 Departamento de Microbiologia, Imunologia, Parasitologia e Patologia, Instituto de Patologia

Tropical e Saúde Pública (IPTSP), Universidade Federal de Goiás (UFG).

Endereço para correspondência: André Kipnis, rua 235, esquina c/1.ª Avenida, Setor Universitário.
CEP 74.605-050, Goiânia, Goiás, Brasil. E-mail: akipnis@[Link]

Recebido para publicação em 6/11/2006. Revisto em 20/4/2007. Aceito em 23/4/2007.

Vol. 36 (1): 1-15. jan.-abr. 2007 

 A tuberculose atingiu proporções alarmantes e hoje é considerada uma
calamidade pública em virtude da redução dos investimentos em pesquisas durante
duas décadas, sobretudo, desde a implantação da rifampicina na quimioterapia de
curto prazo para tuberculose, a partir da década de 1960, quando se acreditava que
a doença estivesse sob controle (20). Somaram-se a isso a combinação de fatores
demográficos, os movimentos populacionais, a expansão da epidemia do HIV e
o aumento da resistência às drogas. Além do mais, estima-se que se a efetividade
do controle da tuberculose não obtiver melhoras substanciais, o número de casos
novos passará dos 200 milhões em 2001 para perto de um bilhão de novas pessoas
infectadas no ano de 2020 (30). O Brasil está entre os principais países que registram
esses casos, ocupando a 15ª posição entre as regiões com a maior prevalência da
doença (48).
Apesar de o agente causador da tuberculose humana ser altamente
infectante, sua capacidade de desenvolver a doença clínica é relativamente
baixa. Estima-se que apenas 10% das pessoas infectadas tornam-se doentes.
Os fatores predisponentes ao desenvolvimento da doença não foram totalmente
elucidados, mas, de maneira geral, eles são atribuídos a uma combinação entre
fatores ambientais, características do hospedeiro e da linhagem do M. tuberculosis.
Fatores sociais típicos de nações em desenvolvimento, como pobreza, desnutrição,
estresse, superpopulação e exposição a micobactérias ambientais, influenciam a
susceptibilidade à tuberculose (4, 13, 43). Contudo, existem evidências de que
uma predisposição genética multifatorial, além de fatores como idade, estado
imunológico do indivíduo, doenças concomitantes e outros fatores de resistência do
hospedeiro estejam associados (21, 28).
Adicionalmente, a emergência e a disseminação de linhagens de M.
tuberculosis multiresistentes a drogas (MDR-TB) também se tornaram uma séria
ameaça para o controle da tuberculose. A falta de novos agentes terapêuticos para
a MDR-TB e a necessidade de desenvolver métodos de diagnóstico molecular
rápidos e eficientes têm estimulado, nos últimos anos, o delineamento das bases
genéticas moleculares da resistência do M. tuberculosis (46) às drogas.
A identificação de linhagens constitui um método adicional útil em
investigações epidemiológicas, pois é um meio para se entender melhor os
mecanismos que influenciam a dinâmica de transmissão e a identificação dos
fatores de risco em uma comunidade. Esta identificação permite a elaboração de um
modelo adequado de medidas de controle, além de poder ser usada para investigar
propriedades biológicas das linhagens, como virulência e patogenia (31).
Algumas das principais características epidemiológicas que são elucidadas
com estas técnicas moleculares são: determinação da origem de uma infecção
em um paciente (familiar ou comunitária); disseminação e detecção precoce de
organismos que adquiriram resistência a antibióticos (1, 19); discriminação entre
doença endógena e exógena (9, 42), além de casos de contaminação cruzada em
laboratório (8).

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 Vários métodos têm sido desenvolvidos para a diferenciação de isolados
clínicos baseados no polimorfismo genético de DNA do M. tuberculosis (DNA
fingerprint). Os primeiros trabalhos para a determinação de polimorfismo genético
de M. tuberculosis utilizaram tipagem por fago (38). Esta técnica foi usada para
analisar a heterogeneidade entre colônias individuais do bacilo obtidas de culturas
isoladas de esquimós. Concluiu-se que 14,1% dos pacientes testados foram
infectados simultaneamente com mais de uma linhagem de M. tuberculosis. Apesar
de ter sido útil na época, esta técnica é limitada pelo número reduzido de tipos de
fagos para Mycobacterium spp. e pela baixa sensibilidade do método (30).
Recentemente, os estudos epidemiológicos da tuberculose foram
facilitados graças à aplicação de marcadores moleculares linhagem-específicos
(56). O desenvolvimento desses métodos e a utilização de DNA fingerprint têm
permitido a distinção dessas linhagens. Quando duas ou mais linhagens têm o perfil
fingerprint idêntico ou muito similar, infere-se que elas pertençam a um mesmo
grupo. Com isso, linhagens isoladas de diferentes pacientes, mas pertencentes a
um mesmo grupo podem ter elevada probabilidade de serem epidemiologicamente
associadas, isto é, podem refletir transmissão recente entre os pacientes (27).
A análise do polimorfismo de comprimento de fragmentos de restrição
baseados em IS6110 (IS6110 - Restriction Fragment length polymorphism-RFLP)
é considerada atualmente a técnica padrão para a comparação de isolados de M.
tuberculosis (56). Outras técnicas, como spoligotyping (29) e, mais recentemente,
a tipagem baseada no número variável de repetições em tandem (VNTRs- Variable
Number of Repeats Tandem) de unidades repetitivas intercaladas de micobactérias
(MIRUs - Mycobacterial Interspersed Repetitive Units) têm representado alternativas
para análises de isolados de M. tuberculosis geneticamente relacionados (24, 39, 52),
especialmente nos casos em que a análise com a utilização de IS6110-RFLP não é
aplicável ou quando os resultados desta análise são de difícil interpretação. Nos casos
de infecção simultânea por duas ou mais linhagens de M. tuberculosis, são necessárias
várias técnicas de DNA fingerprints (49).
Os métodos de tipagem molecular são também úteis para a diferenciação
dos membros do complexo M. tuberculosis. Estes consistem em quatro espécies
relacionadas: Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis, Mycobacterium
microti e Mycobacterium africanum (55), as quais, apesar de demonstrarem
diferenças fenotípicas, possuem um elevado grau de identidade genética (18). Os
genomas dessas espécies são ricos em DNA repetitivo (11), fato que tem sido
explorado pela tipagem molecular. Os conhecimentos adquiridos a partir dessas
análises permitiram a discriminação entre as espécies, bem como correlacioná-
las com as características clínicas da doença, além de fornecerem dados como
patogenicidade, adaptação ao hospedeiro e origem (47).
Nesta revisão, procuramos ressaltar as principais técnicas moleculares
utilizadas para genotipagem de micobactérias, evidenciando suas vantagens,
desvantagens e limitações. Descreveremos as técnicas baseadas na análise de

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polimorfismo do DNA após digestão por enzima de restrição (RFLP), RFLP
seguida de hibridização com sondas (IS6110), spoligotyping e MIRU-VNTR.

MÉTODOS NA ANÁLISE DE POLIMORFISMO DO DNA

1. Polimorfismo de comprimento de fragmentos de restrição (RFLP)

A diferenciação de linhagens do complexo M. tuberculosis pelo uso de

tecnologia baseada em ácidos nucléicos se fundamenta em diferenças especificas de
linhagens e freqüências de certas seqüências de DNA em seu genoma. Neste método,
o DNA é clivado com enzimas de restrição particulares (PvuII, por exemplo),
resultando em fragmentos de restrição de DNA que são separados por eletroforese
em gel de agarose (12, 45). A Figura 1 esquematiza as etapas necessárias.

fragmentos gel de agarose

DNA + enzimas de restrição
de restrição dos fragmentos de restrição

Figura 1. Esquema ilustrativo da técnica do RFLP. Os DNAs extraídos de M.

tuberculosis provenientes de culturas são digeridos in vitro com enzimas
de restrição. O produto da digestão é separado por eletroforese em gel de
agarose corado com brometo de etídeo e, posteriormente, analisado para
a comparação dos perfis de digestão.

Embora esta técnica seja rápida, a interpretação dos resultados do RFLP é

difícil em razão do grande numero de fragmentos gerados, o que resulta em padrões
complexos de difícil diferenciação e baixo poder discriminatório (30).

1.1. RFLP seguido de hibridização

O RFLP seguido de hibridização se baseia na presença de elementos
transponíveis (seqüências de inserção) no genoma do M. tuberculosis (56) ou
seqüências repetitivas do genoma, que podem ser evidenciadas após o emprego de
endonucleases de restrição (Figura 1). Para a execução desta técnica, os elementos
repetitivos de DNA são clonados e usados como sondas para se visualizar somente
os fragmentos de restrição que contenham a seqüência complementar para a
sonda (53). Os principais marcadores, que são utilizados como sondas, atualmente
incluem o elemento de inserção (IS) 6110 e as seqüências repetitivas ricas em GC.
Van Soolingen et al. (1991) demonstraram que IS são estáveis em M. tuberculosis,

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mesmo após várias passagens in vitro. A clonagem e a obtenção das sondas estão
exemplificadas na Figura 2.

Figura 2. Esquema de clonagem da seqüência do IS6110 no plasmídeo pGemT

para obtenção da sonda IS6110. O DNA genômico da cepa padrão
H37RV é amplificado por PCR com oligonucleotídeos específicos
para a região IS6110 e o produto é ligado ao plasmídeo pGemT por
uma enzima DNA ligase, resultando em um plasmídeo que contém o
inserto.

O IS6110 é uma seqüência de 1.361 pares de base (pb) que foi detectada
em membros do complexo M. tuberculosis e tem se mostrado bastante conservada
entre os diferentes isolados. O número de cópias de IS6110 presentes no genoma
é espécie e linhagem dependente (30), portanto o IS6110 RFLP é amplamente
aplicado na diferenciação de isolados (44). A técnica é de fácil comparação porque,
geralmente, apresenta bandas hibridizadas com igual intensidade, diferentemente
de outras técnicas como o spoligotyping (32). Por sua utilização mundial, os dados
obtidos em qualquer laboratório podem ser comparados, facilitando o entendimento
das cadeias de transmissão.
Além do número de cópias de IS6110 por linhagem ser variável, de 0 a
25 cópias, a posição desses elementos no genoma também é variável, ampliando a
possibilidade de gerar maior quantidade de padrões de bandas com os fragmentos
resultantes após o tratamento com a enzima de restrição: PvuII. Os fragmentos de
restrição são separados em gel de agarose e, posteriormente, transferidos para uma

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membrana de nylon ou nitrocelulose. A visualização dos fragmentos que contêm
IS6110 se dá por meio de sondas complementares ao IS6110 marcadas, que são
adicionadas para a hibridização com os fragmentos transferidos para a membrana.
Os fragmentos de restrição hibridizados podem ser visualizados por uma reação de
quimioluminescência ou por radioatividade, dependendo do tipo de marcação da
sonda (56). A Figura 3 ilustra uma reação visualizada por quimioluminescência.

Figura 3. Esquema de hibridização para obtenção do perfil de bandas. DNA

de culturas isoladas de M. tuberculosis são digeridos com enzima
PvuII, separados por eletroforese em gel de agarose e, posteriormente,
transferidos para a membrana. Esta é incubada com sondas
complementares para IS6110 previamente marcadas. Após a hibridização
e a lavagem da membrana, o substrato quimioluminescente da sonda
marcada é adicionado e a membrana é exposta a um filme de raio X, que
revelará a presença dos fragmentos que contêm seqüências IS6110.

As maiores desvantagens dessa técnica referem-se à exigência de cultura

de várias semanas, com organismos viáveis para a obtenção de DNA em grande
quantidade e de elevada qualidade, além de seu alto custo. Adicionalmente, algumas
regiões, como Londres, apresentam grande número de linhagens com baixo número
de cópias de IS6110 (25% do total de linhagens com menos de cinco cópias). As
posições das bandas nestas cepas apresentam menor polimorfismo, portanto baixo
poder discriminatório (6, 37).

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 Uma importante implicação de DNA fingerprint RFLP-IS6110 para
tuberculose é sua habilidade em mensurar a diversidade de linhagens de M.
tuberculosis, incluindo diferenças por região, população e, possivelmente,
prevalência de linhagens endêmicas (40). Esta diversidade foi demonstrada nos
EUA por análises de genotipagem em bases de dados, em que 10.883 pacientes
tuberculosos, representando aproximadamente 11,6% de todos os casos novos
daquele país de 1996 a 2000, resultaram em 6.128 amostras distintas (35).

Métodos Baseados na amplificação de DNA por reação da

polimerase em cadeia (PCR)

Técnicas de tipagem mais rápidas têm sido desenvolvidas e a maioria

delas fundamenta-se na amplificação baseada no método da PCR. Estes métodos
têm sido vantajosos para tipificar M. tuberculosis diretamente em amostras clínicas,
dispensando a etapa de crescimento do microrganismo além da possibilidade de
serem usadas em isolados não mais viáveis para cultivo. Algumas destas técnicas,
contudo, carecem de reprodutibilidade ou têm menor poder discriminatório que
RFLP-IS6110 (32). Existem vários métodos baseados na tipagem molecular
utilizando-se PCR, dentre eles spoligotyping e um número variável de repetições em
tandem (VNTR) se mostram os mais promissores.

1. Spoligotyping

O método spoligotyping tem sido usado para acompanhar linhagens com

diferentes aplicações epidemiológicas (59). Por sua simplicidade é freqüentemente
utilizado para a tipagem do complexo M. tuberculosis. Além disso, ele é usado
também como um método de tipagem adicional para linhagens com menos de cinco
cópias de IS6110 (6, 25, 51).
Esta técnica baseia-se no polimorfismo de DNA na região do lócus
de repetição direta (DR) de M. tuberculosis. Este lócus contém DRs de 36pb
intercaladas com espaços de seqüências não repetitivas de 34-41pb múltiplas e
bem conservadas. Estas regiões foram descritas pela primeira vez flanqueando uma
seqüência IS6110 (41).
As linhagens variam em número de DRs e presença ou ausência de
espaços particulares (29). A técnica envolve a amplificação das regiões espaçadoras
entre os DRs (Figura 4), para posterior hibridização em uma membrana que
contenha oligonucleotídeos específicos para as diferentes seqüências espaçadoras,
previamente ligados covalentemente. O resultado é obtido mediante a hibridização
ou não de cada seqüência espaçadora, resultando em um padrão de hibridização que
é comparado entre as diferentes amostras (27).
O polimorfismo é proporcionado por estes espaços, os quais são
variáveis em comprimento (de 34 a 41) (57), seqüência e número. Embora

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esses espaços variem, cada um é comum para um grupo de linhagens (25).
Este polimorfismo é provavelmente duplo para recombinações homólogas
entre DRs vizinhas ou distantes e para rearranjos dirigidos para o elemento de
inserção IS6110, o qual está presente na região DR de muitas linhagens de M.
tuberculosis. Visto que regiões DRs são bem conservadas entre as linhagens de
M. tuberculosis, cada cópia DR dentro do lócus DR é um potente alvo para a
amplificação por PCR (29).

Regiões espaçadoras 1 2 3 4

DNA genômico DR DR DR DR DR

Oligonucleotídeos
Produtos da PCR

Hibridização dos produtos de cada amostra em membrana

contendo oligonucleotídeos específicos para cada região

6
Regiões espaçadoras 1 2 3 4
Amostra A
Amostra B
Amostra C

Figura 4. Esquema representativo da amplificação por PCR entre as seqüências

DRs utilizadas na técnica do spoligotyping. Dois oligonucleotídeos
iniciadores são utilizados para amplificar as regiões espaçadores entre
regiões DRs, um no sentido 5’-3’ e outro reverso, 3’-5’, resultando em
fragmentos de diversos tamanhos, dependendo da presença ou ausência
destas regiões no genoma que serão reveladas após hibridização.

Quando usado em associação com outras técnicas alternativas ao RFLP-

IS6110, o spoligotyping se mostra uma técnica rápida, efetiva e econômica (7,
34). Entretanto, sua utilização em substituição à técnica do RFLP IS6110 deve
ser considerada com precaução (60), visto que uma proporção de linhagens com
diferenças no perfil do marcador genético RFLP-IS6110 exibem perfis idênticos
de spoligotipyng (17). Segundo estudos realizados por Salmoniere et al. (1997)
(25), o spoligotyping se mostrou um método adequado para triagens iniciais porque
consiste em uma técnica de PCR que requer pouca quantidade de DNA. Isolados
do complexo M. tuberculosis, que apresentem diferentes perfis de spoligotyping,
também revelarão, sem exceção, diferentes RFLPs IS6110.

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2. Número variável de repetições em tandem (VNTR)

Loci genéticos contendo VNTR formam a base do mapeamento

genético humano. Muitos genes de importância médica têm sido identificados por
mapeamento baseado em suas ligações no lócus VNTR. Este método também é
aplicado em medicina forense e em testes de paternidade (2, 22, 23, 26).
Loci de repetição em tandem, similares aos minissatélites em eucariotos,
também têm sido identificados em bactérias do complexo M. tuberculosis. Estes
VNTRs freqüentemente se diferem em número de cópias entre os isolados (24).
Estas estruturas consistem em seqüências repetitivas de 40-100pb, chamadas de
MIRUs (Mycobacterial interspersed repetitive units) encontradas dispersas no
genoma do complexo M. tuberculosis (36, 52). Um estudo recente no genoma do
M. tuberculosis H37Rv revelou que 12 dos 41 loci MIRUs presentes constavam no
genoma de isolados não relatados de diferentes regiões geográficas e que a tipagem
com o uso destes 12 loci proporcionou uma resolução comparável ao RFLP-IS6110.
Estes alvos, portanto, são promissores para o desenvolvimento de um método com
alta resolução, conveniência e grandes aplicações para tipagem (39).
Estudos realizados por Domenech et al. localizaram VNTRs tanto em
regiões codificantes quanto em regiões intergênicas do M. tuberculosis H37RV.
Todos os loci VNTR reportados, presentes em regiões codificantes, tinham tamanhos
repetidos e eram múltiplos de três nucleotídeos. Parece que, em algumas bactérias
patogênicas, VNTRs em regiões codificantes proporcionam grandes variações em
proteínas envolvidas na patogenicidade, as quais podem ajudar o patógeno a se
adaptar melhor e a evadir do sistema imunológico do hospedeiro.
A tipagem VNTR-MIRU é baseada em PCR, produzindo dados facilmente
manejáveis para serem aplicados nos estudos de epidemiologia molecular global do
complexo M. tuberculosis (39). Para revelar o número de repetições em tandem, o
PCR é realizado com oligonucleotídeos iniciadores destinados a amplificar o lócus
de repetição em tandem selecionado. A presença e o tamanho do produto de PCR são
determinados por eletroforese em gel de agarose, sendo destinados para cada lócus
uma reação de PCR e um gel, como mostra a Figura 5. Com base no conhecimento
do tamanho de diferentes repetições em tandem, o número de repetições é calculado
de acordo com dados já publicados (16). Esta tipagem tem se mostrado muito
informativa, pois se baseia na repetição do número de cópias em loci específico.
A identificação do loci VNTR-MIRU mostrou ser igualmente aplicável
para tipagem de Mycobacterium bovis, o qual tem demonstrado ser de difícil tipagem
pelos métodos existentes (14, 15, 16, 50). Esta técnica tem discriminação similar ao
RFLP IS6110 em linhagens com grande número de cópias do elemento IS6110 e se
mostra melhor quando as linhagens possuem número reduzido de cópias (33).
O M. bovis infecta humanos freqüentemente pelo consumo do leite fresco
de vacas e não usualmente de pessoa para pessoa. As infecções por este patógeno
são geralmente encontradas em sítios extrapulmonares. O RFLP IS6110 não é

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um método muito adequado para a investigação do M. bovis. Isso ocorre porque
proporções significativas dessas linhagens isoladas de humanos contêm somente
uma cópia do elemento IS6110, que está em uma posição fixa do genoma (15).
O VNTR-MIRU, quando comparado com RFLP-IS6110 e spoligotyping, produz
amostras mais distintas (5, 16). Segundo um consenso recente da União Européia
sobre a determinação de novos marcadores e técnicas para epidemiologia e controle
da tuberculose, o método de tipagem VNTR-MIRU poderá substituir o IS6110 em
um futuro próximo (30).

Locus 1 2 3 4 5

DNA genômico

Oligonucleotídeos Iniciadores
Produtos da PCR

Gel amostras

Locus A B
1
2
5

Figura 5. Esquema representativo da amplificação utilizada pela técnica VNTR.

Oligonucleotídeos iniciadores específicos para cada lócus VNTR
resultarão em amplificação de acordo com a presença ou ausência
do alvo. Após realizar a PCR para os vários loci, a análise é feita em
gel de agarose para visualizar os produtos esperados. Cada linhagem
apresentará um perfil de acordo com as regiões VNTRs presentes em
seu genoma.

ANÁLISE COMPARATIVA DAS DIFERENTES TÉCNICAS DE TIPAGEM

MOLECULAR

Kremer et al. (1999) avaliaram diferentes métodos de tipagem de M.

tuberculosis, de acordo com seus graus de reprodutibilidade, diferenciação e

10 REVISTA DE PATOLOGIA TROPICAL

especificidade. Oito diferentes laboratórios, especializados em vários métodos de
tipagem, analisaram, cegamente, 131 amostras de DNA por 12 métodos diferentes,
incluindo todos os citados nesta revisão. Dessas amostras, 90 linhagens eram de M.
tuberculosis, dentre as quais 31 amostras estavam em duplicata e outras dez eram
de espécies diferentes do M. tuberculosis.
A reprodutibilidade das técnicas foi analisada comparando-se as
amostras em duplicata. Os resultados obtidos por RFLP-IS6110 foram 100%
reprodutíveis. Das amostras analisadas por métodos baseados em PCR, a
reprodutibilidade variou entre 6% e 97%. A tipagem realizada por VNTR
apresentou apenas um par de amostras em duplicata com discordância, obtendo
um grau de reprodutibilidade de 97%. Quando a análise foi realizada por
spoligotyping, as amostras apresentaram um grau de 94% de identidade (das 31
amostras, 29 foram idênticas).
O RFLP-IS6110 obteve o maior grau de discriminação das 90 linhagens
do complexo M. tuberculosis analisado, apresentando 84 tipos diferentes; o
spoligotyping, 61 tipos e VNTR, 56 diferentes linhagens.
Contudo, apesar de o RFLP ser altamente reprodutível e discriminatório
é pouco útil para tipar linhagens que contenham baixo número de cópias
IS6110 (6, 33). Para a análise da especificidade dos métodos testados, foram
utilizadas aquelas dez linhagens de cinco espécies diferentes não pertencentes
ao complexo M. tuberculosis. Os métodos RFLP-IS6110 e spoligotyping não se
mostraram úteis para tipificar estas linhagens, sendo, portanto, especificos para
M. tuberculosis.

CONCLUSÕES

Estes estudos reforçam a consideração do RFLP, seguido de hibridização

IS6110, como a técnica padrão para tipificar linhagens do complexo M. tuberculosis
mundialmente. O RFLP constitui uma técnica de elevada reprodutibilidade,
sensibilidade, além de ser muito específica. Tais vantagens do RFLP-IS6110
podem ser perdidas quando se tratam de linhagens com baixo número de cópias da
sequência de inserção. Nestes casos, contudo, há a alternativa da utilização de outras
técnicas, como spoligotyping e VNTR, por exemplo.
Durante os últimos anos, fingerprint tem sido utilizado para melhorar
a definição dos fatores de risco na transmissão da TB e, atualmente, é aceita a
hipótese de que linhagens pertencentes a um mesmo grupo estão relacionadas com
transmissões recentes entre os pacientes que as possuem. Há estreita relação entre a
tipagem por RFLP e a origem geográfica das linhagens de M. tuberculosis, sendo,
portanto, determinantes para os programas de controle da tuberculose de cada país
(10, 54, 57, 58, 61).
Os métodos de tipagem molecular têm, assim, importância preponderante
no que diz respeito ao monitoramento da transmissão da tuberculose nos paises
endêmicos.

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ABSTRACT

Methods employed in the molecular epidemiology of Mycobacterium tuberculosis

Almost one third of the world population is infected with Mycobacterium

tuberculosis which results in two millions of deaths annually. Every year, eight
million of new tuberculosis cases are reported worldwide and Brazil is one
of the main contributing countries for those cases. Key factors for controlling
tuberculosis are: rapid detection, adequate therapy, and means to avoid further
transmissions. Strain characterization by molecular typing has become a useful tool
in epidemiological investigations. There are several methods for molecular typing
of these strains, IS6110-RFLP being considered the gold standard. Some methods,
such as spoligotyping, VNTRs-MIRUSs, among others, have proved to be useful
as an alternative in cases where IS6110-RFLP is not applicable. In order to broaden
our understanding about Mycobacterium sp genotyping techniques, as well as
their limitations and advantages, several relevant publications about this matter are
presented and discussed in this review.

KEY WORDS: Mycobacterium. Epidemiology. Molecular typing.

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12 REVISTA DE PATOLOGIA TROPICAL

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Vol. 36 (1): 1-15. jan.-abr. 2007 15

Próximos eventos na área de patologia tropical E SAÚDE
PÚBLICA

XLIII Congresso da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, Campos do Jordão,

SP, 11 a 15 de março de 2007. Informações: [Link] ou atendimento@
[Link]

II Conferencia Internacional sobre Giardia y Cryptosporidium, México, 13 a 18 de

maio de 2007. Informações: [Link]

X Siconbiol Simpósio de Controle Biológico, Brasília, DF, 30 de junho a 04 de julho

de 2007. Informações: [Link]

4th IAS Conference on HIV Pathogenesis, Treatment and Prevention, Sidney,

Australia, 22th to 25th july 2007. Informações: [Link]

XX Encontro Brasileiro de Malacologia, Rio de Janeiro, 5 a 10 de agosto de 2007.

Informações: sbmalacologia@[Link]

13th International Congress of Immunology, Rio de Janeiro, 21 a 25 de agosto de

2007. Informações: [Link]

24º Congresso Brasileiro de Microbiologia, Brasília, DF, 3 a 6 de outubro de 2007.

Informações: [Link]

XVIII Congreso de la Federación Latinoamericana de Parasitologia (FLAP), Isla

de Margarita, Venezuela, 21 a 25 de outubro de 2007. Informações: www.flap2007.
com

XX Congresso Brasileiro de Parasitologia, Recife, PE, 28 de outubro a 01 de

novembro de 2007. Informações: silferreira@[Link]

5º. Congresso Brasileiro de Micologia, Recife, PE, 12 a 16 de novembro de 2007.

Informações: [Link]

VIII Congreso Centroamericano y del Caribe de Parasitologia y Medicina

Tropical, Havana, Cuba, 4 a 7 de dezembro de 2007. Informações: [Link].
cu/eventosipk/cong2007/

44º. Congresso da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, Porto Alegre, RS, 4 a

8 de março de 2008. Informações: [Link]
16 REVISTA DE PATOLOGIA TROPICAL